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尽管脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）对突触前机制的调控可能对脆性X综合征中报道的突触功能障碍具有重要意义，但目前对这一调控作用的认识仍不完整。我们将发育完成后在海马齿状回颗粒细胞中特异性敲除FMRP的方法与光遗传学、全细胞膜片钳电生理记录及超分辨率成像相结合。齿状回（DG）细胞中FMRP的选择性缺失并未改变其内在兴奋性。在缺乏突触前FMRP的情况下，输出端苔藓纤维突触的突触电流幅度降低，而短时程易化仍保持完整。我们证实，成熟苔藓纤维突触的基础突触活动受蛋白激酶A（PKA）调控；我们的结果表明，缺乏FMRP的苔藓纤维突触末梢中存在cAMP-PKA信号传导改变，即刻可释放囊泡池的大小也可能减小。因此，突触前FMRP对于成熟苔藓纤维突触的高效基础神经传递是必需的，并且很可能通过依赖cAMP-PKA的信号通路发挥作用。研究意义声明：脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）作为突触后机制的调控因子已得到广泛研究。然而，其在突触前末梢中的生理功能仍未得到充分阐明。通过在发育完成后进行细胞特异性FMRP敲除，我们表明，突触前FMRP对于维持海马苔藓纤维突触的高效基础神经传递是必需的，并确定cAMP-PKA信号传导可能是介导这一效应的机制。综上，这些结果突显了突触前FMRP在基础突触活动中的生理作用，并展示了通过病毒感染实施的时间可控基因编辑方法如何能够区分原发性将分子功能与发育性代偿区分开来，从而为理解FMRP的突触前功能及脆性X综合征的病理生理机制提供了新的认识。研究亮点• 突触前FMRP的缺失降低了海马苔藓纤维（Mf）突触的基础突触活动。• 成年苔藓纤维突触的基础突触活动受蛋白激酶A（PKA）调控。• 在缺乏突触前FMRP的情况下，基础突触活动期间的腺苷酸环化酶–环磷酸腺苷–蛋白激酶A（AC–cAMP–PKA）通路受损。• 苔藓纤维末梢活性区（AZ）内的即刻可释放池（RRP）大小极有可能减小。
cAMP-PKA介导机制的失调会在突触前FMRP缺失时扰乱基础突触功能 | bioRxiv
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突触前FMRP缺失时，cAMP-PKA介导机制的失调会扰乱基础突触功能
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Lecomte
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Bruna Ferreira
Mira
，
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Grosjean
，
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Christophe
Mulle
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.10.01.755951
Simon Lecomte
1
跨学科神经科学研究所
，CNRS UMR 5297，
波尔多大学
，
法国
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simon.lecomte{at}u-bordeaux.fr
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Christophe Mulle
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摘要
突触前机制的调控由
尽管脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）可能对脆性X综合征中报道的突触功能障碍具有重要影响，但目前对其认识仍不完整。我们在发育完成后对海马齿状回颗粒细胞中的FMRP进行细胞特异性敲除，并结合光遗传学、全细胞膜片钳电生理学和超分辨率成像开展研究。齿状回颗粒细胞中FMRP的选择性缺失并未改变其内在兴奋性。在缺乏突触前FMRP的情况下，这些细胞输出端的苔藓纤维突触电流幅度降低，而短时程易化保持不变。我们证实，成熟苔藓纤维突触的基础突触活动受到蛋白激酶A（PKA）的调控；我们的结果表明，缺乏FMRP的苔藓纤维突触终扣中存在环磷酸腺苷（cAMP）-PKA信号传导改变，并且其易释放囊泡池的大小可能减小。因此，突触前FMRP是成熟苔藓纤维突触维持高效基础神经递质传递所必需的，并且很可能通过cAMP-PKA依赖性信号通路发挥作用。
研究意义声明
脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）作为突触后机制的调控因子已得到广泛研究。然而，其在突触前末梢中的生理功能仍未得到充分阐明。通过在发育完成后进行细胞特异性FMRP敲除，我们发现，突触前FMRP对于维持海马苔藓纤维突触的高效基础神经递质传递是必需的，并确定cAMP-PKA信号传导可能是介导这一效应的机制。综上，这些结果突显了突触前FMRP在基础突触活动中的生理作用，并展示了如何通过病毒感染介导的时间可控基因编辑方法，将初级分子功能与发育相关的
代偿机制，从而为理解FMRP的突触前功能及脆性X综合征的病理生理机制提供了新的见解。
研究亮点
突触前FMRP缺失降低海马苔藓纤维（Mf）突触的基础突触活动。
成年苔藓纤维突触的基础突触活动受PKA调控。
突触前FMRP缺失时，基础突触活动中的AC-cAMP-PKA信号通路受损。
苔藓纤维末梢活性区（AZ）中的即刻可释放囊泡池（RRP）大小很可能减小。
引言
突触传递是神经元相互通信以及神经元集群在脑内处理信息的基本机制。其精确调控依赖于众多信号通路的协同作用，这些通路控制着神经递质释放、突触强度和活动依赖性可塑性（de Jong & Verhage, 2009；Kennedy, 2016；S. Li & Sheng, 2022；Saneyoshi et al., 2010）。人们日益认识到，这些机制的改变是导致神经发育障碍（包括孤独症谱系障碍和智力障碍）的核心因素（Liao et al., 2026；Verpelli & Sala, 2012；Yan et al., 2016；Zhao et al., 2026；Zoghbi & Bear, 2012）。在功能异常可导致神经发育障碍的蛋白质中，脆性X信使核糖核蛋白（FMRP）占据核心地位。位于X染色体上的Fmr1基因沉默可导致脆性X综合征（FXS），这是最常见的遗传性智力障碍，也是孤独症谱系障碍的主要单基因病因之一（Hagerman et al., 2017；Juárez et al., 2024）。FMRP是一种可与RNA和核糖体结合的蛋白质（Ashley et al., 1993；E. Chen et al., 2014），可在所有亚细胞区室中调控数百种神经元mRNA的定位、稳定性及翻译（Anderson et al., 2016
；
Ascano et al., 2012
；
Darnell et al., 2011
；
Klemmer et al., 2011
；
Maurin et al., 2018
；
Suhl et al., 2014
）。理解FMRP如何塑造突触生理特性，对于阐明正常神经环路功能以及识别相关病理状态背后的细胞机制均至关重要。
过去二十年来，FMRP已被确认为神经元兴奋性、连接性和突触发育的重要调控因子（
Contractor et al., 2015
；
Hanson & Madison, 2007
；
Liu et al., 2022
；
Scharkowski et al., 2018
）。大多数机制研究聚焦于FMRP的突触后功能。FMRP调控树突蛋白质合成、肌动蛋白细胞骨架重塑、谷氨酸受体的表达与活性，以及多种细胞内信号级联反应，包括PI3K-AKT-mTOR、ERK-MAPK、Wnt和钙依赖性通路（
Brager & Johnston, 2014
；
Chmielewska et al., 2019
；
Corti & Duarte, 2025
；
Dictenberg et al., 2008
；
Gross et al., 2010
；J.
Huang et al., 2015
；
Huber et al., 2002
；
Luo et al., 2023
；
Meredith et al., 2007
；
Michaelsen-Preusse et al., 2018
；
Salcedo-Arellano et al., 2021
；
Thomazeau et al., 2021
；
Yang et al., 2019
）。这些研究确立了FMRP作为突触功能和可塑性关键突触后调控因子的地位。
越来越多的证据表明，FMRP也发挥重要的突触前功能（X.
Wang et al., 2023
）。FMRP调控轴突发育和突触前局部蛋白质合成（
Akins et al., 2009
；
Ivanco & Greenough, 2002
；
Monday et al., 2022
；
Till et al., 2011
；
Zimmer et al., 2017
）。电生理研究进一步表明，FMRP影响动作电位特性、突触前兴奋性、突触可塑性以及活动依赖性大规模内吞作用（
Bonnycastle et al.,
2022；Deng et al., 2011, 2013, 2019；Deng & Klyachko, 2021；Klemmer et al., 2011；Monday et al., 2022；Myrick et al., 2015；Routh et al., 2017）。然而，尽管这些突触前功能日益受到重视，突触前 FMRP 在基础神经递质传递中的作用仍未有定论（Patel et al., 2013；X.-S. Wang et al., 2014）。
环磷酸腺苷（cAMP）信号通路是反复被证实与脆性 X 综合征（FXS）相关的一条信号通路。自 Berry-Kravis 及其同事开展开创性研究以来，众多研究报道，FMRP 缺失后细胞内 cAMP 信号减弱，由此提出了 FXS 的“cAMP 理论”（Berry-Kravis et al., 1995；Berry-Kravis & Ciurlionis, 1998；Berry-Kravis & Huttenlocher, 1992；Berry-Kravis & Sklena, 1993；Kelley et al., 2007, 2008）。较近期的研究揭示了 FMRP 与 cAMP 稳态之间的分子联系。FMRP 直接调控编码 1 型腺苷酸环化酶（AC）的转录本（Darnell et al., 2011；Maurin et al., 2018）以及编码多种磷酸二酯酶亚型的转录本。因此，FMRP 缺失会增加磷酸二酯酶（即 PDE2A、PDE4D 和 PDE10A）的表达，并扰乱 cAMP 依赖性信号传导（Bardoni et al., 2025；Berry-Kravis et al., 2021；Choi et al., 2015；Darnell et al., 2011；Delhaye et al., 2024；Delhaye & Bardoni, 2021；Jonak et al., 2021；Maurin et al., 2018, 2019；Rosenheck et al., 2021；Schiavi et al., 2022）。尽管这些观察结果有力地提示，FMRP 与 cAMP 信号传导之间存在由磷酸二酯酶（PDE）介导的相互作用，但这种相互作用是否直接参与塑造突触前功能，仍不清楚。
海马苔藓纤维（Mf）突触为探究这些问题提供了一个有力的研究系统。这些巨大的谷氨酸能突触终扣具有高度特化的
突触前分子机器，并表现出显著的突触前易化形式（Marneffe et al., 2025）。突触可塑性，尤其是强直刺激后增强（PTP）和长时程增强（LTP），关键性地依赖于突触前 cAMP-PKA 信号传导（Bruentgens et al., 2026；Fukaya, Miyano, et al., 2023；Kim et al., 2024；Shahoha et al., 2022；Vandael et al., 2020；Weisskopf et al., 1994）。因此，苔藓纤维（Mf）突触对突触前信号通路的依赖，使其成为研究突触前 FMRP 生理功能的理想模型。
理解 FMRP 生理功能的另一项挑战在于，以往大多数研究依赖于组成型敲除模型和嵌合模型。尽管这些模型为理解脆性 X 综合征（FXS）的病理生理机制提供了基础性见解，但它们不可避免地将 FMRP 缺失对神经元功能的直接影响与 FMRP 在神经环路形成和成熟中的作用混杂在一起。因此，仍难以将 FMRP 原发性的细胞自主性生理功能，与其发育作用以及整个环路在其缺失后可能产生的继发性代偿机制区分开来（Pfeiffer & Huber, 2009）。
为解决这些问题，我们采用发育后、细胞特异性的病毒策略，选择性地从成熟齿状回（DG）细胞中敲除 FMRP，并结合光遗传学、海马 Mf-CA3 突触的全细胞膜片钳电生理记录及 Mf 突触终扣的超分辨率成像。这些方法使我们能够在尽量减少发育混杂因素的同时，研究 FMRP 的突触前功能。我们的研究结果揭示，突触前 FMRP 在维持高效的基础神经递质传递中具有重要作用，并确定 cAMP-PKA 信号通路可能是介导这一作用的候选机制
调控。
结果
FMRP缺失不影响DG细胞的兴奋性
已知FMRP可通过直接物理相互作用或间接方式（通过其翻译调控作用）与神经元中的离子通道相互作用（Deng & Klyachko, 2021），从而影响神经元的兴奋性（Contractor et al., 2015; Liu et al., 2022）。因此，一些研究报道，缺乏FMRP的神经元存在阈下膜特性的改变，例如静息膜电位（M. Shen et al., 2023）或输入电阻（Luque et al., 2017; M. Shen et al., 2023）的改变；同时也存在阈上膜特性的改变，例如基强度（Deng et al., 2024）、放电频率（Deng et al., 2024; Routh et al., 2017; Zhang et al., 2014）、放电阈值（Deng et al., 2024; Deng & Klyachko, 2016）、动作电位（AP）幅度（Routh et al., 2017）、时程（Deng et al., 2013; Luque et al., 2017; Myrick et al., 2015; Routh et al., 2017），以及后超极化（AHP）和后去极化（ADP）幅度（Luque et al., 2017）的改变。然而，由于物种、品系、年龄、脑区、细胞亚型、突触后靶细胞乃至亚细胞区室的不同，各项研究中FMRP缺失所改变的细胞机制存在显著差异，有时甚至相互矛盾。因此，有必要评估在齿状回（DG）细胞成熟后删除FMRP是否会影响其产生动作电位的能力，以及动作电位本身的特性。
我们首先证实，在对Fmr1^flox/y小鼠进行慢病毒LV.C1qL2.ChIEF-Tom-2A-Cre（Barthet et al., 2018）的立体定位注射后，我们采用的病毒介导方法能够使DG细胞中的FMRP缺失（图1A–B）。事实上，与Cre⁻细胞不同，DG中的Cre⁺细胞不再表达FMRP蛋白（图1D）。
随后，我们对WT小鼠和Fmr1^flox/y小鼠中表达该病毒构建体的齿状回（DG）细胞进行电生理记录，并检测其膜特性（图1C）。我们还对不表达该病毒的DG细胞（未感染细胞，NI细胞）进行记录，不考虑其在颗粒细胞层内的位置，以对照病毒表达对神经元兴奋性的影响。我们施加了持续500 ms的超极化和去极化阶跃电流（图1E）。WT细胞与FMRP缺失细胞之间的神经元静息膜电位（RMP）（NI：-69.3 ± 2.3，n = 13；WT：-66 ± 5.7，n = 20；cKO：-68.1 ± 2.1，n = 15；NI与WT比较：p = 0.0718；NI与cKO比较：p = 0.3638；WT与cKO比较：p = 0.3571；W(2, 29.4) = 3，p = 0.063；图1F）、输入电阻（NI：425.4 ± 120.4，n = 13；WT：401 ± 116.6，n = 20；cKO：395.5 ± 70.9，n = 15；NI与WT比较：p = 0.9165；NI与cKO比较：p = 0.817；WT与cKO比较：p = 0.9974；W(2, 26.8) = 0.3，p = 0.7418；图1G）、基强度（NI：75.4 ± 44.8，n = 13；WT：65 ± 23.3，n = 20；cKO：64 ± 18.8，n = 15；NI与WT、NI与cKO、WT与cKO比较，均为p > 0.9999；H(2) = 0.08，p = 0.9605；图1H）及放电频率（NI：n = 13，WT：n = 20，cKO：n = 15；F(2, 46) = 1，p = 0.3731；图1I）均无统计学显著差异。因此，可以得出结论：缺失FMRP的DG细胞与含有FMRP的DG细胞具有相同的兴奋性特征。随后，我们分析了动作电位（AP）的特性（图1J）。放电阈值（NI：-32.4 ± 5.1，n = 13；WT：-35.6 ± 6.3，n = 20；cKO：-35.9 ± 9.4，n = 15；NI与WT比较：p = 0.6032；NI与cKO比较：p = 0.2346；WT与cKO比较：p > 0.9999；H(2) = 3.2，p = 0.2005；图1K）、半峰全宽（FWHM）（NI：1.9 ± 0.2，n = 13；WT：1.9 ± 0.4，n = 20；cKO：1.8 ± 0.3，n = 15；NI与WT比较：p = 0.9986；NI与cKO比较：p = 0.9236；WT与cKO比较：p = 0.9833；W(2, 29.9) = 0.2，p = 0.8575；图1M）及后超极化（AHP）（NI：19.6 ± 3.9，n = 13；WT：15.2 ± 3.8，n
=20；cKO：15.7 ± 3.4，n=15；NI 与 WT 比较：p=0.0203；NI 与 cKO 比较：p=0.0308；WT 与 cKO 比较：p>0.9999；H(2)=8.9，p=0.0117；图1N）在 WT 与 FMRP 缺失的 DG 细胞的动作电位之间相似。然而，FMRP 缺失的 DG 细胞的动作电位（AP）幅度（NI：81.2 ± 9.1，n=13；WT：84.9 ± 6.9，n=20；cKO：91.9 ± 8.1，n=15；NI 与 WT 比较：p>0.9999；NI 与 cKO 比较：p=0.0026；WT 与 cKO 比较：p=0.0125；H(2)=13，p=0.0016；图1L）显著增大。这一效应与文献报道一致，可能是由于 FMRP 与胞体及轴突起始段的电压门控钠通道之间的间接相互作用导致电压门控钠电导增加所致（Deng & Klyachko, 2016, 2021；Routh et al., 2017）。
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图1.
