以 AlphaFold 为代表的蛋白质结构预测近期进展，已在很大程度上解决了蛋白质折叠问题的一个方面——静态结构的测定。然而，预测蛋白质到达天然态所经历的折叠路径，仍是一项重大挑战。在此，我们提出 PathFold，这是一种可直接根据序列信息预测蛋白质折叠路径的深度学习框架。PathFold 利用基于 AlphaFold 的模块从序列中提取结构信息，并通过扩散模型生成蛋白质从伸展构象开始的渐进式折叠轨迹。通过对完整轨迹进行建模，该框架能够预测折叠中间态和转变路径，类似于受控分子动力学（SMD）模拟中观察到的结果。预测得到的路径揭示了明确的中间态和顺序发生的折叠事件，并与实验折叠数据（包括测得的 Φ 值）相符。
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摘要
以 AlphaFold 为代表的蛋白质结构预测领域的最新进展，已在很大程度上解决了静态结构的确定问题，即蛋白质折叠问题的一个方面。然而，预测蛋白质达到其天然态所经历的折叠路径，仍然是一项重大挑战。在此，我们提出 PathFold，这是一种直接根据序列信息预测蛋白质折叠路径的深度学习框架。PathFold 利用基于 AlphaFold 的模块从序列中提取结构信息，并使用扩散模型从伸展构象出发生成渐进式折叠轨迹。通过对完整轨迹进行建模，该框架能够预测折叠中间态和转变路径，类似于牵引分子动力学（SMD）模拟中所观察到的结果。预测的路径揭示了明确的中间态和依次发生的折叠事件，并与实验折叠数据（包括测得的 Φ 值）相吻合。
引言
近年来，基于深度学习的蛋白质结构预测取得了成功¹，使得根据氨基酸序列高精度预测蛋白质完全折叠后的三维结构成为可能，显著推进了蛋白质折叠问题中静态结构部分的研究²。然而，这些方法无法解释蛋白质如何从未折叠构象折叠为天然结构³。因此，预测蛋白质折叠仍然是一项重大挑战；蛋白质折叠问题的核心，即生物物理学领域已研究数十年的折叠过程问题，仍然极具难度⁴˒⁵。
蛋白质折叠已得到广泛研究，在过去的
过去几十年来，研究者采用了多种实验方法来表征折叠路径和中间态，包括快速混合方法⁶、氢交换实验⁷、单分子荧光共振能量转移（FRET）⁸、光镊⁹、超快温度跃迁光谱¹⁰以及小角X射线散射（SAXS）研究¹¹。在所谓的Φ值分析中，研究者利用点突变对折叠动力学和稳定性的影响，推断折叠过渡态中形成的类天然态结构的程度¹²。在计算研究方面，分子动力学（MD）模拟已被用于研究折叠过程的原子级细节和热力学性质¹³˒¹⁴。除常规MD模拟外，通过施加外力拉伸蛋白质链的牵引分子动力学（SMD）模拟也已被广泛用于研究一系列生物物理过程，包括蛋白质折叠与解折叠机制¹⁵˒¹⁶。SMD能够模拟原子力显微镜（AFM）拉伸实验，此类实验可测量拉伸蛋白质链过程中产生的力¹⁷˒¹⁸。SMD的优势包括能够与单分子AFM实验数据进行直接比较，以及能够加速构象变化的采样，从而在残基层面揭示结构转变的机制。SMD还已成功应用于研究蛋白质解离¹⁹、异质性解折叠路径²⁰以及肽–受体相互作用²¹，确立了其作为一种可靠方法的地位，可在原子分辨率下模拟基于AFM的力学测量。
在后AlphaFold时代的过去几年中，深度学习已被应用于与蛋白质及其他生物分子结构相关的多种建模和预测任务²²–²⁸，并且
设计²⁹–³²。在这些任务中，一个主要研究重点是在不同尺度上对蛋白质柔性进行建模。AlphaFlow³³将 AlphaFold 与基于流的生成式建模相结合，以学习和采样以序列为条件的蛋白质构象系综，而不局限于单一静态结构。BioEMU 采用深度生成模型，重现从分子动力学模拟中学习到的平衡构象系综³⁴。aSAM 是一种基于潜在扩散的生成模型，使用分子动力学数据进行训练，其温度条件化变体能够显式捕捉温度依赖的蛋白质构象系综³⁵。尽管这些方法在构象系综建模方面取得了成功，但它们并非为研究蛋白质折叠而设计，也不能生成有序的折叠轨迹。
在此，我们提出 PathFold，这是首个用于蛋白质折叠路径预测的深度学习框架。PathFold 在 Cα 层级上运行，采用以 AlphaFold 生成的单残基表征和残基对表征为条件的扩散架构；这些表征提供了作为折叠终点的天然结构信息。给定蛋白质序列和固定数量的先前中间态，PathFold 预测下一个构象，并通过迭代生成从完全伸展链趋向天然结构的有序轨迹。开发此类模型面临的一项根本挑战是缺乏可用于训练的大规模原子级蛋白质折叠轨迹：在实验上，无法以原子分辨率直接观测完整的折叠路径；而在计算上，生成足够长的折叠轨迹所需的成本仍然高昂，难以用于构建大规模数据集。为绕过这一数据瓶颈并验证其可行性
为学习折叠路径，我们生成了通过机械作用使蛋白质去折叠的导向分子动力学（SMD）轨迹，并将这些轨迹反转，以提供用于监督学习的折叠路径。尽管这些反转轨迹并不代表真实的折叠动力学过程，但在缺乏大规模折叠轨迹数据集的情况下，它们为开发和测试轨迹学习框架提供了一种实用的替代方案。
评估折叠路径预测需要采用超越静态结构比较的指标，因为均方根偏差（RMSD）等常规结构比较指标不足以评估折叠过程的时序推进和中间态的对齐情况。为解决这一局限性，我们提出了一种轨迹对齐评分指标，通过对齐中间态，并基于天然接触的形成来量化折叠进程，从而将预测轨迹与源自SMD模拟的参考轨迹进行比较。
我们在包含175种蛋白质的基准数据集上评估了PathFold，这些蛋白质的序列长度为29至399个残基，SMD轨迹包含62至1,612帧。采用本研究开发的轨迹对齐评分指标进行评估，PathFold始终能够生成具有较高轨迹对齐得分的有序折叠路径。此外，PathFold生成的蛋白质中间态与SMD模拟中观察到的中间态具有较高相似性，并且能够一致地预测正向折叠轨迹。我们进一步考察了三种已得到充分表征的蛋白质：WW结构域³⁶、冷休克蛋白³⁷和泛素³⁸，其折叠机制均已通过实验得到广泛研究。从预测轨迹中推导出的残基水平折叠评分与实验结果表现出高度一致性
Φ值谱，表明PathFold能够捕捉折叠过渡态的关键特征。
结果
PathFold架构概述
图1展示了PathFold的整体工作流程，包括用于预测折叠轨迹的推理循环（图1a、b）和训练范式（图1c）。PathFold以目标蛋白质序列及初始的完全伸展构象为输入，生成蛋白质折叠轨迹，该轨迹由一系列按顺序排列、最终通向天然结构的蛋白质结构帧组成。首先，利用AF2 Evoformer¹从输入序列计算单体表征和成对表征。PathFold基于Genie³⁹框架构建，后者是一种基于扩散的蛋白质设计模型，最初用于骨架生成。Genie侧重于从头骨架设计，而PathFold对其架构进行了扩展，以纳入额外的条件信号，包括AF2的单体表征和成对表征以及中间结构状态（补充算法1）。这些修改使PathFold能够生成蛋白质特异性的折叠路径，而非通用的骨架结构。PathFold的详细架构见补充图S1。
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图1.
