- 8 次围观
体积成像在神经科学等领域日益重要，因为结构量化和特征图谱绘制本质上都是三维问题。块面连续双光子断层成像（STPT）已成为实现高分辨率全器官体积成像的有力方法。STPT 无需复杂的样品制备，并兼顾图像质量、成像速度和可扩展性。然而，STPT 的应用仍较为小众，部分原因在于缺乏灵活、通用的控制软件。在此，我们介绍 BakingTray，这是一个在 ScanImage 基础上扩展开发的开源 STPT 软件平台。BakingTray 的模块化框架可适配多种硬件配置，使用户能够构建符合自身需求的定制系统。自 2016 年以来，全球已建成 12 套此类系统，我们将其称为 BrainSaws，目前还有更多系统正在建设中；这些系统迄今已为 35 篇研究论文提供支持。仅塞恩斯伯里韦尔科姆中心的三套系统，就已在一个繁忙的多用户共享设施中完成了超过 7,000 个样品的成像采集。我们展示了该平台在神经科学核心应用中的表现，包括电极轨迹定位、全脑细胞计数和群体神经投射图谱绘制。此外，我们还绘制了腹侧外膝状体中抑制性神经元的细胞类型特异性突触输出图谱，并结合整体染色，绘制了阿尔茨海默病小鼠模型的全脑淀粉样斑块分布图谱。对于需要定制化体积成像解决方案的研究团队或共享设施而言，BakingTray 是一个成熟的平台，既可用于新建系统，也可用于以较低成本改造现有双光子显微镜。
3
光学与生物科学实验室，巴黎综合理工学院、法国国家科学研究中心、法国国家健康与医学研究院、巴黎理工学院
，帕莱索，
法国
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Hugo Blanc
3
光学与生物科学实验室，巴黎综合理工学院、法国国家科学研究中心、法国国家健康与医学研究院、巴黎理工学院
，帕莱索，
法国
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Antonin Blot
2
弗朗西斯·克里克研究所
，伦敦，
英国
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Juan Carlos Boffi
2
弗朗西斯·克里克研究所
，伦敦，
英国
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Vincent Bonin
4
VIB 神经科学中心
，鲁汶，
比利时
5
生物系统系与鲁汶脑研究所
，比利时鲁汶大学，鲁汶，
比利时
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Howard HW Chan
6
香港大学
，香港
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Beverley Clark
7
伦敦大学学院医学院
，伦敦，
英国
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Georgios Foustoukos
8
洛桑大学
，洛桑，
瑞士
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Peter Gordon
1
伦敦大学学院，萨恩斯伯里·威康中心
，伦敦，
英国
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Del Halpin
1
伦敦大学学院塞恩斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Yunyun Han
9
华中科技大学
，武汉，
中国
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Michael Häusser
6
香港大学
，香港
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Sonja B Hofer
1
伦敦大学学院塞恩斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Friedrich W Johenning
10
柏林夏里特医学院
，柏林，
德国
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Stephan Junek
11
马克斯·普朗克脑科学研究所
，法兰克福，
德国
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Loukia Katsouri
1
伦敦大学学院塞恩斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Michael Krumin
7
伦敦大学学院医学部
，伦敦，
英国
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Pierre Mahou
3
光学与生物科学实验室、巴黎综合理工学院、法国国家科学研究中心，
INSERM，巴黎综合理工学院
，帕莱索，
法国
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Troy W Margrie
1
伦敦大学学院，桑斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Adrien Philippon
12
imec，鲁汶，
比利时
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Viktor M Plattner
1
伦敦大学学院，桑斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Claudio Polisseni
13
马克斯·普朗克研究所
，慕尼黑，
德国
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Solène Prudhomme
3
光学与生物科学实验室，巴黎综合理工学院、法国国家科学研究中心、法国国家健康与医学研究院、巴黎综合理工学院
，帕莱索，
法国
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Rajeev Rajendran
14
荷兰神经科学研究所
，阿姆斯特丹，
荷兰
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Simon Townsend
1
伦敦大学学院，桑斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Nicole Vissers
1
伦敦大学学院，桑斯伯里-威康中心
，伦敦，
英国
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Florian Vollrath
11
马克斯·普朗克脑研究所，法兰克福，
德国
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Simon Weiler
1
伦敦大学学院，桑斯伯里—威康中心，伦敦，
英国
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摘要
体积成像在神经科学等领域日益重要，因为结构定量和特征绘制本质上都是三维问题。块面连续双光子断层成像（STPT）已成为一种强有力的方法，可用于高分辨率的全器官体积成像。STPT 无需复杂的样品制备，并兼顾图像质量、成像速度和可扩展性。然而，STPT 仍属小众技术，部分原因在于缺乏灵活的通用控制软件。在此，我们介绍 BakingTray，这是一款面向 STPT、扩展了 ScanImage 功能的开源软件平台。其模块化框架兼容多种硬件配置，用户可据此构建满足自身需求的系统。自2016年以来，全球已建成12套此类系统，我们称之为“BrainSaws”；目前还有更多系统正在建设中。这些系统迄今已为35篇研究论文作出贡献。仅桑斯伯里—威康中心的三套系统，就已在繁忙的多用户设施中采集了逾7,000个样本。我们展示了该平台在神经科学核心应用中的表现：电极轨迹定位、全脑细胞计数和整体投射图谱绘制。除此之外，我们还绘制了腹外侧膝状体中抑制性神经元的细胞类型特异性突触输出
细胞核，以及通过整体染色对阿尔茨海默病小鼠模型全脑范围内的淀粉样斑块进行成像。BakingTray 是一个成熟的平台，适用于需要定制体积成像解决方案的团队或设施，无论是从头搭建，还是以较低成本由现有双光子显微镜改造而成。
1 引言
1.1 体积成像
现代解剖学越来越依赖于将样本配准至三维参考图谱，以便自动勾画结构，并在共同坐标空间中比较不同动物的结果（Osten and Margrie 2013；Tyson and Margrie 2022）。如果将样本作为完整体积进行成像，配准就会简单得多，因为各平面之间的几何关系得以保留。将样本切成薄片并安装在载玻片上会破坏这种关系，因为各薄片会独立变形，甚至可能受损。将这类数据集与三维图谱对齐并非易事（Puchades et al. 2019；Puchades et al. 2025）。体积成像可绕开这一问题，但对于小鼠脑等较大的结构，技术上仍然颇具挑战；目前还没有一种方案能够适用于所有类型的样本。
通过光学透明化使组织透明（Richardson and Lichtman 2015），随后使用光片显微镜成像（Stelzer et al. 2021），是体积成像的一种常用方法。该流程无需缓慢的手工切片，并且兼容抗体标记（例如 Renier et al. 2014）。透明化还可选择与组织膨胀相结合（Chen, Tillberg, and Boyden 2015）；若再配合专为该技术设计的显微镜，效果尤为显著（Glaser et al. 2025）。然而，透明化可能耗时较长，并且需要大量的…
要获得最佳结果，需要专业技能。连续切片技术提供了一种替代方案，尤其适用于无需进行整体标记的样本。
1.2 连续切片显微成像
连续切片成像技术无需对样本进行透明化处理，因为样本会被切片或铣削，成像时仅观察暴露的表面。切片通常会被丢弃；由于样本块近似刚性，只需将图像简单地“堆叠”起来，即可生成三维体积图像。连续切片技术易于扩展：可将多个样本排列成网格并同时处理，而人工劳动时间只需略有增加。早期系统（图1—图补充材料1）采用体视成像（入射光成像），采集经树脂包埋（Odgaard et al. 1990；Ewald et al. 2002）、石蜡包埋（Weninger et al. 1998；Weninger and Mohun 2002；Weninger et al. 2006）或冷冻切片（Spitzer et al. 1996；Zhang et al. 2003；Roy et al. 2009）制备样本的块面图像。同样的方法也适用于电子显微镜（Leighton 1981；Soto et al. 1994；Denk and Horstmann 2004；Kasthuri et al. 2015）。在刀刃扫描显微镜中，样本在切割过程中成像，而切片则位于刀片上方（Mayerich, Abbott, and McCormick 2008；Pesavento et al. 2017）。因此，物理切片厚度决定了有效光学切片厚度：采用常规明场显微镜（Li, Gong, et al. 2010）或荧光显微镜（Gong et al. 2013），即可对薄至1 µm的切片成像，无需复杂的光学切片技术。要可靠地切割出这种厚度的切片，需要使用石蜡或树脂包埋制备的硬质样本块。然而，这类包埋耗时较长，并且根据所采用的方案，可能会淬灭
荧光蛋白。因此，需要开发基于真正光学切片、且组织处理最少的替代性连续切片方法。
1.3 具有光学切片能力的块面成像
琼脂糖包埋的固定组织易于制备，通常也适合用振动切片机切片，但所得切片相对较厚且易变形，因此不适用于刀口成像。要对琼脂糖包埋样品进行高分辨率成像，需要使用具备固有光学切片能力的显微镜。这可以通过多种方式实现，例如连续切片光片成像（Narasimhan 等，2017；Yang 等，2018），以及基于紫外激发落射荧光显微镜的系统（Kolluru 等，2022；Yu 等，2022）。共聚焦方法也已得到应用，相关系统采用了转盘式（Seiriki 等，2017；Seiriki 等，2019）和狭缝式共聚焦技术（Deng 等，2022；该研究使用了冷冻切片机）。尽管这些共聚焦技术在光学切片方面表现出色，但用于块面成像时，其代价是成像深度较浅，而且散射和针孔串扰可能导致对比度较低。
与共聚焦显微镜相比，双光子显微镜能够对散射组织进行更深层的成像（Denk、Strickler 和 Webb，1990）；在块面成像系统中，它只需达到表面以下 50–100 µm（略大于一个切片的厚度），因此即使是致密器官或大型样本也仍可成像。因此，双光子显微镜已应用于多种连续切片块面成像系统。最早的此类系统通过激光消融（Tsai 等，2003）或铣削（Ragan 等，2007）去除成像后的组织。然而，与切片相比，这些过程的破坏性更强，也更难操作。
当代连续切片双光子断层成像（STPT，图1）显微镜采用振动切片机，已有多种实现方案，包括线性扫描器（Ragan 等，2012）、声光偏转器（Zheng 等，2013）、共振扫描器（Economo 等，2016）和多焦点扫描（Chen 等，2020）。以 STPT 为代表的基于扫描器的成像方法可同时采集多个通道，且不会遇到转盘共聚焦等多相机成像方法固有的对准问题。常规 STPT 系统可轻松处理三种同时成像的荧光团；专用系统则通过合并两台激光器发出的脉冲产生三色双光子激发，从而激发更多种类的荧光团（Abdeladim 等，2019）。STPT 已应用于多个领域，包括癌症生物学（Grauel 等，2020；Taranda 等，2021）和免疫学（Li 等，2021；Li 等，2024）。尤其是，它彻底改变了神经科学领域：该技术被用于构建艾伦小鼠脑图谱（Wang 等，2020），并与相关技术（Gong 等，2013；Gong 等，2016；Gao 等，2022）一道，开创了小鼠全脑范围的单轴突追踪研究（Han 等，2018；Winnubst 等，2019）。
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图1.
