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突触的精确形成确保神经系统实现正确的连接与功能。突触黏附分子通过连接突触前和突触后细胞，调控特异性突触的形成。尽管突触黏附分子发挥着这一核心作用，但人们对其如何在细胞内组织并传递信号以构建突触核心结构，仍知之甚少。在此，我们发现秀丽隐杆线虫突触黏附分子 SYG-1 的胞质尾部存在多个酪氨酸磷酸化位点，这些位点对于启动突触前结构形成至关重要。我们确定，SRC-1 和 SRC-2 酪氨酸激酶以冗余方式负责 SYG-1 的磷酸化，因此对突触前结构组装至关重要。处于磷酸化状态的 SYG-1 分子在更大的 SYG-1 分子群中形成簇集，这些簇集标记了突触前活性区组装的位置。利用 SH2 结构域衔接蛋白和 WSP-1 在体外重构 SYG-1 簇集，揭示了一个动态的生物分子凝聚体形成系统。在体内阻断磷酸酪氨酸衔接蛋白和凝聚体形成，会导致 SYG-1 簇集消失、突触前结构形成缺陷以及神经递质传递受损。我们得出结论：一部分突触黏附分子的磷酸化会激活并促使其组织成基于凝聚体的簇集，从而启动突触前结构的形成。
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酪氨酸磷酸化诱导的生物分子凝聚体形成激活并组织突触黏附分子信号传导
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Wu
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Morales
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Li
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Nathan A.
McDonald
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https://doi.org/10.64898/2026.08.25.747070
Shenghan Wu
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，佐治亚州亚特兰大，
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Nicole A. Morales
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摘要
突触的精确形成确保了神经系统的正确连接与正常功能。特异性突触的形成由连接突触前、后细胞的突触黏附分子调控。尽管如此，
尽管黏附分子发挥着核心作用，但对于其如何在细胞内组织并传递信号以构建突触核心结构，目前仍知之甚少。在此，我们鉴定出秀丽隐杆线虫（C. elegans）突触黏附分子SYG-1胞质尾部的多个酪氨酸磷酸化位点，这些位点对启动突触前结构的形成至关重要。我们确定，酪氨酸激酶SRC-1和SRC-2以功能冗余的方式负责SYG-1的磷酸化，因此对突触前结构的组装至关重要。磷酸化的SYG-1亚群在更大的SYG-1分子群体内呈簇状定位，这些簇标记了突触前活性区的组装位点。利用含SH2结构域的衔接蛋白和WSP-1在体外重构SYG-1簇，揭示了一个可形成动态生物分子凝聚体的系统。在体内阻断磷酸酪氨酸衔接蛋白的作用及凝聚体的形成，会导致SYG-1簇丧失、突触前结构形成缺陷以及神经递质传递受损。我们得出结论：突触黏附分子某一亚群的磷酸化可将其激活，并使其组织成基于凝聚体的簇，从而启动突触前结构的形成。
引言
