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N-连接的Fc半乳糖基化会导致治疗性单克隆抗体（mAb）质量的差异，影响补体依赖性细胞毒作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。现有控制策略存在调控范围狭窄、生产率下降或产生非期望糖型等问题。本研究将代谢工程与细胞糖工程相结合，向通过敲除COSMC并过表达β4-半乳糖基转移酶（C−/GT+）而实现高半乳糖基化的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中补加2-脱氧-2-氟半乳糖（2FG），从而实现对Fc β4-半乳糖基化的广泛、可调控控制。在DP12 C−/GT+细胞中，分次补料方案实现了较宽的半乳糖基化调控范围（95%–46%），但产生了大量无糖基化糖型和Man5糖型。同一方案用于另一宿主VRC01 C−/GT+时，调控范围却很窄，表明2FG的给药方案无法直接跨细胞系通用。基于这样一种假设机制——2FG经Leloir途径代谢，生成具有抑制作用的氟化核苷酸糖中间体——我们开发了一种按细胞量归一化的多次推注补料策略，在显著拓宽VRC01 C−/GT+细胞调控范围的同时，抑制了无糖基化糖型和Man5糖型的形成。在补料分批Ambr® 250工艺中，该策略仅需约十分之一的2FG，即可实现相当程度的半乳糖基化降低，表明补料后分泌的mAb比例是决定控制策略效率的关键因素。在由此获得的糖型范围内，生物层干涉分析发现，Fc β4-半乳糖基化程度与FcγRIIIA（CD16a）结合亲和力的相关性最强（R² = 0.92）。总之，这些发现确立了代谢工程与细胞糖工程相结合的平台，可在宽广范围内控制mAb半乳糖基化，并有望精细调节其下游药理活性。
下一代糖工程：结合细胞工程与代谢工程，精细调控单克隆抗体（mAb）的β1,4-半乳糖基化 | bioRxiv
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ioscani.jimenezdelval{at}ucd.ie
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N-连接型 Fc 半乳糖基化会导致治疗性单克隆抗体（mAb）质量的差异，影响补体依赖性细胞毒作用和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。目前的控制策略存在调控范围狭窄、生产率下降或产生非预期糖型等问题。本研究通过向经工程改造、可实现超半乳糖基化的 CHO 细胞（敲除 COSMC 并过表达 β4-半乳糖基转移酶，C−/GT+）中添加 2-脱氧-2-氟半乳糖（2FG），将代谢工程与细胞糖工程相结合，从而实现对 Fc β4-半乳糖基化的广泛、可调控控制。在 DP12 C−/GT+ 细胞中，分次补料方案覆盖了较宽的半乳糖基化范围（95–46%），但产生了大量非糖基化糖型和 Man5 糖型。同一方案用于另一种宿主 VRC01 C−/GT+ 时，仅获得狭窄的调控范围，表明 2FG 的给药方案无法直接套用于不同细胞系。基于一项提出的作用机制——2FG 经 Leloir 途径代谢，形成具有抑制作用的氟化核苷酸糖中间体——我们开发了一种按细胞量归一化的多次脉冲补料策略，在显著拓宽 VRC01 C−/GT+ 细胞中调控范围的同时，抑制了非糖基化和 Man5 糖型的形成。在采用 Ambr® 250 的补料分批工艺中，
该策略以约低十倍的 2FG 用量实现了相当的半乳糖基化降低效果，表明补料后分泌的 mAb 比例是决定控制策略效率的关键因素。在由此产生的糖型范围内，生物层干涉测量确定 Fc β4-半乳糖基化是与 FcγRIIIA（CD16a）结合亲和力相关性最强的指标（R² = 0.92）。综上，这些发现确立了代谢与细胞糖工程相结合的平台，可在较宽范围内控制 mAb 半乳糖基化，并有望微调其下游药理活性。
利益冲突声明
作者声明存在以下利益冲突：Ioscani Jimenez del Val 持有 GlyvantisBio Ltd（https://glyvantisbio.com/）的股份。该公司将本研究中使用的 C-/GT+ 糖工程技术商业化。已提交一项涵盖 C-/GT+ 技术的专利申请（PCT/EP2021/072287）。其余作者声明不存在利益冲突。
已声明的资助方信息
Taighde Éireann - Research Ireland，
，12/RC/2275_P2 SSPC
Irish Research Council，
，GOIPG/2015/3863
版权
本预印本的版权持有人为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示该预印本的许可。
本预印本依据
CC-BY 4.0 International 许可
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发布于 2026 年 9 月 28 日。
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2026.09.26.754714；
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关键词：单克隆抗体 · Fc糖基化 · β1,4-半乳糖基化 · 细胞糖工程 · 代谢工程 · CHO细胞
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.26.754714v1?rss=1