块面连续切片成像流程。
STPT 系统利用与振动切片机耦合的双光子显微镜，对经固定并以琼脂糖包埋的样本进行切片和成像。切片刀和物镜的位置固定，不过在成像过程中，物镜可借助压电调焦器采集小范围的 z 轴层扫图像。
步骤1。在此例中，四个脑组织样本包埋于琼脂糖中，琼脂糖块粘接在载玻片上。
步骤2。载玻片被夹持在装有磷酸盐缓冲液的水浴槽中；水浴槽由一个三轴位移台承载。该位移台可提供
进行图块扫描，并将样品驱动送入振动切片机进行切片。样品通过双光子显微镜成像。
步骤3
系统对块面处样品暴露的表面进行图块扫描。图像采集完成后，对样品进行切片。切割循环首先将样品提升一个实体切片的厚度，以低速将其送入振动刀片，随后将其送回成像位置。切下的切片沉降到腔室底部并被弃置。随后，在暴露的块面上重新进行图块扫描，并重复这一循环，直至整个器官完成成像。
步骤4
采集结束后，将数据拼接并组装成三维体积图像。所得数据可以采用自动化方法进行分析，并将结果显示在统一的坐标空间中。另请参见：连续切片方法的历史时间线见图1—图补充材料1。
1.4 BakingTray
尽管具有重要影响，STPT 目前仍局限于相对较少的实验室。商业仪器成本高昂，而且可能无法提供所需的功能，这促使一些研究团队自行构建系统。希望自行搭建系统的研究人员可以参考已发表的硬件设计，包括 Teravoxel 项目的设计方案（Economo 等，2016），以及 Seiriki 等（2019）在旋转盘方法论文中提供的出色硬件说明。然而，控制软件的发展相对滞后：Teravoxel 项目提供了用于运行 STPT 的 C++ 软件包 fetch，但该软件是围绕该仪器特有的数字化仪和运动控制硬件编写的，自2015年以来一直未更新。其 MouseLight 分支最后一次更新是在2020年，但仍然依赖特定硬件。在此，我们介绍 BakingTray，据我们
据我们所知，BakingTray 是唯一一款不依赖特定硬件且持续维护的 STPT 控制平台。它通过 API 扩展了广受欢迎的双光子图像采集软件 ScanImage（Pologruto, Sabatini, and Svoboda 2003），新增了拼接扫描、自动样本检测、切片以及样本设置任务自动化等功能。此外，用户可以根据自身需求和预算构建定制系统，而不必采用固定设计。我们将任何运行 BakingTray 的 STPT 系统称为“BrainSaw”。
我们展示了 BakingTray 是一个成熟、可靠的平台，可用于多种样本的三维成像。它尤其适用于神经科学中的三项关键应用：电极轨迹定位、全脑细胞计数和大规模投射图谱绘制。我们还展示了双颜色全脑细胞计数，探究了腹外侧膝状体（vLGN）多种抑制性细胞类型的投射和突触位点，并展示了阿尔茨海默病小鼠模型中全脑淀粉样斑块染色。BakingTray 使研究团队和核心设施都能开展全器官自动化、高通量体积成像；尤其是在可改造利用现有双光子显微镜的情况下，它具有很高的成本效益。
2 结果
2.1 设计概述
BakingTray 是一款基于 ScanImage 构建的通用型 STPT 软件解决方案。ScanImage 负责图像采集、激光功率控制和光电倍增管（PMT）控制；BakingTray 则负责设置成像参数、拼接扫描、切片和自动样本检测。BakingTray 通过 ScanImage 支持最多四个探测器通道和多条激光线的图像采集。
BakingTray 不受特定硬件配置的限制。该软件可扩展以纳入新的硬件组件（载物台、激光器、振动切片机
控制器等），而且代码有详尽的文档说明，便于开展上述工作。核心采集类不包含任何特定于硬件的命令：相反，每类硬件均由一个抽象类表示，该抽象类声明了简洁且有文档说明的接口。支持新设备只需编写一个实现该接口的类（补充表1）。为便于开发，模拟模式使BakingTray能够在没有任何硬件的情况下运行（例如，参见文档页面上的视频）。目前支持的硬件列于补充表2。BakingTray的模块化特性使得用户能够以约30,000欧元的成本，将现有的共振扫描双光子显微镜改造为STPT系统（见附录1），或升级旧款TissueCyte 1000系统（附录2）。
2.2 BakingTray已具备生产就绪状态且运行稳定
全球已建成12台BrainSaw（补充表3），并为35篇论文作出了贡献（补充表4）。我们估计，约有40个研究团队已使用BakingTray发表论文，或正在积极使用该系统。
为量化系统通量和可靠性，我们从本中心的存储平台抓取数据，对Sainsbury Wellcome Centre（SWC）三套BrainSaw系统的历史采集日志文件进行了分析（方法部分4.3节）。该中心最初只有一台显微镜；2019年增添了第二台，2021年又增添了第三台。我们发现，共有7,090个样本在3,251次独立采集中成像；其中约一半的采集（1,676次）包含两个或更多样本，678次包含四个或更多样本（图2A和B），这反映出常规采用多样本运行以提高通量。以约2和4 µm/像素进行的采集最为常见（图2C），因为这些是
我们针对主要应用场景推荐的分辨率（见结果部分2.6）。
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图2.
SWC三台显微镜的采集通量和可靠性。2018年之前的数据由现位于SWC的一台显微镜在其迁至SWC之前采集。图表显示截至2026年7月中旬的数据。
A. 折线表示成像样本累计数量随时间的变化（左轴）。灰色柱表示每年成像样本的总数（右轴）。
B. BakingTray支持每次采集处理多个样本。此面板显示单次采集中成像样本数量的分布，例如，有139次采集中成像了6个或更多样本。
C. 这些采集所采用的横向（X/Y）像素尺寸。细胞计数建议采用约2 µm/像素；绘制电极轨迹和纤维轨迹图建议采用4–8 µm/像素（补充表5）。
D. 有211次采集因某种原因重新启动（采集不超过5个切片后重启的情况反映的是设置错误，未计入；见方法）。其中53次是用户手动中止采集后重新启动；34次是采集按计划停止后又重新启动；39次是BakingTray因报告激光器未运行而停止采集。其余85次采集因未知原因停止，随后重新启动。
E. 按年份细分重启次数。因激光器问题导致的重启以高亮显示；这些情况更可能是由串行通信协议中的一个错误所致（已于2026年修复），而非激光器本身确有故障。
F. 采集停止至重新启动之间的时间。此处未纳入“用户中止”后重启的数据，因为这类采集通常会立即重新启动。
G. 显示了
一种失效时间指标：每年每次非计划重启对应的采集次数。
H
. 将 G 中的数据重新表示为每次非计划重启对应的采集小时数。
I
. 各年度的重启率。用户发起的重启发生在用户请求停止或 BakingTray 按设计停止之后（手动中止、达到指定切片数量或未发现组织）。非计划重启发生在错误导致的强制停止之后，例如激光器故障、MATLAB 严重崩溃或断电。2016—2019 年的采集次数较少，因此这些年份的重启率可靠性较低，且当时 BakingTray 的开发工作也更为密集。
样本设置很快，但采集本身需要持续数小时，往往直至深夜。因此，BakingTray 必须运行稳定，无需过多干预即可成功完成采集。我们进一步挖掘存储平台上的日志数据，以评估其可靠性。采集元数据文件不仅记录分辨率和样本数量，还记录采集耗时，以及采集是否被手动中止、重启或因其他原因未按预期结束。在这 3,251 次独立采集中，94.5% 无需重启即可完成；其余 180 次中断的采集（5.5%）共重启了 211 次（
图 2D
），原因分为两类：用户请求停止或 BakingTray 按设计停止（87 次；用户发起），以及真正的故障（124 次；非计划）。采集开始后五张切片以内发生的重启未计入上述统计。这类重启极有可能与用户操作错误有关，并不能反映系统可靠性。
这 87 次用户发起的重启分为两类。其中 53 次是用户
手动
中止了采集
并重新启动采集，例如更改成像设置或纠正样本安装问题。在34例中，采集正常结束且未发生错误，但用户随后重新启动了采集。其原因包括用户设定的切片数量过少，或BakingTray无法找到组织，因而出于安全考虑停止采集。先前切下的切片若漂浮在物镜与样本之间，也可能触发此类安全停机。
采集因错误而提前停止的情况共发生124次。其中，39次故障与激光器有关；这些故障更可能是由一个现已修复的软件缺陷导致的串行通信中断，而非真正的激光器故障（图2E）。最后，还有85次采集突然停止且未记录任何错误，但随后被重新启动。这些情况包括停电、MATLAB随机发生的严重崩溃、极少见的ScanImage图像帧记录错误，以及尽管已将更新策略设置为禁止无人值守重启，Windows更新仍执行了重启。在大多数情况下，采集在不到一小时内便得以恢复（图2F），部分原因在于采集提前结束时会通过Slack消息进行通知。自2020年以来，系统发生需要计划外重启的错误（即由激光器引起［n=24］或原因不明［n=69］）的频率一直相对稳定（图2I），约每34次采集中就有1次需要人工干预才能完成（图2G；2020—2026年各年度数值的平均值）。这相当于每470小时的采集时间需要进行一次重启干预（图2H；同样为各年度数值的平均值）；若每晚使用，则大约每月一次。
2.3 BakingTray用户体验
设置样本时，用户首先在主界面中定义样本ID、成像分辨率和切片厚度
BakingTray 窗口（图 3A），其中待采集通道在 ScanImage 中定义。BakingTray 的“Prepare”（准备）图形用户界面（GUI；图 3B）用于将组织块修切至起始深度，并检查切片的一致性（见附录 5）。“Acquisition”（采集）GUI（图 3C）允许用户执行快速、低分辨率的瓦片扫描，以评估图像质量、设置成像深度，并检查振动切片机刀片的对齐情况（见附录 4）。准备就绪后，用户执行“Auto-Thresh”（自动阈值分割；图 3C），以自动识别组织并为其匹配瓦片布局（见方法第 4.2 节），随后启动采集。每层组织成像完成后，显微镜系统便从组织块顶部切下一层；已完成成像的切片被移除并沉至水浴槽底部。每次切片后，系统都会自动重新检测组织边界，使成像区域随组织块表面样本形状的变化而调整。采集持续进行，直至达到所要求的切片数量或不再检测到组织；随后，激光器自动关闭，光电倍增管（PMT）增益设为零。BakingTray 与激光器通信（图 3D），设置激光波长，并在激光器失锁时自动停止采集。软件实施的安全保护措施（附录 3—表 1）及其他运行原理详见附录 3 和方法第 4.2 节。
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图 3.