神经系统发育通过突触连接，协调神经元精确连接并形成回路¹。突触使信息能够在神经元之间快速传递和转换。突触的位置和特性最终决定了构成神经系统的神经回路的功能。
各类化学突触均具有典型的结构：突触前末梢与突触后特化结构直接相对，两者之间由突触间隙分隔。突触前末梢组装形成核心活性区结构，该结构组织钙通道、释放装置以及突触囊泡池²˒³。该
突触后结构形成突触后致密区（postsynaptic density，PSD），以组织神经递质受体⁴。研究表明，这些结构均可通过液–液相分离形成生物分子凝聚体⁵，即从细胞质中去混合而形成的蛋白质富集组装体⁶˒⁷。核心活性区支架蛋白SYD-2/Liprin-α、ELKS、RIM和RIM-BP驱动活性区凝聚体的形成⁸–¹¹。突触囊泡蛋白Synapsin和突触素Synaptophysin进一步将突触囊泡池包裹在液态凝聚体中¹²˒¹³。包括PSD-95和SynGAP在内的突触后支架蛋白通过相分离形成凝聚体，这些凝聚体对PSD的形成和功能至关重要¹⁴–¹⁶。突触凝聚体的形成对构建突触结构至关重要，而凝聚体的性质也会影响突触功能¹⁷。
突触的核心结构形成于特定的亚细胞位点和特定细胞之间。据推测，突触细胞黏附分子（synaptic cell adhesion molecules，SAMs）在突触组装的上游发挥作用，并指导这一过程¹˒¹⁸。SAMs在形成突触连接的细胞之间相互结合，并可能通过双向信号传导促进突触的形成与塑造。目前已鉴定出多种能够选择合适的伙伴细胞并启动突触形成的突触细胞黏附分子，包括Neurexins¹⁹、Neuroligins²⁰、Teneurins²¹、Latrophilins²²、LAR型受体蛋白酪氨酸磷酸酶（LAR-RPTPs）²³、Ephrin及Eph受体²⁴、多种含免疫球蛋白（Ig）结构域的黏附分子²⁵˒²⁶等。这些分子通过胞外相互作用结构域结合，赋予突触伙伴选择以特异性，并控制突触形成的亚细胞位置。SAMs的高度多样性构建了极其复杂的相互作用组¹。例如，LAR-RPTPs与多种
不同的突触后细胞黏附分子（CAM），包括TrkC²⁷、突触黏附样分子（SALM）²⁸、Slit-trk家族蛋白²⁹和Netrin-G配体3³⁰。此外，不同的突触黏附分子（SAM）对特定细胞类型和突触具有特异性³¹。因此，复杂的SAM编码协同调控突触连接。
尽管在揭示驱动突触特异性的SAM胞外相互作用方面已取得显著进展，但这些分子随后如何在细胞内传递信号以指导突触核心结构形成，仍不甚清楚¹。目前，已从某些CAM（如突触前LAR型蛋白酪氨酸磷酸酶（LAR-PTP））出发，绘制出细胞内蛋白质相互作用网络³²。这些相互作用会影响突触的结构和功能，但其是否驱动突触的初始形成尚不明确。近期研究还表明，某些SAM在锚定基于凝聚体形成的突触结构中发挥直接作用。突触前Teneurin3的胞内结构域能够整合到RIM和RIM-BP凝聚体中³³，提示其在体内可能发挥锚定作用。类似地，突触后Latrophilin3可整合到PSD-95凝聚体中³⁴。此外，latrophilin等SAM属于G蛋白偶联受体（GPCR），能够产生cAMP，后者可能通过局部信号传导促进突触形成³⁵。目前尚不清楚是否存在足以促成突触形成的通用SAM信号传导机制；然而，无论具体由哪种SAM启动，突触核心结构均会形成。
在本研究中，我们确定了秀丽隐杆线虫（C. elegans）突触黏附分子SYG-1启动胞质信号传导的机制。我们发现，SYG-1胞质尾部的酪氨酸磷酸化可通过含SH2结构域的衔接蛋白和Arp2/3激活因子WSP-1，诱导生物分子凝聚体形成。凝聚体的形成将处于活性状态的SYG-1亚群组织成簇，从而启动突触前结构的形成
形成。
结果
