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由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的结核病（tuberculosis，TB）仍是全球健康面临的主要威胁之一，耐多药菌株的出现使这一问题尤为严峻。一线药物异烟肼（isoniazid，INH）以及二线药物乙硫异烟胺（ethionamide，ETH）和丙硫异烟胺（prothionamide，PTH）均为前药，其靶点是必需的烯酰基酰基载体蛋白还原酶InhA，该酶是参与分枝菌酸生物合成的关键酶。对这些药物的耐药性主要源于遗传突变，导致各自生物活化酶的酶功能失活。尽管近期开发的化学增效剂在恢复这些突变株的药物敏感性方面已显示出良好前景，但能够动态调控这些通路并精细调节耐药性的遗传工具，对于开发下一代靶向InhA的药物可能极具价值。在此背景下，我们利用CRISPR干扰（CRISPR interference，CRISPRi）技术，开发了可诱导且可逆的遗传系统，以精细调节耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Msmeg）和Mtb的抗生素敏感性。利用这一基于CRISPRi的方法，我们首先构建了可诱导的inhA功能减弱株；inhA是分枝菌酸合成和细菌生长所必需的靶基因，由此验证了该方法的有效性。随后，我们开发了选择性靶向katG、ethA以及转录抑制因子编码基因ethR的遗传工具，以构建抗生素敏感性谱发生改变的条件性功能减弱株。抗生素敏感性试验证实，在诱导CRISPRi后，这些条件性功能减弱株选择性地表现出对INH或ETH的高水平耐药性或超敏感性。总之，本研究确立了CRISPRi作为选择性精细调节分枝杆菌药物敏感性的强大遗传平台，并展现出其在开发下一代抗结核药物方面的潜在应用价值。治疗方法。
靶向 InhA 的抗结核药物疗效精细调控诱导型遗传系统的开发 | bioRxiv
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靶向 InhA 的抗结核药物疗效精细调控诱导型遗传系统的开发
Eliana
Sepulveda Ramos
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Maria Sofia
Deschutter
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Vanessa
Point
,
Thibault
Brunet
,
Janis
Laudouze
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Wafaa
Achache
,
Celine
Crauste
,
Stephane
Canaan
,
Gabriela
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,
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,
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Pierre
SANTUCCI
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.09.25.754513
Eliana Sepulveda Ramos
1
法国马赛，艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B；
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Maria Sofia Deschutter
2
法国马赛，艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B；阿根廷罗萨里奥，罗萨里奥分子与细胞生物学研究所（IBR-CONICET-UNR）；
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Vanessa Point
1
法国马赛，艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B；
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Thibault Brunet
1
法国马赛，艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B；
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Janis Laudouze
1
法国马赛，艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B；
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Wafaa Achache
3
法国马赛，艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B；法国艾克斯-马赛大学地中海感染研究所（IHU Méditerranée Infection）；
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Celine
Crauste
4
IBMM、蒙彼利埃大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、ENSCM，法国蒙彼利埃34060；
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Stephane Canaan
1
艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B，法国马赛；
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Gabriela Gago
5
罗萨里奥分子与细胞生物学研究所（IBR-CONICET-UNR），阿根廷罗萨里奥
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Mickael Maziero
1
艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B，法国马赛；
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Pierre SANTUCCI
1
艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、LISM、IM2B，法国马赛；
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结核病（TB）由结核分枝杆菌（Mtb）引起，仍然是全球主要的健康威胁，尤其是多重耐药菌株的出现加剧了这一问题。一线药物异烟肼（INH）以及二线药物乙硫异烟胺（ETH）和丙硫异烟胺（PTH）均为前药，其靶点是必需的烯酰基-ACP还原酶InhA；该酶是分枝菌酸生物合成过程中的关键酶。对这些药物产生耐药，主要是由于遗传突变使相应生物活化酶的酶功能失活。尽管近期开发的化学增效剂在恢复这些突变体对药物的敏感性方面显示出良好前景，但能够动态调节这些通路并精细调控耐药性的遗传工具，对于开发
下一代抗InhA药物。在此背景下，我们利用CRISPR干扰（CRISPRi）技术，建立了可诱导且可逆的遗传系统，以精细调控耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，Msmeg）和结核分枝杆菌（Mtb）的抗生素敏感性。利用这一基于CRISPRi的方法，我们首先构建了可诱导的inhA功能减弱株；inhA是分枝菌酸合成和细菌生长所必需的关键靶标，由此证实了我们的方法具有完整的功能。随后，我们开发了选择性靶向katG、ethA及转录抑制因子ethR的遗传工具，以构建抗生素敏感性谱发生改变的条件性功能减弱株。抗生素敏感性试验证实，在诱导CRISPRi后，这些条件性功能减弱株选择性地表现出对异烟肼（INH）或乙硫异烟胺（ETH）的高水平耐药性或超敏感性。总之，本研究确立了CRISPRi作为一种强大的遗传平台，可用于选择性精细调控分枝杆菌的药物敏感性，并有望应用于下一代抗结核疗法的开发。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
已声明的资助方信息
法国国家艾滋病与病毒性肝炎研究机构（ANRS/MIE）
，项目编号ANRS0358
法国国家科学研究中心，
艾克斯-马赛大学，
法国国家研究署，
，ANR-24-CE15-2633
，ANR-25-ERCS-0022
艾克斯-马赛大学卓越计划——A*MIDEX
，AMX-19-IET-006
FEBS-IUBMB-PABMB PROBio-LatAm奖学金计划
生物学家公司，
，#DMMTF25051802
欧洲生物化学学会联合会，
，2023年FEBS卓越奖
版权
版权所有者
本预印本的版权所有者为作者／资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示本预印本的许可。
本预印本依据
CC BY 4.0 国际许可协议
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发布于2026年10月7日。
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开发可诱导遗传系统以精细调控靶向 InhA 的抗结核药物的效力
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Sepulveda Ramos
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Maria Sofia
Deschutter
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Thibault
Brunet
,
Janis
Laudouze
,
Wafaa
Achache
,
Celine
Crauste
,
Stephane
Canaan
,
Gabriela
Gago
,
Mickael
Maziero
,
Pierre
SANTUCCI
bioRxiv
2026.09.25.754513;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.09.25.754513
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开发可诱导遗传系统以精细调控靶向 InhA 的抗结核药物的效力
Eliana
Sepulveda Ramos
,
Maria Sofia
Deschutter
,
Vanessa
Point
,
Thibault
Brunet
,
Janis
Laudouze
,
Wafaa
Achache
,
Celine
Crauste
,
Stephane
Canaan
,
Gabriela
Gago
,
Mickael
Maziero
,
Pierre
SANTUCCI
bioRxiv
2026.09.25.754513;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.09.25.754513
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关键词：CRISPR干扰 · 诱导型遗传系统 · 抗结核药物 · InhA靶点 · 抗生素敏感性 · 分枝杆菌耐药性
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.25.754513v1?rss=1