展示 ScanImage 和 BakingTray 的采集界面截图。
截图展示了采集过程中软件的典型界面：灰色的 ScanImage 窗口位于左侧，黑色的 BakingTray 窗口（标记为 A–D）位于右侧。ScanImage 与 BakingTray 通过双向交互，提供一体化的用户体验。
ScanImage 未经修改，负责图像采集、激光功率控制、光电倍增管（PMT）控制、快速和粗略调焦以及通道选择。
A
. BakingTray 主窗口，用户可在此设置成像参数，如样本保存路径、图像分辨率、切片数量等。
B
. “Prepare”图形用户界面（GUI）用于在样本设置过程中交互式移动 XYZ 位移台，并负责样本的初始修整。
C
. “Acquisition”图形用户界面显示样本的实时预览，用于设置初始成像感兴趣区域（ROI），并在采集过程中于本地监控进度。
D
. “Laser”图形用户界面与激光器连接，使用户能够更改波长、控制快门开闭以及开启或关闭激光器。
设置是采集过程中唯一需要人工操作的阶段，耗时约 45 分钟；其余采集过程均自动完成，通量取决于所选的分辨率、帧平均次数及样本数量。对于较低分辨率的任务，例如绘制小鼠脑内的电极轨迹，24 小时内最多可对六个脑进行成像。对于较高分辨率的任务，例如小鼠脑内的细胞计数，在相同时间内最多可对四个脑进行成像，具体取决于所需的帧平均次数（
图 2—补充图 1
）。每个脑的采集时间约为 4–15 小时，取决于分辨率及同时成像的样本数量（
图 2—补充图 1C
）。我们常规使用的成像、切片和通量参数汇总于
补充表 5
。
将各个图块组装为拼接平面的工作由我们开发的 StitchIt 软件包完成（见方法
第 4.5 节
）。采集结束后，数据会自动进行拼接；在采集过程中，StitchIt 还会生成临时拼接预览，并将其流式传输至网站，从而允许
对采集过程进行远程监控。
2.4 用于体积成像的 BakingTray
BakingTray 能够对多种样本进行高质量三维成像，包括小鼠和大鼠脑、鸣禽脑，以及小鼠肾脏和脾脏（图 4、图 4—补充图 1、图 4—补充图 2 和图 4—补充图 3）。该方法适用于任何能够包埋于琼脂糖中、使用振动切片机平整切片并通过双光子显微镜成像的样本。STPT 可生成细胞分辨率的无缝三维数据集（图 4A、图 4—补充图 1 和图 4—补充图 2），并可在 780 nm 波长下同时激发三种荧光标记：tdTomato 或 mCherry、GFP 以及 BFP（图 4B）。固定组织在双光子激发下呈现丰富的自发荧光，因此无需额外染色即可进行无标记结构成像（包括二次谐波产生，图 4C）。自发荧光信号可用于自动配准至标准图谱，从而无需 DAPI 等专门用于显示细胞构筑的染色即可划定脑区，也可用于构建新图谱的模板（例如 Wang 等，2020；Gustison 等，2024；Sirmpilatze 等，2026）。我们使用 BrainGlobe 工具（brainglobe.info），但这些数据同样兼容其他图谱映射流程，例如 ANTsX（Tustison 等，2025）、D-LMBmap（Li、Shang 等，2023）和 BIRDS（Wang 等，2021）。我们通常对已通过转基因表达、病毒注射或染料标记电极在体内进行荧光标记的样本成像。
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图 4.
高质量体积成像。
A. 稀疏表达 mNeonGreen 的大鼠脑（黄色）；自发荧光以蓝色显示。右：100 μm 厚的最大强度投影，显示稀疏的
单个浦肯野细胞的标记。数据来自 Chen 等人（2023）：通过全身性 AAV 注射实现 mNeonGreen 表达。B. 小鼠脑的四个光学平面；通过三次 AAV 注射对初级视觉皮层第 5 层神经元进行标记，在 780 nm 激发波长下对 mCherry、GFP 和 BFP 成像。插图以更高分辨率显示方框标示区域。C. 采用稀疏 Confetti 标记的小鼠脾脏。左上方为该器官的三维视图，其旁为一张代表性的二维切片。右侧显示该切片的局部细节。白髓的自发荧光较强，在三维图中呈黄色。血管壁中的胶原可高效产生二次谐波，在用于双光子成像的同一束 930 nm 飞秒脉冲激发下产生蓝色光子（约 460 nm）。
2.5 整体标记组织的 STPT 成像
对于未进行体内标记的靶标，如内源性蛋白或疾病病理改变，可在 STPT 成像前进行整体染色。我们展示了两个原理验证示例：抗体染色和组织学染料染色。图 5A–C 展示了使用偶联远红色荧光染料 Vio667 的抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体进行的标记。远红色荧光蛋白的使用相对较少，因此，在配备远红色通道的成像系统上，Vio667 染色可作为遗传编码标记或体内标记的补充，而不占用这些标记的检测通道。正如预期，图 5A 中的水平面主要显示纹状体内密集的 TH 阳性轴突末梢。投射至纹状体的中脑多巴胺能核团在图像顶部可见，并在矢状面切面（图 5B）中再次呈现。冠状面（图 5C）位于黑质致密部所在层面。标记对比度高，具有良好的
渗透性和均一性良好，且组织周缘未出现非特异性标记环带。
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图5.
整体标记。
A. 使用偶联Vio667的抗酪氨酸羟化酶（TH）一抗进行标记。水平面视图由各向同性降采样至25 µm/体素的图像堆栈经重切片获得。自发荧光通道（绿色）以灰度显示，显示Vio667信号的远红光通道以红色显示。箭头指示切片伪影，其产生原因是通透化后的组织比通常的脑组织更柔软。
B. 同A，但为矢状面视图。
C. 冠状面视图，为便于显示，将原始数据从2.2 µm/像素降采样至4.4 µm/像素。远红光通道的自发荧光极少，因此使用Fiji的“去斑点”滤波器进行处理，以消除散粒噪声。
D. 使用刚果红标记半脑中的淀粉样斑块。该矢状面视图由各向同性降采样至10 µm/体素的图像堆栈经重切片获得（原始像素间距：2.0 × 2.0 × 5 µm）。自发荧光通道（蓝色）以灰度显示，并叠加包含刚果红标记的红色信号通道。
E. 从D中所示的同一10 µm/体素图像堆栈获得的冠状切面。可见大量斑块标记。插图显示采用相同方式处理并使用相似查找表显示的对照脑。该脑中未见斑块标记。所有比例尺均为1 mm。
为实现整体抗体标记，采用EZ Clear对脑组织进行脱脂（Hsu等，2022），并采用iDISCO方法进行标记（Renier等，2014）。完整方案耗时约两周，详见附录6。经此处理后，组织变得更柔软，因此更难以均匀切片。图5A中的箭头指示切片伪影。
这是由组织相对于琼脂糖块的移动所致；其他面板中也可见同样的现象。该脑组织采用我们的标准切片方案进行切割，而该方案并未针对这种较软的组织进行调整。因此，降低切割速度、使用更软的琼脂糖，以及用明胶增强组织的硬度（见附录7），可能会有所帮助。另一种方法是采用iDISCO脱脂方案，该方案可使脑组织更加坚实，切片也更为可靠。
淀粉样斑块是阿尔茨海默病（AD）的标志性病理特征，可用刚果红染色。为缩短标记时间，我们对半脑进行了处理。染色前，使用CUBIC-L对组织进行脱脂，整个流程耗时略少于两周（附录7）。我们对两组老龄（22月龄）小鼠进行了标记：App^NL-G-F敲入小鼠（Saito等，2014），其携带的人源化基因含有与家族性AD相关的突变；以及App^hu/hu小鼠（Serneels等，2020），作为月龄匹配的对照，其携带的人源化基因不含这些突变。此处展示了每组各一只小鼠；这些动物属于一项比较人源化AD模型的大型行为学研究的一部分（论文准备中）。图5D和E展示了一个经标记的App^NL-G-F脑组织示例；斑块（红色）数量众多，遍布全脑，且易于与背景自发荧光（灰色）区分。月龄匹配的对照（图5E插图）未见斑块标记。斑块也可使用methoxy-X04进行活体标记（Klunk等，2002），此类脑组织可直接进入STPT流程，无需死后染色步骤（例如Whitesell等，2019；Oblak等，2021）。
尽管BrainSaw兼容整体标记，但由于制备时间显著延长，且较软组织的切片存在困难，因此STPT最适用于经活体标记的组织。
2.6 主要
应用场景
我们对使用 BakingTray 的 35 篇出版物（补充表 4）进行了分类，以确定该方法最常见的应用场景。BakingTray 最常用于定位染料标记的电极轨迹（13 篇）或光纤轨迹（2 篇）。10 篇出版物进行了全脑细胞计数，另有研究对整体投射（5 篇）和损毁灶（1 篇）进行了定位。其余应用场景大多与方法学相关，例如图谱生成、AAV 表达筛查或硬件开发。下文将展示三种最常见的应用。
应用场景——电极轨迹
用于在体记录的电极会蘸取亲脂性染料（如 CM-DiI），电极撤出后，染料仍残留在组织中。对动物进行灌流后，使用 STPT 对脑进行成像，以精确定位染料轨迹。我们以较低分辨率对这类样本进行成像（通常为 4 × 4 × 20 μm/体素；小鼠脑每个通道的数据量约为 6 GB），且通常在单次采集中处理 4–6 个样本。随后可追踪电极轨迹，并将脑配准至标准图谱（图 6A）。这能够客观地确定电极轨迹在解剖空间中的位置，并使研究人员能够在同一标准空间中叠加不同轨迹的位置。国际脑实验室已大规模开展此类工作（Int. Brain Lab. 等，2025，图 6A、B），利用 BrainSaw 对 139 只小鼠中 699 次 Neuropixels 探针插入的位置进行了定位。
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图 6.