发育后选择性敲除齿状回颗粒细胞中的 FMRP 不改变其内在兴奋性。
(A) 立体定位注射示意图，该注射使出生后第25—30天（P25—P30）的野生型（WT，黑色）小鼠和齿状回特异性 Fmr1 条件性敲除（cKO，蓝色）小鼠的齿状回中表达 ChIEF 和 Cre。
(B) 立体定位注射4周后，ChIEF 在齿状回中选择性表达的图像。比例尺：300 µm。
(C) 急性海马脑片示意图，记录电极置于齿状回颗粒细胞胞体内，以记录膜特性。A/C：联合/连合环路；CA1-3：阿蒙角亚区；DG：齿状回；Mf：苔藓纤维通路；SC：Schaffer 侧支通路。
(D) 上图：代表性免疫荧光图像，显示一只齿状回 FMRP 条件性敲除（FMRP DG-cKO）小鼠的齿状回颗粒细胞胞体中的 DAPI 染色、Cre 和 FMRP 表达。下图：方框区域的放大图，显示 Cre⁺ 颗粒细胞中 FMRP 表达缺失，而 FMRP 表达保留
未发生重组的（Cre⁻）颗粒细胞中的信号。gcl：颗粒细胞层；ml：分子层；pl：多形细胞层。比例尺：30 μm。
(E) 急性脑切片中齿状回颗粒细胞对持续500 ms的阶跃电流（超极化和去极化）的代表性反应记录，阶跃刺激前施加持续300 ms、强度为−20 pA的超极化预脉冲。
(F) FMRP缺失不影响静息膜电位（Welch方差分析，W(2, 29.4)=3；Dunnett事后检验，p=0.3571）。
(G) FMRP缺失不影响输入电阻（Welch方差分析，W(2, 26.8)=0.3；Dunnett事后检验，p=0.9974）。
(H) FMRP缺失不改变基强度（Kruskal–Wallis检验，H(2)=0.08；Dunn T3事后检验，p>0.9999）。
(I) FMRP缺失不改变放电频率（双因素方差分析，组间主效应，F(2, 46)=1，p=0.3731）。
(J) 急性脑切片中齿状回颗粒细胞在基强度阶跃电流刺激下产生的动作电位的代表性波形。
(K) FMRP缺失不影响放电阈值（Kruskal–Wallis检验，H(2)=3.2；Dunn T3事后检验，p>0.9999）。
(L) FMRP缺失时动作电位幅度增大（Kruskal–Wallis检验，H(2)=13；Dunn T3事后检验，p=0.0125）。
(M) FMRP缺失不改变半峰全宽（Welch方差分析，W(2, 29.9)=0.2；Dunnett事后检验，p=0.9833）。
(N) FMRP缺失不改变动作电位的后超极化阶段（Kruskal–Wallis检验，H(2)=8.9；Dunn T3事后检验，p>0.9999）。NI：n=13个细胞；WT：n=20个细胞；cKO：n=15个细胞。NI：N=8只小鼠；WT：N=7只小鼠；cKO：N=5只小鼠。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。
所使用的病毒构建体在Fmr1中表达时，使我们能够选择性刺激缺乏FMRP的苔藓纤维（Mfs）
在蓝光照射（470 nm、1 ms 脉冲）下，对 flox/y 小鼠进行研究，以探究突触前 FMRP 缺失对突触活动的影响。为确保该刺激方式的可靠性，并能够有效比较各实验组之间的突触后电流，需要确定在阶跃电流刺激期间观察到的动作电位（AP）特性在光遗传学刺激期间是否得以保持（图 S1A）。以焦平面处 LED 辐照度为自变量、动作电位发生概率（%）为因变量绘制的输入-输出曲线显示，当辐照度为 11.36 mW/mm² 时，光脉冲在两组中均始终能够诱发动作电位（图 S1B）。因此，整个研究均选用 11.36 mW/mm² 的辐照度作为刺激参数，后续动作电位特性分析也采用该参数。在齿状回（DG）细胞中，光诱发动作电位的发放阈值（WT：-40.3 ± 6.4，n = 21；cKO：-41.9 ± 4.4，n = 20；t(35.4) = 0.9，p = 0.3565；图 S1C）、半峰全宽（FWHM；WT：1.5 ± 0.2，n = 21；cKO：1.7 ± 0.3，n = 20；t(37.6) = 1.6，p = 0.1129；图 S1E）、后超极化（AHP；WT：10.4 ± 5.8，n = 21；cKO：10.9 ± 5.4，n = 20；U = 191，p = 0.633；图 S1F）和后去极化（ADP；WT：10.4 ± 1.9，n = 21；cKO：9.2 ± 3.3，n = 20；t(30.4) = 1.5，p = 0.1541；图 S1G）在野生型（WT）与 FMRP 缺失的 DG 细胞之间均无统计学差异。令人意外的是，光遗传学刺激诱发的动作电位幅度在两组间也相似（WT：88.7 ± 5.1，n = 21；cKO：88.4 ± 9.3，n = 20；U = 187，p = 0.5612；图 S1D）。根据这些数据可以得出结论，光遗传学刺激是可靠的，且两组在所有已分析参数上均严格一致。因此，组间突触后电流的任何差异均不能归因于刺激伪影（即动作电位幅度更高或宽度更大）。
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图S1
（与图2相关）。FMRP缺失不影响光遗传学诱发的齿状回颗粒细胞胞体动作电位的特性。
(A) 在对照小鼠（黑色）和FMRP DG-cKO小鼠（蓝色）的急性脑切片中，以波长470 nm、辐照度11.36 mW/mm²的光脉冲刺激1 ms后，从齿状回颗粒细胞记录到的代表性动作电位。动作电位以1 Hz的频率诱发。
(B) 动作电位数量与焦平面处LED辐照度（E_LED）的关系。在11.36 mW/mm²下，刺激具有足够的可靠性，能够始终在对照小鼠和FMRP DG-cKO小鼠的颗粒细胞胞体中诱发动作电位（蓝色区域）。因此，选择11.36 mW/mm²用于动作电位特性的比较分析。
(C) FMRP缺失不影响放电阈值（Welch t检验，t(35.4) = 0.9，p = 0.3565）。
(D) FMRP缺失不影响动作电位幅度（Mann–Whitney检验，U = 187，p = 0.5612）。
(E) FMRP缺失不改变半峰全宽（Welch t检验，t(37.6) = 1.6，p = 0.1129）。
(F) FMRP缺失不改变动作电位的后超极化阶段（Mann–Whitney检验，U = 191，p = 0.633）。
(G) FMRP缺失不改变动作电位的后去极化阶段（Welch t检验，t(30.4) = 1.5，p = 0.1541）。WT：n = 21个细胞；cKO：n = 20个细胞。WT：N = 7只小鼠；cKO：N = 6只小鼠。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。
FMRP DG-cKO突触中突触反应幅度的受损依赖于突触前机制
突触前FMRP在基础突触传递中的作用仍存在争议。一项在嵌合小鼠中开展的研究（Patel等，2013）表明，突触前FMRP的缺失损害了传向皮层各层中快速放电中间神经元的兴奋性传递
在基础条件下，小鼠桶状皮层第4–5层中。相比之下，兴奋性神经元之间的突触未观察到突触功能缺陷，提示突触前FMRP的作用可能取决于突触后靶细胞。
为检验突触前FMRP是否调控Mf-CA3突触特性，我们对对照组（经注射的WT小鼠）和FMRP DG-cKO小鼠（经注射的Fmr1^flox/y小鼠）的CA3神经元进行膜片钳记录，并以聚焦于DG的1 ms光脉冲（0.1 Hz）诱发CA3锥体神经元的兴奋性突触后电流（图2A–B）。在缺失突触前FMRP的情况下，Mf-EPSC幅度（WT：111.3 ± 79.9，n = 68；cKO：54.4 ± 41.2，n = 75；U = 1076，p < 0.0001；图2C、H，表1）和Mf-EPSC有效反应幅度（WT：123.7 ± 75.8，n = 68；cKO：73.1 ± 38.2，n = 75；U = 1156，p < 0.0001；图2D、G，表2）均降低。在缺失突触前FMRP的情况下，失败率（WT：14.1 ± 14，n = 68；cKO：30.5 ± 18.6，n = 75；U = 1207，p < 0.0001；图2E）和变异系数（CV）（WT：75.1 ± 26.8，n = 68；cKO：102.6 ± 36，n = 75；U = 1384，p < 0.0001；图2F）均升高。综上，这些结果表明，突触前FMRP有助于维持Mf-CA3突触处针对兴奋性神经元的强健、可靠的基础兴奋性传递。
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图2.
