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传统的 CRISPR 敲除筛选通过局部插入或缺失（indel）靶向基因，这类变异易于破坏开放阅读框（ORF）。然而，其在靶向候选顺式调控元件方面的应用仍然受限，因为局部插入或缺失无法以高置信度消除增强子活性。更进一步，传统 CRISPR 筛选无法直接验证单个细胞中是否成功发生编辑，而是通过检测 sgRNA 来推断扰动情况；这一替代指标并不完善，容易产生假阳性（即检测到 sgRNA，但未发生编辑）和假阴性（即已发生编辑，但未检测到 sgRNA）。为着手应对这些挑战，我们开发了基于 PRIME-Del、通过 T7 插入实现多重筛选的最优配对编辑技术（Optimal Paired-edits via T7 Insertions for Multiplexed Screening using PRIME-Del，OPTIMuS PRIME-Del）。该技术利用配对先导编辑，以编程方式实现精确缺失，同时插入 T7 噬菌体 RNA 聚合酶启动子（T7-P）和一段短条形码（BC）。这一设计能够对成功发生的缺失事件进行分子标记、验证和定量。在本项概念验证研究中，我们设计并测试了 pegRNA 对，以在 K562 细胞中对约 1,200 个内含子候选顺式调控元件（cCRE）进行带标记的程序化删除。结合对其中约 100 个最易编辑的 cCRE 开展的二次筛选，我们表明，OPTIMuS PRIME-Del 支持以多重化方式大规模生成带有精确标记的 cCRE 缺失。最后，我们将 OPTIMuS PRIME-Del 与单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）相结合，以确定哪些细胞携带特定缺失，并量化这些缺失对转录的影响。我们鉴定出了一些内含子增强子，其缺失可使宿主基因表达降低 20%–30%，还发现了一项跨越 124 kb 的候选增强子–基因相互作用，并进一步利用基于序列的、针对缺失所诱导的……的预测来评估这些效应染色质可及性的变化。综上，这些结果确立了 OPTIMuS PRIME-Del 作为一种多重化平台，可用于对非编码区缺失进行精准编程、分子标记和功能表征。
shendure{at}uw.edu
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传统的 CRISPR 敲除筛选通过局部插入缺失（indel）靶向基因，这类变异易于破坏开放阅读框（ORF）。然而，其在靶向候选顺式调控元件方面的效用仍然有限，因为局部插入缺失无法高置信度地消除增强子活性。使这一局限性进一步加剧的是，传统 CRISPR 筛选无法直接验证单个细胞中的编辑是否成功，而是根据 sgRNA 的检出来推断扰动——这种替代指标并不完善，容易产生假阳性（即检出 sgRNA，但未发生编辑）和假阴性（即存在编辑，但未检出 sgRNA）。为逐步应对这些挑战，我们开发了利用 PRIME-Del、通过 T7 插入实现多重筛选的优化成对编辑方法（Optimal Paired-edits via T7 Insertions for Multiplexed Screening using PRIME-Del，OPTIMuS PRIME-Del）。该方法利用成对先导编辑，在编程实现精确删除的同时插入一个 T7 噬菌体聚合酶启动子（T7-P）和一段短条形码（BC）。这一设计能够对成功发生的删除事件进行分子标记、验证和定量。在这项概念验证研究中，我们设计并测试了 pegRNA 对，以在 K562 细胞中对约 1,200 个内含子候选顺式调控元件（cCRE）进行带标记的程序化删除。结合针对其中约 100 个最易编辑的 cCRE 开展的二次筛选，我们表明，OPTIMuS PRIME-Del 支持大规模、多重生成带有精确标记的 cCRE 删除。最后，我们将 OPTIMuS PRIME-Del 与单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）相结合，以确定哪些细胞携带特定删除，并量化这些删除对转录的影响。我们鉴定出了一些内含子增强子，其删除使宿主基因表达降低了 20–30%，还发现了一种跨越 124 kb 的候选增强子–基因相互作用，
并进一步利用基于序列的预测，评估了缺失所引起的染色质可及性变化及其效应。总体而言，这些结果确立了 OPTIMuS PRIME-Del 作为一种多重化平台，可用于非编码区缺失的精确编程、分子标记和功能表征。
利益冲突声明
J.S. 担任 Guardant Health、Phase Genomics、Pacific Biosciences、Cellular Intelligence 和 10x Genomics 的科学顾问委员会成员、顾问和/或联合创始人。所有其他作者均声明不存在利益冲突。
已声明的资助方信息
美国国立卫生研究院，
，RM1-HG009491
，DP5-OD036167
，R01HG010632
，R00HG012973
，P30CA008748
陈—扎克伯格倡议（美国），
，CZIF2024-349901
，CZIF2025-011511
美国国防高级研究计划局
，HR0011263E037
西雅图合成生物学中心
，CZIF2023-008738
达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会
，DFS-64-24
瑟尔学者奖
，SSP-2025-101
欧洲分子生物学组织博士后奖学金
，ALTF-717-2024
版权
本预印本的版权持有人为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示本预印本的许可。
本预印本依据
CC-BY 4.0 国际许可协议
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发布于 2026 年 10 月 17 日。
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可定位、带分子标签的基因组缺失的多重编程
Aidan
Keith
,
Riza M
Daza
,
Jonas
Koeppel
,
Hanna
Liao
,
David S
Lee
,
David K
Moraes
,
Troy A
McDiarmid
,
Junhong
Choi
,
Xiaoyi
Li
,
Jean-Benoit
Lalanne
,
Chengxiang
Qiu
,
Sudarshan
Pinglay
,
Jay
Shendure
bioRxiv
2026.10.13.758960;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.10.13.758960
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关键词：先导编辑 · 非编码区缺失 · 顺式调控元件 · 分子条形码 · 单细胞RNA测序 · 增强子功能筛选
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.13.758960v1?rss=1