主要应用场景。
本图展示了 BakingTray 三种最常见应用场景所对应的原始数据示例。
A. 含有 DiI 标记电极轨迹的单个脑的原始数据。左侧展示了全脑的三维视图，以及一个
右侧显示了包含电极轨迹并已配准至 Allen 小鼠脑图谱的切片。A 中的数据来自一只纳入 IBL 全脑图谱（IBL Brain-Wide Map）项目的动物（Int. Brain Lab. et al. 2025）。B 显示了在图谱空间中叠加的全部 699 条电极轨迹。C. 用于细胞计数实验、以 2 × 2 µm/像素分辨率成像的切片局部细节。表达核靶向 H2B-tdTomato 的细胞（红色）将通过 cellfinder 流水线进行自动计数。另一个神经元群体中由 eGFP 填充的神经突起以绿色显示。此图旨在让读者了解高质量、可直接用于 cellfinder 分析的数据集应呈现何种图像效果。D. 来自不同动物的已定位神经元坐标（红色和蓝色）可在图谱空间中叠加并进行联合分析，改编自 Tyson and Margrie 2022 的图 1。E. 小鼠脑的三个正交视图，显示两处大体积病毒注射所诱导的 eGFP（青色）和 mCherry（品红色）表达。重叠区域呈白色。图像来自采集结束时生成的各向同性 25 µm/体素降采样图像堆栈。该分辨率通常足以对此类数据进行定量分析。授权：B 图改编自 Int. Brain Lab. et al. 2025 的图 2A，D 图改编自 Tyson and Margrie 2022 的图 1。两篇文章均依据 CC BY 4.0 许可协议发表。
应用场景——细胞计数
STPT 数据集使用户能够利用自动化流水线，对全脑标记细胞的数量及分布进行定量分析。在此应用中，脑组织以 2 × 2 × 5 µm/体素的分辨率成像（切片厚度为 40 µm，包含八个光学平面）。在这些较高分辨率下，24 小时内可完成 2–4 个脑的成像，所生成的数据量约为每个小鼠脑、每个通道 120 GB。
图
图6C展示了此类采集数据中某一单层面的局部细节；其中一群神经元表达核靶向tdTomato（红色），另一群则由eGFP填充标记（绿色）。BrainGlobe工具cellfinder（Tyson等，2021）可用于对全脑所有标记细胞进行计数，并在图谱空间中显示这些细胞（图6D）。只要有合适的参考图谱，同一流程也适用于其他物种：我们对经全身性AAV注射进行稀疏标记的大鼠脑（如图4A所示）运行了cellfinder，并将检测到的细胞配准至大鼠脑图谱（图6—补充图1）。更多细胞计数数据见下文结果部分第2.7节。
应用案例——群体投射
无需追踪单根轴突，即可绘制标记神经元群体的投射图谱。单细胞轴突追踪耗时较长，且需要体量极大的数据集（通常为5–30 TB），因此仅在科学问题确有需要时才适用（见讨论部分第3.2节）。群体标记数据的采集分辨率约为4 × 4 × 20 μm/体素至2 × 2 × 20 μm/体素（每个小鼠脑的每个通道约为6–24 GB）。仅通过对表达信号进行阈值分割，即可确定投射位置。图6E展示了一个包含两次病毒注射的示例；数据以25 μm各向同性体素的三个正交视图呈现。即使如此低的分辨率，也足以用于此类数据的定量分析，从而加快分析速度（例如，参见Esmaeili等，2022，图5；El-Boustani等，2020，图1）。
2.7 双色细胞计数
在同一动物中标记两个神经元群体，可消除动物个体间的变异，从而最有效地比较两个脑区的全脑输入。在此，我们证明，可以对使用BrainSaw成像的同一脑内两种不同标记的神经元群体进行计数。我们
采用携带核靶向荧光标记的逆行病毒载体 rAAV2-retro-EF1a-H2B-eGFP 和 rAAV2-retro-EF1a-H2B-tdTomato 进行示踪（Tervo 等，2016；Weiler、Teichert 和 Margrie，2025），沿小鼠初级视觉皮层的内外侧轴在相邻位置注射这两种载体（图 7A、B）。tdTomato 和 eGFP 通常可在约 920–950 nm 的单一波长下同时得到良好激发（图 7—补充图 1A），即使在该波长范围的短波端，也常可观察到丰富的 tdTomato 信号（图 4—补充图 1 和图 4—补充图 2）。不过，也可选择增加一条约 1030–1090 nm 的激光光路，以增强 tdTomato 信号。在这一预实验数据集中，我们将一束 1064 nm 激光与系统的主可调谐激光共轴对准，并将主激光波长设为 920 nm，同时进行扫描，以展示多波长成像。随后，我们使用 cellfinder 进行双色细胞检测（图 7C、D），成功排除了强 eGFP 发射信号串入相邻红色通道所造成的假阳性信号（图 7—补充图 1B）。通过这一方法，我们得以可视化呈现投射至初级视觉皮层内两个相邻位点的不同脑区中，逆行标记神经元细胞核的拓扑分布及其相对比例（图 7E、F）。
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图 7.
双色细胞核逆行全脑示踪。
A. 双色病毒示踪方法示意图。待病毒表达后，使用 STPT 对全脑进行切片，并在 920 和 1064 nm 波长下同步成像。
B. 图谱到样本的配准。在原始双光子图像上叠加基于艾伦小鼠脑共同坐标框架的脑区分割边界，显示注射位点以及 retro-GFP（青色）和 retro-tdTom（品红色）标记的细胞核
细胞。
C
. B中标示区域的放大图，显示VISl区及其邻近区域中经retro-tdTom+和retro-GFP+标记的细胞核（左），以及使用cellfinder自动检测到的retro-GFP+（中）和retro-tdTom+（右）细胞核。
D
. C中标示区域的放大图，展示tdTom+通道（左）、GFP+通道（中）及两个通道的叠加图（右），并标示检测到的细胞核。白色箭头指示强GFP+信号串入tdTom+通道的现象，但该信号并未被错误地检测为tdTom+细胞核。
E
. 将检测到的逆行标记细胞核通过形变配准映射至双侧大脑半球三维渲染空间后的可视化结果。注意，此处仅显示细胞核计数最高的十个脑区。
F
. 条形图展示E中所示十个脑区在同侧和对侧半球中的归一化细胞计数占比。各脑区按retro-GFP+细胞核的计数占比排序。
2.8 全脑突触位点图谱绘制
利用细胞质荧光蛋白进行示踪可揭示神经元轴突的分布范围，但无法确定其可能形成突触接触的位置。推定突触位点的位置可通过荧光标记方法揭示，例如表达突触素-eGFP（Li, Tasic, et al. 2010）。与轴突群体示踪（图6E）类似，STPT可用于绘制突触素-eGFP的分布图谱，而无需采用极高的放大倍数（此处使用的体素尺寸为2 × 2 × 5 μm），也无需对单个末梢进行计数。由此，可以中等分辨率采集全脑数据，同时获取轴突投射模式和推定突触输出的分布，并将数据配准至共同的图谱空间。我们在腹侧外侧膝状核中对此进行展示
（vLGN），这是一个前丘脑核团，包含至少18种抑制性神经元细胞类型（Stebbins et al. 2026），这些细胞在全脑范围内形成长程投射。尽管此前已对vLGN的轴突分布进行过绘制（Moore, Weis, and Moga 2000；Fratzl et al. 2021；Salay and Huberman 2021；Li, Peng, et al. 2023；Mederos et al. 2025），但尚未按细胞类型进行细分，也未评估推定突触位点的位置。因此，vLGN是展示这种突触标记方法优势的理想靶区。本文采用描述性方式进行展示，每个驱动品系使用一只动物；定量分析不在本文的研究范围内。
我们使用AAV[2/1]-hSyn-DIO-tdTomato-Synaptophysin-eGFP病毒标记神经元，使tdTomato充盈胞体、树突和轴突，同时利用突触素-eGFP标记推定的突触前末梢（图8A；方法第4.4节）。该病毒具有Cre依赖性，因此我们能够利用Cre驱动品系，将其表达靶向特定细胞类型：囊泡GABA转运蛋白（vgat）、小清蛋白（PV）、前脑啡肽原（Penk）和生长抑素（SOM）。我们展示了各驱动品系的代表性图像，以说明如何联合绘制轴突和推定突触位点的分布（图8）。在所有情况下，我们均使用BrainGlobe工具将数据配准至增强统一小鼠脑图谱（Chon et al. 2019），从而能够依据客观界定的脑区边界比较突触输出模式（图8B、C）。
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图8.
全脑突触分布绘制。
A. 向vLGN注射Cre依赖性病毒，使tdTomato充盈神经元，并利用突触素-eGFP标记突触前末梢。
B. 图谱与样本的配准。叠加显示的原始双光子图像
脑区分割边界依据增强与统一小鼠脑图谱绘制，显示了腹侧外膝体核（vLGN）内的注射部位，以及由 tdTomato（品红色）标记的胞体和轴突及由 eGFP（青色）标记的突触前末梢。比例尺为 500 μm。
C. 同 B，但显示上丘（SC）内的投射和推定的突触前末梢。比例尺为 500 μm。
D–G. 通过病毒在 vLGN 的 vgat、PV、Penk 和 SOM 神经元中的表达，显示丘脑外侧后核（LP）前部区域的局部及长程投射。比例尺为 500 μm。
H–K. 同 D–G，但显示 LP 后部区域。
L–O. 至 SC 的长程投射。比例尺为 500 μm。
P–S. vLGN 内的局部突触前标记。比例尺为 200 μm。来自单只动物的更多图像见图 8–补充图 1。
缩写：
APN，顶盖前前核；dLGN，背侧外膝体核；dSC，上丘深层；iSC，上丘中间层；LP，丘脑外侧后核；SC，上丘；sSC，上丘浅层；vLGN，腹侧外膝体核。
我们的数据清晰展示了轴突仅穿行而过的区域与存在推定突触接触的区域之间的区别（例如，图 8H、I 及图 8–补充图 1）。不同抑制性细胞类别在同侧丘脑和顶盖前区的投射模式存在差异（图 8D–K）。表达 vgat 的 GABA 能神经元总体在多个丘脑核团和顶盖前核团中形成推定的突触位点，尤其是在顶盖前前核（APN）中；而 GABA 能神经元的亚型，如表达 PV 和 Penk 的神经元，似乎仅支配这些区域中的一部分。在上丘内
在上丘（SC）中，同样，表达 vgat、PV 和 Penk 的神经元均形成了推定的突触接触，但靶向不同的亚区（图 8L–O）。
数据的空间分辨率足以用于考察腹侧外侧膝状体（vLGN）内部的局部突触前标记。所有四种细胞类型中均可见局部突触素-eGFP 点状信号，但其在 vLGN 内的分布有所不同。vgat-Cre 小鼠的神经元表现出广泛的局部轴突标记，同时整个 vLGN 内均有密集的突触素-eGFP 点状信号，表明存在大量局部抑制性输出（图 8P）。其余三组的突触素-eGFP 点状信号分布各不相同（图 8Q–S），其中，表达 SOM 的神经元的点状信号和胞体位于最内侧。这些观察结果揭示了特定 vLGN 抑制性神经元亚型的局部及长程连接模式，并展示了 STPT 在单个脑内跨多个空间尺度研究突触组织结构的优势。
3 讨论