缺失突触前FMRP时，基础Mf传递减弱，而Mf突触末梢的体积及其含有Bassoon蛋白的活性区数量保持不变。
（A）急性海马切片示意图：在DG细胞的树突处施加蓝光脉冲（1 ms，470 nm）以诱发动作电位，并将记录电极置于CA3锥体细胞的胞体内，以记录Mf突触电流。A/C：联合/连合环路；CA1–3：阿蒙角亚区；DG：齿状回；Mf：苔藓纤维通路；
SC：Schaffer侧支通路。
(B) 在0.1 Hz刺激方案下，从对照（黑色）和FMRP DG-cKO（蓝色）小鼠中记录到的苔藓纤维兴奋性突触后电流（Mf-EPSCs）的代表性轨迹。
(C) 缺失突触前FMRP时，Mf-EPSCs的平均幅度降低（Mann-Whitney检验，U = 1076，p < 0.0001）。
(D) 缺失突触前FMRP时，MF-EPSCs的平均效能（分析中剔除失败事件）降低（Mann-Whitney检验，U = 1156，p < 0.0001）。
(E) 缺失突触前FMRP时，Mf-EPSCs的平均失败率升高（Mann-Whitney检验，U = 1207，p < 0.0001）。
(F) 缺失突触前FMRP时，Mf-EPSCs的平均变异系数增大（Mann-Whitney检验，U = 1384，p < 0.0001）。WT：n = 68个细胞；cKO：n = 75个细胞。WT：N = 49只小鼠；cKO：N = 58只小鼠。
(G) 对照和FMRP DG-cKO小鼠的Mf-EPSCs效能分布（0–600 pA）。组距为5 pA。WT：n = 4350个Mf-EPSCs；cKO：n = 3975个Mf-EPSCs。WT：N = 68个细胞；cKO：N = 75个细胞。
(H) Mf-EPSCs幅度分布的累积概率分析表明，缺失突触前FMRP时，Mf-EPSCs的幅度降低（Kolmogorov-Smirnov检验，D = 0.2，p < 0.0001）。未进行分箱。WT：n = 5184个Mf-EPSCs；cKO：n = 5582个Mf-EPSCs。WT：N = 68个细胞；cKO：N = 75个细胞。
(I) 左图：显示对照和FMRP DG-cKO小鼠苔藓纤维突触终扣中ChIEF和tdTomato表达的代表性图像。比例尺：50 µm。
中图：使用Imaris检测并分离苔藓纤维突触终扣。比例尺：50 µm。
右图：使用Imaris对苔藓纤维突触终扣进行三维重建。比例尺：5 µm。
(J) 左图：显示对照和FMRP DG-cKO小鼠苔藓纤维突触终扣中ChIEF和tdTomato表达的代表性免疫荧光图像。比例尺：5 µm。
中图：显示苔藓纤维中Bassoon表达的代表性免疫荧光图像
突触末梢。比例尺：5 µm。
右图：使用 Imaris 对苔藓纤维（Mf）突触末梢表面及 bassoon 蛋白簇进行的三维重建。比例尺：5 µm。
(K) Mf 突触末梢体积分布的直方图。组距为 5 µm³。
(L) Mf 突触末梢体积分布的累积概率分析显示，对照小鼠与 FMRP DG-cKO 小鼠的 Mf 突触末梢体积无统计学差异（Kolmogorov–Smirnov 检验，D = 0.03，p = 0.8807）。未分组。
(M) FMRP 缺失不改变 Mf 突触末梢的平均体积（Mann–Whitney 检验，U = 283795，p = 0.4127）。WT：n = 837 个 Mf 突触末梢；cKO：n = 695 个 Mf 突触末梢。WT：N = 3 只小鼠；cKO：N = 3 只小鼠。
(N) FMRP 缺失不改变每个 Mf 突触末梢内距质膜 200 nm 范围内的 bassoon 蛋白簇平均数量（Mann–Whitney 检验，U = 275，p = 0.3591）。WT：n = 27 个 Mf 突触末梢；cKO：n = 24 个 Mf 突触末梢。WT：N = 3 只小鼠；cKO：N = 3 只小鼠。
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表 1.
以 0.1 Hz 记录的苔藓纤维兴奋性突触后电流（Mf-EPSCs）幅度分布（包括传递失败事件）。
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表 2.
以 0.1 Hz 记录的 Mf-EPSCs 有效幅度分布（不包括传递失败事件）。
突触前改变可通过突触后机制对突触传递产生显著影响，这类机制被称为“跨突触机制”（Chia et al., 2013；K. Shen & Scheiffele, 2010；Verpoort & de Wit, 2024）。在报告突触活动的变化时，考察导致这些变化的突触位点十分重要。平均突触后电流幅度由三个量子参数决定（Johnson & Wernig, 1971；Korn & Faber, 1991；McLachlan, 1978；Redman, 1990）。即独立且活跃的释放位点的平均数量 ⟨n⟩，以及这些位点在传入动作电位（AP）到达后的平均释放概率
⟨p⟩以及单次量子释放事件引发的平均突触后反应⟨q⟩。根据经典的 Katz 突触传递模型，这些参数分别对应特定的突触位点：⟨n⟩和⟨p⟩是突触前参数，而⟨q⟩主要是突触后参数。
为检验突触后机制能否解释缺失突触前 FMRP 时基础突触传递的改变，我们通过浴液施加镉离子（Cd²⁺），并记录量子突触事件的幅度（见图6A–B）。两组量子事件的幅度相近（WT：37.3 ± 16.1，n = 8；cKO：41.2 ± 22.4，n = 8；U = 29，p = 0.7984；图6C）。这一结果表明，突触前 FMRP 的缺失会影响苔藓纤维（Mf）突触的突触前功能。与此一致的另一项观察结果是，在缺失突触前 FMRP 时，Mf 诱发的兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）幅度降低，同时变异系数增大（图2C、F）；这两个参数的协同变化与突触前机制的改变有关。为明确受影响的是哪一个突触前参数（即⟨n⟩或⟨p⟩），我们首先考察了初始⟨p⟩的一个常用替代指标：双脉冲比率（PPR）。两组的 PPR 相近（WT：2.7 ± 1.4，n = 25；cKO：2.7 ± 2.2，n = 26；U = 241，p = 0.1162；图3I）。这表明，在缺失突触前 FMRP 时，受影响的并非释放概率⟨p⟩，而是独立且活跃的释放位点数量。与这一假设一致，缺失突触前 FMRP 时，传递失败率升高（图2E），这可能提示活跃释放位点的数量存在缺陷。苔藓纤维具有巨大的突触前终扣，其中包含多达约45个活性区（AZ）（Chicurel & Harris, 1992；Rollenhagen et al., 2007），其易释放囊泡池内约有40个囊泡
每个活性区（AZ）的易释放池（RRP）（Maus et al., 2020；Vandael & Jonas, 2024）。由于苔藓纤维末梢具有大量活性区，独立且活跃的释放位点数量 ⟨n⟩ 的变化可能源于每个突触末梢的活性区数量发生变化、RRP 内已停泊/已预备囊泡的数量发生变化，或两者兼有。为明确其中涉及的机制，我们采用共聚焦显微镜和受激发射损耗（STED）显微镜，测量了苔藓纤维（Mf）末梢的体积（图 2I）以及每个末梢的活性区（即 bassoon 簇）数量（图 2J）。两组的 Mf 末梢平均体积（WT：16.8 ± 11，n = 837；cKO：18.2 ± 13.3，n = 695；U = 283795，p = 0.4127；图 2K–M）和每个末梢的 bassoon 簇平均数量（WT：12.9 ± 7.7，n = 27；cKO：11.1 ± 6.7，n = 24；U = 275，p = 0.3591；图 2N）均相近。这些结果表明，突触前 FMRP 不影响 Mf 末梢中含 bassoon 的活性区数量；相反，它可能参与决定活跃释放位点的数量，进而决定其 RRP 的大小。
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图 3.
缺失突触前 FMRP 不改变苔藓纤维易化的幅度。
（A）在对照小鼠（黑色）和 FMRP DG-cKO 小鼠（蓝色）的急性脑片中，采用 0.1 Hz、1 Hz 和 3 Hz 刺激方案，从 CA3 锥体神经元记录到的苔藓纤维诱发兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）的代表性轨迹。
（B）0.1 Hz（浅橙色）、1 Hz（橙色）和 3 Hz（深橙色）刺激下 Mf-EPSC 幅度的时间变化过程。缺失突触前 FMRP 时，Mf-EPSC 的幅度降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 29) = 8.4，p = 0.007）。
（C）1 Hz 下的频率易化（1 Hz 与 0.1 Hz 下平均幅度之比）不受突触前 FMRP 缺失的影响（Welch t 检验，t(28) = 0.5，p = 0.6268）。
（D）平均频率易化
3 Hz时的比值（3 Hz与0.1 Hz下平均幅度之比）不受突触前FMRP缺失的影响（Welch t检验，t(28.4)=0.5，p=0.6349）。
(E) 突触前FMRP缺失时，0.1 Hz、1 Hz和3 Hz刺激下Mf-EPSCs的平均变异系数增大（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 29)=9，p=0.0055）。WT：n=15个细胞；cKO：n=16个细胞。WT：N=8只小鼠；cKO：N=10只小鼠。
(F) 在对照小鼠和FMRP DG-cKO小鼠急性脑片的CA3锥体神经元中，采用脉冲间隔为40 ms的双脉冲刺激方案记录到的Mf-EPSCs代表性波形。
(G) 双脉冲刺激方案下，突触前FMRP缺失时，第一次Mf-EPSCs的平均幅度降低（Mann–Whitney检验，U=193，p=0.0123）。
(H) 双脉冲刺激方案下，突触前FMRP缺失时，第二次Mf-EPSCs的平均幅度降低（Mann–Whitney检验，U=165，p=0.0022）。
(I) 双脉冲比值（第二次脉冲与第一次脉冲所诱发响应的平均幅度之比）不受突触前FMRP缺失的影响（Mann–Whitney检验，U=241，p=0.1162）。
(J) 双脉冲刺激方案下，突触前FMRP缺失时，Mf-EPSCs的平均变异系数增大（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 49)=8.6，p=0.0051）。WT：n=25个细胞；cKO：n=26个细胞。WT：N=18只小鼠；cKO：N=18只小鼠。
(K) 在对照小鼠和FMRP DG-cKO小鼠急性脑片的CA3锥体神经元中，以20 Hz频率施加10个光脉冲的序列刺激期间记录到的Mf-EPSCs代表性波形。
(L) 突触前FMRP缺失时，序列刺激中Mf-EPSCs的平均幅度降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 62)=19.2，p<0.0001）。
(M) 序列刺激易化（序列中每次Mf-EPSCs与第一次Mf-EPSCs的幅度之比）
不受突触前 FMRP 缺失的影响（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 62)=0.2，p=0.6413）。
(N) 突触前 FMRP 缺失时，刺激串期间 Mf-EPSC 的平均变异系数升高（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 62)=12.1，p=0.0009）。WT：n=31 个细胞；cKO：n=33 个细胞。WT：N=20 只小鼠；cKO：N=21 只小鼠。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
突触前 FMRP 缺失不影响 Mf 突触的短时程易化
我们研究了突触前 FMRP 在 Mf-CA3 突触显著的短时程可塑性中的作用（Marneffe et al., 2025）。我们首先检测了频率易化，即将刺激频率从 0.1 Hz 提高至 1 Hz 和 3 Hz（图 3A）；双脉冲易化，即给予间隔为 40 ms 的成对刺激（图 3F）；以及串刺激易化，即以 20 Hz 的频率给予包含 10 次刺激的刺激串（图 3K）。在这些实验中，我们反复观察到，突触前 FMRP 缺失时，Mf-EPSC 的幅度一致性降低，这一现象见于频率易化期间（WT：n=15，cKO：n=16；F(1, 29)=8.4，p=0.007；图 3B）、双脉冲易化期间的第一个 EPSC（WT：84.5 ± 61.1，n=25；cKO：46.7 ± 29.6，n=26；U=193，p=0.0123；图 3G）和第二个 EPSC（WT：179 ± 115.5，n=25；cKO：105 ± 84.3，n=26；U=165，p=0.0022；图 3H），以及串刺激易化期间（WT：n=31，cKO：n=33；F(1, 62)=19.2，p<0.0001；图 3L）。
两组的易化程度相近：1 Hz 下的频率易化（WT：5.2 ± 2.2，n=15；cKO：4.9 ± 2，n=16；t(28)=0.5，p=0.6268；图 3C），3 Hz 下的频率易化（WT：8.2 ± 4.2，n=15；cKO：8.9 ± 3.9，n=16；t(28.4)=0.5，p=0.6349；图 3D），对于
双脉冲比值（图3I）以及串刺激易化（WT：n=31，cKO：n=33；F(1, 62)=0.2，p=0.6413；图3M）。在缺失突触前FMRP的情况下，频率易化（WT：n=15，cKO：n=16；F(1, 29)=9，p=0.0055；图3E）、双脉冲易化（WT：n=25，cKO：n=26；F(1, 49)=8.6，p=0.0051；图3J）和串刺激易化（WT：n=31，cKO：n=33；F(1, 62)=12.1，p=0.0009；图3N）期间的变异系数均增大。
总体而言，我们观察到，在缺失突触前FMRP的情况下：（1）Mf-EPSC的幅度降低（图3B、G、H、L）；（2）Mf短时程易化的程度未发生变化（图3C、D、I、M）；（3）变异系数增大（图3E、J、N）。这些结果表明，Mf突触处突触前FMRP的缺失并未改变频率易化和串刺激易化的机制。
突触前FMRP缺失增加Mf-optoPTP的幅度
Mf突触还表现出另一种类型的短时程易化：强直刺激后增强（PTP）。在苔藓纤维（Mf）处，以100 Hz频率施加3串、每串100次的电刺激可诱导突触前形式的长时程增强（LTP）（Monday et al., 2018；Monday & Castillo, 2017；Nicoll & Schmitz, 2005），而仅施加一串刺激则会引起短时程可塑性（Griffith, 1990）。已有研究表明，FMRP通过参与Mf末梢的局部蛋白质合成，对LTP的维持发挥关键作用（Monday et al., 2022）。然而，其在PTP过程中的作用尚未得到研究。光遗传学的一项主要局限在于通道视紫红质变体所能支持的刺激频率。ChIEF（携带I170V突变的嵌合体EF）仅能在最高25 Hz的频率下提供可靠刺激（Lin, 2011）。因此，我们采用20 Hz作为刺激频率，以诱导PTP，所用的是
通过包含50个脉冲的脉冲串进行光遗传学刺激（因此称为“optoPTP”；图4A）。
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图4.
