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定量荧光寿命成像显微术（FLIM）受到探针匮乏的限制：现有探针难以兼具单残基特异性、极小的空间位阻扰动、可见光激发以及显著的环境依赖性寿命对比。我们提出以苯并二唑为基础的非天然氨基酸（BD-ncAA），将其作为紧凑型遗传编码传感器，用于位点特异性FLIM。借助经工程改造的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶配对系统，我们将三种不同的BD-ncAA掺入活细胞中的蛋白质。在纳米抗体的不同位点进行位点特异性掺入后，BD-ncAA仍能保留其天然结构和抗原结合能力。作为主力探针，氰基取代的CBDS具有可见光激发特性、大斯托克斯位移，以及显著的环境依赖性荧光寿命变化，范围为1至24 ns。在无洗涤的活细胞FLIM条件下，CBDS能够定量分辨局部结构微环境和跨膜水合梯度，同时还能区分真核生物蛋白质分泌过程中的不同状态。BD-ncAA可作为遗传编码且扰动极小的报告基团，通过定量FLIM在活细胞中追踪靶蛋白、检测其与结合伙伴的相互作用，并定量分析位点特异性的溶剂可及性。
定量荧光寿命成像显微术（FLIM）受限于缺乏兼具单残基特异性、最小空间位阻扰动、可见光激发以及显著环境依赖性寿命对比的探针。我们提出基于苯并噁二唑的非天然氨基酸（BD-ncAAs），作为用于位点特异性 FLIM 的紧凑型基因编码传感器。利用经过工程化改造的吡咯赖氨酰-tRNA 合成酶对，我们将三种不同的 BD-ncAAs 掺入活细胞中的蛋白质。在纳米抗体的不同位点进行位点特异性掺入，均保留了其天然结构和抗原结合能力。主力探针——氰基取代的 CBDS——具有可见光激发、大斯托克斯位移，以及显著的环境依赖性荧光寿命变化，寿命范围为 1 至 24 ns。在无洗涤的活细胞 FLIM 条件下，CBDS 可对局部结构微环境和跨膜水合梯度进行定量分辨，同时还能区分真核生物蛋白分泌过程中的不同状态。BD-ncAAs 是基因编码、扰动极小的报告分子，可用于追踪靶蛋白、检测其与结合伙伴之间的相互作用，并通过定量 FLIM 测定活细胞中位点特异性的溶剂可及性。
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关键词：遗传编码探针 · 非天然氨基酸 · 荧光寿命成像 · 蛋白质微环境 · 活细胞成像
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.13.758698v1?rss=1