我们介绍了 BakingTray，这是一个完整的开源 STPT 采集平台，拥有稳定的用户群体，并已在实际应用中得到验证。本文重点介绍了软件及由此构建的系统在实际应用中的性能，因为软件是使 DIY 构建者群体能够开展 STPT 的关键因素。我们仅对硬件作简要描述，因为此前已有相关文献对其进行了记录（Ragan 等，2012；Zheng 等，2013；Economo 等，2016；Seiriki 等，2019），而且我们的 BrainSaw 系统并非采用单一设计。硬件的关键在于如何对成像平面、三轴位移台和振动切片机进行共同对准。我们在附录 4 中描述了这一过程，公开了详细展示相关关键特征的 CAD 图纸，并提供了在线文档以供
作为动态信息存储库。BakingTray 与 StitchIt（stitchit.swcmicroscopy.com）协同运行，后者在采集过程中执行各种预处理操作，并将图像瓦片拼接成完整的图像平面。BakingTray、StitchIt 和 BrainSaw 硬件共同构成了一个生态系统，实现了从采集到下游分析的串行双光子断层成像（STPT）流程。下文将结合相关背景讨论这些工具，重点探讨该方法的局限性以及本项目未来的发展方向。
3.1 基于 ScanImage 构建
开发之初需要作出的首个决策是：BakingTray 应自行采集图像，还是将这一任务交由其他软件完成。编写基本的扫描软件并不困难（例如 SimpleMScanner），但开发稳定、经过充分测试且支持广泛采集硬件的软件，则是一项规模大得多的工程。因此，BakingTray 基于已解决这一问题的 ScanImage 构建。这将项目范围限定为瓦片扫描、样品检测、切片以及流畅的用户体验。ScanImage 在 MATLAB 中运行，因此 BakingTray 也采用了 MATLAB。事实证明，这有利于软件的长期维护：MATLAB 各版本之间引入的破坏性变更极少，因此维护较为容易。
因此，BakingTray 依赖于两款商业产品：MATLAB 和 ScanImage。MATLAB 学术许可证的年费与 SWC 每年购买 BrainSaw 振动切片机刀片的支出大致相当。ScanImage 许可证的费用更高，但可获得专业技术支持，且费用远低于商业显微镜的维护服务合同。由于无论选择何种编程语言，底层硬件控制库（NI-DAQmx、PI 的运动控制 API 等）均为闭源，我们并未将 MATLAB 和 ScanImage 的专有性质视为一种限制。BakingTray 和 StitchIt 本身则以开源方式发布，所采用的许可证为
许可。
3.2 BrainSaw 的适用范围
我们使用 BakingTray 进行中等分辨率、高通量的体积成像，此类数据的主要使用者通常是自动化分析流程，而非人工观察者。BrainSaw 系统在适用于电极轨迹定位、胞体计数和整体投射图谱绘制的分辨率下表现出色，这些都是系统神经科学中的常规核心应用。在这些分辨率下，数据集的规模通常适中，单台显微镜即可在一夜之间完成多个样本的成像。这使得来自不同实验组的样本能够在相同条件下同时进行成像。
尽管利用 STPT（Zheng 等，2013；Han 等，2018；Winnubst 等，2019）和 BakingTray（Liu 等，2022）可以实现全脑单轴突追踪，但由于用户群体对此需求较少，我们尚未针对其所需的亚微米体素尺寸对平台进行优化。目前，专为单轴突追踪设计的系统，如 ExA-SPIM（Glaser 等，2025；Su 等，2026），可能是最佳选择。
尽管我们主要关注神经科学应用，STPT 也可用于其他结构的成像，例如脾脏（图 4C，Li 等，2021）、前列腺和肝脏（Taranda 等，2021）、肿瘤（Grauel 等，2020）以及肾脏（图 4—补充图 3）。任何能够用振动切片机良好切片的器官或结构，均可使用 BrainSaw 系统进行成像（参见新鲜胡萝卜，图 4—补充图 3C）。
3.3 系统可靠性
在结果部分第 2.2 节中，我们通过分析 SWC 的三套 BrainSaw 系统未能在无人值守的情况下完成采集的次数，对其可靠性进行了量化。可靠性数据仅采集自 SWC，因为这是唯一一个站点
在该平台上，我们可以便捷地获取大量数据。用户不太可能只是未将失败的采集任务上传至存储平台：恢复采集操作十分简单，而且用户没有理由丢弃部分完成的采集任务并损失数据。我们没有理由认为其他站点的可靠性有所不同，但有一个已知的例外：某个使用 Zaber 直线位移台进行拼接扫描的站点发现，这些位移台需要定期润滑（方法第 4.1 节），且容易发生卡滞，导致采集中止。
采集统计数据无法反映更隐蔽的错误，例如用户未正确设置样本，从而产生错误数据或质量不佳的数据。经验不足或时间紧迫的用户确实会犯错，这凸显了充分开展用户培训以及配备尽职的系统管理员或“超级用户”的必要性，后者还负责光路对准、校准和故障排查。为此，我们提供了详尽的文档和其他辅助资源。
3.4 谁适合搭建 BrainSaw？
BrainSaw 并非开箱即用的仪器。它需要搭建——或至少维护——一台高质量的双光子显微镜，其中涉及危险的 IV 类激光器的光路对准。整个 STPT 系统由许多相互作用的部件组成，需要定期检查与维护，才能长期无故障运行。需要专家监督维护并不罕见；许多光片显微镜及其他高端商用显微镜也是如此。
对于具备相应专业知识的人而言，BakingTray 不仅解决了关键的硬件控制问题，还提供了一套经过充分测试的采集流程，否则，实现这样的流程需要耗费数月的开发时间。操作人员可以直接着手进行硬件设计和组装，因为他们知道 BakingTray 的模块化
这种架构意味着硬件选择不受软件限制。除本稿件外，我们还提供了在线文档（bakingtray.swcmicroscopy.com），以协助设备搭建。如需在 BrainSaw 的规划、搭建或运行方面获得帮助，可联系通讯作者。
潜在用户还应规划数据分析与存储基础设施。根据所选分辨率的不同，每个样本每个通道的数据集大小约为 6–120 GB（补充表 5）。我们使用配备 12–24 TB 本地存储空间的 Linux 工作站进行图像拼接和预处理。随后，该计算机将数据发送至受管理的存储平台，以进行长期存储和磁带归档。
3.5 局限性
由于 STPT 具有破坏性，成像不正确的样本无法重新采集。因此，必须在开始时正确设置各项参数，并在启动采集前解决明显的问题，例如切片不一致（附录 5）。不太熟悉双光子成像的终端用户有时会在未察觉的情况下采集存在明显缺陷的数据（例如激光功率过低）。尽管用户经验不足所引发的问题并非 STPT 所独有，但由于该技术具有破坏性，消除此类问题尤为重要。
BrainSaw 无法在切片脱离组织块表面时自动收集切片。用户偶尔会在采集完成后收集切片，以便对其中少量切片进行抗体染色和成像。对于需要常规性地对大量切片进行事后标记的用户，可以改为对数量较少、厚度较大的透明化切片（例如 500 µm 厚的切片）进行染色，并使用共聚焦显微镜成像。
大多数用户对采用遗传编码荧光团或在体内沉积的有机染料标记的样本进行成像。其主要优势之一在于
STPT所需的样本制备极为简便，因此这类样本非常适合该技术。虽然可以先进行整体标记，再进行STPT成像（见结果第2.5节），从而提高该技术的灵活性，但要获得良好的整体标记效果仍具有较高的技术难度，因此我们并未将其作为常规操作。对于实验依赖整体标记的研究团队而言，组织透明化结合光片成像可能是更合适的选择，因为这些标记方案正是为此类方法开发的。
在STPT系统上成像效果不佳的样本包括体积较大或具有脑回的脑组织，以及质地过软、无法用振动切片机可靠切片的脑组织。雪貂等较大型动物的脑具有较厚的硬脑膜，振动切片机无法将其切断；硬脑膜会形成长条状拖尾，遮挡样本表面并造成阴影伪影，而由于皮质表面存在褶皱，又无法将硬脑膜完全去除。与小鼠脑相比，大鼠脑更容易出现硬脑膜引起的阴影，尤其是在海马尾侧附近，成像采集过程中会有膜性组织从脑室中露出。小鼠脑的切片效果良好，但若在成像前未去除硬脑膜，仍有少数样本会出现阴影伪影（图9）。胚胎等质地柔软的样本可能难以切片，并可能过早从琼脂糖中脱出，或在切片过程中发生位移。虽然已有将样本与琼脂糖共价交联的技术（Ragan等，2012），但这些技术会显著延长样本制备时间，且无法完全消除上述问题。根据我们的操作经验，小鼠脑和大鼠脑，以及大小和硬度相近的其他器官，均可可靠地进行常规成像。
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图9.
即使是小鼠脑，成像前未去除硬脑膜也可能造成阴影伪影。
A. 包埋于琼脂糖中的小鼠脑，位于
BrainSaw 水浴槽。成像前未去除硬脑膜，因此其呈长条带状延伸至组织块表面之外（箭头所示）。
B。采集过程中截取的 BakingTray 图形用户界面（GUI）局部图像，展示 A 中暴露的组织块表面在完成成像后的外观。图像右侧可见一处尤为明显的阴影。由于在采集的这一阶段尚未校正渐晕，因此可见图像的拼块图案。
为简化设计，BakingTray 不追踪组织块表面的绝对高度，因此无法在其下方的固定距离处成像。值得注意的是，一旦组织块经过正确修整（附录 5），物镜与组织块表面之间的距离在整个采集过程中通常不会出现可检测到的漂移。偶尔会发生 10–20 μm 的漂移，相对于我们通常采集第一个光学层面时所采用的 25–35 μm 深度而言，这一漂移幅度占有相当大的比例。用户可以实时调整物镜高度进行校正，而无须暂停或重新开始采集（有关采集过程中可更改哪些设置的更多信息，见附录 3）。软件中可以加入自动表面检测功能，但需要谨慎实现，以免引入的问题多于其解决的问题。
采集过程中可以手动更改样本处的激光功率（附录 3），但无法根据局部信号强度自动调节。因此，明亮的病毒注射部位可能出现信号饱和（例如图 4B 插图），因为这些区域的荧光团密度非常高。这是一项值得注意的限制，尽管它很少构成问题。
3.6 维护与未来方向
BakingTray 是 SWC 使命的重要组成部分，在可预见的未来，中心的专职科研人员将持续积极维护该软件，他们
由 Wellcome Trust 和 Gatsby Charitable Foundation 提供核心经费支持（见“经费资助”）。已安装系统数量的不断增长也构成了另一层面的支持。
BakingTray 的功能已基本完备，但我们仍在持续改进其易用性并修复程序错误。目前计划新增的唯一一项重要功能，是在单个切片内实现多激光交错采集。这将允许使用不同的激发谱线和采集通道，对同一区域快速进行依次成像，从而最大限度地减少串扰。该方法将是“结果”第 2.7 节所展示的双激光激发数据采集方式的扩展；在该节中，两条激光谱线同时扫描，未采用多路复用。
我们希望，通过共享 BakingTray 和 BrainSaw 生态系统，降低有意采用 STPT 的研究团队的入门门槛，并鼓励更广泛的开发者群体沿着我们尚未预见的方向拓展该平台。
4 方法
关键资源表
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4.1 系统硬件
由于 BakingTray 不受特定硬件配置的限制，我们构建的各套 BrainSaw 系统并不完全相同（图 10）。下文将概述核心硬件，并重点介绍尤为有效的配置选择。我们的 BrainSaw_CAD GitHub 代码仓库提供了通用系统从物镜向下部分的 CAD 模型。
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图 10.