SYG-1通过其胞内尾部酪氨酸残基的磷酸化启动突触前结构的形成
秀丽隐杆线虫（C. elegans）的雌雄同体特异性神经元（Hermaphrodite Specific Neuron，HSN）与阴门肌细胞和VC中间神经元形成具有固定模式的突触，以调控线虫的产卵回路（图1A）³⁶–³⁸。HSN中的突触形成受两种含免疫球蛋白（Ig）结构域的突触黏附分子SYG-1（图1B）和SYG-2调控³⁹˒⁴⁰。这两种分子通过胞外Ig结构域特异性结合⁴¹，从而指定HSN的突触区域并启动突触形成。我们推测，启动突触核心结构形成的胞内信号必然源自这些黏附分子的胞质尾部。我们首先通过在内源性基因中删除编码该结构域的序列，证实了突触前SYG-1的胞质尾部是其发挥功能所必需的（图1C）。我们利用活性区（SYD-2/Liprin-α）和突触囊泡（RAB-3）的内源性荧光标记，对HSN突触前结构的形成进行成像。我们发现，syg-1(tailΔ)突变体中的突触显著减少，其程度与功能缺失型syg-1Δ等位基因相当（图1C–D）。syg-1(tailΔ)突变体蛋白仍能正常定位于HSN的突触区域，证实受损的仅为其胞内功能（图S1）。
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图1：
SYG-1通过其胞内尾部的酪氨酸残基启动突触前结构的形成。
A）秀丽隐杆线虫雌雄同体特异性神经元（HSN）示意图。该神经元与阴门肌和VC神经元形成突触，以调控产卵。B）SYG-1突触黏附分子示意图，其中突出标示了胞质尾部的基序。C）利用内源性标记的SYD-2（活性区）和RAB-3显示所示syg-1突变体中HSN的突触形成表型
（突触囊泡）标记物。BFP在细胞质中表达。比例尺，5 μm。D）对（C）中HSN突触标记物荧光强度的定量分析。****，p < 0.0001。E）所示syg-1突变体的产卵测定。将成虫第1天个体在1小时内产下的卵按发育阶段分为原肠胚期、逗号期至二折期以及三折期。产卵时胚胎发育阶段较晚表明HSN神经回路功能受损。每种基因型的N > 300。
SYG-1的胞质尾部长155个氨基酸，含有两个已知的蛋白质结合基序：WAVE调节复合物（WRC）相互作用受体序列（WIRS）⁴²和一个预测的PDZ结构域结合基序（PBM）³⁹（图1B）。我们还注意到，该尾部富含酪氨酸残基，这与其他系统中通过酪氨酸磷酸化而被激活的黏附分子和受体相似⁴³（图1B）。为检验这些基序对突触形成的重要性，我们在内源基因中分别对其进行突变以损害其功能：将WIRS位点的4个残基替换为丙氨酸，以阻断其与WRC的相互作用⁴²；删除PBM；以及进行10YF替换，即将尾部所有酪氨酸替换为苯丙氨酸。随后对HSN突触形成的成像观察显示，破坏WIRS或PBM的影响有限⁴⁴；然而，syg-1(10YF)突变体的突触显著减少，其程度与syg-1(tailΔ)或syg-1Δ等位基因相当（图1C–D）。为确认所观察到的突触形成缺陷对神经递质传递和HSN神经回路功能的影响，我们进行了产卵测定。HSN突触传递受损会导致产卵延迟⁴⁵，使胚胎在排出前已发育至较晚阶段。野生型动物在胚胎处于原肠胚期时产卵，而syg-1Δ、syg-1(tailΔ)和syg-1(10YF)突变体则表现出一种
显著延迟（图1E）。syg-1(WIRS4A)和syg-1(PBMΔ)等位基因也表现出显著但较小的影响。综上，这些数据表明，SYG-1尾部的酪氨酸残基是HSN突触正常形成和发挥功能所必需的。
