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用于分析16S rRNA扩增子数据的去噪算法，如UNOISE3和DADA2，能够恢复经纠错的序列变体；与以往基于聚类的方法相比，这些算法通过保留单核苷酸变异提高了分辨率。然而，序列水平的分辨率并不一定能够反映物种水平的生态多样性。16S rRNA基因在基因组内和物种内的变异可能将单一物种拆分为多个推断的序列变体（即zOTU），从而高估微生物多样性。利用全物种生命树计划（All-Species Living Tree Project，LTP）和Greengenes2数据库中的16S rRNA序列，我们证明，仅依赖序列变异会高估物种水平的生态多样性。我们通过改变序列长度引入变异，并观察到，基于序列多样性估算的丰富度有所增加，尤其是在数据库中存在物种内冗余的情况下。此外，我们分析了来自11个人工模拟群落的27次V4区Illumina测序运行数据，这些群落的组成均已知，并展示了物种内序列变异对所推断的α多样性和β多样性的放大效应。去噪算法引起或检出的物种内拆分，导致推断的丰富度以及相对于预期群落组成的、不考虑系统发育关系的距离（即Jaccard距离、加权Jaccard距离和Bray-Curtis距离）被高估。去噪后聚类降低了多样性估计的膨胀程度，从而减少了相异性度量引入的偏差，并使距离值趋于一致。我们提出，应将去噪和聚类视为实现生物学分辨率的两种互补手段。我们推出了TACTIC，这是一种16S rRNA扩增子分析工具，提供操作分类单元（OTU）聚类（UPARSE）和zOTU推断（UNOISE3），以及两种能够克服各方法局限性的混合式去噪后聚类策略：分类学信息引导聚类（Taxonomy-Informed Clustering，TIC）和分类学无关聚类（Taxonomy-Agnostic Clustering，TAC）。
3
克里特大学医学院临床微生物学与微生物发病机制实验室；
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Markus List
4
慕尼黑工业大学 TUM 生命科学学院系统生物学数据科学组
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Klaus Neuhaus
2
慕尼黑工业大学 ZIEL 食品与健康研究所微生物组核心设施；
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Ilias Lagkouvardos
2
慕尼黑工业大学 ZIEL 食品与健康研究所微生物组核心设施；
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摘要
用于分析 16S rRNA 扩增子数据的去噪算法（如 UNOISE3 和 DADA2）能够恢复经错误校正的序列变体，并通过保留单核苷酸变异提高分辨率，这与以往基于聚类的方法不同。然而，序列层面的分辨率并不一定能够反映物种层面的生态多样性。16S rRNA 基因在基因组内和物种内均存在变异，这可能导致单个物种被拆分为多个推断出的序列变体（即 zOTU），从而夸大微生物多样性的估计。利用 All-Species Living Tree Project（LTP）和 Greengenes2 数据库中的 16S rRNA 序列，我们证明，仅依赖于
序列变异会夸大物种水平的生态多样性。我们利用序列长度引入变异，并观察到采用序列多样性时，丰富度有所增加；当数据库中存在种内冗余时，这一现象尤为明显。此外，我们分析并展示了种内序列变异对推断的 α 多样性和 β 多样性的放大效应，分析对象为来自 11 个组成已知的模拟群落的 27 次 V4 Illumina 测序运行。由去噪算法造成或检出的种内拆分，会夸大推断的丰富度以及与系统发育无关的距离（即 Jaccard、加权 Jaccard 和 Bray-Curtis 距离），使其偏离预期组成。去噪后的聚类降低了多样性估计的膨胀程度，从而减轻了由差异度量引入的偏差，并使距离值趋于一致。我们认为，去噪和聚类应被视为实现生物学分辨率的两种互补手段。我们推出 TACTIC，这是一款 16S rRNA 扩增子分析工具，提供操作分类单元（OTU）聚类（UPARSE）和 zOTU 推断（UNOISE3），以及两种去噪后混合聚类策略，以克服各方法的局限性：分类学信息引导聚类（TIC）和非分类学引导聚类（TAC）。
利益冲突声明
M.L. 为 mbiomics GmbH 提供咨询服务。其他作者声明不存在利益冲突。
脚注
https://doi.org/10.5281/zenodo.23415406
https://github.com/MPourjam/TACTIC-Pipeline
https://github.com/TUM-Core-Facility-Microbiome/BiotaWiz
https://github.com/MPourjam/TIClust
https://github.com/caporaso-lab/mockrobiota
基金资助信息声明
德国研究联合会，
，395357507
版权
本预印本的版权所有者是 the
作者/资助方已授予 bioRxiv 永久展示该预印本的许可。
本文依据
CC-BY 4.0 国际许可协议
提供使用。
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发布于2026年10月22日。
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TACTIC：结合去噪与聚类，实现稳健的16S扩增子多样性估计
Mohsen
Pourjam
，
Zeno
Sewald
，
Antonios
Kioukis
，
Markus
List
，
Klaus
Neuhaus
，
Ilias
Lagkouvardos
bioRxiv
2026.10.17.759814；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.10.17.759814
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关键词：16S rRNA扩增子 · 序列去噪 · 操作分类单元聚类 · 微生物多样性 · 物种内序列变异 · 多样性估计偏差
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.17.759814v1?rss=1