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尽管生物治疗药物的体内合成已取得广泛成功，但其受到细胞生物学限制，以及实施从发现到生产制造的整个流程所涉及的复杂性、时间和成本的制约。无细胞表达系统（cell-free expression systems，CFES）利用细胞的转录和翻译机制在体外表达蛋白质，为该流程提供了一种有望提高稳健性和模块化程度的替代方案。然而，目前基准水平的CFES生产率远低于输入核苷酸和氨基酸的理论产能。由于既往研究表明，无细胞裂解液中的代谢酶会造成显著的背景代谢活性，并影响蛋白质表达，因此，人们对CFES中除基因表达之外的酶活性程度了解有限，这阻碍了应对这一问题的相关努力。在本研究中，我们提出，蛋白质表达的拐点是CFES代谢的一个关键时间尺度。我们对CFES反应进行了代谢组学表征，发现拐点处发生了显著的代谢变化。受这些发现的启发，我们试图确定可添加到无细胞反应体系中以避免代谢限制的补充物。我们发现，只有在拐点之后添加氨基酸时，氨基酸补充才会提高表达生产率和持续时间；而在拐点之前添加氨基酸实际上会损害表达。对于其他一些代谢物，我们也发现了类似的补充时机影响。这些发现表明，内源性代谢与补充时机之间存在密切关联，是优化CFES时必须重点考虑的因素；同时，受代谢组学指导的补料分批补充是一种具有潜在价值的策略，可用于提高反应生产率。
尽管生物治疗药物的体内合成已取得广泛成功，但其受到细胞生物学限制，以及实施从发现到生产制造的整个流程所涉及的复杂性、时间和成本的制约。无细胞表达系统（cell-free expression systems，CFES）利用细胞的转录和翻译机制在体外表达蛋白质，为该流程提供了一种有望提高稳健性和模块化程度的替代方案。然而，目前基准水平的CFES生产率远低于输入核苷酸和氨基酸的理论产能。由于既往研究表明，无细胞裂解液中的代谢酶会造成显著的背景代谢活性，并影响蛋白质表达，因此，人们对CFES中除基因表达之外的酶活性程度了解有限，这阻碍了应对这一问题的相关努力。在本研究中，我们提出，蛋白质表达的拐点是CFES代谢的一个关键时间尺度。我们对CFES反应进行了代谢组学表征，发现拐点处发生了显著的代谢变化。受这些发现的启发，我们试图确定可添加到无细胞反应体系中以避免代谢限制的补充物。我们发现，只有在拐点之后添加氨基酸时，氨基酸补充才会提高表达生产率和持续时间；而在拐点之前添加氨基酸实际上会损害表达。对于其他一些代谢物，我们也发现了类似的补充时机影响。这些发现表明，内源性代谢与补充时机之间存在密切关联，是优化CFES时必须重点考虑的因素；同时，受代谢组学指导的补料分批补充是一种具有潜在价值的策略，可用于
提高反应生产率。
作者声明不存在利益冲突。
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关键词：无细胞表达系统 · 大肠杆菌 · 代谢组学 · 蛋白质表达 · 补料时机 · 代谢调控
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.26.746766v1?rss=1