为确定SYG-1尾部的酪氨酸残基是否确实发生磷酸化，我们分离了在内源位点融合SNAP标签的SYG-1，并进行质谱分析。使用O⁶-苄基鸟嘌呤微珠与带标签的SYG-1共价结合，从而能够在严格的变性条件下，从稳定且耐去污剂的突触结构中提取磷酸化形式的SYG-1（图2A–B）。由于磷酸化事件较少，在直接进行SYG-1下拉获得的样品中未能检测到，因此还需要进一步富集磷酸化肽段。富集后，质谱分析在SYG-1尾部鉴定出7个酪氨酸磷酸化位点（Y603、Y608、Y623、Y649、Y660、Y686和Y711）（图2C、图S2和表S1）。我们构建了7YF突变体，以确定这些位点是否足以重现10YF突变体中观察到的突触缺失表型。事实上，syg-1(7YF)突变体表现出与syg-1(10YF)相似的突触形成缺陷（图2D和2E），并由此导致HSN神经回路功能受损（图2F），表明这7个磷酸化酪氨酸残基是SYG-1尾部信号传导所必需的。综上，这些数据证实，SYG-1尾部的多个酪氨酸磷酸化位点对SYG-1的突触形成功能至关重要。
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图2：
SYG-1胞内尾部发生酪氨酸磷酸化，以启动突触形成。
A）SYG-1 SNAP标签下拉及磷酸化肽段富集的工作流程。O6-BG：O⁶-苄基鸟嘌呤；TiO2：二氧化钛；Fe-IMAC：铁离子固定化
金属离子亲和层析。B）SYG-1-FLAG-tev-SNAP 下拉产物的蛋白质印迹分析。通过 TEV 蛋白酶消化，切断 SNAP 标签与 O6-BG 微珠之间的共价连接。C）SYG-1 胞内尾部示意图，标示了通过质谱鉴定的磷酸化酪氨酸位点（Y603、Y608、Y623、Y649、Y660、Y686 和 Y711）。相关质谱图见图 S2 和表 S1。D）利用内源性标记的 SYD-2（活性区）和 RAB-3（突触囊泡）标志物，观察所示 syg-1 突变体中的 HSN 突触形成表型。BFP 在细胞质中表达。比例尺，5 μm。E）对（D）中 HSN 突触标志物的荧光强度进行定量。****，p < 0.0001。F）所示 syg-1 突变体的产卵测定。将成虫第 1 天个体在 1 小时内产下的卵按发育阶段分为原肠胚期、逗号期至二倍期和三倍期。产卵时胚胎发育阶段偏晚表明 HSN 神经环路功能存在缺陷。每种基因型的 N > 300。
邻近标记鉴定 SYG-1 胞内尾部相关激酶及相互作用蛋白
为研究哪些激酶负责 SYG-1 的磷酸化，并鉴定该信号的潜在结合伙伴和效应分子，我们对 SYG-1 的胞质尾部进行了邻近标记⁴⁶。我们在 SYG-1 胞质尾部的 C 末端内源性融合 TurboID 标签（图 3A），用生物素处理动物，并使用链霉亲和素微珠下拉富集由此产生的生物素化蛋白。后续质谱分析鉴定出 1311 种相较于链霉亲和素下拉对照显著富集的蛋白质（图 3B 和表 S2）。基因本体分析显示，参与细胞骨架组织、轴突发育、细胞间连接形成及其他过程的蛋白质显著富集，这与此前报道的 SYG-1 在突触形成中的功能一致。
以及轴突分支形成³⁹˒⁴²（图3C）。所鉴定的蛋白质还富集了与这些功能相关且值得关注的蛋白质结构域，包括酪氨酸激酶结构域、SH2结构域、磷酸酪氨酸结合结构域、SH3结构域和PDZ结构域（图3D）。
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图3：
TurboID介导的邻近标记鉴定出与SYG-1胞内尾部相互作用的蛋白质。
A）内源性标记的SYG-1-TurboID示意图。B）通过质谱分析，在SYG-1-TurboID样本与未标记对照的比较中鉴定出的蛋白质。粗点表示被判定为显著的蛋白质，其log₂（TurboID∶对照比值）> 1且Q值< 0.05。含有关注的功能结构域的蛋白质以高亮显示。C、D）对所鉴定的相互作用蛋白中显著富集的生物学过程（C）和蛋白质结构域（D）进行的基因本体（GO）富集分析。点的大小表示与相应类别匹配的基因数量。完整数据见表S2。