突触前FMRP缺失时，光遗传学诱导的PTP幅度增大，而绝对增强幅度保持不变。
(A) optoPTP诱导期间记录的苔藓纤维诱发的兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）代表性轨迹：以20 Hz频率施加单串50个光脉冲（蓝色横条）。记录来自对照（黑色）和FMRP DG-cKO（蓝色）小鼠急性脑片中的CA3锥体神经元。
(B) 突触前FMRP缺失不影响脉冲串内Mf-EPSC的平均幅度（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 49)=0.3，p=0.5796）。
(C) 突触前FMRP缺失不影响脉冲串内Mf-EPSC的累积幅度（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 49)=0.8，p=0.3615）。WT：n=23个细胞；cKO：n=28个细胞。WT：N=14只小鼠；cKO：N=20只小鼠。
(D) 在10分钟基线记录期间、optoPTP诱导后5秒（optoPTP）及optoPTP诱导后10分钟，以0.1 Hz频率记录的Mf-EPSC代表性轨迹。记录来自对照和FMRP DG-cKO小鼠急性脑片中的CA3锥体神经元。
(E) (D)中实验的Mf-EPSC幅度时间进程显示，突触前FMRP缺失时，其幅度与对照相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 30)=2.6，p=0.1194）。各时间点的数据为5个Mf-EPSC幅度的平均值。插图：诱导后5秒记录的首个Mf-EPSC的平均幅度，显示两组的绝对增强幅度相近（Mann–Whitney检验，U=106，p=0.423）。
(F) (D)中实验的归一化Mf-EPSC幅度时间进程显示，突触前FMRP缺失时，幅度增大（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 30)=4.3，p=0.0479）。各时间点的数据通过以下方式获得：
计算5个Mf-EPSC的平均幅度。插图：诱导后5秒记录的第一个Mf-EPSC的平均幅度显示，突触前FMRP缺失时，optoPTP的幅度增大（Mann–Whitney检验，U=71，p=0.0318）。
(G)（D）中实验的Mf-EPSC失败率时间进程显示，突触前FMRP缺失时，失败率相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 30)=3，p=0.0961）。各时间点的数值通过计算5分钟记录期间的失败率获得。
(H)（D）中实验的Mf-EPSC变异系数时间进程显示，突触前FMRP缺失时，变异系数相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 30)=3.3，p=0.0779）。各时间点的数值通过计算5分钟记录期间的变异系数获得。WT：n=16个细胞；cKO：n=16个细胞。WT：N=12只小鼠；cKO：N=13只小鼠。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。
对照小鼠与FMRP DG-cKO小鼠之间，诱导刺激序列内的Mf-EPSC幅度（WT：n=23，cKO：n=28；F(1, 49)=0.3，p=0.5796；图4B）和整个刺激序列的累积幅度（WT：n=23，cKO：n=28；F(1, 49)=0.8，p=0.3615；图4C）均无显著差异。这表明两组的总体optoPTP诱导情况相当。然而，对单个Mf-EPSC进行更仔细的分析发现，与对照小鼠相比，FMRP DG-cKO小鼠在前10个Mf-EPSC中的幅度降低（与图3L所述结果一致），而在刺激序列的其余部分未观察到此类差异。在optoPTP诱导前后，分别以0.1 Hz的频率记录Mf-EPSC，持续10分钟（图4D）。首先，FMRP DG-cKO小鼠在基线期间的Mf-EPSC绝对幅度显著降低
与对照小鼠相比（WT：143.5 ± 128.1，n = 16；cKO：72.1 ± 71.9，n = 16；U = 74，p = 0.0426；图4E）。然而，诱导后5秒记录到的首个Mf-EPSC的幅度在两组间无差异（WT：501.2 ± 263.4，n = 16；cKO：483.9 ± 455.9，n = 16；U = 106，p = 0.423；图4E，插图）。因此，将幅度相对于基线进行归一化后，与对照小鼠相比，FMRP DG-cKO小鼠在optoPTP诱导后即刻表现出显著更大的增强幅度（WT：466.6 ± 218，n = 16；cKO：850.2 ± 601.9，n = 16；U = 71，p = 0.0318；图4F，插图）。最后，在optoPTP诱导后，FMRP DG-cKO小鼠与对照小鼠之间的失败率（WT：n = 16，cKO：n = 16；F(1, 30) = 3，p = 0.0961；图4G）和变异系数（WT：n = 16，cKO：n = 16；F(1, 30) = 3.3，p = 0.0779；图4H）均无统计学差异。
综上，这些数据支持以下观点：Mf-optoPTP能够抵消上述由突触前FMRP缺失引起的表型，即基础突触活动期间Mf-EPSC幅度降低、失败率升高以及变异系数增大。这使得FMRP DG-cKO小鼠在optoPTP诱导后表现出过度增大的增强幅度。
突触前FMRP缺失引起苔藓纤维突触处Ca²⁺相关机制的改变
由于苔藓纤维末梢中升高的Ca²⁺水平衰减缓慢（Chamberland et al., 2018；Scott & Rusakov, 2006），而这在一定程度上归因于较强的突触前Ca²⁺缓冲作用（Vyleta & Jonas, 2014），因此为异步谷氨酸释放提供了最佳条件（Chamberland et al., 2020）。
异步释放通常在动作电位后约10 ms开始，并可持续数百毫秒。与同步释放一样，异步释放也具有Ca²⁺依赖性，但其特异性地依赖于
动作电位后在突触前末梢积累的残余 Ca²⁺（Rozov et al., 2019）。因此，异步释放可作为突触前残余 Ca²⁺ 积累的替代指标。为确定突触前 FMRP 缺失是否损害苔藓纤维（Mf）突触终扣中的 Ca²⁺ 积累，我们在 0.1、1、3 和 20 Hz 刺激方案下（刺激串包含 10 次或 50 次刺激），测量了光刺激后 20 ms 起的异步释放电荷量（图 5A、C、E）。在 1 Hz 和 3 Hz 刺激频率下，与对照小鼠相比，FMRP DG-cKO 小鼠的异步释放电荷量降低（WT：n=15，cKO：n=16；F(1, 29)=6.7，p=0.0152；图 5B）。短刺激串后，FMRP DG-cKO 小鼠的异步释放电荷量也低于对照小鼠（WT：8.0 ± 4.4，n=15；cKO：4.7 ± 2.6，n=16；t(22.2)=2.5，p=0.0183；图 5D），但在光遗传学强直后增强（optoPTP）诱导后，两组间的异步释放电荷量不再存在差异（WT：17.9 ± 10.1，n=23；cKO：18.7 ± 23，n=28；U=279，p=0.4244；图 5F）。这些结果表明，随着刺激频率升高，在突触前 FMRP 缺失的情况下，突触前末梢的残余 Ca²⁺ 积累较少，从而导致 Mf 诱发的兴奋性突触后电流（Mf-EPSCs）幅度降低（图 3B、G、H、L）。然而，在 optoPTP 诱导后，FMRP DG-cKO 小鼠与对照小鼠的残余 Ca²⁺ 似乎恢复至相同水平，因此两组在诱导后即刻表现出相近的 Mf-EPSCs 幅度（图 4E）。
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图 5.
在突触前 FMRP 缺失的情况下，optoPTP 诱导消除了异步释放电荷量的降低
（A）在 0.1 Hz、1 Hz 和 3 Hz 刺激方案中，光脉冲后 200 ms 内的代表性记录轨迹。异步释放电荷量（橙色区域）从光脉冲后 20 ms 起计算。记录来自急性脑切片中的 CA3 锥体神经元
来自对照（黑色）和FMRP DG-cKO（蓝色）小鼠。
(B) 在1 Hz和3 Hz刺激方案下，突触前FMRP缺失时的平均异步电荷量降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 29)=6.7，p=0.0152）。WT：n=15个细胞；cKO：n=16个细胞。WT：N=8只小鼠；cKO：N=10只小鼠。
(C) 左图：在对照和FMRP DG-cKO小鼠急性脑片的CA3锥体神经元中，以20 Hz施加10个光脉冲组成的刺激串期间记录到的苔藓纤维兴奋性突触后电流（Mf-EPSCs）代表性轨迹。右图：方框区域的放大图，显示最后一个光脉冲后450 ms内的轨迹。异步电荷量（橙色区域）从光脉冲结束后20 ms开始计算。
(D) 在以20 Hz施加10个光脉冲组成的刺激串后，突触前FMRP缺失时的平均异步电荷量降低（Welch t检验，t(22.2)=2.5，p=0.0183）。WT：n=15个细胞；cKO：n=16个细胞。WT：N=8只小鼠；cKO：N=10只小鼠。
(E) 左图：在对照和FMRP DG-cKO小鼠急性脑片的CA3锥体神经元中，以20 Hz施加50个光脉冲组成的刺激串期间记录到的Mf-EPSCs代表性轨迹。右图：方框区域的放大图，显示最后一个光脉冲后450 ms内的轨迹。异步电荷量（橙色区域）从光脉冲结束后20 ms开始计算。
(F) 在以20 Hz施加50个光脉冲组成的刺激串后，突触前FMRP缺失时的平均异步电荷量未发生改变（Mann–Whitney检验，U=279，p=0.4244）。WT：n=23个细胞；cKO：n=28个细胞。WT：N=14只小鼠；cKO：N=20只小鼠。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。
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图6.
