Adawarbler全胚胎旋转培养技术及其应用研究进展[1]

        体外全胚胎培养技术 ( whole  embryo  culture, WEC) 是一种将动物的完整胚胎移植到体外进行培养的实验技术。 

        Nicholas于1934年采用血浆作为培养基, 证明大鼠胚胎能够在母体外培养成活 24~36h, 从而创立了该实验方法。之后, 科学家们对培养基以及培养方法等条件不断改善。20世纪 80年代, Brown制定了用于评价胚胎的生长和分化情况的评分系统, 作为评价胚胎发育程度的指标。 目前, WEC已经被广泛用于胚胎发育、化合物的胚胎毒性和致畸性研究以及药物的安全评价等 。能够用于WEC 的胚胎材料来源广泛, 鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类胚胎均可用于实验。采用上述动物胚胎进行的各种研究均已见文献报道, 例如, 朱小山、端正花等应用斑马鱼胚胎分别研究了富勒烯和双酚 A 的胚胎毒性;  L i X Y 等应用蛙卵研究了1甲基 3 辛烷基咪唑啉酮溴化物对胚胎发育的影响; Alva rezl等应用鸡胚胎研究了成纤维细胞生长因子 ( FGFs) 的神经诱导作用; Hansen JM 等采用兔胚胎与大鼠胚胎对比研究了谷胱甘肽和半胱氨酸在反应停致畸中的作用等。目前, 利用大鼠或小鼠器官形成期的胚胎通过旋转培养方法进行化合物的致畸研究最为常见。

1.WEC 技术及其发展概况

1.1培养方法 

         全胚胎培养技术经历了从静态培养向旋转培养发展的过程。20世纪 30 年代, Nicholas等建立了早期的体外静态胚胎培养技术。以大鼠肝素化血清与大鼠14~15d的胚胎提取物混合作为培养基, 可使得大鼠胚胎在体外生长。然而, 胚胎生长的时间较短, 一般在培养的 24 h内生长, 而36h后胚胎生长速度即减慢。培养48h内正常生长的胚胎不到一半, 正常分化的胚胎只有3/4。

        New等通过静态培养法, 以血浆凝块作为培养基, 并在培养过程中通入4%-5%CO2气体, 有效地提高了体节阶段早期胚胎的生长发育率。通过该实验还发现, 通入60%的O2气体对于胎龄较长的胚胎的生长发育率有提高作用。在此之后, New对其技术进行了改进, 其设计的循环器装置采用循环的同源离心血清培养基进行胚胎培养, 在培养过程中通入95% O2和5% CO2气体。结果证明, 除在30体节胚胎无法建立血管与尿囊胎盘的连接外, 胚胎生长发育和器官分化均与体内同龄胚胎无显著性差异。

        由于循环器装置较复杂, New等随后又设计了一套更为简便的充气旋转瓶装置, 采用旋转培养法, 其培养效果与循环培养器装置的培养基本一致。目前所采用的WEC技术基本上是在New的实验基础上改进而来, 即采用大鼠或小鼠受孕后8-10d的全胚胎,在合适的气体环境和适当的培养基条件下, 进行旋转培养一定时间后, 根据研究目的进行全胚胎评价。

1.2 培养工具

        Adawarbler® WEC001-GT系列（点击查看仪器详情）是一款基于New等科学家当初的充气旋转瓶装置原理再次创新的革命性的AI智能精密型全胚胎旋转培养系统。该系统突破了传统静态或简单悬浮培养胚胎的局限，集成了 Gastri3 AI三气智能分配管理系统、高精度压力控制模块及EmbyroLive20 远程摄像模块。它专为高度模拟体内复杂微环境而设计，至少支持全胚胎或类器官从E0到E90的长时程动态培养，广泛应用于：

• 啮齿动物全胚胎培养 (WEC)
• 类胚胎 (Embryoids) 与类囊胚 (Blastoids) 构建
• 人/鼠类器官 (Organoids) 的长期分化与发育