BrainSaw 系统的多样性。
A. 法兰克福马克斯·普朗克研究所的系统在水浴槽上装有摄像头，其水浴槽采用独特设计。
B. SWC 的“NeuroVision”系统由 TissueCyte 1000 改装而成，是唯一配备硅光电倍增器（SiPM）的系统。
C. 弗朗西斯·克里克研究所的“CrickSaw”系统的样品台不具备倾斜调节功能，并配有一个
基于液体光导的光收集通路。
D. SWC 的“OrganGrinder”系统除配备一台波长可调的 Mai Tai eHP DS 激光器外，还配备了一台单谱线 Axon 1064 nm 激光器。
E. 我们的交互式 BrainSaw 系统地图（见 swcmicroscopy.com/brainsaw）展示了迄今为止搭建的所有系统、其状态及相关发表文献。
扫描器与光学元件
我们推荐使用谐振扫描，而非振镜扫描。谐振扫描器能够实现更高的帧率，但代价是像素驻留时间缩短，因此信噪比降低（Nguyen 等，2001）；不过，对于荧光水平较低的样品，可使用 ScanImage 中的帧平均功能。系统支持振镜扫描，但不推荐使用：振镜在驱动速度过快时容易产生不稳定的双向扫描相位伪影，且无法通过后期处理校正。我们使用 4 kHz 或 8 kHz 谐振扫描器（Cambridge Technology 或 Thorlabs），慢轴振镜则采用 ScannerMax 的产品。我们的系统既有采用紧耦合扫描头的，也有采用光学中继扫描头的。光学中继可使视场照明更加均匀，但代价是增加玻璃光学元件的数量和系统复杂性。我们根据物镜后孔径选择匹配的扫描透镜和管镜，以实现尽可能大的扫描角度。扫描光学组件通常使用 Thorlabs 透镜组装。我们一般采用 Nikon W 16×/0.8 物镜，其视场约为 1.15 mm，场曲约为 20 μm。对于分辨率要求更高的应用，Zeiss W Plan-Apochromat 20×/1.0 是一种可行的替代选择。
探测器与前置放大器
我们的系统最多使用四个探测通道（图 11），通过 NI DAQ 或 ScanImage 的“vDAQ”硬件进行采集。不同系统采用多种不同类型的探测器。Hamamatsu R10699 多碱光电倍增管（PMT）为
足够，但使用 GaAsP 光电倍增管（如 Hamamatsu H16201P-40）可以获得更高的灵敏度。优先选用不带跳闸电路的 GaAsP 光电倍增管，因为明亮的样品区域可能触发该电路。请注意，GaAsP 光电倍增管在较高光照水平下更容易发生性能退化。应持续记录 GaAsP 光电倍增管的灵敏度，以便在必要时进行更换（Lees 等，2025）。尽管 R10699 等多碱光电倍增管的初始量子效率低于相应的 GaAsP 光电倍增管，但我们尚未发现其随时间发生性能退化（即使在使用近 10 年后也是如此）。我们使用 Thorlabs TIA60 或 Femto DHPCA-100 前置放大器。
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图 11。
典型四通道 BrainSaw 系统所使用的滤光片通带。
蓝色：Semrock FF01-460/60。绿色：Semrock FF01-525/39。红色：Chroma ET605/70m。远红：Semrock FF01-676/29。
硅光电倍增器（SiPM），如 Thorlabs PDA45，是传统光电倍增管的替代方案。尽管这类探测器的有效区域较小，仅为 3 mm，但它们可以集成到配备大后孔径物镜的系统中（Modi 等，2019），并且具有与 GaAsP 探测器相当的量子效率。SiPM 不会因高光照水平而损坏，并且可以始终保持开启，因此非常适合设施使用。这类探测器尤其具有成本效益，因为它们内置了前置放大器（这一特性可显著降低其对电噪声的敏感性）。在我们的测试中，6 个 Thorlabs PDA45 探测器中有 5 个在一次典型采集过程中出现了明显的偏置漂移。这虽然不便，但可以在拼接前采用移动基线校正，将其从数据中完全消除（参见 StitchIt 提交 8676986）。
振动切片机
我们使用的切片头和刀架来自
Leica VT1000S 振动切片机（分别为 P/N 14047248229 和 14046230131）的备件直接从制造商处采购。切片头内装有 Faulhaber 直流电机，由 Faulhaber MCDC3006 S RS 控制器驱动。设置说明见 BakingTray 文档。遗憾的是，MCDC3006 S RS 控制器已停产，制造商也没有提供直接替代产品；我们建议从二手市场寻找翻新设备，不过 BakingTray 也支持其他控制器（补充表 2）。我们从 Campden Instruments 采购高品质不锈钢刀片（型号 752-1-SS），并在每次采集前更换刀片。
水浴槽
切片和成像均在水浴槽中进行，槽内盛有约 750 mL 的 50 mM 磷酸盐缓冲液。水浴槽由整块亚克力铣削加工而成，其内壁经过充分抛光，使设置过程中能够从侧面观察样本（图 12C）。载玻片夹持在不锈钢支座上，支座固定于水浴槽底部（图 12）。各次实验中支座位置保持一致，因此 Baking-Tray 能够精确确定载玻片的位置，从而简化样本设置。水浴槽的 CAD 模型可在 GitHub 上的 SWC-Advanced-Microscopy/BrainSaw_CAD 获取。
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图 12。
水浴槽。
A. 未注水的 BrainSaw 水浴槽。
B. 放置在显微镜上的水浴槽及其中的样本。
C. 透过水浴槽壁观察样本和刀片的侧视图。
运动控制：X/Y 平铺扫描
我们建议使用 Physik Instrumente (PI) 线性位移台实现 X 和 Y 方向的运动。许多系统采用 V-551.4B 和 V-551.2B 直驱位移台，并由 C-891 控制器驱动。我们使用 PI 的旧款 M-531.DD 和 M-605.2DD 也取得了良好效果。
TissueCyte 1000 系统随附的位移台。用于拼块扫描的位移台是关键部件；鉴于这些位移台将承受的工作负荷，不建议采用更便宜的替代品（图 2）。BakingTray 支持 Zaber 位移台，但我们发现 X-LRM 系列需要定期润滑，且丝杠会随着时间推移而磨损，因此不太适合。
运动控制：Z 升降台
X/Y 位移台安装在 Z“升降”台上。Z 升降台负责在采集过程中将样品向上移动一个切片的厚度，以便对其进行切片。构建这一 X/Y/Z 平台最简单的方法是使用高负载升降台，使其能够精确顶升拼块扫描位移台和水浴槽。市面上此类升降台很少。我们已成功使用 Aerotech PRO190SV-035 或 Prior FB204E 升降台搭建系统。Prior 位移台与其 OptiScan III 控制器配合使用效果良好，且具有成本效益。在 2024/2025 年前后，Aerotech 停产了 Ensemble 和 Soloist 电机控制器，改用 Automation1 系列，并取消了 MATLAB 支持。Aerotech 表示，Automation1 于 2026 年年中恢复了 MATLAB 支持（个人通信），但我们尚未对此进行测试，而且目前尚无适用于新控制器的硬件控制类。Zaber 的 VSR 升降台也是一种选择，目前 BakingTray 已支持该产品，但尚未在本应用中进行测试。
运动控制：物镜粗调焦与快速调焦
物镜安装在一个“粗调焦”电机上，该电机用于在设置过程中寻找样品表面。该过程完全通过 ScanImage 控制，因此任何受 ScanImage 支持的硬件都可以使用。我们使用 Zaber 位移台和控制器取得了良好效果
在该应用中，成像期间的快速 Z 轴堆栈采集也通过 ScanImage 控制：我们使用 PI 的 PIFOC 系统。
4.2 软件
安装
BakingTray 需要 MATLAB（目前我们使用 2021b）和 ScanImage Basic 2023（较早版本应当也可运行，但最新的 2023 版本包含相关错误修复和实用功能）。ScanImage 是一款稳健、经过充分测试的产品，可在多种图像采集硬件上运行，并提供技术支持。完整的安装说明，包括 ScanImage 配置、BakingTray 硬件类设置和校准流程，详见：
bakingtray.swcmicroscopy.com
总体运行原理
ScanImage 与 BakingTray 进行双向通信：ScanImage 负责图像采集任务，BakingTray 则负责 X/Y/Z 载物台、切片、激光通信以及大多数采集参数的设置。BakingTray 通过 API 调用与 ScanImage 对接，因此 ScanImage 源代码未作修改。样本采集主要由瓦片扫描阶段和切片阶段构成。“瓦片”是指在单个 X/Y 载物台位置采集的数据，包括所有光学平面和所有采集的探测器通道。在具有三个通道、每个实体切片包含五个光学平面的采集中，每个瓦片会保存为一个包含 15 张图像的小型 TIFF 堆栈。一个实体切片中的所有瓦片均存储在同一个子目录中。
开始采集时，BakingTray 会确定瓦片位置的数量，并请求 ScanImage 对相应数量的“采集”执行一次“循环”。每完成一个瓦片的采集，ScanImage 就会运行 BakingTray 的回调函数（SIBT.tileAcqDone）。该函数会使 X/Y 载物台移动到下一个瓦片位置，更新本地瓦片扫描预览窗口，然后触发下一个瓦片的采集。一旦
所有图块采集完成后，ScanImage 返回“Idle”模式，BakingTray 启动一个切削循环。样本向上移动一个切片厚度，在预先设定的速度（通常约为 0.4 mm/s）下被推向刀片，然后移回物镜下方。图块扫描和切片过程不断重复，直至获得所需数量的切片。
‘autoROI’ 自动样本检测
采集可分为两种类型：“手动 ROI”或“autoROI”。手动 ROI 采集是指用户在块体表面对样本进行图块扫描预览，并在希望成像的区域周围绘制一个边界框。该固定 ROI 将应用于所有切片。由于大多数样本在块体表面的面积会在采集过程中发生显著变化，对整个器官进行手动 ROI 采集的效率较低。当一次采集包含多个样本时，这种方式的效率尤其低下。为解决这一问题，BakingTray 提供了基于阈值的“autoROI”功能，可自动检测样本，并在采集过程中计算各个 ROI。
大多数采集均在 autoROI 模式下进行。用户像之前一样，在块体表面对样本进行图块扫描预览。该图像被下采样至 50 µm/像素，并进行中值滤波（滤波器大小为 5 × 5 像素）；距离图像边缘 200 µm（4 个像素）以内的像素被视为背景。组织/背景阈值设定为该背景分布的中位数加上 k 个标准差。如果 k 过高，部分样本可能会被当作背景而不进行成像。如果 k 过低，所得 ROI 往往会不断扩展，直至涵盖整个琼脂糖块。为选择 k，分割过程会从 k = 12 递减至 2 反复运行；k 被设定为……的中心。
检测到的区域数量保持不变的最大范围。该选择准则能够有效检测组织，并将 k 值确定在分割对阈值最不敏感的区域。因此，即使组织侵入边界带导致背景估计不准确，该流程仍具有容错性。
将选定的 k 应用于中值滤波后的图像，以生成二值掩膜。随后通过形态学操作对其进行清理。移除偏心率较高的对象，因为在信噪比较低的图像中，细长结构是电噪声的特征。再对二值图像进行中值滤波（滤波器尺寸：5×5 像素），并使用半径为 50 µm 的圆盘形结构元素进行一次腐蚀–膨胀循环，以去除残留的斑点噪声。在当前采样条件下，该半径相当于一个像素，因此形成一个 3×3 的十字形结构元素。此时，除少数例外情况外，掩膜已能表示真实组织。将其膨胀 600 µm，以留出安全缓冲区。计算保留区域的最小外接矩形；如果合并矩形后成像面积的增幅小于 30%，则将其合并；最后，将每个矩形向上取整至完整的瓦片数，以供成像。