PathFold的推理与训练框架。
a，推理流程概览。PathFold模型的输入包括：（1）由目标蛋白质序列获得的AF2单体表征和成对表征；（2）当前中间状态。PathFold采用扩散网络生成候选中间状态，使蛋白质逐步折叠。最终结构根据预定义标准从候选池中选出，这些标准考虑接触图向折叠态的演进，同时
防止结构发生突变（见“方法”）。随后，将选定的中间状态反馈至模型，用于后续迭代。
b
，PathFold 从完全伸展状态开始生成折叠轨迹，并迭代预测后续中间状态，直至蛋白质达到其天然折叠结构。图中以 PDB ID 为 1A2P 的蛋白质为例，展示了一条生成的轨迹。
c
，PathFold 训练流程概述。除 AF2 Evoformer 生成的单体表示和成对表示外，我们还使用了来自 SMD 模拟、相隔 50 帧的两个 Cα 结构。折叠程度较高的构象用作目标状态，并在扩散训练期间加入高斯噪声进行扰动；折叠程度较低的构象则用作前一状态。AF2 表示和前一状态结构经编码后，与不变编码器生成的单体编码和成对编码进行融合；该不变编码器处理的是在围绕目标状态的扩散过程中采样得到的当前含噪结构。随后，等变解码器整合单体编码和成对编码，以预测去噪后的目标结构。通过计算预测结构与真实目标状态之间逐残基的 L2 距离损失，对预测结构进行监督。
我们使用基于操纵分子动力学（SMD）的折叠与解折叠模拟数据集训练 PathFold，该数据集包含 940 个蛋白质，序列长度范围为 29 至 399 个残基（见“方法”）。SMD 模拟从目标蛋白质的天然结构开始，固定其中一个末端，同时使用谐振弹簧牵拉另一末端
40
。模拟持续进行，直至蛋白质达到完全伸展构象，此时每个残基主要仅与其序列上紧邻的残基相互作用。
为构建该
在训练数据集中，每条 SMD 轨迹被分解为独立的时间帧，每一帧代表展开路径上的一个中间结构状态（图 1c）。训练过程中，我们从同一条 SMD 轨迹中采样间隔为 50 帧的结构对。折叠程度较高的结构被用作目标状态，而折叠程度较低的结构则作为前一状态，其接触图经编码后作为模型输入。目标状态通过基于 Frenet–Serret（FS）标架的 SE(3) 不变编码器⁴¹进行编码，同时纳入扩散步信息；该编码器在保持旋转和平移不变性的同时捕获局部几何特征。该编码器生成表征残基在蛋白质序列中位置的单体编码，以及捕获由 Cα 坐标计算得到的成对距离的配对编码。这些编码与经投影的 AF2 单体表示和配对表示相结合，为网络提供额外的输入信息。另一方面，前一状态以残基接触图表示，并融合至配对编码中，为折叠进程提供结构上下文。随后，融合后的单体表示和配对表示被输入采用不变点注意力（Invariant Point Attention，IPA）的 SE(3) 等变解码器，该解码器类似于 AlphaFold2（AF2）所使用的结构模块。解码器预测下一个折叠中间状态的 Cα 坐标，并通过逐残基 L2 距离损失将其与真实目标状态进行比较。由于训练过程中使用了多种不同的折叠构象作为目标状态，该模型能够有效学习蛋白质折叠过程中结构形成的一般演进规律。
我们在一个包含 940 种蛋白质的数据集上训练了 PathFold。
包含728,597帧SMD模拟数据（补充表S1），并在一个独立数据集上对其进行了验证，该数据集包含175个蛋白质及69,953帧SMD模拟数据（补充表S2）。训练集与验证集的划分确保了较低的序列冗余度，任意两个序列之间的序列一致性均不超过25%。在基准测试中，我们在包含175个蛋白质、共99,172帧SMD模拟数据的数据集上评估了PathFold（补充表S3）。SMD模拟的帧数与蛋白质长度成正比（补充图S2）。数据集构建的更多细节见方法部分。
在推理阶段，PathFold以完全伸展的蛋白质构象以及AF2的单残基表征和残基对表征作为起点。通过迭代预测下一个中间结构状态生成折叠轨迹，随后将该状态用作下一轮迭代的前一状态（补充算法2）。在每轮迭代中，扩散模型采用可配置的批次大小（设为10），通过单次前向采样同时生成多个下一状态的候选结构。这些采样结构构成一个候选池，并通过基于折叠进展的模型选择策略从中选出一个结构（见方法部分）。折叠进展定义为候选结构与折叠态结构之间的接触图相似性相较于上一轮迭代的变化。为促进折叠过程稳步推进并防止结构发生突变，每轮迭代均选择折叠进展低于预设阈值且进展最大的结构，作为下一个中间状态。除以单个前一状态作为输入的基础模型（称为PathFold-1模型）外，我们进一步
进一步开发了两种 PathFold 变体，分别纳入前序三个或六个中间结构（PathFold-3 和 PathFold-6 模型）。为生成折叠轨迹动画，首先使用基于局部 Cα 叉积的骨架手性判据，检查预测的中间结构相对于 AF2 预测的折叠结构是否发生镜像反转（补充算法 3）。通过对坐标系进行反射变换来校正镜像结构。随后，使用 PyMOL⁴² 的 morph 功能连接相邻结构，生成经插值的多状态轨迹，用于动画渲染（补充算法 4）。推理计算效率较高，PathFold 可在 45 分钟内为长度不超过 400 个残基的蛋白质生成折叠轨迹（补充图 S3）。
PathFold 预测的轨迹
我们首先展示 PathFold 生成的代表性折叠轨迹（图 2）。使用本研究开发的轨迹比对方法 PathScorer（方法），将预测轨迹与相应的 SMD 轨迹进行比对。PathScorer 基于帧间两两结构相似性评分，利用动态规划进行全局轨迹比对。结构相似性通过接触图进行量化，评分范围为 0 至 1，其中 1 表示接触图完全相同。
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图 2.