• iPSC (诱导多能干细胞) 的动态扩增

          系统技术原理：该装置是DAT New和DL Cockroft Experientia 35,138(1979)描述的充气旋转瓶装置(当时领域内首创)的现代化改进版本，每个培养瓶都具有封闭独立的微环境，并且经过技术工程师二次创新设计成完全适合小鼠等全胚胎等组织培养的可稳定长期发育的精密培养系统。具体的培养方法已经预设在系统内。本装置中的培养小瓶也同样基于其经典的"British Turntable Culture (BTC)"标准并进行了现代化制造：

1. 动态旋转： 通过DishKP系列可插拔单轴回转器（20孔位），带动薄壁（1000μm）培养瓶旋转，确保持续的高效率的营养交换和气体平衡，几乎无体内流体剪切力，保压且可自由插拔，更适合高通量培养。
2. 精密控气： 内置 AI 算法实时调控CO2、O2、N2的体积（%vol）或质量（%wt）比例，支持低氧（Hypoxia）及高氧（Hyperoxia）培养，无需人工干预。
3. 微正压环境： 创造高于大气压的微正压环境（0.0-20.0PSI），并且可以自由控制，非常准确的模拟胚胎或器官发育过程中的体内生理压力环境。

1.3培养基和气体条件

         培养基作为WEC成功与否的关键, 长期以来一直是学者们关注的焦点。Nicholas等早期采用鸡血浆、淀粉琼脂、营养琼脂、胎盘提取物、琼脂+不同浓度盐溶液、鸡血浆+大鼠胚胎提取物作为培养基进行胚胎培养, 均未取得满意结果。New等通过实验证明同种血清是大鼠胚胎体外培养的最佳培养基, 且培养效果与提供血清的大鼠性别、是否怀孕、是否与提供胚胎的大鼠为同一只等因素无关。近年来, 一些国内学者也对WEC的培养基进行了进一步探索。张天宝等通过实验发现, 用人工合成培养基全部和部分替代大鼠血清进行全胚胎培养, 结果发现 TC 199培养基在添加 60%大鼠血清后可替代大鼠血清作为培养基进行全胚胎培养。单用小牛血清及用小牛血清+10% 大鼠血清作为培养基, 胚胎的生长发育都不能达到纯大鼠血清的水平。王秋枫等以90%人血清+10%大鼠血清进行全胚胎培养, 除胚胎 DNA 含量外,其他各项生长分化指标与大鼠血清培养的胚胎无明显差异,可以作为替代培养基用于胚胎早期生长发育的研究和评价。

         目前用于WEC最常用的培养基为同源即刻离心血清 (immediately centrifugal serum,ICS), 即用于大鼠WEC的培养基为成年健康大鼠麻醉后经腹主动脉快速抽血、立即离心后而分离的血清。

        气体环境是决定 W EC培养效果的另一重要因素。New等发现,在气体系统中加入5% CO2能够起到中和碳酸氢盐,维持培养基pH的作用, 有益于胚胎的生长发育。氧在哺乳动物胚胎器官发育期的代谢过程中起到重要作用, 合适的氧浓度是WEC成功与否的关键。氧浓度过高会导致氧化,氧浓度过低则会造成代谢性应激。New等在确定CO2气体含量后, 又将O2限定到 20% -95%,观察胚胎发育情况,发现随着胚胎生长发育的进行, 耗氧量将会增加。

目前广泛应用的WEC气体系统是由O2,CO2,N2 三种气体组成。分别于培养开始时、第 16小时,第26小时往培养瓶内通入混合气体, 其比例变化依次O2:CO2:N2(5:5:90,20:5:75,40:5:55)。

以上培养条件已实现自动化更改比例，内置在了Gastri3三气管理系统中，更方便使用人。

关于WEC培养中应注意的问题、WEC技术在生长发育和毒理学中的应用参考下一章节。