用户按下“Bake”后，采集开始，并对瓦片图案进行成像。每完成一个切片，都会重新计算样本位置并切取组织块。对于之后的切片，分析仅限于先前成像的 ROI：背景统计数据仅根据每个 ROI 边缘附近的像素计算，这些像素已被前一切片的掩膜识别为非组织像素。因此，采集开始后，不再假定所有边界像素都是背景像素。绝对阈值采用滚动中值进行平滑，计算范围为最近五个切片。如果检测到组织，则
如果组织与ROI边缘相接的长度超过350 µm，则沿相应方向将该ROI扩展450 µm，使成像区域能够跟踪在块面处快速生长或漂移的样本。如果相邻切片之间组织与背景的面积比变化超过十倍——例如在采集过程中途改变激光功率或波长时——则从头重新计算阈值。该过程不断重复，直至获得所需数量的切片，或不再检测到组织。
为开发这一流程，我们收集了133次以往采集的数据，涵盖300多个样本。该样本库既包括典型样本，也包括少见样本（眼睛、脊髓、雪貂大脑半球），还包括信号极弱的低质量采集数据（例如激光功率过低、成像平面过深或波长不正确）。我们对每张切片中的组织位置进行人工标注，以获得真实标注数据，并据此通过启发式方法开发了autoROI算法。
自2020年以来，BakingTray的autoROI已在SWC采集约6,000个样本。据我们所知，仅发生过一次样本丢失的异常情况。通常情况下，autoROI不会丢失任何组织；在少数情况下，丢失的数据相当于2–6个图块，而小鼠脑约由20,000个图块组成。总体而言，autoROI已被证明对于缩短采集时间和样本准备时间，以及简化用户培训，都发挥着关键作用。
4.3 日志分析
我们对存储平台上的BakingTray日志文件进行了挖掘，以计算吞吐量和可靠性统计数据。通过查找包含“recipe”文件和数据文件夹的目录，识别BakingTray采集目录。为简化分析，我们复制了存储平台的目录树，仅保留了…
BrainSaw 目录及元数据文件：“配方”文件和“采集日志文件”。我们分析了截至2026年7月中旬所有可用样本。
样本与采集
配方文件记录了开始日期和时间、BakingTray 成像设置、关键 ScanImage 设置以及显微镜名称等信息。该文件在采集开始时写入；如果已停止的采集重新启动，则会写入一份带有新时间戳的副本。此处展示了其中一个文件的若干选定行：
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单次采集可能包含多个样本，我们希望在样本和采集两个层面提取统计数据。样本目录分布于整个存储平台，涉及多个研究组，各组的数据管理实践也不尽相同。因此，要确保最终数据集中不包含重复采集并非易事。我们将包含配方文件的目录定义为一个样本，并据此统计样本数量。由于系统中有些样本出现在多个路径下，因此每个样本只计数一次。如果两个配方文件内容相同且样本名称相同，则视为重复文件。如果两个配方文件的显微镜和样本名称相同，且属于同一次采集，也视为重复文件。样本名称取自文件名。我们忽略了 BakingTray 保存在其 logfiles 目录中的配方文件备份副本。如果一个样本目录中包含多个配方文件（通常是因为重新启动采集时会写入一份新的、带日期时间戳的配方文件），我们只保留其开始时间最接近该目录采集日志中首次记录的开始时间的文件。对于恢复到新目录中的采集，
仅统计了两次运行中其中一次运行的样本（见下文）。总共切取五个或更少切片的采集被视为测试或设置失败，既不计作一次采集，也不计作一个样本。
StitchIt 为每个光学平面、每个通道生成一个 TIFF 文件，因此，多个样本一同成像时，都会出现在同一张图像中。用户可通过一个软件工具将各个样本裁剪出来，并分别存入以唯一样本名称命名的目录。每个目录中都保存着一份配方文件副本，文件名改为相应样本的名称，并在正文中相应修改样本 ID。这些拆分后的样本没有明确记录其与哪些样本一同采集。为了确定哪些样本是同时采集的，并由此确定采集总次数，我们必须找出在同一台显微镜上于同一时间采集的样本。我们依据配方文件中的 Acquisition.acqStartTime 和 SYSTEM.ID 字段进行判定。综合这些数据，我们得以绘制样本累积数量随时间变化的图，并确定每次采集所含样本数的分布。同样，也可以从配方文件中提取不同采集之间图像分辨率的分布情况。
重启
采集日志文件是一份持续更新的日志，BakingTray 会在采集过程中不断向其中追加进度信息。日志首先记录采集开始时间、软件版本以及激光波长和功率，随后记录带时间戳的进度消息。这些消息包含激光器状态，以及足以还原总采集时间及其在各个切片间分布情况的信息（为缩短行长，下文对目录路径进行了截断）。该消息块的开头和结尾如下所示。最后一行表明，此次采集
由于找不到更多组织，采集在第 373 张切片处停止。请求的切片数量似乎从 377 张变为 368 张，这是因为采集在完成 9 张切片后重新启动。
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恢复已停止的采集时，BakingTray 会在现有采集日志中追加一个新的标题块，开头为 STARTING NEW ACQUISITION。日志中除第一条以外的每一条 STARTING NEW ACQUISITION 行都被视为一次重启；每次重启的分类依据是该行之前、回溯至上一次启动之间的日志内容。用户手动中止并重新启动采集的情况很明确。在以下示例中，用户要求采集在第 13 张切片后停止，并在 5 分钟内重新启动。15:47:21 的 abortAfterSectionComplete 消息表明了这一点。
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相比之下，以下日志中没有中止消息，但用户约一小时后重新启动了采集。这次重启被归类为原因未知的停止。
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根据日志文件中的消息，重启被分为以下四类：
手动中止的采集：abortAfterSectionComplete
按计划停止后由用户重新启动的采集：FINISHED AND COMPLETED ACQUISITION，或 Found no tissue … Quitting acquisition
与激光相关的情况：STOPPING ACQUISITION DUE TO LASER 或 LASER NOT RUNNING
原因未知的停止
需要注意的是，在大多数情况下，激光故障是由一个现已修复的串行通信错误造成的，而非锁模或电源故障。每次重启都根据显微镜及时间进行识别，因此无论多少个共成像样本的日志记录了该次重启，都只计为一次；若一次采集重启两次，则计为两次重启。
偶尔，停止的】【。
采集以新名称恢复，因此恢复后的运行拥有独立的目录、配方文件和采集日志。采集日志记录了每个切片的切削深度，以及数据写入采集计算机上的哪个目录。我们将同一台显微镜上的两次连续采集视为一次被重新启动的采集，前提是第二次采集开始时的深度，正好是第一次采集本应切取下一张切片的深度。如果以下三个条件均得到满足，我们还会合并这类采集。第一，后一次运行在前一次运行结束后的24小时内开始。第二，后一次运行写入的目录名称与前一次运行相同，或是在该名称后加上后缀（例如 AB_rab0405 和 AB_rab0405_NEWLASER）。第三，后一次运行要么延续前一次运行的切片编号，要么接续一个少于80张切片的前次运行。总计有22对运行以这种方式合并（其中12对依据深度，10对依据目录名称）。两次运行包含相同的样本，因此只计数一组样本：即被拆分到更多样本目录中的那次运行所包含的样本（未裁剪的运行会将其全部样本存放在一个目录中）。两次运行之间的停止被视为一次重启，根据第一次运行日志的末尾进行分类，并将两次运行的成像时间相加。
如果自采集开始或上次重启以来切取的切片数不超过5张，则无论停止原因为何，该次重启均不计入。此类停止发生在设置阶段，例如用户请求了错误数量的切片（某些情况下仅为一张切片），或注意到前几张切片存在问题。这些快速重启反映的是对设置错误的纠正，而非系统的可靠性。在发现的311次重启中，有100次据此被排除，剩下211次。从
利用这些数据，我们可以计算重启事件的数量、其随时间的分布及其原因。在某些情况下，重启事件的性质并不明确。例如，一些日志中缺少 abortAfterSectionComplete 消息，但采集几乎立即重新开始，这表明用户在整个过程中可能一直处于系统旁。因此，我们将这些事件归类为非计划重启，尽管它们实际上可能并非如此。因此，尽管部分重启的确切性质仍不清楚，但所有发生在采集超过五个切片之后的重启均纳入统计分析。
采集时长
根据日志文件计算每次采集的总时长。每个切片所用的时间均打印在相应的 FINISHED 行中，并将这些时间相加。该方法排除了采集中止后重新启动所产生的任何停机时间。由于部分用户并未采集完整脑组织，各样本的组织切取厚度有所不同。因此，我们将每次采集的成像时间除以切取深度，再乘以 12.5 mm，以报告成像 12.5 mm 深度所需的时间。切取深度小于 9.5 mm 的运行被剔除，而未进行缩放。对于显示每个脑的采集时间的图，我们将归一化总时间除以该次采集中的样本数量。为降低方差，我们采用以下方式筛选数据。我们根据已知进行这些样本采集的用户姓名首字母排除了大鼠脑样本；这些首字母分别从样本目录名和配方文件中的样本 ID 中读取。根据样本目录名，我们发现数据集中存在未裁剪的多脑采集数据。我们通过移除所有每个切片的平均 tile 位置数超过的单样本采集，排除了这些数据以及其他可能属于此类的采集。
该数值在相同分辨率下的单样本采集中位数的1.6倍。在两种分辨率下，中位数均约为每个切片58个拼图位置，因此排除阈值约为92。这40次被排除的采集包括若干大脑的采集，这些大脑从未被裁剪到单独的目录中，且其配方样本ID通常对应多个动物；还包括在异常大面积区域进行成像的单个大脑。由于其中包含的大脑数量未知，因此在其他地方仍将其计为单个样本。我们将分析限定于配备8 kHz共振扫描器的两台显微镜；设施中的第三台显微镜配备4 kHz扫描器，因此运行速度较慢。我们使用了2020年及之后的数据，此时两台显微镜均已在该设施中稳定运行。上述分析所使用的数据和代码可在以下网址获取：
github.com/SWC-Advanced-Microscopy/BrainSaw_Log_Analysis
4.4 成像与样本处理方法
本节介绍用于处理本文所呈现样本的方法。
外科手术与灌流
病毒注射手术在异氟烷（2–5%）麻醉下进行，以氧气作为载气，流速为2 L/min，并在给药卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）后实施。所有外科手术过程中均使用眼部凝胶（Lubrithal），并通过直肠探针和设定在约35 °C的电加热垫控制体温。所有手术均在立体定位仪（Benchmark）上进行。进行灌流时，使用戊巴比妥钠（80 mg/kg，腹腔注射）对小鼠进行深度麻醉。将钝针置于左心室，并在心脏右心房处切开一个切口。使用手持式10 mL注射器，以100 mM PBS（10 mL，2.5 mL/min）冲洗去除血液。
随后用含4% PFA的10 mL PBS对动物进行灌流。通过肌肉僵硬程度确认固定成功后，去除头部并小心取出脑组织。脑组织随后浸没于4% PFA中，在4 °C下过夜进行进一步固定，然后储存在4 °C的PBS中，直至准备成像。
成像样品制备
详细的样品制备方案见BakingTray用户指南。样品包埋于用50 mM磷酸盐缓冲液配制的5%琼脂糖中（Campbell 2024a），该缓冲液在成像过程中起pH缓冲作用。使用定制的包埋模具，样品可单独包埋（Campbell 2024c），也可四个一组包埋（Campbell 2024b）。将琼脂糖块从模具中取出，并用强力胶粘附到普通玻璃显微镜载玻片的磨砂部分。
脾脏