蛋白质折叠轨迹预测示例及其与相应 SMD 轨迹的比对。
SMD 轨迹（洋红色）与 PathFold 预测轨迹（青色）的比较。各列依次表示从伸展构象到折叠结构的连续时间步。绿色实线箭头表示两条轨迹中由 PathScorer 匹配的帧对，以及
黄色虚线箭头表示部分相邻帧对。数字为基于其接触图计算的相似性得分。
A，CsTAL3 的钙调蛋白样结构域（5X2E_A），含 80 个残基。SMD 轨迹包含 311 帧。中间各行展示 SMD 轨迹与预测轨迹在相应阶段的残基–残基接触图。底部热图展示 SMD 帧（x 轴）与预测轨迹状态（y 轴）之间的两两相似性得分。深蓝色表示比对得分更接近 1，浅蓝色表示比对得分更接近 0。红框标示与每个预测轨迹状态相似性最高的 SMD 帧。
B，CST 复合物亚基 TEN1（4JOI_D），含 116 个残基。SMD 轨迹包含 463 帧。
C，5-羧甲基-2-羟基黏康酸 δ-异构酶（4JJ9_B），含 151 个残基。SMD 轨迹包含 600 帧。
D，膜蛋白插入酶 YidC（5Y82_C），含 199 个残基。SMD 轨迹包含 799 帧。图 B–D 的接触图和比对热图见补充图 S6。
为便于理解比对得分的意义，我们为每个测试蛋白生成了五条独立的 SMD 轨迹，并计算了这些轨迹之间的两两比对得分。轨迹的两两比较结果见补充图 S4，得分分布汇总于补充图 S5。独立的 SMD 模拟并未产生完全相同的轨迹，但其平均比对得分较高，为 0.894。预测轨迹的得分略低，但仍具有可比性；使用前一帧、前三帧和前六帧的 PathFold 模型，其平均比对得分分别为 0.804、0.815 和 0.733。
图 2 展示了四个预测折叠轨迹的示例。第一个示例（图 2A）为 CsTAL3 的钙调蛋白样结构域（PDB ID：5X2E_A），含 80 个氨基酸残基。该结构
由五段较短的α螺旋组成，分别位于残基1–7（螺旋1）、19–26（螺旋2）、36–45（螺旋3）、51–58（螺旋4）和66–76（螺旋5）。SMD模拟中的折叠过程（洋红色）始于螺旋2和螺旋3，随后扩展至螺旋1区域，不过此时螺旋1尚未完全形成。之后形成螺旋4，轨迹最终以螺旋1的形成与螺旋5的折叠同时发生而告终。五条SMD轨迹的平均路径相似性得分高达0.925，彼此高度一致。在此示例中，预测的折叠轨迹（青色）与SMD轨迹高度吻合。图中显示了SMD轨迹与预测轨迹对应帧之间的相似性得分（绿色箭头），以及相邻帧之间的相似性得分（黄色虚线）。对应帧之间的得分高于相邻帧之间的得分，表明预测轨迹中的折叠进程清晰明确，且与SMD结果高度一致。中间一行展示了相应帧的接触图，为折叠过程中残基间相互作用的变化提供了另一视角。第三行以可视化形式展示了SMD轨迹（横轴）与PathFold轨迹（纵轴）中各帧的两两得分。红框标出了由PathScorer比对算法匹配的帧。总体而言，预测轨迹捕捉到了关键折叠事件，并与SMD结果高度吻合，获得了0.93的高比对得分。
下一个示例（图2B和补充影片1）为人端粒酶CST复合物亚基TEN1（4JOI_D；116个残基）。该蛋白含有螺旋体状β-折叠，其中包括位于残基25–96的五条β链（β1，残基30–36；β2，残基38–48；β3，残基50–56；β4，残基71–77；β5，残基80–90），以及位于C端的α螺旋（残基106–116）。该蛋白质的折叠过程具有顺序性。
完整的螺线体 β-折叠区域形成，随后螺旋发生折叠。在五条 MD 轨迹中，螺线体 β-折叠区域内部各部分的形成顺序有所不同：三条轨迹先形成 β1–β2 相互作用，随后形成 β3–β5；而另外两条轨迹则先形成 β3–β5，之后才形成 β1–β2。PathFold 预测的轨迹捕捉到了 β1–β2 优先形成的路径。在 PathFold 预测的 12 个帧中，第 4 帧形成了 β1–β2 相互作用，与相应 SMD 帧的相似性评分高达 0.95。完整的螺线体 β-折叠在第 7 帧完成折叠，与相应 SMD 帧的相似性极高，达到 0.995。最后，螺旋在第 8–12 帧形成。
图 2C 展示了一个 α/β 类蛋白质——5-羧甲基-2-羟基黏康酸 δ-异构酶（PDB ID：4JJ9_B）的折叠路径，该蛋白质含有 151 个残基。SMD 轨迹包含 600 个帧。作为一种 α/β 类蛋白质，其二级结构呈交替排列：β-链 1（残基 6–16）、α-螺旋 1（残基 26–38）、β-链 2（残基 45–56）、β-链 3（残基 81–91）、α-螺旋 2（残基 94–118）以及 β-链 4（残基 121–131）。对于该蛋白质，五条 SMD 轨迹均表现出高度一致的折叠模式，平均路径评分为 0.903。从伸展态开始，第一次主要折叠事件在 SMD 第 210 至 240 帧之间迅速发生，其特征是 α-螺旋 2 与 β-链 3 和 β-链 4 同时形成，并组装成初始折叠单元。随后，在第 390–435 帧期间，通过引入 α-螺旋 1 和 β-链 2，这一折叠中间体进一步扩展。最后，β-链 1 发生折叠并与现有结构堆积，在 SMD 第 480 至 600 帧之间完成天然 β-折叠构架。PathFold 成功捕捉到了这一折叠过程。
折叠路径。PathFold识别出α螺旋2和β链3–4的初始形成，对应于SMD第421帧，接触相似度为0.877。随后，PathFold捕捉到α螺旋1和β链2的并入，发生于第6至第8时间帧，分别对应SMD第478、491和516帧，接触相似度分别为0.874、0.915和0.979。最后，β链1并入预先形成的β折叠层，这一过程在第9时间帧被捕捉到，对应SMD第591帧，接触相似度为0.966。
最后一个例子（图2D）展示了PathFold预测与SMD轨迹并不完全一致的情况。目标蛋白为膜蛋白插入酶YidC（PDB ID：5Y82_C；199个残基），其在799个SMD帧内完成折叠，形成由15条β链（残基1–171）构成的β超夹层结构，后接两条C端α螺旋（残基175–181和186–196）。在分析中，我们将β超夹层结构划分为三个区域：区域1（残基12–48）、区域2（残基56–96）和区域3（残基116–150）。在全部五条SMD轨迹中，β超夹层结构均先于C端螺旋形成。然而，早期折叠事件的顺序有所不同：在三条轨迹中，区域2首先形成，并引发β超夹层结构的组装；在其余两条轨迹中，则是区域1首先形成。尽管存在这种差异，所有轨迹最终都汇聚于一个共同的晚期事件：区域3首先形成局部β折叠层，随后在第568至643帧之间整合进由区域1和区域2形成的折叠单元。
PathFold预测了一条在SMD轨迹中未观察到的折叠路径。具体而言，区域1–3在早期阶段（第3帧）独立形成；此后，区域2和区域3相互结合，形成一个中间折叠单元，随后该单元又纳入了
区域1，以完成β-超夹层结构。因此，在早期折叠阶段，与SMD轨迹的一致性有限；PathFold第3帧与SMD第582帧的接触相似度最高，为0.710。然而，β-超夹层结构组装完成后，PathFold便很好地再现了其余折叠事件。具体而言，PathFold第7–9帧中两个C端α螺旋的形成，分别与SMD第758、780和785帧相吻合，接触相似度分别为0.964、0.974和0.961。
多结构域蛋白的轨迹
接下来，我们展示多结构域蛋白折叠轨迹的实例（图3）。第一个实例是双结构域端粒保护蛋白1（POT1）（PDB ID：5UN7_A；图3A和补充影片2），该蛋白由302个残基组成，其折叠过程历经1,257个SMD帧。该蛋白包含一个寡核苷酸/寡糖结合（OB）折叠结构域（残基1–60和208–302）以及一个霍利迪连接酶解酶（HJR）结构域（残基61–207）；HJR结构域插入OB折叠结构域中⁴³。五条SMD轨迹高度一致（轨迹相似度得分平均值：0.896）。对SMD轨迹的分析揭示了一个层级式折叠过程。HJR结构域首先折叠，在SMD第282至735帧之间达到类天然构象。随后，OB折叠结构域的第二段（残基208–302）在第800至1127帧之间折叠，而OB折叠结构域的第一段（残基1–60）则在第761至1257帧之间折叠。这些观察结果共同表明，HJR结构域的形成先于完整OB折叠结构域的组装。PathFold成功捕捉到了该折叠路径上的主要事件。在第4帧，PathFold识别出HJR结构域的形成，其接触相似度为
与 SMD 第 814 帧的结构相似度为 0.849。随后，在第 6、7 和 8 帧捕捉到 OB 折叠结构域的折叠，其与 SMD 第 1037、1143 和 1194 帧的相似度分别为 0.953、0.934 和 0.924。
图 4A
展示了预测折叠中间态与天然结构之间的结构域特异性相似度。与 SMD 轨迹一致，HJR 结构域在较早帧便达到较高的相似度，而 OB 折叠结构域仅在较晚阶段才达到其天然构象。
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图 3.