突触前FMRP缺失时，量子幅度未发生改变，但电压门控钙通道（VGCCs）受抑制后的恢复受损。
(A) 在2 min基线期以及施用镉（32 µM，电压门控
钙通道抑制剂，灰色区域），以及施加镉后17 min（洗脱）的记录。记录来自对照（黑色）和FMRP DG-cKO（蓝色）小鼠急性脑片中的CA3锥体神经元。虚线表示平均量子幅度。
(B)（A）中实验的苔藓纤维诱发兴奋性突触后电流（Mf-EPSCs）幅度随时间的变化显示，突触前FMRP缺失时幅度降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 14)=4.5，p=0.05）。每个时间点的数值为10次Mf-EPSCs幅度的平均值。橙色区域表示进行量子幅度分析的时段（见方法）。
(C) 柱状图显示，在橙色区域内计算且不计入失败事件的量子幅度相近（Mann-Whitney检验，U=29，p=0.7984）。
(D)（A）中实验的归一化Mf-EPSCs幅度随时间的变化显示，突触前FMRP缺失时幅度无统计学显著差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 14)=3.4，p=0.0882）。每个时间点的数值为10次Mf-EPSCs幅度的平均值。
(E) 记录最后1 min内（D中的箭头）计算的归一化Mf-EPSCs幅度柱状图显示，突触前FMRP缺失时，施加镉后的恢复程度降低（Mann-Whitney检验，U=12，p=0.0379）。
(F)（A）中实验的Mf-EPSCs失败率随时间的变化在WT与cKO之间无统计学显著差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 14)=2.4，p=0.1431）。每个时间点的数值通过计算30 s记录内的失败率获得。
(G)（A）中实验的Mf-EPSCs变异系数随时间的变化在对照组与FMRP DG-cKO组之间无统计学显著差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 14)=2.4，p=0.1455）。各时间点的数值通过计算
30 s记录期间的变异系数。WT：n = 8个细胞；cKO：n = 8个细胞。WT：N = 4只小鼠；cKO：N = 4只小鼠。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。
另一项发现揭示了突触前FMRP与Ca²⁺相关机制之间的联系，即电压门控钙通道（VGCC）受抑制后的恢复。在浴液中加入Cd²⁺后，我们记录了洗脱过程，以确认在Cd²⁺抑制Ca²⁺通道后，苔藓纤维诱发的兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）幅度能够完全恢复（图6A）。我们预期两组均能完全恢复。然而，两组归一化后的Mf-EPSC相对幅度存在差异（WT：87.3 ± 55.2，n = 8；cKO：45.2 ± 33.9，n = 8；U = 12，p = 0.0379；图6E）。进一步的统计分析表明，对照小鼠归一化后的Mf-EPSC幅度在实验结束时完全恢复（T = −10，p = 0.5469），而FMRP DG-cKO小鼠归一化后的Mf-EPSC幅度仅部分恢复（T = −34，p = 0.0156）。综上，这些结果表明，突触前FMRP缺失会损害苔藓纤维末梢中的Ca²⁺积累及其动态变化。
突触前FMRP缺失导致苔藓纤维突触处AC-cAMP-PKA信号通路失调
Ca²⁺内流可通过Ca²⁺/钙调蛋白激活的腺苷酸环化酶（AC）刺激cAMP生成，进而激活蛋白激酶A（PKA），后者是突触可塑性的关键调节因子（Ferguson & Storm, 2004；H. Wang & Storm, 2003；Wong et al., 1999）。在海马苔藓纤维末梢中，PKA是强直刺激后增强（PTP）诱导和维持所必需的（Y. Y. Huang et al., 1994；Kim et al., 2024；Vandael et al., 2020；Weisskopf et al., 1994）。由于光遗传学诱导PTP（optoPTP）是唯一能够挽救FMRP DG-cKO小鼠突触前表型的实验方案，我们接下来探究了在突触前缺失的情况下，PKA活性是否也参与基础神经递质传递
FMRP。
在以0.1 Hz刺激记录10分钟基线后，在浓度为10 µM的PKA抑制剂H89存在的条件下记录Mf-EPSC，持续50分钟（图7A）。在对照小鼠中，施用H89使Mf-EPSC的幅度显著降低。记录45分钟后，其幅度已降至与FMRP DG-cKO小鼠Mf-EPSC基线幅度相当的水平（蓝色虚线；图7B）。在整个记录过程中，FMRP DG-cKO小鼠的Mf-EPSC绝对幅度均低于对照小鼠（WT：n=13，cKO：n=16；F(1, 27)=13.5，p=0.001；图7B）。值得注意的是，在对照小鼠中，采用光遗传学刺激观察到的H89效应也在采用电刺激时得到重现（图S2C–F）。然而，经基线归一化后，FMRP DG-cKO小鼠的Mf-EPSC相对幅度显著高于对照小鼠（WT：n=13，cKO：n=16；F(1, 27)=4.9，p=0.0358；图7C）。值得注意的是，施用H89 30分钟后，FMRP DG-cKO小鼠的Mf-EPSC幅度仍约为基线的93%，而对照小鼠的Mf-EPSC幅度降至基线的约65%（WT：65.2 ± 14.6，n=13；cKO：92.6 ± 30.4，n=16；Šídák多重比较检验，p=0.0254）。施用H89后，不同基因型之间的失败率（WT：n=13，cKO：n=16；F(1, 27)=1.5，p=0.2286；图7D）和变异系数（WT：n=13，cKO：n=16；F(1, 27)=1.5，p=0.2246；图7E）均无显著差异。施用H89后，FMRP DG-cKO小鼠与对照小鼠之间的配对脉冲比值（PPR）无差异（图S2A、B）。
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图S2
（与图7相关）。突触前FMRP缺失不影响H89施用期间的释放概率，且H89对电刺激和
光遗传学诱发的苔藓纤维兴奋性突触后电流（Mf-EPSCs）。
(A) 在对照（黑色）和FMRP DG-cKO（蓝色）小鼠急性脑切片中，采用双脉冲刺激方案获得的Mf-EPSCs代表性轨迹。在施用H89（10 µM）30 min前后分别进行双脉冲记录（各10次）。
(B) 施用H89前后，对照小鼠与FMRP DG-cKO小鼠的双脉冲比率均无差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 18)=1.5，p=0.2424）；基线期间（Fisher最小显著差异事后检验，p=0.0701）和施用H89后（Fisher最小显著差异事后检验，p=0.9024）均无差异。WT：n=10个细胞；cKO：n=10个细胞。WT：N=10只小鼠；cKO：N=8只小鼠。
(C) 在10 min基线期间以及施用H89（10 µM，灰色区域）后30 min和50 min时，以0.1 Hz频率记录的Mf-EPSCs代表性轨迹。记录取自对照小鼠急性脑切片中的CA3锥体神经元，采用光遗传学刺激或电刺激。
(D) 10 min基线期间及施用H89（10 µM）的50 min内，Mf-EPSCs幅度的时间进程显示，光遗传学刺激（黑色实心圆）与电刺激（空心圆）诱发的电流幅度相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 18)=0.2，p=0.6641）。每个时间点为6次Mf-EPSCs幅度的平均值。
(E) 10 min基线期间及施用H89（10 µM）的50 min内，归一化Mf-EPSCs幅度的时间进程显示，光遗传学刺激与电刺激诱发的电流幅度相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 18)=2.1，p=0.1616）。每个时间点为6次Mf-EPSCs幅度的平均值。
(F) 10 min基线期间及施用H89（10 µM）的50 min内，光遗传学刺激与电刺激所诱发Mf-EPSCs的失败率时间进程无统计学差异（双因素方差分析，组间主效应
组间，F(1, 18)=0.8，p=0.3913）。各时间点通过计算5 min记录期间的失败率获得。光刺激：n=13个细胞；电刺激：n=7个细胞。光刺激：N=11只小鼠；电刺激：N=6只小鼠。数据以均值±标准误（SEM）表示。
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图7.
缺失突触前FMRP时，基础突触传递过程中的AC-cAMP-PKA通路受损。
(A) 左图：cAMP相关信号通路。腺苷酸环化酶（AC）催化三磷酸腺苷（ATP）转化为3′,5′-环磷酸腺苷（cAMP）。随后，cAMP激活多种效应分子，如cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）。最后，磷酸二酯酶（PDE）水解cAMP中的磷酸二酯键，生成5′-AMP。H89是PKA抑制剂。右图：在10 min基线记录期间以及施用H89（10 µM，灰色区域）后30 min和50 min时，以0.1 Hz频率记录的苔藓纤维诱发兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）的代表性波形。记录来自对照小鼠（黑色）和FMRP DG-cKO小鼠（蓝色）急性脑切片中的CA3锥体神经元。蓝色虚线表示FMRP DG-cKO小鼠的平均基线幅度。
(B) (A)中实验的Mf-EPSC幅度时间进程显示，缺失突触前FMRP时，幅度降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 27)=13.5，p=0.001）。各时间点通过计算6次Mf-EPSC的平均幅度获得。蓝色虚线表示FMRP DG-cKO小鼠的平均基线幅度。
(C) (A)中实验的归一化Mf-EPSC幅度时间进程显示，施用H89期间，对照小鼠的幅度降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 27)=4.9，p=0.0358）。各时间点通过计算10 min内Mf-EPSC的平均归一化幅度获得。
(D) (A)中实验的Mf-EPSC失败率时间进程并未
在施用H89期间，对照组与FMRP DG-cKO小鼠之间无统计学差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 27)=1.5，p=0.2286）。各时间点的失败率根据每5分钟记录期间的数据计算得出。
（E）实验（A）中Mf-EPSC变异系数的时间进程显示，在施用H89期间，对照组与FMRP DG-cKO小鼠之间无统计学差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 27)=1.5，p=0.2246）。各时间点的变异系数根据每5分钟记录期间的数据计算得出。WT：n=13个细胞；cKO：n=16个细胞。WT：N=11只小鼠；cKO：N=15只小鼠。
（F）
左图：cAMP相关信号通路。AC催化ATP转化为3′,5′-cAMP。随后，cAMP激活包括PKA在内的多种效应分子。最后，PDE降解cAMP中的磷酸二酯键，生成5′-AMP。IBMX是PDE抑制剂。
右图：代表性Mf-EPSC轨迹，记录频率为0.1 Hz；先记录10分钟基线，再分别施用2、5、10和25 µM IBMX各10分钟（灰色区域）。记录取自对照组和FMRP DG-cKO小鼠急性脑切片中的CA3锥体神经元。虚线表示对照组小鼠的平均基线幅度。
（G）实验（F）中Mf-EPSC振幅的时间进程显示，缺乏突触前FMRP时振幅降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 26)=44，p=0.001）。各时间点的振幅为6个Mf-EPSC振幅的平均值。
（H）实验（F）中剂量反应实验的汇总结果：归一化Mf-EPSC振幅随IBMX浓度的变化显示，缺乏突触前FMRP时振幅降低（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 26)=7.2，p=0.0124）。
（I）实验（F）中Mf-EPSC失败率的时间进程显示出一种
在IBMX处理期间持续升高（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 26)=14.3，p=0.0008）。各时间点的失误率根据5 min记录期间的数据计算得出。
（J）实验（F）中Mf-EPSCs变异系数的时间进程显示，在IBMX处理期间变异系数持续升高（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 26)=7，p=0.0131）。各时间点的变异系数根据5 min记录期间的数据计算得出。WT：n=14个细胞；cKO：n=14个细胞。WT：N=10只小鼠；cKO：N=10只小鼠。
（K）左图：cAMP相关信号通路。AC催化ATP转化为3’,5’-cAMP。随后，cAMP激活PKA等多种效应分子。最后，PDE降解cAMP中的磷酸二酯键，生成5’-AMP。福斯可林（FSK）是AC的激活剂。右图：代表性Mf-EPSCs轨迹，记录条件为0.1 Hz，包含10 min基线期、施用FSK（10 µM，灰色区域）10 min后，以及施用FSK后20 min（洗脱期）。记录对象为对照小鼠和FMRP DG-cKO小鼠急性脑切片中的CA3锥体神经元。虚线表示对照小鼠的基线平均振幅。
（L）实验（K）中Mf-EPSCs振幅的时间进程显示，在突触前FMRP缺失时振幅相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 21)=1.6，p=0.2145）。各时间点的振幅为6个Mf-EPSCs振幅的平均值。
（M）实验（K）中Mf-EPSCs归一化振幅的时间进程显示，在突触前FMRP缺失时振幅相近（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 21)=1，p=0.3378）。各时间点的振幅为10 min内Mf-EPSCs归一化振幅的平均值。
（N）实验（K）中Mf-EPSCs失误率的时间进程显示其升高，在
突触前FMRP缺失（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 21)=6，p=0.0239）。各时间点的失败率根据每5分钟记录期间的数据计算得出。
