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内容形式：摘要译文
反向遗传学系统对于在广泛的转化研究和基础研究流程中实现病毒的精确操纵至关重要。在本研究中，我们比较了环状聚合酶延伸反应（circular polymerase extension reaction，CPER）、Gibson组装和感染性亚基因组扩增子（infectious subgenomic amplicons，ISA）在无细菌条件下挽救正义链RNA病毒方面的效果。通过优化CPER，我们实现了更快的病毒挽救和更高的病毒产量。我们进一步探究了通过引入替代启动子和非编码元件来提高不同正义链RNA病毒科挽救效率的策略。为评估埃及伊蚊多聚泛素启动子（Aedes aegypti polyubiquitin promoter，AePUb）与锤头状核酶（hammerhead ribozyme，HH Rbz）及聚合酶暂停位点联合应用于昆虫细胞中病毒挽救的性能，我们利用一种20 kb的昆虫特异性中病毒构建了新的荧光报告基因组。使用AePUb和HH Rbz时，通过CPER在体外挽救该中病毒仅需1天；相比之下，使用最小OpIE2-CA启动子则需4天。我们还评估了这些元件在昆虫细胞中（使用AePUb）挽救正黄病毒属病毒——Binjari病毒（BinJV）和登革病毒2型（DENV-2）的效果；以及在哺乳动物细胞中（使用CMV启动子）启动DENV2和SARS-CoV-2的效果。AePUb启动子和HH Rbz均改善了BinJV和DENV-2的挽救效果。然而，对于DENV-2和SARS-CoV-2，将HH Rbz和聚合酶暂停位点添加到CMV连接片段中，与标准CMV启动子系统相比均未产生显著差异，这凸显了应用这些元件所具有的情境特异性优势。总而言之，我们证明了一种强效的组成型启动子系统和一种锤头状核酶
显著提高利用CPER拯救正链RNA病毒的效率。
关键词：正链RNA病毒 · 反向遗传学 · 病毒拯救 · 环状聚合酶延伸反应 · 荧光报告基因组 · 昆虫细胞
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.08.25.746995v1?rss=1