多结构域蛋白质的轨迹示例。
SMD 轨迹（洋红色）与 PathFold 预测轨迹（青色）的比较。每列表示从拉伸构象到折叠结构的一个连续时间步。绿色实线箭头连接由 PathScorer 识别的匹配帧对，数字表示其接触图相似度分数。对于每种蛋白质，展示的是五条生成轨迹中对齐分数最高的 SMD 轨迹。
A，双结构域端粒保护蛋白 1（POT1）（PDB ID：5UN7_A），含 302 个残基；MD 轨迹 1 包含 1257 帧（图 4A 中以蓝色表示）。中间各行展示 SMD 轨迹与预测轨迹在各对应阶段的残基间接触图。底部热图显示 SMD 帧（x 轴）与预测轨迹状态（y 轴）之间的成对相似度分数。蓝色越深，表示对齐分数越接近 1；浅蓝色表示对齐分数越接近 0。红框标示每个预测轨迹状态对应的相似度最高的 SMD 帧。
B，铁载体生物合成蛋白 SbnI（PDB ID：5UJD_B），含 254 个残基。MD2 轨迹包含 1035 帧（图 4B 中以红色表示）。
C，细胞外溶质结合蛋白（PDB ID：5SV6_A），246
个残基。MD5的995帧（图4C中为橙色）。
D，拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）Toc75 POTRA结构域（PDB ID：5UAY_A），302个残基。MD1的1230帧（图4D中为蓝色）。B–D面板的接触图和对齐热图见补充图S7。
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图4. 基于结构域水平结构相似性的MD与PathFold折叠轨迹比较。
PathFold轨迹以蓝色圆点和连线表示，其中第0帧代表初始伸展状态，第10帧代表折叠结构。图中还展示了五条MD轨迹以供比较：MD1（蓝色）、MD2（红色）、MD3（绿色）、MD4（紫色）和MD5（橙色）。结构域相似度通过Dice相似度计算，即比较PathFold预测结构或MD帧中结构域的接触图与相应天然折叠结构中的接触图。
A，端粒保护蛋白1（POT1；PDB ID：5UN7_A），一种含有两个结构域的蛋白质，包括寡核苷酸/寡糖结合（OB）折叠结构域（残基1–60和208–302）以及Holliday连接解离酶（HJR）结构域（残基61–207）。OB折叠结构域的相似度显示在x轴，HJR结构域的相似度显示在y轴。
B，铁载体生物合成蛋白SbnI（PDB ID：5UJD_B），含有结构域1（残基1–83和205–240）、结构域2（残基84–204）和结构域3（残基241–254）。结构域1的相似度显示在x轴，结构域2的相似度显示在y轴。
C，细胞外溶质结合蛋白（PDB ID：5SV6_A）。该蛋白由两个结构域组成：结构域1（D1；残基1–77和195–246）和结构域2（D2；残基88–194）。结构域1的相似度显示在x轴，结构域2的相似度显示在y轴。
D. 拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）Toc75 POTRA结构域。
（PDB ID：5UAY_A）。该蛋白含有三个串联的多肽转运相关（POTRA）结构域：POTRA1（残基34–103）、POTRA2（残基104–193）和POTRA3（残基194–302）。POTRA2的相似性显示在x轴上，POTRA3的相似性显示在y轴上。
第二个例子是一个三结构域结构——铁载体生物合成蛋白SbnI（PDB ID：5UJD_B；图3B和补充影片3）43。该蛋白长254个残基，在1,035个SMD帧内完成折叠。该目标蛋白包含三个结构域：结构域1（残基1–83和205–240）、结构域2（残基84–204）和结构域3（残基241–254）。该蛋白的五条SMD轨迹呈现出两种不同的折叠路径（图4B）。其中四条轨迹（蓝色、红色、紫色和橙色）的折叠路径高度相似，而剩余一条轨迹中各结构域形成的顺序略有不同。在五条轨迹中观察到的主导折叠路径中，折叠始于结构域2的第一部分（残基84–170）的形成，该过程发生在SMD帧226至528之间。随后，结构域1的一段（残基20–65）在第530至571帧之间形成。之后，结构域2的其余部分在第580至728帧之间折叠，接着结构域1在第730至979帧之间达到其天然构象。最后，结构域3在折叠后期，即第980至1035帧之间形成。在剩余轨迹中观察到的另一条路径（绿色）中，结构域2在SMD帧190至620之间几乎完全折叠。随后，结构域1的两段在第630至979帧之间同时折叠，之后结构域3在第980至1035帧之间形成。尽管中间折叠事件的顺序有所不同，所有轨迹均表现出
总体趋势相同：结构域2最先形成，而结构域3最后形成。这种一致性表明，最早和最晚折叠事件的相对顺序在不同轨迹之间具有稳健性。
在PathFold预测的路径中，结构域2的形成在第4帧被识别，对应于SMD第593帧，结构相似性为0.795。随后，结构域1片段（残基20–65）的形成在PathFold第5帧被捕捉到，对应于SMD第778帧，相似性为0.863。最后，结构域3的形成在第9帧被识别，这与SMD第1012帧高度吻合，结构相似性高达0.963。总体而言，PathFold准确再现了5UJD_B的层级折叠过程，正确识别出结构域2的早期形成和结构域3的晚期形成。
第三个例子是胞外溶质结合蛋白（PDB ID：5SV6_A）⁴⁵，该蛋白包含246个残基，其SMD轨迹包含995帧（图3C）。该蛋白由两个结构域组成：结构域1（D1；残基1–77和195–246）以及结构域2（D2；残基88–194），二者由柔性β-折叠连接子（残基78–87）连接。对五条SMD轨迹的分析揭示了三种折叠模式（图4C）。五条MD轨迹的主要差异体现在覆盖残基6–60的D1亚区域的折叠行为上（图4C）。MD1（蓝色）和MD5（橙色）遵循几乎相同的折叠路径。在这两条轨迹中，D2首先折叠，随后是β-折叠连接子。在D1内部，6–60亚区域最后发生折叠（MD1对应SMD第788–808帧，MD5对应第807–875帧）。另外三条轨迹偏离了这一折叠路径。在MD2（红色）和MD4（紫色）中，6–60 D1亚区域作为独立的折叠中间体在更早阶段形成，位于SMD第帧
分别位于250–403帧和711–766帧，之后D1的其余部分才完成折叠。相比之下，在MD3（绿色）中，D1的6–60亚区从未形成独立的中间态，而是在SMD第789至876帧期间与D1的其余部分逐步协同折叠。
PathFold预测的轨迹与MD2（红色）和MD4（紫色）中观察到的另一种折叠路径最为相似。它首先预测D2在第3–4帧发生部分折叠。接着，D1的6–60亚区在第6帧形成一个独立的折叠单元，与SMD第713帧相对应，接触相似度为0.822。最后，β-折叠连接区和D1的其余部分在第7–9帧期间折叠。