（O）实验（K）中Mf-EPSC变异系数的时间过程在对照小鼠与FMRP DG-cKO小鼠之间无统计学差异（双因素方差分析，组间主效应，F(1, 21)=3，p=0.1033）。各时间点的变异系数根据每5分钟记录期间的数据计算得出。WT：n=10个细胞；cKO：n=13个细胞。WT：N=8只小鼠；cKO：N=10只小鼠。数据以均值±SEM表示。
总体而言，这些实验表明，在对照小鼠中抑制PKA可模拟FMRP DG-cKO表型，降低Mf-EPSC振幅，同时提高失败率和变异系数。这提示在基础突触活动期间，FMRP DG-cKO小鼠中的PKA活性很可能较低。这种效应可由三种假设解释：（1）磷酸二酯酶（PDE）介导的cAMP降解增加，导致PKA活性降低；（2）腺苷酸环化酶（AC）活性降低；或（3）上述两种机制共同作用，损害PKA活性。我们使用非选择性PDE抑制剂IBMX检验了第一种假设。在以0.1 Hz记录10分钟基线后，于不同的连续浓度IBMX（2、5、10和25 µM）存在下记录Mf-EPSC，共40分钟（图7F）。在对照小鼠中，施用IBMX显著增强了Mf-EPSC振幅。然而，在整个记录过程中，FMRP DG-cKO小鼠的Mf-EPSC绝对振幅均低于对照小鼠（WT：n=14，cKO：n=14；F(1, 26)=44，p<0.0001；图7G）。以基线值归一化后，对照小鼠的Mf-EPSC相对振幅仍显著高于FMRP DG-cKO小鼠（WT：n=14，cKO：n=14；F
（1，26）=7.2，p=0.0124；图7H）。最后，IBMX应用并未使FMRP DG-cKO小鼠中观察到的失败率缺陷恢复正常（WT：n=14，cKO：n=14；F（1，26）=14.3，p=0.0008；图7I），也未使变异系数缺陷恢复正常（WT：n=14，cKO：n=14；F（1，26）=7，p=0.0131；图7J）。因此，PDEs活性增强似乎不太可能是原因，因为在应用IBMX后，FMRP DG-cKO小鼠中仍然存在该表型。
采用毛喉素（forskolin，一种浓度为10 μM的非选择性ACs激活剂）检验了ACs的作用。在0.1 Hz下记录10分钟基线后，在FSK存在的条件下记录10分钟Mf-EPSC，随后在20分钟的洗脱期内进行记录（图7K）。在对照小鼠和FMRP-cKO小鼠中，FSK应用均导致Mf-EPSC振幅明显增强。FSK应用后，FMRP DG-cKO小鼠与对照小鼠之间的Mf-EPSC绝对振幅无统计学差异（WT：n=10，cKO：n=13；F（1，21）=1.6，p=0.2145；图7L）。然而，将其归一化至基线后，对照小鼠与FMRP DG-cKO小鼠之间的Mf-EPSC相对振幅也无统计学差异（WT：n=10，cKO：n=13；F（1，21）=1，p=0.3378；图7M）。最后，FSK应用挽救了FMRP DG-cKO小鼠中观察到的变异系数缺陷（WT：n=10，cKO：n=13；F（1，21）=3，p=0.1033；图7O），但未挽救失败率缺陷（WT：n=10，cKO：n=13；F（1，21）=6，p=0.0239；图7N）。总之，这些结果提示，突触前FMRP会损害突触前ACs活性，因为在应用FSK后，FMRP DG-cKO小鼠的表型几乎完全得到挽救。
讨论
在本研究中，我们证明，在海马Mf突触处选择性删除突触前FMRP会损害基础神经传递，这一点表现为Mf-EPSC降低
通过突触前机制影响幅度、增加失败率并改变变异系数。我们的数据进一步提示，cAMP-PKA信号通路可能是导致这一表型的原因，并可能使活性区（AZ）的易释放囊泡池（RRP）缩小。
出乎意料的是，条件性删除FMRP并未改变齿状回（DG）细胞的内在兴奋性，这与组成型FMRP缺失模型中报道的高兴奋性形成对比（Contractor et al., 2015；Deng & Klyachko, 2021；Liu et al., 2022）。这一差异可能源于FMRP删除时机的不同（Gredell et al., 2023）。既往研究使用组成型Fmr1敲除（KO）或嵌合模型，而我们在DG细胞及其苔藓纤维（Mf）突触成熟后才删除FMRP（Amaral & Dent, 1981；Marchal & Mulle, 2004），从而最大限度地减少发育适应性变化。因此，我们的结果可能更能反映突触前FMRP的生理功能，而非其在发育过程中缺失所产生的继发性后果。组成型模型不可避免地将FMRP缺失的即时效应与神经回路形成和成熟过程中产生的长期代偿机制混合在一起。相比之下，发育完成后进行删除提供了一种单独研究FMRP原发生理功能的方法。这一区别可能解释了本研究与经典脆性X相关文献之间的差异，并提示脆性X综合征的某些相关表型不仅可能源于成年阶段FMRP的直接缺失，也可能源于其在发育过程中的缺失。
本研究中一个一致的发现是，在缺乏突触前FMRP的小鼠中，基础突触传递期间的Mf诱发兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）幅度显著降低（约50%），而短时程易化未发生变化。这些发现拓展了此前在某一
小鼠新皮层中的兴奋性至抑制性突触（Patel et al., 2013）延伸至海马中的兴奋性至兴奋性突触。多项观察结果表明，该缺陷位于突触前：Mf-EPSC的幅度与其变异系数协同变化，而双脉冲比（PPR）和量子幅度均未发生变化。释放失败率升高，加之两组含有Bassoon蛋白的活性区数量相同，进一步提示，在缺失突触前FMRP的情况下，每个活性区（AZ）中处于释放就绪状态的囊泡数量减少，因而易释放池（RRP）的大小减小。
鉴于PKA参与突触囊泡的停泊和预备，并调节活性区中易释放池的大小（Bruentgens et al., 2026；Cazares et al., 2016；Cesca et al., 2010；Leenders & Sheng, 2005；Pernía-Andrade & Jonas, 2011），尤其是在苔藓纤维（Mf）突触的强直后增强（PTP）过程中（Kim et al., 2024；Vandael et al., 2020），我们研究了突触前FMRP缺失是否会改变这种形式的可塑性。在缺失突触前FMRP的情况下，光遗传学诱导的强直后增强（optoPTP）幅度增大，但在optoPTP诱导后即刻，两组的Mf-EPSC幅度相近。FMRP DG-cKO小鼠在诱导后的异步电荷量恢复至正常水平，提示两组在诱导刺激序列期间的Mf末梢中具有相近的Ca²⁺积累。相比之下，在缺失突触前FMRP的情况下，1 Hz、3 Hz刺激时以及20 Hz的10脉冲刺激序列后的异步电荷量均降低。
FMRP与突触前电压门控钙通道（VGCC）之间的关系提供了一种潜在的机制解释。FMRP调节Cav2通道的细胞表面表达和电导：其缺失会降低Cav2.1（P/Q型）的细胞表面表达和电导（Castagnola et al., 2018），同时增加Cav2.2（N型）和Cav2.3（R型）的表达和电导（Ferron et
等，2014，2020；Gray 等，2019）。在苔藓纤维（Mf）突触终末中，这些亚型的贡献随活动水平而异。在单个动作电位和短串刺激（<12 个动作电位）期间，Ca²⁺ 内流主要由 Cav2.1 介导，其次为 Cav2.2，Cav2.3 的贡献较小（Breustedt 等，2003；L. Li 等，2007）。随着刺激增强，Cav2.3 的贡献逐渐增加，约从第 20 个动作电位开始占据主导地位，并支持强直后增强（PTP）的诱导（Dietrich 等，2003；Vandael 等，2020）。
基于上述观察，我们提出，突触前 FMRP 通过对 Cav2 通道和 cAMP-PKA 信号通路进行活动依赖性调控来调节神经递质释放。在基础活动和短串刺激期间，FMRP 缺失所致的 Cav2.1 表达降低可能减少 Mf 终末的 Ca²⁺ 内流（Castagnola 等，2018；Chamberland 等，2017，2020；L. Li 等，2007）。这将降低 Ca²⁺/钙调蛋白（CaM）依赖性腺苷酸环化酶 AC1 和 AC8 的激活水平（Shahoha 等，2022），从而降低 PKA 活性，进而减少突触囊泡的停泊/预备，并缩小易释放囊泡池（RRP）。然而，在光遗传诱导的 PTP（optoPTP）诱导期间，Ca²⁺ 内流主要由 Cav2.3 介导，而 Cav2.3 在 FMRP 缺失时过度表达（Gray 等，2019）。因此，增强的 Cav2.3 依赖性 Ca²⁺ 内流可能在诱导刺激串期间提高 AC1/8 的激活水平和 PKA 活性，增加已停泊/已预备囊泡的数量，从而解释 FMRP DG-cKO 小鼠中 optoPTP 幅度的增大。
药理学实验支持这一框架。PKA 抑制剂 H89 在对照小鼠中重现了 FMRP DG-cKO 表型，而 IBMX 介导的磷酸二酯酶（PDE）抑制未能逆转 FMRP DG-cKO 小鼠的表型。相比之下，使用毛喉素激活腺苷酸环化酶则几乎完全
恢复了基础突触活动。这些结果表明，在缺乏突触前FMRP的情况下，基础活动期间腺苷酸环化酶（ACs）介导的cAMP生成及随后的PKA募集减少，导致突触囊泡停靠/预备受损。我们还发现，突触前PKA在维持成熟苔藓纤维（Mf）突触高效的基础传递方面发挥着此前未得到充分重视的作用，而其作用通常被认为与强直后增强（PTP）和长时程增强（LTP）等高频活动相关（Vandael et al., 2020；Weisskopf et al., 1994）。
我们还发现，在缺乏突触前FMRP的情况下，电压门控钙通道（VGCC）受抑制后突触活动的恢复受损。据我们所知，此前尚无研究报道施用Cd²⁺后出现这一效应。仅凭VGCC，尤其是Cav2.1的细胞表面表达减少，可能不足以完全解释这一表型；相反，该表型可能反映了通道动态特性的改变。一种可能的机制涉及Cav2辅助亚基的变化：α2δ和β亚基调控Cav2的转运和动力学特性（Dolphin, 2013, 2016, 2018；Isom et al., 1994），其表达减少可能减缓VGCC受抑制后的恢复。另一种可能的机制涉及网格蛋白衔接蛋白复合物2（AP-2），其表达通常受FMRP抑制，并介导包括VGCC的α2δ-1亚基在内的突触蛋白的内吞作用（Shi et al., 2025）。在缺乏FMRP的情况下，AP-2表达增加可能增强与α2δ-1关联的VGCC的活动依赖性内吞作用（Imoto & Watanabe, 2025；Kadlecova et al., 2016；McMahon & Boucrot, 2011；Royle & Lagnado, 2010）。由于Cav2.1优先与α2δ-1偶联，而Cav2.3则不然（Dolphin, 2016），这一机制可能既能解释突触前表型，也能解释施用Cd²⁺后恢复受损的现象。
若干局限性应当被
需要加以考虑。首先，我们的结果间接表明，苔藓纤维（Mf）末梢的 Cav2 通道发生了改变，但仍需直接证实 Cav2.1 的细胞表面表达减少和 Cav2.3 的过表达，并测量各特定通道介导的 Ca²⁺ 电导，理想情况下应采用 Mf 突触终扣的全细胞膜片钳记录。其次，尽管我们的药理学结果提示基础传递过程中 PKA 活性降低，但 H89 也可作用于 PKA 以外的靶点（Y. Chen & Sabatini, 2021；Davies et al., 2000；Fusi et al., 2017；Limbutara et al., 2019；Lochner & Moolman, 2006；Murray, 2008）。因此，应使用其他 PKA 抑制剂（如 Rp-8-CPT-cAMPS 或 Rp-8-Br-cAMPS）以及 cAMP 类似物（如 Sp-cAMPS）进行验证。利用基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器（如 Epac-Sᴴ¹⁸⁷、cAMPFIRE 和 AKARs）直接测量突触前 cAMP 和 PKA 的动态变化，可进一步检验这一机制（Klarenbeek et al., 2015；Ma et al., 2018；Massengill et al., 2022）。第三，尽管 IBMX 未揭示磷酸二酯酶（PDE）的直接贡献，但它也会影响腺苷受体（Prince & Stevens, 1992）；因此，需要使用选择性 PDE 亚型抑制剂来证实这一结论。尽管如此，PDE 仍可能在特定的活动模式、发育阶段、亚细胞区室或神经调质条件下发挥作用，这与已有研究报道的 FMRP 与 PDE2A、PDE4D 和 PDE10A 之间的联系一致。第四，应通过超微结构和功能性方法直接检验所提出的易释放囊泡池（RRP）大小减小这一假说，包括利用电子显微技术（如冷冻电子断层成像［cryo-ET］、冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜［cryo-FIB/SEM］、冷冻关联光电显微镜［cryo-CLEM］）定量分析已停泊囊泡，以及通过 Mf 突触终扣的全细胞记录，根据膜电容跃变估算 RRP 大小（Bischofberger et al., 2006；Fukaya, Hirai, et al., 2023；Hallermann et al., 2003；
Kushmerick & von Gersdorff, 2003；Midorikawa & Sakaba, 2017；Miyano et al., 2019）。
最后，一个重要问题是，在组成型敲除 FMRP 后，是否也会出现本研究中观察到的相同突触前表型。若能在 Fmr1-KO 小鼠中重复观察到这些结果，将支持以下结论：这些机制是突触前 FMRP 缺失的稳定特征，并直接参与脆性 X 综合征的病理生理过程。相反，如果未出现该表型或出现不同表型，则表明发育性代偿改变了 FMRP 缺乏对突触前功能的影响。鉴定此类机制有助于阐明突触如何适应组成型 FMRP 缺失，并揭示潜在的新型治疗靶点。
总体而言，我们的研究结果表明，突触前 FMRP 整合了汇聚于 cAMP-PKA 信号通路的多条信号通路，从而在基础突触活动期间调控神经递质释放。除与脆性 X 综合征相关外，这些发现还为理解突触前信号通路如何控制成熟苔藓纤维（Mf）突触的囊泡释放和突触功能提供了框架。因此，对这些机制进行更深入的表征，可能有助于推动基础神经科学研究，并发现新的治疗策略。
材料与方法
动物
本研究使用了 X 染色体上的 Fmr1 基因经 loxP 位点夹置的雄性 C57Bl/6J 小鼠（Fmr1^flox/y），称为 Fmr1 条件性敲除（cKO）小鼠（Mientjes et al., 2006），以及其未经 loxP 位点夹置的野生型（WT）同窝小鼠。这些动物由冷冻精子样本繁育获得，样本购自 Janvier Labs（法国 Le Genest-Saint-Isle），由 Isabelle Caillé† 教授（法国巴黎索邦大学巴黎塞纳生物学研究所）慷慨提供。繁育和饲养在 EOPS 和 Pôle In 进行
法国波尔多新阿基坦布罗卡中心（Centre Broca Nouvelle-Aquitaine）的 Vivo-EXPE 设施。所有实验程序均经当地“波尔多伦理委员会”（CEEA-050）批准，并符合欧洲和法国有关动物研究的法规（APAFIS 编号：2021040211108206）。小鼠于出生后第21天（P21）断奶，并与同窝小鼠共同饲养，自由摄取食物和饮水。饲养笼置于温度受控的环境中，采用12小时明暗交替周期。