SRC-1和SRC-2以功能冗余的方式磷酸化SYG-1胞内尾部，并对突触形成至关重要
接下来，我们尝试从TurboID鉴定出的相互作用蛋白中确定负责SYG-1尾部磷酸化的酪氨酸激酶（表S2）。我们检测了所鉴定的酪氨酸激酶的功能缺失突变体对HSN突触形成的影响。我们发现，src-2Δ突变体表现出轻度的突触形成缺陷（图4A–B）。src-1Δ src-2Δ双突变体表现出HSN突触的大量丢失（图4A–B），提示这两种激酶可能通过磷酸化SYG-1参与突触形成。为确定这些激酶是否直接磷酸化SYG-1，我们使用纯化的重组SYG-1胞质尾部以及SRC-1和SRC-2激酶进行了体外激酶测定（图4C）。这些测定显示，SYG-1尾部可被SRC-1和
SRC-2。这些激酶也发生了自磷酸化（图4C），这与Src家族激酶的调控机制一致⁴⁷,⁴⁸。对体外磷酸化的SYG-1尾部进行质谱分析发现，10个酪氨酸残基中有8个可被SRC-1和SRC-2两者磷酸化（图S3A和表S3），且这些位点与体内发现的位点存在重叠。使用SYG-1(10YF)突变体进行的激酶测定显示，其体外磷酸化被完全消除（图S3）。综上，这些数据表明，SRC-1和SRC-2激酶以功能冗余的方式磷酸化SYG-1的胞质尾部，因此对HSN突触形成至关重要。
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图4：
SRC-1和SRC-2酪氨酸激酶以功能冗余的方式磷酸化SYG-1的胞内尾部，并对突触形成至关重要。
A）利用内源性标记的活性区标志物SYD-2显示所示突变体中的HSN突触形成表型。BFP在胞质中表达。比例尺，5 μm。B）对（A）中HSN突触标志物荧光强度的定量分析。*，p < 0.05；****，p < 0.0001。C）使用纯化的重组SRC-1、SRC-2与SYG-1尾部进行的体外激酶测定。
一部分磷酸化SYG-1形成与活性区形成相伴的簇集
在鉴定出SYG-1中的关键磷酸化位点及负责其磷酸化的激酶后，我们接下来尝试通过可视化确定磷酸化SYG-1在HSN中的分布位置。传统上用于检测磷酸化蛋白定位的方法，如磷酸化特异性抗体，难以应用于秀丽隐杆线虫。因此，我们寻求一种可由遗传编码的SYG-1磷酸化传感器。邻近标记实验鉴定出多种含有SH2结构域的潜在相互作用蛋白，已知该结构域可直接结合磷酸化酪氨酸位点⁴⁹,⁵⁰。因此，我们构建了一种SYG-1
通过将这些相互作用蛋白中分离出的 SH2 结构域与荧光蛋白融合，构建可用于可视化的磷酸酪氨酸传感器。我们发现，NCK-1 是 SYG-1 的人类同源蛋白 Neph1 和 Nephrin 的已知相互作用蛋白⁵¹˒⁵²，其 SH2 结构域能够有效标记 HSN 中磷酸化的 SYG-1（图 5A）。该传感器定位于 HSN 突触区域内的小点状结构，而在 syg-1(10YF) 突变体中，其定位消失，证实了该传感器对 SYG-1 磷酸酪氨酸位点的特异性（图 5A–B）。重要的是，由于 SH2 结构域可能直接结合磷酸化的 SYG-1 并遮蔽具有功能的磷酸化位点，我们考察了传感器的表达是否会改变突触形成，结果发现其并无影响（图 S4）。
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图 5：
一部分磷酸化的 SYG-1 形成簇集，其位置与活性区形成位点重合。