最后，我们举例说明PathFold预测的折叠路径与SMD轨迹存在一定差异（图3D、图4D）。研究对象为拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）Toc75多肽转运相关蛋白（POTRA）结构域（PDB ID：5UAY_A）⁴⁶。该蛋白由302个残基组成，其SMD轨迹包含1,230帧。该结构含有三个串联的POTRA结构域：POTRA1（残基34–103）、POTRA2（残基104–193）和POTRA3（残基194–302）。五次SMD模拟的结果高度一致，平均轨迹相似度得分为0.937（图4D）。SMD轨迹显示了依次发生的结构域折叠过程：POTRA2首先在SMD第430–543帧期间折叠，随后POTRA3在第728–858帧期间折叠。之后，POTRA1最后在第879–1074帧期间折叠，从而形成天然的三结构域构型。
另一方面，PathFold预测POTRA3的一部分首先发生折叠（第5帧），随后是POTRA2。POTRA1最后折叠，这与SMD结果一致。在第4帧，PathFold预测形成了一个部分折叠的中间态，其核心位于POTRA2的残基151–193。然而，SMD轨迹中的对应阶段包含了
POTRA2快速折叠，且未呈现出可比的中间态。在第5帧，PathFold预测POTRA3已大体折叠，而SMD轨迹的对应阶段则以POTRA2的快速折叠为主。随后，POTRA2在第6帧折叠。最后，第7–9帧捕捉到POTRA1的逐渐折叠，这与SMD轨迹高度一致；其与SMD第1113帧和第1164帧的接触相似度分别为0.940和0.958。
PathFold三种模型的折叠路径预测
在此，我们比较了三种PathFold模型的整体比对分数。这些模型分别以前一帧、前三帧或前六帧中间结构作为输入，以预测折叠路径上的下一个结构（分别记为PathFold-1、PathFold-3和PathFold-6）（图5；各项数据见补充表S4–S6）。第一幅图（图5A）展示了比对分数和重新排序后的比对分数的分布。对于重新排序后的比对分数，根据各中间结构与AF2预测的折叠结构之间的相似性对预测轨迹重新排序，并使用PathScorer重新计算比对分数。推理过程中可以进行这种重新排序，因为AF2结构已生成并用于提供输入表征。在这三种模型中，PathFold-3的平均比对分数总体最高，其次是PathFold-1和PathFold-6。三种模型的平均比对分数分别为0.815、0.804和0.733，对应PathFold-3、PathFold-1和PathFold-6。根据预测的中间结构与天然结构之间的相似性对其重新排序后，三种模型的比对分数均有所提高。重新排序后的平均比对分数分别为0.840、0.848和0.848，对应于
分别对应 PathFold-1、PathFold-3 和 PathFold-6。PathFold-6 的提升幅度最大，表明该模型生成折叠进程非单调的轨迹更为频繁。
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图 5.
PathFold 预测路径的比对得分。
在 175 种测试蛋白质上，评估了三种 PathFold 模型的路径预测性能。这些模型分别以一个、三个或六个先前帧作为输入（分别为 PathFold-1、PathFold-3 和 PathFold-6）。
A， 比对得分及重排序后比对得分的小提琴图。重排序后比对得分是通过依据各中间结构与折叠态的接触图相似性对预测轨迹进行重排序后计算得到的（见正文）。内嵌箱线图显示中位数、四分位距及1.5倍四分位距。PathFold-1、PathFold-3 和 PathFold-6 的平均比对得分分别为 0.804、0.815 和 0.733；相应的重排序后比对得分分别为 0.840、0.848 和 0.848。
B，PathFold-1（红色）、PathFold-3（紫色）和 PathFold-6（绿色）的正向进展率分布。正向进展率指每次迭代生成的 10 个候选结构中，呈现折叠正向进展的结构所占比例（见正文）。
C，PathFold-1（红色）、PathFold-3（紫色）和 PathFold-6（绿色）的比对得分随蛋白质长度的变化。
图 5B 更清楚地显示了这一趋势。该图展示了正向进展率，用以衡量预测结构在每个预测步骤中是否向天然结构靠近。在每次迭代中，正向进展率定义为 10 个候选结构中比输入帧（或多个输入帧）更接近天然结构的结构所占比例。该值为
随后在一条轨迹的所有迭代中取平均值。预测结构与天然结构的接近程度通过二者接触图之间的 Dice 相似度来衡量。与另外两个模型相比，PathFold-6 的前向进展率分布偏向较低值。PathFold-1、PathFold-3 和 PathFold-6 的平均前向进展率分别为 0.784、0.678 和 0.325。当某次迭代生成的全部 10 个候选结构均比输入帧更远离天然结构时，我们便认为该预测步骤发生了倒退。PathFold-6 有 28.9% 的迭代步骤出现这种情况，显著高于 PathFold-1（15.1%）和 PathFold-3（13.0%）。我们还发现，PathFold-6 预测的轨迹更常表现出非天然样折叠行为，例如沿折叠路径发生过快或过慢的构象变化（补充表 S7）。为量化这些偏差，我们在 PathScorer 中实现了天然样轨迹评分，该评分会对上述三种非天然样行为进行惩罚（方法中的公式 5）。根据这一指标，PathFold-6 生成的轨迹得分显著低于 PathFold-1 和 PathFold-3 生成的轨迹（补充图 S8）。
有趣的是，尽管人们可能会认为 PathFold-6 表现最佳，因为能够利用更长的历史帧信息应当为折叠轨迹提供更丰富的信息，但它的表现却最差。一种可能的解释是，PathFold-6 可获得的有效训练信息较少。由于每次预测都以此前六个中间状态为条件，许多训练轨迹——尤其是短蛋白质的轨迹——所包含的信息不足以
帧以提供全部六个输入，因此缺失的输入需要用零填充。因此，PathFold-6 的训练样本中有 38.7% 包含一个或多个填充输入，而 PathFold-3 和 PathFold-1 中这一比例分别为 19.4% 和仅 6.5%。频繁使用填充输入可能减少了训练期间可利用的有效上下文信息，并导致 PathFold-6 的性能较差。
图 5C 显示了比对得分随蛋白质长度的变化情况。随着蛋白质长度增加，该得分略有下降。这一趋势符合预期，因为较长的蛋白质需要折叠的结构元件更多，而且通常包含多个结构域。
折叠轨迹的 Φ 值分析
