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从头转录组组装是在缺乏高质量基因组的非模式植物中构建参考转录组的标准方法，但短读长组装难以解析全长转录本异构体。长读长 Iso-Seq（PacBio）可直接获取全长转录本，但对于将其用作主要参考以及下游组装流程的选择，目前仍缺乏充分的基准评估。本研究针对非模式物种 Moricandia arvensis (L.) DC.（十字花科）的花和叶两个器官，构建了不依赖基因组的 Iso-Seq 参考转录组，并系统比较了结合 Iso-Seq 聚类、CD-HIT 去冗余和 Cogent 图重建的不同流程策略，以 BUSCO 完整性、RSEM 短读长比对和 TransDecoder 开放阅读框（ORF）完整性为基准进行评估。我们发现，最优流程具有器官特异性。对于花，先进行 CD-HIT 预过滤，再进行 Cogent 重建，可获得高质量参考转录组（BUSCO 完整率为 95.3%）。对于叶，相同的 Cogent 步骤则产生了负面影响：由于错误地合并了不同基因，BUSCO 完整率从 90.1% 降至 78.0%；因此，最终保留采用 95% 序列一致性阈值进行 CD-HIT 去冗余、不进行重建的方案。我们将这一差异追溯至器官特异性的输入数据特征：叶转录本的全长读段分布呈现极端的表达偏斜，且基因主要仅有单一异构体支持，导致 Cogent 图算法缺乏所需的多异构体证据。我们发现，全长读段在最高表达转录本中的集中程度可在重建前预测流程的适用性，而每个转录本的读段深度仅构成必要但不具区分能力的最低要求。由于叶参考转录组缺乏基因层级结构，我们进一步恢复了基因与异构体的分组关系，所采用的方法为表达感知型读段聚类（Corset）在保持完整性的同时，恢复了古多倍体基因组预期具有的旁系同源基因结构，且优于仅基于序列的聚类方法。我们的结果为非模式植物物种构建全长参考转录组提供了一个稳健且不依赖参考基因组的框架，并表明应针对不同器官分别评估分析流程的选择，而不应假定同一流程适用于所有器官。
非模式植物物种从头转录组组装中长读长 RNA 测序的基准评估：来自 Moricandia arvensis 的启示 | bioRxiv
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对于缺乏高质量基因组的非模式植物，转录组从头组装是构建参考转录组的标准方法，但短读长组装难以准确解析全长转录本异构体。长读长 Iso-Seq（PacBio）可直接获取全长转录本，但将其用作主要参考数据以及如何选择下游组装流程，仍缺乏充分的基准评估。本研究在不依赖基因组的条件下，为非模式物种 Moricandia arvensis (L.) DC.（十字花科）的花和叶两种器官构建了 Iso-Seq 参考转录组，并系统比较了结合 Iso-Seq 聚类、CD-HIT 去冗余和 Cogent 基于图的重建的不同流程策略，以 BUSCO 完整度、RSEM 短读长比对和 TransDecoder 开放阅读框（ORF）完整度作为基准评估指标。我们发现，最优流程具有器官特异性。对于花，先使用 CD-HIT 进行预过滤，再使用 Cogent 进行重建，可获得高质量的参考转录组（BUSCO 完整度为 95.3%）。对于叶，同样的 Cogent 步骤却产生了负面影响，因错误合并不同基因而使 BUSCO 完整度从 90.1% 降至 78.0%；因此，最终保留了仅使用序列一致性阈值为 95% 的 CD-HIT、而不进行重建的流程。我们将这一差异追溯至器官特异性的输入数据特征：叶转录本的全长读段所反映的表达分布极度偏斜，且基因主要仅有单一转录本异构体的支持，使 Cogent 的图算法缺乏
其所需的多异构体证据。我们发现，在转录本重建之前，全长读段在最高表达转录本中的集中程度可预测分析流程的适用性，而每个转录本的读段深度则是必要但不具区分力的最低要求。由于叶片参考转录组缺乏基因层级结构，我们进一步利用考虑表达信息的读段聚类方法（Corset）恢复了基因与异构体的分组关系；该方法在保持完整性的同时，恢复了古多倍体基因组预期具有的旁系同源基因结构，并优于仅基于序列的聚类方法。我们的结果为非模式植物物种构建全长参考转录组提供了稳健且不依赖基因组的框架，并表明必须针对各个器官评估分析流程的选择，而不能假定一种流程适用于所有器官。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
已声明的资助方信息
西班牙科学与创新部
，PID2021-126456NB
，PID2025-168039NB
，IE2017-5537
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版权
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本预印本依据
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Francisco
Perfectti
bioRxiv
2026.09.08.750093；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.09.08.750093
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2026.09.08.750093；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.09.08.750093
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关键词：长读长RNA测序 · 转录组从头组装 · 非模式植物 · 流程基准评估 · 器官特异性 · 转录本聚类
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.08.750093v1?rss=1