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在嵌合组织中精确分析内源蛋白的行为，需要采用既能修饰天然等位基因、又能在单细胞分辨率下识别成功编辑细胞的策略。在此，我们建立了一种基于 CRISPR 的基因组编辑平台，将内源蛋白可视化与等位基因特异性突变追踪相结合，并应用于体内研究。我们以鸡胚神经管和 β-连环蛋白为模型系统，通过引入稳定化突变，验证了胞嘧啶碱基编辑、先导编辑和双引导先导编辑，并再现了这些突变预期产生的细胞和形态学表型。随后，我们开发了一种双引导先导编辑策略，将特定致癌突变的引入与最小化肽标签的同步插入相结合，从而无需克隆筛选，即可在单细胞分辨率下直接观察到有效编辑。对 ALFA、V5 和分体 GFP 标签的比较分析表明，分体 GFP 是体内可视化内源蛋白最可靠的策略；基于荧光的细胞筛选则能显著富集预期的双引导先导编辑产物。最后，我们将该方法拓展至内源野生型 β-连环蛋白，确定了一个功能上中性的插入位点，使其能够在生理性、非稳定化的表达水平下实现可视化，同时保持蛋白质的正常行为。综上，这些结果确立了双引导先导编辑这一多功能平台，可在完整脊椎动物组织中直接关联精确的内源基因组修饰、蛋白质可视化与等位基因特异性突变分析。
要在嵌合组织中精确分析内源蛋白的行为，需要既能修饰天然等位基因，又能在单细胞分辨率下识别成功编辑细胞的策略。在此，我们建立了一个基于 CRISPR 的基因组编辑平台，将内源蛋白可视化与等位基因特异性突变追踪相结合，并应用于体内研究。我们以鸡胚神经管和 β-连环蛋白为模型系统，通过引入稳定化突变来重现预期的细胞和形态学表型，从而验证了胞嘧啶碱基编辑、先导编辑和双引导先导编辑。随后，我们开发了一种双引导先导编辑策略，将特定致癌突变的引入与最小肽标签的同步插入相结合，从而无需克隆筛选即可在单细胞分辨率下直接观察有效编辑。对 ALFA、V5 和分裂型 GFP 标签的比较分析表明，分裂型 GFP 是体内内源蛋白可视化最可靠的策略；基于荧光的细胞筛选则显著富集了预期的双引导先导编辑产物。最后，我们将该方法拓展至内源野生型 β-连环蛋白，并确定了一个功能上中性的插入位点，使其能够在生理性、非稳定化的表达水平下实现可视化，同时维持蛋白的正常行为。综上，这些结果确立了双引导先导编辑作为一种多用途平台，可在完整脊椎动物组织中直接关联精确的内源基因组修饰、蛋白质可视化和等位基因特异性突变分析。
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关键词：双引导先导编辑 · CRISPR基因组编辑 · 内源蛋白可视化 · 等位基因特异性追踪 · β-连环蛋白
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.21.753164v1?rss=1