最后，我们考察了 PathFold 对三种具有实验测定 Φ 值的蛋白质所预测的折叠轨迹。Φ 值是一种公认的指标，可用于表征蛋白质折叠的过渡态，并识别在折叠过程中较早形成类天然相互作用的残基^12。实验上，Φ 值通过点突变确定，并计算为突变引起的折叠活化自由能变化与蛋白质整体稳定性相应变化之比。接近 1 的值通常表明，在过渡态系综中，涉及突变残基的相互作用大体上具有类天然特征；而接近 0 的值则表明这些相互作用在很大程度上仍具有类变性特征。
为将 PathFold 轨迹与实验 Φ 值进行比较，我们根据天然接触形成的时间，计算了范围为 0 至 1 的残基层面折叠得分（见方法部分）。得分越高，表示该残基在预测的折叠轨迹中越早建立其类天然局部环境。
我们分析了三种实验研究充分的蛋白质，其实验测定值为】【。
有十余个残基的 Φ 值数据可供参考，包括 FBP28 WW 结构域（PDB ID：1E0L）36、冷休克蛋白 B（CspB；PDB ID：1CSP）37，以及泛素（PDB ID：1UBQ）38。实验 Φ 值取自 Petrovich 等人47、Garcia-Mira 等人48以及 Went 和 Jackson49的研究，并遵循 Ooka 等人50采用的流程。数据见补充表 S8–S10。
第一个例子（图 6A）是 FBP28 WW 结构域（PDB ID：1E0L），这是一种由 37 个残基组成、具有三股 β 折叠的蛋白质。实验结果显示，Gly16（红色）和 Thr18（黄色）的 Φ 值较高，分别为 1.00 和 0.84，表明在折叠过程中，第一处 β 发夹较早形成，β 链 2 也开始形成47。PathFold 定性地再现了这一模式。在时间戳 1，最高的接触比例集中在 β 转角 I 附近，包括 Ala14（残基分数：0.50）和 Asp15（0.67）；与此同时，β 链 1 和 β 链 2 内部的接触大多尚未形成（0.08 至 0.17）。至时间戳 2，接触的形成已扩展至整个第一处 β 发夹。与此一致，PathFold 折叠分数曲线（右上图）在 β 转角 I 附近达到峰值，Ala14（0.96）、Asp15（1.00）、Gly16（0.94）和 Thr18（0.66）的分数均较高，呈现出与 Φ 值曲线相似的模式。总体而言，β 链 1 和 2 中的残基 8–23 的平均折叠分数（0.79）显著高于其余残基（0.43），这表明 PathFold 轨迹与实验确定的高 Φ 值区域在定性上吻合。
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图 6.
与实验 Φ 值的比较。
将 PathFold 预测轨迹中观察到的折叠事件与三种蛋白质的实验 Φ 值进行比较。左：按残基测量的实验 Φ 值；
未有实验测量数据的残基不予赋值。中间：热图显示了 PathFold 各时间点上，每个残基形成的接触数占其在 AF2 预测折叠结构中接触数的比例。残基位置标示在 y 轴上，颜色刻度范围为 0（深紫色）至 1（黄色）。右上：PathFold 折叠得分（蓝色；见正文）与实验 Φ 值（红色虚线）的比较。PathFold 得分沿序列平滑处理并归一化至 0–1，而实验 Φ 值经平滑处理但未进行归一化。FBP28 WW 结构域和泛素采用两个残基的滑动平均窗口，冷休克蛋白采用三个残基的滑动平均窗口。右下：AF2 预测的折叠结构。
A，FBP28 WW 结构域（PDB ID：1E0L，37 个残基）。红色：Gly16；黄色：Thr18。
B，冷休克蛋白（PDB ID：1CSP，67 个残基）。红色：Lys7；黄色：Val26。
C，泛素（PDB ID：1UBQ，76 个残基）。红色：Thr7；黄色：Asp21。
第二个例子是冷休克蛋白 B（CspB；PDB ID：1CSP），一种由 67 个残基组成的五股 β 桶（图 6B）。实验 Φ 值表明其过渡态具有明显的极化特征：高值集中在 N 端 β1–β3 折叠片层，尤其是 Lys5、Val6、Lys7（红色）、Asn10 和 Val26（黄色），而 C 端 β4–β5 折叠片层则没有这种特征⁴⁸。Lys7–Asp25 相互作用也被认为参与了 β3 的早期对接⁵¹。PathFold 定性地再现了这一模式。在时间点 2，β1–β3 的平均接触比例高于其余区域（0.38 对 0.22），且 Lys7–Asp25 接触已形成。折叠得分曲线同样显示 β1–β3 得分较高（β1：残基 2–10；β2：14–19；β3：26–30），其平均得分为 0.72，而其余残基为 0.55。
Lys7（0.87）、Asn10（0.98）、Asp25（0.73）和Val26（0.68）的得分尤其高，支持N端β折叠片层较早形成，这与实验Φ值一致。
第三个例子是泛素（PDB ID：1UBQ），一种由76个残基组成的α/β蛋白（图6C）。实验Φ值表明，其过渡态具有极性，涉及N端β发夹（残基1–17）和主要α螺旋（残基23–34）；Thr7（红色）和尤其是Asp21（黄色）的Φ值较高，而残基41–69的Φ值则普遍较低⁴⁹,⁵²,⁵³。PathFold重现了这一总体上的N端优先折叠模式，但残基水平的一致性不如前述例子显著。至时间戳4时，β发夹和α螺旋的平均接触分数分别达到0.45和0.43，形成了类似天然态的构象排列。与此一致，残基1–35的平均折叠得分显著高于残基36–76（0.66对0.23）。尽管由于残基18–23与C端区域存在广泛接触，其得分有所下降，但残基31–35的得分尤其高（平均值为0.91）。总体而言，PathFold预测N端β发夹–螺旋区域较早组装，这在定性上与实验推断的折叠核心一致。
讨论
我们提出了PathFold，这是一种基于扩散模型的框架，仅利用序列信息即可预测蛋白质从未折叠状态到天然构象的折叠轨迹。据我们所知，这是首个旨在生成完整、有序蛋白质折叠路径的深度学习方法。PathFold能够生成渐进式中间构象，其预测轨迹与SMD模拟结果高度一致。此外，根据预测的……推导出的残基水平折叠得分
这些轨迹总体上再现了实验 Φ 值的变化趋势，表明生成的路径捕捉到了折叠过程中的有意义特征。
开发蛋白质折叠数据驱动模型面临的一项根本挑战，是缺乏大规模的原子级折叠轨迹数据集。在原子分辨率下通过实验观测完整的折叠过程十分困难，而要以足够大的规模通过计算生成自发折叠轨迹，成本仍高得令人难以承受。因此，我们采用反向 SMD 解折叠轨迹，作为开发和评估轨迹学习方法的一种实用替代方案。尽管这些轨迹并不等同于真实的折叠路径，也无法再现其动力学或热力学特征，但它们提供了有序的构象转变，可用于检验深度学习能否学习结构轨迹，而非仅仅学习其端点。因此，PathFold 为方法学研究奠定了基础；随着适用数据集的逐步出现，这一方法可用于真实的折叠轨迹。