病毒载体
本研究使用慢病毒载体，因为其能够将大型转基因高效递送至神经元，且细胞毒性极低。断奶后（P25–P30），通过立体定位注射，将慢病毒 LV.C1qL2.ChIEF-Tom-2A-Cre 注入 floxed 和非 floxed 小鼠的齿状回（Barthet et al., 2018）。稀疏表达由 C1qL2 启动子驱动，该启动子在齿状回（DG）细胞中选择性富集（Dalley et al., 2008；Iijima et al., 2010）。该构建体可使野生型（WT）和条件性敲除（cKO）小鼠共表达 ChIEF（一种光敏感的通道视紫红质变体）和 tdTomato，而 Cre 重组酶通过自切割 2A 肽序列与 ChIEF 和 tdTomato 分离。病毒滴度约为 1.21 × 10⁹ 颗粒/mL。
立体定位注射
为进行镇痛，在小鼠切口部位皮下注射 lurocaine（7 mg/kg），随后腹腔注射丁丙诺啡（0.5 mg/kg）和美洛昔康（5 mg/kg）。使用4%异氟烷诱导麻醉，并以1.5%–2%的浓度维持麻醉（流量约为0.2 L/min），根据动物的呼吸频率进行调整。整个手术过程中，将小鼠置于加热垫上以防止体温过低。确认痛觉反射消失后，剃除切口部位的毛发，然后使用
聚维酮碘。以解剖学前囟点为参照调整头部位置。
以前囟点为参照，在以下立体定位坐标处进行小范围开颅：前后向（AP）= −2.2 mm，内外侧向（ML）= ±2.0 mm，背腹向（DV）= −2.0 mm。使用微量注射泵（World Precision Instruments），以100 nL/min的速率向每侧半球注射750 nL慢病毒。对病毒滴度进行优化，以最大限度提高齿状回中的感染效率。注射后缝合切口，并将小鼠置于加温笼中，在监护下恢复。每日监测体重，持续至少3天，或直至体重完全恢复至术前水平。为确保转基因稳定表达，在注射后超过1个月（最短35天，最长56天）对小鼠进行电生理记录。
免疫组织化学
将小鼠深度麻醉后，经心灌注以1×磷酸盐缓冲液（PBS）配制的4%多聚甲醛（PFA）。小心取出脑组织，在4% PFA中后固定数小时或过夜，随后使用振动切片机（Leica Microsystems，VT1200S）制备厚度为50 μm的冠状切片。
将游离漂浮切片置于含5%正常山羊血清（NGS）和0.3% Triton X-100的PBS封闭液中，于室温孵育1小时，以减少非特异性结合并使细胞膜通透。随后，将切片置于用封闭液稀释的一抗中，于4°C孵育过夜。所用一抗如下：兔抗FMRP抗体（Rb11，自制，1:250），由Barbara Bardoni博士和Marielle Jarjat（法国瓦尔邦，蔚蓝海岸大学分子与细胞药理学研究所）惠赠；以及豚鼠抗Cre重组酶抗体（Synaptic Systems，257004，1:500）。
次日，切片
在PBS中洗涤3次，每次10 min，随后与用PBS稀释的二抗在室温下孵育2 h。二抗包括山羊抗豚鼠Alexa Fluor 488（1:500）和山羊抗兔Alexa Fluor 647（1:500）。再次用PBS洗涤3次后，将切片贴附于载玻片上，并使用含DAPI（300 mM）的Fluoromount封片剂封片。封片后立即采集共聚焦图像。
离体
膜片钳记录
取先前已注射慢病毒构建体的2月龄（P60–P86）小鼠制备急性海马切片。通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）对小鼠进行深度麻醉。确认痛觉反射消失后，经左心室以冰冷、充氧（95% O₂、5% CO₂）的人工脑脊液（ACSF）进行心脏灌流。ACSF的成分如下（单位：mM）：120 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH₂PO₄-H₂O、27 NaHCO₃、1无水MgCl₂、2 CaCl₂-H₂O₂、16.5葡萄糖、2.8丙酮酸和0.5抗坏血酸（pH 7.4，310 mOsm）。迅速取出脑组织，并切除小脑和嗅球。沿中线分离两个大脑半球，将各半球的内侧面粘附于振动切片机载物台上，以制备旁矢状切片。使用振动切片机（Leica Microsystems，VT1200S）在冰冷、充氧的ACSF中切取厚度为300 µm的切片，随后将切片置于34°C的ACSF中孵育15 min以恢复。此后，将切片保存在室温下持续充氧的ACSF中，并于当天使用。
使用垂直拉制仪（Narishige）将硼硅酸盐玻璃微管（Harvard Apparatus）拉制成电阻为3–6 MΩ的微电极。进行电压钳记录时，电极内充灌铯基内液
溶液包含以下成分（单位：mM）：125 甲磺酸铯、2 MgCl₂·6H₂O、4 NaCl、5 磷酸肌酸、10 EGTA、10 HEPES 和 4 NaATP（用 CsOH 将 pH 调至 7.3，渗透浓度为 300 mOsm）。
电流钳记录采用钾基电极内液，其成分如下（单位：mM）：115 葡萄糖酸钾、10 KCl、0.2 EGTA、0.02 CaCl₂、10 HEPES、15 磷酸肌酸、4 MgATP 和 0.3 NaGTP（用 KOH 将 pH 调至 7.3，渗透浓度为 300 mOsm）。
在电压钳实验中，于每次扫描开始时施加一个 −10 mV、5 ms 的测试脉冲，以监测串联电阻。对于短时记录（即少于 30 min），若串联电阻超过 20 MΩ 或相对于基线的变化超过 20%，则舍弃该记录；对于长时记录（即超过 30 min），若串联电阻超过 25 MΩ 或相对于基线的变化超过 30%，则舍弃该记录。未进行液接电位校正或串联电阻补偿。神经元的保持电位设为 −70 mV。
信号使用 EPC-10 放大器（HEKA Elektronik）记录，经 2.9 kHz 贝塞尔滤波器滤波，并以 10 kHz 的采样率进行数字化。所有记录均在室温下进行。
首先在 10× 放大倍率下（Nikon，Plan fluor 10×/0.30）识别海马，并通过检测 tdTomato 荧光确认病毒感染情况。随后在更高放大倍率下（Nikon，NIR Apo 60×/1.0）进行膜片钳记录。在电压钳实验中，对 CA3 锥体细胞（PCs）进行膜片钳记录，同时通过实时监测诱发反应，将光遗传刺激位点定位于颗粒细胞的树突树中。LED 光（470 nm）的强度设为 66%（CoolLED，pE-1&2），因为该强度可可靠地在颗粒细胞胞体中诱发动作电位。为测量“光强”，我们采用了焦平面处 LED 光的辐照度（
使用……测量照明强度
准确性与精密度
，2019），其条件与光遗传刺激期间相同（即存在滤光片和二向色镜）。使用光功率传感器（Thorlabs，S120C）和光功率计（Thorlabs，PM100D）测量通过60倍物镜的光功率。在本实验条件下，光辐照度（E）由以下公式给出：
其中，功率值为PN（mW），视场数为FN（mm），物镜放大倍数为Mo。对于所用物镜，FN为22 mm，Mo为60。当LED光强设为66%时，PN为1.2 mW。因此，在本实验装置中，光遗传刺激期间焦平面处的辐照度估计约为11.36 mW/mm²。
对苔藓纤维束进行电刺激时，我们使用置于齿状回门区的硼硅酸盐玻璃微电极（尖端直径约1 µm）施加最小强度刺激。刺激微电极内充灌人工脑脊液（ACSF），基础条件下以0.1 Hz的频率施加刺激脉冲（200 µs，10–80 µA）。
通过兴奋性突触后电流（EPSC）的特征性动力学以及对波形的目视检查，验证苔藓纤维输入的单突触激活。苔藓纤维（Mf）突触电流根据以下标准进行鉴定：显著的低频易化、0.1 Hz下较低的释放概率，以及单个EPSC快速的上升时间。在电流钳实验中，对齿状回（DG）颗粒细胞进行膜片钳记录。使用Patchmaster软件（HEKA Elektronik）编制并控制采集程序。
为尽量减少统计偏倚，每只动物记录的细胞数上限设为5个。施加20 Hz成串刺激或药理学试剂时，每张急性脑切片仅记录1个细胞；其余情况下，每张切片记录的细胞数上限设为2个。
药理学
对于
在电压钳记录中，始终向人工脑脊液（ACSF）中加入荷包牡丹碱（bicuculline，10 µM，Hellobio）、盐酸CGP-55845（1 µM，Hellobio）和D-APV（25 µM，Hellobio），以分离兴奋性突触后电流（EPSC）中由AMPA受体（AMPAR）和海人酸受体（KAR）介导的电导。
所有其他药理学试剂均通过闭路循环系统，在100–200 mL充氧ACSF中以浴液灌流方式施用。在给药的前5分钟内，暂时将循环回路切换为开放状态，以确保达到正确浓度的药液进入记录槽；如需洗脱，在洗脱期的前5分钟内也进行同样操作。
本研究使用的其他药理学试剂包括福斯可林（FSK，10 µM，Sigma-Aldrich）、二盐酸H-89（10 µM，Tocris）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，2–25 µM，Sigma-Aldrich）和氯化镉（Cd²⁺，32 µM，Sigma-Aldrich）。
电生理数据分析
所有分析均使用IgorPro软件（WaveMetrics）中的Neuromatic插件（Rothman & Silver, 2018）完成。对于CA3锥体细胞的电压钳实验，测量了诱发兴奋性突触后电流（EPSC）的幅度、有效幅度、失败率和变异系数。EPSC幅度（pA）为基线电流与峰值电流之差，计算其平均值时包括神经传递“失败”的事件（即0 pA，如有）。EPSC有效幅度（pA）为排除“失败”事件（即0 pA）后计算得到的EPSC平均幅度。失败率（%）为失败事件数除以EPSC总数。变异系数（CV，%）为EPSC幅度的标准差（σ）除以EPSC幅度的平均值（µ），如下所示：
为研究苔藓纤维突触的量子幅度，我们使用32 µM的Cd²⁺（一种钙通道抑制剂），并在……期间通过浴液灌流施用。
采用1 Hz刺激方案（Barthet et al., 2018）。该方法的原理是大幅降低释放概率，使记录到的绝大多数突触后事件源于单量子释放（约占事件总数的95%）。我们首先记录2分钟基线，随后施加Cd²⁺ 5分钟，最后洗脱17分钟。我们选取失败率和变异系数（CV）最高的时间窗，计算成功事件的平均幅度（即效能），以确定平均量子幅度。该时间窗为记录开始后7分50秒至9分50秒，共2分钟。
我们量化了单次动作电位刺激（0.1、1或3 Hz）及动作电位串刺激（以20 Hz给予10或50个脉冲）后的异步电荷量（pA·s）。异步电荷量被用作突触前残余钙的间接指标，而非用于研究异步释放本身（Llinares et al., 2025）。由于电荷量整合了异步事件的幅度、频率和动力学特征，因此能够对残余钙依赖性释放进行总体估计。对于单次动作电位，异步电荷量的量化时间窗自光脉冲结束后20 ms开始，持续180 ms。对于动作电位串，异步电荷量的量化时间窗自最后一次刺激的光脉冲结束后20 ms开始，持续430 ms。排除刺激后最初20 ms是为了避免同步释放的干扰；这一排除时段被认为是充分的，因为尽管在0.1 Hz刺激下，对照小鼠与FMRP DG-cKO小鼠的诱发苔藓纤维兴奋性突触后电流（Mf-EPSC）幅度存在差异（图2C），两组测得的异步电荷量仍相当（图5B）。
在齿状回（DG）颗粒细胞的电流钳实验中，通过阶跃电流或光脉冲（470 nm，1 ms）诱发放电。
对受感染的野生型（WT）或FMRP条件性敲除（FMRP-cKO）齿状回（DG）细胞及其周围未感染细胞（NI）进行膜片钳记录。对NI细胞进行膜片钳记录时，不考虑其在颗粒细胞层内的位置（即外侧或内侧）。在电流注入实验中，以20 pA为增量，向细胞施加持续500 ms的超极化阶跃电流（−80至0 pA）和去极化阶跃电流（0至240 pA）。每个阶跃之前均施加持续300 ms、幅度为−20 pA的超极化阶跃电流。使用整个实验方案中各次300 ms、−20 pA阶跃稳态期间记录的膜电位平均值计算输入电阻（MΩ）。静息膜电位（RMP，mV）根据该实验方案首次记录的第一个阶跃中、施加−20 pA阶跃电流之前（即刚破膜后）的膜电位计算。基强度（pA）通过首次诱发至少一个动作电位的电流阶跃确定，其数值即为该阶跃所注入电流的幅度。放电频率（次/秒）通过将去极化电流阶跃期间的动作电位数量除以该阶跃的持续时间（此处为0.5秒）计算。动作电位特性基于基强度下诱发的第一个动作电位进行分析。放电阈值（mV）利用动作电位的一阶导数确定。幅度（mV）计算为动作电位峰值与放电阈值之差。半峰全宽（FWHM，ms）测量为幅度一半处两点之间的时间差（Δt）。快速后超极化幅度（AHP，mV）计算为放电阈值与复极化阶段之后膜电位最低值（亦称AHP峰值）之差。对于光刺激，后去极化幅度（ADP，mV）为
计算为后超极化（AHP）峰值与AHP峰值之后膜电位最大值（亦称后去极化〔ADP〕峰值）之间的差值。
所有分析均在不知晓基因型和实验分组的情况下进行。
苔藓纤维（Mf）突触终末的STED和共聚焦成像
组织制备与免疫组织化学
使用振动切片机（VT1000S，Leica Microsystems）在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备海马冠状切片（70 μm）。解剖后，去除小脑和脑干，并将脑组织固定于振动切片机载物台上进行切片。切片收集于PBS中，并于4°C保存，直至后续处理。
进行免疫组织化学标记时，将游离漂浮切片置于含5%正常山羊血清和0.3% Triton X-100的1× PBS封闭液中，于室温孵育2小时。随后用PBS洗涤切片3次，并与以封闭液按1:500稀释的小鼠单克隆抗Bassoon抗体（Synaptic Systems，141111）于4°C孵育过夜。次日，用PBS洗涤切片3次，再与以封闭液按1:500稀释的ATTO647N偶联抗小鼠二抗（Sigma-Aldrich，50185）于室温孵育2小时。再次用PBS洗涤后，使用Mowiol封片剂封片，用于受激发射损耗（STED）显微成像。
STED显微成像
STED成像在法国波尔多的波尔多成像中心（BIC）使用Leica DMI6000 TCS SP8 X显微镜进行。采用混合检测器采集图像，扫描速度设为400，行平均次数设为4次，图像分辨率为1024 × 1024像素，位深为12位，变焦倍数为6，所得像素尺寸为20 × 20 nm。采集覆盖整个苔藓纤维突触终末的Z轴图像堆栈，用于
所有样本。
使用561 nm激光激发TdTomato荧光，并在570–621 nm范围内采集发射信号。使用647 nm激发光激发Bassoon免疫反应信号，并在670–720 nm范围内采集发射信号。使用775 nm损耗激光实现超分辨率成像。
共聚焦显微成像