图4C中的脾脏样本取自一只Tlr7-GoF Gcsam-ert2cre Confetti（Het）小鼠；该小鼠在组织采集前7天接受了单次他莫昔芬（15 mg）处理。该小鼠品系会产生自身免疫表型，导致脾脏自发形成生发中心。通过Gcsam启动子（对生发中心B细胞具有特异性）驱动的Cre表达，诱导了生发中心B细胞中的Confetti表达。样本同时使用两条激光线进行成像：Spectra-Physics Mai Tai eHP DS（930 nm，样品处功率为97 mW）和Coherent Axon 1064（1064 nm，样品处功率为141 mW）；图像分辨率为2 × 2 × 10 μm/体素。
全组织标记
经四氢呋喃脱脂处理（EZ Clear；Hsu等，2022）后，使用与Vio667偶联的重组单克隆抗体（Miltenyi Biotec）对酪氨酸羟化酶（TH）进行标记。脑组织采用800 nm激发光进行成像，样品处功率为125 mW，并采集远红和绿色通道。该方案详见
详见附录6。采用经CUBIC-L脱脂的半脑进行刚果红标记，以标记淀粉样斑块（Tainaka et al. 2018）；随后在ScaleCUBIC-1a中用刚果红染色（Susaki et al. 2014），再用经PFA交联的明胶加固，以抵消脱脂造成的软化（附录7）。脑样本在820 nm激发、样本处功率为80 mW的条件下成像，并采集蓝色和红色通道。我们最初尝试了基于iDISCO的方法（Liebmann et al. 2016），但该方法导致样品表面出现明亮的刚果红环。
双颜色逆行病毒示踪
进行双颜色逆行病毒示踪时，我们使用了rAAV2-retro-EF1a-H2B-eGFP和rAAV2-retro-EF1a-H2B-tdTomato（1 × 10¹³ GC/mL）（Tervo et al. 2016；Weiler, Teichert, and Margrie 2025）。用推剪剃除头部背侧表面的毛发后，再用手术刀沿头部中线作前后向切口，并使用手持式牙科钻（Osada）进行小型开颅。随后使用硼硅酸盐玻璃注射吸管（Wiretrol II；Drummond Scientific）注射病毒；吸管由垂直拉针仪（PC-10，Narishige）拉制，锥形段长度约为30 mm，尖端直径约为50 µm。每种病毒的注射体积为60 nL，使用Nanoject III（Drummond Scientific）以1–2 nL/s的速度递送，注射深度为皮层下650 µm。相对于前囟的注射坐标为：retro-GFP位于外侧2.1 mm，retro-tdTom位于外侧2.25 mm；两种病毒的注射位置均位于后方3.8 mm。注射后，用硅胶（Kwik-Cast）封闭开颅处，并用组织黏合剂（3M Vetbond）重新闭合皮肤。随后让动物恢复2–3周以使病毒表达，再进行灌流。我们使用一台……对脑进行成像。
BrainSaw 系统配备了一台 Coherent Axon 1064 激光器，与主可调谐 Mai Tai 激光器共轴。在这些特定实验中，Mai Tai 激光器的波长为 920 nm、功率为 75 mW，Axon 1064 nm 激光器的功率为 150 mW。
突触位点定位
为绘制全脑范围内可能的突触位点图谱，我们向腹侧外侧膝状体核（vLGN）注射了 60 nL AAV[2/1]-hSyn-DIO-tdTomato-Synaptophysin-eGFP（1.90 × 10¹³ GC/mL）。使用了四种 Cre 驱动系，均来自 SWC 小鼠种群：vgat-Cre（STOCK Slc32a1tm2(cre)Lowl/J）、PV-Cre（B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr/J）、Penk-Cre（B6;129S-Penktm2(cre)Hze/J）和 SOM-Cre（STOCK Ssttm2.1(cre)Zjh/J）。剃除头部毛发、沿中线切开、进行颅骨切开术以及注射后闭合伤口的方法均见第 4.4 节。注射所用玻璃移液管（内径 0.53 mm 的 4.2 µL 毛细管，Drummond Scientific）使用 P-1000 微量移液管拉制仪（Sutter Instrument）拉制，并用微型研磨器（EG-45，Narishige）磨尖。病毒以 1–2 nL/s 的速度使用 Nanoject III（Drummond Scientific）注射。相对于前囟的注射坐标为：前后方向 −2.35 mm、内外侧方向 2.43 mm、背腹方向 −3.44 mm。注射后等待 7 周以使其表达，随后进行灌流。使用 STPT 对脑组织成像（每条品系 n=1），体素分辨率为 2 × 2 × 5 µm，切片厚度为 40 µm，采集八个光学平面，并进行四帧平均。部分早期试验脑样本采用了更高分辨率成像（例如，见图 8—图补充 1）。样本处的 920 nm 激发光功率约为 130 mW。
STPT 成像流程
本文所示的所有成像数据均采集自 SWC 高级显微镜设施（AMF）的三台 BrainSaw 系统之一。系统配备了 PIFOC 快速调焦系统（行程范围为 100 µm 或 400 µm）。
图像使用尼康 16×/0.8 水浸物镜采集。各系统配备 Cambridge Technology 的 4 kHz 或 8 kHz 谐振扫描器。我们选用了增益较高的 Hamamatsu R10699 光电倍增管（PMT）。信号通过 Femto DHPCA-100（带宽切换至 80 MHz）或 Thorlabs TIA60 跨阻放大器进行前置放大。数据采集由 NI DAQ 硬件控制。所有成像系统均配备带 DeepSee 的 Spectra-Physics Mai Tai eHP 激光器。我们使用 Conoptics Pockels 盒调制光束强度，并对 ScanImage 进行校准，使其能够报告本实验所用各波长下样品处的功率。成像时样品处的功率通常约为 120 mW，所用功率范围约为 75–175 mW。第一个光学平面通常位于样品表面下方 25–35 µm 处。
4.5 采集过程中的数据处理与拼接
我们将数据采集到 Windows 采集计算机上的专用 8 TB SSD 中。每次采集都有自己的文件夹，其中包含与采集参数相关的元数据、日志文件，以及用于存储图像的 rawData 文件夹。rawData 中为每个实体切片设置了单独的子文件夹。每个 X/Y 瓦片位置均保存为一个较小的 TIFF 堆栈，其中包含该位置采集的所有通道和光学平面。
我们另有一台运行“StitchIt”分析软件包的 Linux 计算机，为全部三套采集系统提供服务。采集开始后，我们会启动 StitchIt 命令“syncAndCrunch”。该命令会自动搜索当前正在运行的采集任务，然后反复运行 rsync，将数据从采集计算机复制到分析计算机上的本地 RAID 阵列。每个切片采集完成后，系统会加载瓦片、提取统计数据，并保存该切片的平均图像。总体
这些图像的平均图会定期生成。这些总体平均图用于校正渐晕以及其他会在图块中引入系统性不均匀性的伪影。系统会对初步图像进行拼接并将其发送至网络服务器，从而为用户提供监控实时采集过程的途径。采集结束时，会在采集文件夹中写入一个名为“FINISHED”的文件。分析计算机检测到该文件后，会启动整个数据集的拼接。拼接后的数据会针对每个光学平面和通道分别保存为一个 16 位 TIFF 文件。StitchIt 还会生成具有各向同性体素（例如 10 或 25 µm）的下采样堆栈，并将其保存为多页 16 位 TIFF 文件，便于可视化以及在其他平面进行重新切片。
我们的拼接流程速度很快，并且完全依据记录的载物台位置运行。拼接误差通常小于 30 µm，足以满足我们的使用需求。其他研究者已经针对 STPT 开发了更为复杂但精度更高的拼接方法（参见 Economo 等，2016；Chen 等，2020，尤其是 González-Solares 等，2023）。
4.6 采集后数据处理
拼接完成后，用户可以交互式地运行名为 stitchit.sampleSplitter 的命令，以裁剪样本（针对单样本采集），或将采集数据拆分到不同目录中（针对多样本采集）。对于较大的数据集，这种裁剪操作可以节省相当可观的存储空间。
我们使用一个可通过 pip 安装的 Python 软件包 btpytools 来简化文件处理。该软件包提供了一个名为 compressRawData 的 shell 命令，可对 rawData 文件夹执行并行 bzip 压缩（pbzip2），供希望归档原始图块、而非完全依赖拼接输出的用户使用。此外，它还提供了一个 transferToServer 命令，用于
是一个面向用户的 rsync 封装工具，用于将采集数据从分析电脑复制到已挂载的存储服务器。与 rsync 相比，该工具提供了更简便的操作界面，会再次确认传输是否成功，并在采集目录中创建一个空文件，以表明传输已成功。分析电脑上的已成功传输文件夹会根据该文件的存在情况，由 cron 作业自动删除。
双通道自动配准与细胞检测
使用软件工具 brainreg（Tyson 等，2022；Tyson 和 Margrie，2022）将图像配准至 Allen 小鼠脑通用坐标框架（Wang 等，2020；分辨率为 10 µm）。该工具基于 aMAP（Niedworok 等，2016）。所有图谱数据均由 BrainGlobe Atlas API 提供（Claudi 等，2020）。使用 cellfinder 软件（Tyson 等，2021）进行自动细胞检测和基于深度学习的细胞分类。双通道细胞检测（结果见第 2.7 节）通过运行两次 cellfinder 完成：第一次将红色通道设为信号、绿色通道设为背景；第二次则交换两个通道。
4.7 动物福利
所有动物实验均遵循英国《1986 年动物（科学程序）法》规定的英国政府内政部指导原则和法规，并经动物福利与伦理审查委员会（AWERB；SWC）批准，同时符合 ARRIVE 指南。本研究中涉及、且未在其他地方报告的实验所对应的 PPL 编号如下：
双通道细胞计数：PP1819274
TH 标记、突触标记和整体投射示踪：PP4459082
刚果红标记：PP2015516
小鼠脾脏由弗朗西斯·克里克研究所提供，并遵循上述法案的规定，项目许可证（PPL）编号为
PP2867252。鸟脑数据是在经德国地方和国家主管部门批准的动物实验程序下获取的，批准机构为德国奥尔登堡州消费者保护与食品安全局（Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit/LAVES；档案编号：33.19-42502-04-20/3492；33.19-42502-04-21/3650）。其余数据均取自先前发表的文献，相关动物使用声明见所引文献。
4.8 分析
使用 napari（napari contributors 2019）对全脑数据进行可视化，并添加比例尺。通过截屏将图像导出至 Affinity Designer，以进行子面板排版。裁剪掉原始比例尺之前，先将其转换为矢量元素。折线图使用 Python 生成。
AI 的使用
BakingTray、StitchIt 和 btpytools 的编写未使用 AI。自 2026 年第二季度起，Claude Opus 5.0–5.5 和 Claude Fable 5 被用于审查 BakingTray 和 StitchIt 的代码。根据 Claude 提供的工作包，建议的更改通常由人工手动实施，并在部署前进行合理性检查。
本稿由人类作者撰写。Claude 被用于检查文稿中的错误和行文流畅度。此外，Clau
关键词：连续双光子断层成像 · 高通量体积成像 · 开源成像软件 · 全脑细胞计数 · 神经投射图谱 · 淀粉样斑块
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.28.748989v1?rss=1