我们还开发了轨迹对齐和相似性度量方法，用于定量比较分子路径，因为相似的结构事件可能出现在不同的时间点。这些度量方法依据结构进程而非模拟时间对齐轨迹，从而能够比较中间构象和折叠事件。PathFold 与这些评估方法共同构成了一个用于蛋白质折叠及其他动态分子过程的数据驱动建模框架。
未来仍有若干研究方向。首先，PathFold 目前在 Cα 层级运行，因此不会显式建模影响折叠动力学的侧链相互作用。此外，尽管当前的折叠
进程判据能够稳定轨迹生成并防止出现突兀的结构转变；若进一步纳入更符合物理实际的能量或热力学约束，则可进一步提高预测路径的真实性和稳健性。最后，只要有合适的训练数据集，该框架便可轻松扩展至其他类型的分子轨迹，例如蛋白质–配体结合和构象转变。
更广泛而言，PathFold 等机器学习方法凸显了人工智能驱动的方法在补充传统生物物理模拟方面日益增长的潜力。基于机器学习的分子建模近期进展已展现出加速构象采样⁵⁴、学习广义分子动力学模式⁵⁵的能力；仅依靠传统分子动力学模拟，这些任务仍面临计算上的挑战。此类进展最终或将推动细胞系统的大规模模拟⁵⁶，从而更高效地研究折叠、结合、构象转变以及生物分子组装动力学。
作者贡献
DK 构思了本研究。Z.Z 设计并实现了 PathFold 流程。Y.K. 制备了 SMD 数据。Z.Z 完成计算并分析了数据。N.I 设计并实现了比对评分。Z.Z 和 Z.X. 分析了 Φ 值实验。P.P 参与分析了折叠轨迹数据。Z.Z、Y.K、N.I 和 Z.X. 撰写了论文初稿。D.K. 对论文进行了严格审阅。所有作者均阅读并批准了稿件。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
方法
数据集构建
我们采用了先前工作⁴⁰中所述的分子动力学模拟。数据集取自 PISCES⁵⁷ 2019 年 1 月版本，并筛选出序列一致性低于 25% 且
分辨率≤2.5 Å。排除长度短于25个残基、含有非标准残基以及在2018年5月14日之后发布的结构（CASP13 截止日期）。移除缺口超过2个残基的结构；使用 MODELLER⁵⁸ 对较小的缺口进行建模，并仅保留相对于原始结构的 Cα-RMSD <2.0 Å 的结构。进一步排除打结蛋白以及在拉伸模拟过程中未能完成的条目，最终得到6,718条蛋白质链。为提高计算效率，随机选取1,290个长度≤400个残基的蛋白质用于训练、验证和测试。
牵引分子动力学（SMD）模拟
SMD模拟方案基于我们此前的工作⁴⁰。所有分子动力学（MD）模拟均使用 NAMD⁵⁹ 执行，时间步长为1 fs。首先，使用 VMD⁶¹ 中的 autopsf 工具，基于 CHARMM36 力场⁶⁰ 对每种蛋白质进行参数化，并禁用二硫键的形成。设置 SMD 时，固定 N 端残基的 Cα 原子，并沿连接两端的单位化向量牵引 C 端残基的 Cα 原子。采用广义 Born 隐式溶剂（GBIS）模型，通过10,000步共轭梯度法进行能量最小化。随后进行生产阶段的 SMD 模拟，对 C 端 Cα 原子施加弹簧常数为7 kcal/mol/Ų、恒定牵引速度为0.001 Å/fs的牵引。每种蛋白质的总模拟时长按下式确定：
其中，Nres 为残基数，Dinit 为初始 Cα–Cα 距离；假设伸展链中每个残基占据3.5 Å，并乘以1.2作为20%的安全裕度。对于每种蛋白质，均从同一初始 PDB 结构出发，独立重复完整流程五次，每次均先进行能量最小化，再进行 SMD 模拟。坐标
每隔 1 ps 保存一次，以供分析。
轨迹比对评分
为量化两条折叠轨迹的相似性，我们开发了 PathScorer，利用动态规划（DP）对两条轨迹进行全局比对⁶²。在每一步比对中，使用基于接触图的评分评估不同构象之间的结构相似性。PathScorer 的设计受到先前应用 DP 比较 MD 轨迹的研究启发⁶³，但其专门用于比较从未折叠构象到天然构象的完整折叠轨迹。它不采用全局均方根偏差（RMSD），而是使用归一化接触图相似性和轨迹感知型间隙惩罚，从而能够稳健地比对速率、持续时间和局部方向性各异的折叠路径。
形式上，设一条 MD 轨迹为 T = {t₁, t₂, …, tₙ}，其采样间隔为 dt，其中 tᵢ 表示第 i 个时间点的蛋白质结构。同样，PathFold 预测的轨迹为 P = {p₁, p₂, …, pₘ}，但其生成步长为 Δt。我们旨在计算评分 score(P, T)，以量化两条轨迹之间的相似性。在我们的方法中，dt < Δt，这意味着 n > m。为比较这两条轨迹，我们分别从中采样长度相等的子序列 k（= min(n, m) = m）：
以及
。利用相似性度量
，我们计算匹配帧之间的相似性，并可加入惩罚项，以鼓励选择合理且有意义的子序列。
比较两种构象时，均方根偏差（RMSD）并不适合用于比较折叠轨迹，因为较大的构象变化可能导致数值高度波动，无法可靠地反映折叠进程。因此，我们采用接触图相似性，它能够自然地捕捉
折叠过程中残基间相互作用的形成。如果两个残基的 Cα 原子之间的距离小于 14 Å，且它们在序列中的位置相隔至少三个残基，则认为这两个残基接触。两个结构之间的相似性定义为它们共有的接触数，并以天然折叠结构中共有的接触数进行归一化：
其中，cm1、cm2 是来自两条不同折叠轨迹的两个接触图，native 对应最终折叠结构。∩表示两者共有的接触。在统计共有接触时，我们只考虑处于接触状态的残基对，而忽略未接触的残基对（例如，处于伸展构象时）。以天然折叠结构中共有的接触数进行归一化后，完全匹配时的得分上限为 1。
由于预测轨迹和真实轨迹所含帧数不同，对齐过程中不可避免地会出现间隙。PathFold 每隔 50 帧预测一次结构，因此，对于跨度不超过 50 帧的间隙，不施加惩罚。对于更长的间隙，间隙延伸惩罚依据间隙两端的结构距离定义，而非采用传统的线性模型；后者不适用于折叠轨迹中观察到的高度可变的构象变化速率。结构距离通过接触图之间的 Dice 距离量化；实验表明，该距离能够稳健地衡量构象变化。
DP 的递推关系如下：
其中，间隙阈值设为 50。利用该动态规划递推关系，可计算全局比对得分 DP(n,m)，并以匹配数（即较短轨迹的长度）进行归一化，从而得到介于 0 和 1 之间的得分。因此，
此外，我们还开发了一种新的比对指标——天然态相似性。
轨迹评分用于惩罚预测折叠轨迹中不符合天然行为的情况。该评分仅用于评估路径比对，不影响比对过程本身。尽管上述比对方法能够稳健地衡量轨迹相似性，但 PathFold 偶尔会生成进展过快、过慢，甚至折叠进程发生逆转的轨迹。类天然轨迹评分根据连续预测帧之间与天然折叠结构的相似性变化，对这些行为施加启发式惩罚。具体而言，变化超过预设阈值的情况被归类为快速转变，低于阈值的情况被归类为缓慢转变，而负向变化则被视为折叠进程逆转。相应的惩罚定义如下：