共聚焦成像在BIC使用配备63×油浸物镜的Leica DM6 CFS TCS SP8显微镜进行。使用561 nm激发光激发TdTomato荧光，并通过光电倍增管（PMT）检测器在570–621 nm范围内检测发射信号。所有样本的采集参数均保持一致，包括扫描速度为400、分辨率为1024 × 1024像素、位深为16位，并采集覆盖组织切片整个体积的Z轴图像堆栈。
苔藓纤维末梢体积分析
使用Imaris软件（Oxford Instruments）进行形态学分析。在确定适当的感兴趣区域后，使用Surface工具对苔藓纤维末梢体积进行定量。根据感染密度调整分割阈值，但各样本的阈值均保持在一致的范围内。体积小于5 μm³或大于70 μm³的对象被排除在分析之外。所有分析均在对基因型和实验分组设盲的条件下进行。
Bassoon簇分析
使用Imaris软件对Bassoon簇进行定量。首先使用Surface工具分割苔藓纤维末梢，然后使用Spots工具识别所定义的末梢体积内的Bassoon阳性簇。根据染色强度调整检测参数，同时确保所有样本的参数均保持在一致的范围内。在簇检测过程中考虑了图像堆栈采集所导致的Z轴伸长，并且
定量分析。仅对距离质膜200 nm以内的簇进行计数。所有分析均在对基因型和实验分组不知情的条件下进行。
统计分析
将在整个研究期间不同时间点、完全相同实验条件下记录的0.1 Hz基线、双脉冲、20 Hz脉冲串及optoPTP诱导脉冲串数据合并（如适用），用于统计分析和图表绘制。
采用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性，该检验非常适用于本研究所采用的样本量（Ghasemi & Zahediasl, 2012）。根据正态性检验结果，酌情采用参数或非参数统计检验。比较两个独立均值时，采用双侧非配对Welch t检验（t）或Mann-Whitney检验（U）。比较两个独立数据集的累积分布时，采用Kolmogorov-Smirnov检验（D）。比较单个均值与假设均值时，采用单样本t检验（t）或Wilcoxon符号秩检验（T）。比较两个以上独立均值时，采用Welch单因素方差分析（W，随后进行Dunnett事后检验）或Kruskal-Wallis检验（H，随后进行Dunn T3事后检验）。比较多个时间点的两个或多个独立均值时，采用双因素方差分析（使用Geisser-Greenhouse校正的混合模型）（F），报告组间主效应，并在适用时随后进行Šídák多重比较检验或Fisher最小显著差异（LSD）事后检验。统计学显著性阈值设定为p≤0.05。未采用任何离群值检验。未使用统计检验预先确定样本量。所有分析和图表绘制均使用GraphPad完成
Prism（GraphPad Software）。
图中数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示，“结果”部分正文中的数据以均值 ± 标准差（SD）表示。
数据可用性
本研究产生的所有数据均将公开提供。
作者贡献
Simon Lecomte：研究设计；研究实施；数据分析；数据整理；撰写论文初稿；论文修订；论文撰写；获取资助（FRM）。
Bruna Ferreira Mira：研究实施；数据分析。Noelle Grosjean：研究实施；数据分析。
Christophe Mulle：研究设计；研究监督；论文修订；论文撰写；获取资助（ANR）。
利益冲突
Simon Lecomte、Bruna Ferreira Mira、Noelle Grosjean、Christophe Mulle：上述作者均声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 Isabelle Caillé† 教授（法国巴黎，索邦大学巴黎塞纳生物学研究所）提供用于建立本研究小鼠的精子样本。感谢 Barbara Bardoni 博士（法国瓦尔邦，蔚蓝海岸大学分子与细胞药理学研究所）富有启发性的讨论，以及 Marielle Jarjat 提供本研究所用的抗 FMRP 一抗。感谢波尔多成像中心（BIC，波尔多大学的服务单位，同时隶属于法国国家级基础设施 France BioImaging），本研究的显微成像及部分图像分析工作在该中心完成。本研究获得 ANR（NotifX，编号 ANR-20-CE16-0016，资助对象为 CM）和 FRM（FDT202404018556，资助对象为 SL）的支持。
谨以本文纪念 Isabelle Caillé。
脚注
↵
2
主要联系人
参考文献
↵
Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., & Fallon, J.（2009）。突触前翻译：走出突触后的阴影。Frontiers in Neural Circuits，3。
doi: 10.3389/neuro.04.017.2009
OpenUrl
CrossRef
PubMed
↵
Amaral, D. G., & Dent, J. A.（1981）。
齿状回苔藓纤维的发育：Ⅰ. 苔藓纤维及其膨大部的光镜和电镜研究。
《比较神经学杂志》，195（1），51–86。
doi: 10.1002/cne.901950106
打开链接
CrossRef
PubMed
Web of Science
↵
Anderson, B. R., Chopra, P., Suhl, J. A., Warren, S. T., & Bassell, G. J.（2016）。
共有结合位点的鉴定阐明了FMRP结合的决定因素。
《核酸研究》，44（14），6649–6659。
doi: 10.1093/nar/gkw593
打开链接
CrossRef
PubMed
↵
Ascano, M., Mukherjee, N., Bandaru, P., Miller, J. B., Nusbaum, J. D., Corcoran, D. L., Langlois, C., Munschauer, M., Dewell, S., Hafner, M., Williams, Z., Ohler, U., & Tuschl, T.（2012）。
FMRP靶向不同的mRNA序列元件以调控蛋白质表达。
《自然》，492（7429），382–386。
doi: 10.1038/nature11737
打开链接
CrossRef
PubMed
Web of Science
↵
Ashley, C. T., Wilkinson, K. D., Reines, D., & Warren, S. T.（1993）。
FMR1蛋白：保守的核糖核蛋白家族结构域与选择性RNA结合。
《科学》，262（5133），563–566。
doi: 10.1126/science.7692601
打开链接
摘要／免费全文
↵
Bardoni, B., Gwizdek, C., & Maurin, T.（2025）。
我们距离基于cAMP和cGMP理论的脆性X综合征药物治疗还有多远？
《细胞报告·医学》，6（2），101972。
doi: 10.1016/j.xcrm.2025.101972
打开链接
CrossRef
PubMed
↵
Barthet, G., Jordà-Siquier, T., Rumi-Masante, J., Bernadou, F., Müller, U., & Mulle, C.（2018）。
早老素介导的APP裂解调控突触结合蛋白7及突触前可塑性。
《自然·通讯》，9（1），4780。
doi: 10.1038/s41467-018-06813-x
打开链接
CrossRef
PubMed
↵
Berry-Kravis, E., & Ciurlionis, R.（1998）。脆性X基因（FMR-1）转录本的过表达增加神经细胞中cAMP的生成。《神经科学研究杂志》，51（1），41–48。doi: 10.1002/(SICI)1097-4547(19980101)51:1%3C41::AID-JNR4%3E3.0.CO;2-L
OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science
Berry-Kravis, E., Harnett, M. D., Reines, S. A., Reese, M. A., Ethridge, L. E., Outterson, A. H., Michalak, C., Furman, J., & Gurney, M. E.（2021）。成人脆性X综合征患者中磷酸二酯酶4D的抑制：一项随机、安慰剂对照的Ⅱ期临床试验。《自然医学》，27（5），862–870。doi: 10.1038/s41591-021-01321-w
OpenUrl CrossRef PubMed
Berry-Kravis, E., Hicar, M., & Ciurlionis, R.（1995）。脆性X综合征中环磷酸腺苷生成减少：细胞遗传学与分子层面的相关性。《儿科研究》，38（5），638–643。doi: 10.1203/00006450-199511000-00002
OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science
Berry-Kravis, E., & Huttenlocher, P. R.（1992）。脆性X综合征中的环磷酸腺苷代谢。《神经病学年鉴》，31（1），22–26。doi: 10.1002/ana.410310105
OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science
Berry-Kravis, E., & Sklena, P.（1993）。脆性X综合征患者血小板中环磷酸腺苷生成异常的证实。《美国医学遗传学杂志》，45（1），81–87。doi: 10.1002/ajmg.1320450120
OpenUrl CrossRef PubMed
Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., & Jonas, P.（2006）。海马切片中苔藓纤维末梢的膜片钳记录。《自然实验手册》，1（4），2075–2081。doi: 10.1038/nprot.2006.312
OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science
Bonnycastle, K., Kind, P. C., & Cousin, M. A.（2022）。FMRP
通过调控活动依赖性大规模内吞作用维持突触前功能。《神经科学杂志》，42（8），1618–1628。doi: 10.1523/JNEUROSCI.0852-21.2021
打开链接 摘要／免费全文
↵ Brager, D. H., & Johnston, D.（2014）。脆性X综合征中的离子通道病与树突功能障碍。《脑研究通报》，103，11–17。doi: 10.1016/j.brainresbull.2014.01.002
打开链接 CrossRef PubMed Web of Science
↵ Breustedt, J., Vogt, K. E., Miller, R. J., Nicoll, R. A., & Schmitz, D.（2003）。含α1E亚基的Ca²⁺通道参与突触可塑性。《美国国家科学院院刊》，100（21），12450–12455。doi: 10.1073/pnas.2035117100
打开链接 摘要／免费全文
↵ Bruentgens, F., Schmitz, D., & Orlando, M.（2026）。灵活的突触——苔藓纤维结构如何适应不断变化的需求。《神经生物学进展》，258，102882。doi: 10.1016/j.pneurobio.2026.102882
打开链接 CrossRef PubMed
↵ Castagnola, S., Delhaye, S., Folci, A., Paquet, A., Brau, F., Duprat, F., Jarjat, M., Grossi, M., Béal, M., Martin, S., Mantegazza, M., Bardoni, B., & Maurin, T.（2018）。关于Caᵥ2蛋白家族在Fmr1基因敲除神经元钙通量失调中作用的新认识。《分子神经科学前沿》，11，342。doi: 10.3389/fnmol.2018.00342
打开链接 CrossRef PubMed
↵ Cazares, V. A., Njus, M. M., Manly, A., Saldate, J. J., Subramani, A., Ben-Simon, Y., Sutton, M. A., Ashery, U., & Stuenkel, E. L.（2016）。SNARE结合蛋白Tomosyn对突触囊泡池的动态划分。《神经科学杂志》，36（44），11208–11222。doi: 10.1523/JNEUROSCI.1297-16.2016
打开链接 摘要／免费全文
↵ Cesca,
F., Baldelli, P., Valtorta, F., & Benfenati, F.（2010）。突触蛋白：突触功能与可塑性的关键参与者。《神经生物学进展》，91（4），313–348。doi: 10.1016/j.pneurobio.2010.04.006
OpenUrl CrossRef PubMed Web of Science
↵ Chamberland, S., Evstratova, A., & Tóth, K.（2017）。引爆型突触的短时程易化需要多种类型电压门控钙通道的差异性贡献。《神经科学杂志》，37（19），4913–4927。doi: 10.1523/JNEUROSCI.0159-17.2017
OpenUrl 摘要／免费全文
↵ Chamberland, S., Timofeeva, Y., Evstratova, A., Norman, C. A., Volynski, K., & Tóth, K.（2020）。缓慢衰减的突触前钙动态门控海马苔藓纤维至CA3锥体细胞突触的持久异步释放。《突触》，74（12），e22178。doi: 10.1002/syn.22178
OpenUrl CrossRef PubMed
↵ Chamberland, S., Timofeeva, Y., Evstratova, A., Volynski, K., & Tóth, K.（2018）。巨大苔藓纤维末梢的动作电位计数门控海马中的信息传递。《美国国家科学院院刊》，115（28），7434–7439。doi: 10.1073/pnas.1720659115
关键词：突触前FMRP · cAMP-PKA信号通路 · 海马苔藓纤维突触 · 基础突触传递 · 即刻可释放囊泡池 · 脆性X综合征
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.01.755951v1?rss=1