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治疗性碱基编辑可将约30%的致病性错义突变直接恢复为野生型序列。拓展其适用范围的一种策略是引入第二位点校正突变，以改善携带多种不同致病等位基因的蛋白质的稳定性或功能。在本研究中，我们采用平铺式腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑筛选，鉴定NPC1中的此类校正突变。NPC1是一种溶酶体胆固醇转运蛋白，其错误折叠会导致C型尼曼–匹克病。在携带常见致病等位基因NPC1 I1061T的单倍体人细胞中，我们对内源性NPC1基因座进行平铺式诱变，并结合反映胆固醇转运和蛋白质丰度的表型报告系统，发现了分布于多个结构域的罕见基因内抑制突变。出乎意料的是，我们鉴定出一种具有广泛校正作用的第二位点变异，能够校正多种不同的NPC1致病突变。这些校正突变可提高蛋白质稳定性，促进蛋白质从内质网输出并转运至溶酶体，并在患者来源的成纤维细胞和诱导神经元中恢复胆固醇清除能力。我们的研究确立了利用原位碱基编辑筛选发现第二位点校正突变的方法；当原始突变无法被纠正时，这些校正突变可作为治疗性碱基编辑的干预靶点。
平铺式碱基编辑筛选揭示可挽救错误折叠致病蛋白的罕见第二位点突变 | bioRxiv
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平铺式碱基编辑筛选揭示可挽救错误折叠致病蛋白的罕见第二位点突变
Shivali Rawat，Parijat Sarkar，Eric Giavedoni，Ganesh V. Pusapati，Murugesh Padmanarayana，Mallory Shin，Elizabeth Phillippi，Taylar Simmons，Ruth Azaria，Diwakar Shukla，Mark L. Schultz，Rajat Rohatgi
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.10.30.763201
Shivali Rawat
1
美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院生物化学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院内科学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福癌症研究所；
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Parijat Sarkar
1
美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院生物化学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院内科学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福癌症研究所；
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Eric Giavedoni
2
美国伊利诺伊州厄巴纳，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学与生物分子工程系；
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Ganesh V. Pusapati
1
美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院生物化学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院内科学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福癌症研究所；
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网站
Murugesh Padmanarayana
1
美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院生物化学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院内科学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福癌症研究所；
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Mallory Shin
3
美国艾奥瓦州艾奥瓦城，艾奥瓦大学斯特德家族儿科学系；
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Elizabeth Phillippi
3
美国艾奥瓦州艾奥瓦城，艾奥瓦大学斯特德家族儿科学系；
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Taylar Simmons
3
美国艾奥瓦州艾奥瓦城，艾奥瓦大学斯特德家族儿科学系；
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Ruth Azaria
4
美国密歇根州安娜堡，密歇根大学医学院病理学系
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Diwakar Shukla
2
美国伊利诺伊州厄巴纳，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校化学与生物分子工程系；
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Mark L. Schultz
3
美国艾奥瓦州艾奥瓦城，艾奥瓦大学斯特德家族儿科学系；
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Rajat Rohatgi
1
美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院生物化学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院内科学系；美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福癌症研究所；
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治疗性碱基编辑可将约 30% 的致病错义突变直接改回野生型序列。扩大其适用范围的一种策略，是引入第二位点校正突变，以提高多种致病等位基因对应蛋白的稳定性或功能。在本研究中，我们利用腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑的平铺筛选，在 NPC1 中鉴定此类校正突变。NPC1 是一种溶酶体胆固醇转运蛋白，其错误折叠会导致 C 型尼曼-匹克病。我们在携带常见 NPC1I1061T 致病等位基因的单倍体人细胞中，对内源性 NPC1 位点进行平铺诱变，并结合胆固醇转运和蛋白丰度表型报告系统，发现了分布于多个结构域中的罕见基因内抑制突变。出乎意料的是，我们还发现了一种具有广泛作用的第二位点变异，可校正多种不同的 NPC1 致病突变。这些校正突变能够提高蛋白稳定性、促进其离开内质网并转运至溶酶体，同时在患者来源的成纤维细胞和诱导神经元中恢复胆固醇清除功能。我们的研究确立了在细胞原位开展碱基编辑筛选的方法，可用于发现第二位点校正突变；当原始突变无法校正时，这类突变可为治疗性碱基编辑提供可行策略。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
基金资助信息
圣母大学 Ara Parseghian 医学研究基金
美国国立卫生研究院（NIH）
R35GM142745
R35GM154959
T32MH019113-31
版权
本预印本的版权持有者为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 展示该文的许可。
永久保留预印本。
本文依据
CC-BY-NC 4.0 国际许可协议
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发布于2026年11月2日。
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平铺式碱基编辑筛选揭示可挽救错误折叠的致病蛋白的罕见第二位点突变
Shivali
Rawat
，
Parijat
Sarkar
，
Eric
Giavedoni
，
Ganesh V.
Pusapati
，
Murugesh
Padmanarayana
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Mallory
Shin
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Elizabeth
Phillippi
，
Taylar
Simmons
，
Ruth
Azaria
，
Diwakar
Shukla
，
Mark L.
Schultz
，
Rajat
Rohatgi
bioRxiv
2026.10.30.763201；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.10.30.763201
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平铺式碱基编辑筛选揭示可挽救错误折叠的致病蛋白的罕见第二位点突变
Shivali
Rawat
，
Parijat
Sarkar
，
Eric
Giavedoni
，
Ganesh V.
Pusapati
，
Murugesh
Padmanarayana
，
Mallory
Shin
，
Elizabeth
Phillippi
，
Taylar
Simmons
，
Ruth
Azaria
，
Diwakar
Shukla
，
Mark L.
Schultz
，
Rajat
Rohatgi
bioRxiv
2026.10.30.763201；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.10.30.763201
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关键词：碱基编辑筛选 · 第二位点校正突变 · NPC1 · 蛋白质错误折叠 · C型尼曼–匹克病 · 胆固醇转运
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.30.763201v1?rss=1