快速转变和缓慢转变的阈值分别设为 0.2 和 0.01。这些值是根据对约 30 条预测轨迹的人工审查，通过启发式方法确定的。具体而言，连续帧之间相似性增幅超过 20% 的转变被归类为快速转变，而增幅低于 1% 的转变则被归类为缓慢转变，并受到惩罚。
类天然轨迹评分通过将 DP 比对得分与这些额外惩罚相结合得到：
我们将 \(w_{\mathrm{fast}}\)、\(w_{\mathrm{Slow}}\) 和 \(w_{\mathrm{back}}\) 均设为 0.1。这些权重同样通过启发式评估选定。我们人工审查了预测效果较差的轨迹，并设定权重值，以使其得分分布与理想预测的得分分布明显区分开来。
PathFold 模型的训练
PathFold 是一种以 AF2 嵌入和一个……为条件的去噪扩散概率模型（DDPM）框架。
中间折叠状态。PathFold 生成后续中间折叠状态，推动蛋白质朝折叠完成的方向演变。
PathFold 的输入由前一状态和目标状态构成，二者均表示为从 SMD 模拟中提取、相隔 50 帧的 Cα 结构。在训练过程中，PathFold 经过优化，以预测正向折叠进程，其中折叠程度较低的结构作为前一状态，折叠程度较高的结构作为目标状态。首先，将 Cα 坐标转换为 Frenet–Serret（FS）标架；该标架根据主链几何结构导出的旋转矩阵和平移向量来表示每个残基。随后，利用 SE(3) 不变编码器处理这些标架。该编码器基于逐残基标架、残基索引的正弦编码以及扩散时间步，生成单残基编码和成对编码。然后，将所得的单残基编码和成对编码与 AF2 的单残基表示和成对表示融合。具体而言，给定大小为 \(L \times H\) 的单残基嵌入和大小为 \(L \times L \times H\) 的成对嵌入，其中 \(L\) 为蛋白质长度，\(H\) 为隐藏维度；通过线性投影层将 AF2 表示映射至与不变编码器输出相同的嵌入维度。为编码中间折叠状态，先将前一结构转换为接触图：若两个残基的 Cα–Cα 距离小于 10 Å，则将其视为接触。接触图经由两个由 3×3 卷积层构成的 ResNet 模块处理，生成大小为 \(L \times L \times H\) 的成对嵌入。随后，将这些嵌入与投影后的 AlphaFold 成对表示逐元素相加，为解码器提供结构上下文。
PathFold 使用 PyTorch 实现。训练大约需要…
在一块配备 48 GB 显存的 NVIDIA RTX 6000 GPU 上运行了八周。我们的实现基于 Genie 框架^39，并针对折叠轨迹预测对其架构进行了改造。我们使用 AdamW 优化器训练模型，学习率为 1e−3，批大小为 4，并进行 8 步梯度累积。我们使用 AlphaFold 的官方实现（https://github.com/google-deepmind/alphafold）运行 AF2，以生成单体表示和成对表示，并将其用作 PathFold 的结构先验。
折叠轨迹生成
在每次迭代中，PathFold 通过单次扩散采样同时生成 10 个候选结构。为促进平滑且符合物理规律的折叠路径，我们使用候选结构与折叠结构之间的 Dice 相似度对候选结构进行评估，其定义如下：
其中，c₁ 和 c₂ 分别表示候选结构和折叠结构的接触图。如果两个残基的 Cα 原子间距离小于 14 Å，则认为这两个残基相互接触。仅当候选结构与根据 AF 嵌入预测得到的折叠结构之间的相似度相较于前一次迭代有所提高，且增幅低于预定义阈值（0.01）时，才接受该候选结构，从而避免出现较大的结构跳变。在所有被接受的候选结构中，选择朝向折叠状态取得最大前向进展的结构。如果没有候选结构满足这些条件，则采用回退策略，选择相似度下降幅度最小的结构。随后，将选定的结构作为下一次迭代的起始点，并重复这一过程，直至其与折叠构象之间的相似度达到 0.95 的阈值。该过程在保留有意义的中间状态的同时，促进折叠过程以单调且渐进的方式进行。
在残基水平分析折叠轨迹
根据 PathFold 预测的折叠轨迹，我们通过考察各时刻已形成的天然接触比例，评估轨迹中残基的天然性。对于轨迹帧 \(j\) 中的残基 \(i\)，天然接触比例的计算方式如下：
其中，\(N_{\mathrm{nat}}(i)\) 表示天然结构（由 AF2 预测的结构）中残基 \(i\) 形成的接触数，\(N(j,i)\) 表示在帧 \(j\) 中仍然存在的这些接触数。
与式（2）一致，当两个残基的 Cα-Cα 距离小于 14 Å 时，视为二者接触。序列上相隔不超过三个残基的残基对不纳入考虑。随后，通过对所有帧中的 \(F_{\mathrm{cont}}\) 累积求和，计算残基 \(i\) 的残基折叠得分：
如果某残基在折叠早期便建立起其天然接触环境，并在整个折叠轨迹中保持该环境，则其残基折叠得分将接近 1。
致谢
我们感谢 Steven Hayward 教授就蛋白质轨迹形变提供的宝贵讨论和技术建议。本研究部分由美国国立卫生研究院（R35GM158267、R01GM133840、R21AI187928）和美国国家科学基金会（IIS2211598、DMS2151678、DBI2146026 和 DBI2422620）资助。
资助方信息声明
美国国立卫生研究院，https://ror.org/01cwqze88，R01GM133840、R35GM158267、R21AI187928
美国国家科学基金会，IIS2211598、DMS2151678、DBI2146026、DBI2422620
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PathFold：仅凭蛋白质序列预测完整的蛋白质折叠路径
Zicong Zhang，Nabil Ibtehaz，Yuki Kagaya，Ziyi Xu，Pranav Punuru，Daisuke Kihara
bioRxiv
2026.08.26.747321；
doi：https://doi.org/10.64898/2026.08.26.747321
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PathFold：仅凭蛋白质序列预测完整的蛋白质折叠路径
Zicong Zhang，Nabil Ibtehaz，Yuki Kagaya，Ziyi Xu，Pranav Punuru，Daisuke Kihara
bioRxiv
2026.08.26.747321；
doi：https://doi.org/10.64898/2026.08.26.747321
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