A）野生型和 syg-1(10YF) 突变体中 SH2nck-1-mNeonGreen 传感器的共聚焦显微图像。BFP 在细胞质中表达。传感器在无法发生磷酸化的 syg-1(10YF) 突变体中不发生定位，表明其对 SYG-1 酪氨酸磷酸化具有特异性。B）对（B）中 SH2nck-1-mNeonGreen 荧光强度的定量分析。****，p < 0.0001。C）HSN 中 SH2nck-1-mNeonGreen SYG-1 磷酸化传感器与内源性 SYG-1-mScarlet3 的共聚焦显微图像。BFP 在细胞质中表达。在较大的 SYG-1 定位区域内，存在一小部分呈簇集分布的磷酸化 SYG-1。D）HSN 中 SH2nck-1-mNeonGreen 传感器与内源性 mScarlet3-FLPon-SYD-2 活性区标记物的共聚焦显微图像。BFP 在细胞质中表达。E）对（A）和（D）中 SH2nck-1-mNeonGreen、SYG-1-mScarlet3 和 mScarlet3-FLPon-SYD-2 之间重叠情况的定量分析。由 SYD-2 标记的大多数活性区与磷酸化的 SYG-1 重叠
簇，而这些簇仅代表全部 SYG-1 中的一个小亚群。****，p < 0.0001。比例尺，5 μm。
接下来，我们将该 SYG-1 磷酸化传感器与带有 mScarlet3 标记的 SYG-1 共同进行可视化观察。SYG-1 通过与其配对蛋白 SYG-2 结合，定位于 HSN 轴突“平台”上的突触区域⁴⁰（图 1A）。该区域的细胞膜上分布着大量 SYG-1（图 5C 和图 S1）。SH2_nck-1-mNeonGreen 传感器显示，磷酸化 SYG-1 仅占其中一个小亚群，并在庞大的 SYG-1 蛋白群体中定位于离散的簇内（图 5C）。这一化学计量关系解释了我们在 SYG-1 下拉实验中难以富集磷酸化肽段的原因（图 2A–C）。随后，我们比较了磷酸化 SYG-1 簇与由 SYD-2 标记的活性区形成位点的定位，发现二者高度共定位（图 5D）。对重叠情况的定量分析显示，大多数 SYD-2 活性区位点均与一个磷酸化 SYG-1 簇重叠（图 5E）。因此，这些数据表明，仅有一小部分 SYG-1 发生磷酸化，并形成标示活性区形成位点的簇。
磷酸化的 SYG-1 尾部及其相互作用伙伴形成对突触形成至关重要的生物分子凝聚体
接下来，我们旨在确定磷酸化 SYG-1 簇的形成机制，并检验这些簇是否对突触形成至关重要。鉴于 SH2_nck-1-mNeonGreen 传感器能够有效标记磷酸化 SYG-1（图 5A–D），且 SH2 蛋白在其他磷酸酪氨酸信号通路中发挥关键作用⁵³˒⁵⁴，我们研究了含 SH2 结构域的蛋白，以寻找介导 SYG-1 磷酸化信号的潜在衔接蛋白和效应蛋白。通过邻近标记数据，我们鉴定出多个潜在的 SH2 结构域相互作用蛋白（
图3C和表S2）。我们对磷酸化的SYG-1尾部与已鉴定相互作用蛋白的SH2结构域进行了体外结合测定，发现其中三种蛋白可直接结合：NCK-1、SEM-5/Grb2和RIN-1（图6A）。这些相互作用特异性地发生于经SRC-1和SRC-2磷酸化的SYG-1尾部，而在未磷酸化状态下未观察到相互作用。
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图6：
磷酸化的SYG-1尾部与含SH2结构域的衔接蛋白相互作用，形成生物分子凝聚体。
A）SYG-1胞质尾部与通过邻近标记鉴定的SH2衔接蛋白之间的体外结合测定。在加入SH2结构域之前，先用SRC-1和SRC-2对SYG-1尾部进行过夜磷酸化。B–D）结合有SYG-1胞质尾部的支持性脂质双层。B）加入SRC-1和SRC-2激酶，使SYG-1尾部磷酸化。C）向结合有SYG-1尾部的支持性脂质双层（SLB）中加入NCK-1的SH2结构域以及SRC-1和SRC-2，以显示磷酸化。D）向结合有SYG-1尾部的SLB中加入NCK-1和WSP-1。当SYG-1被SRC-1和SRC-2磷酸化时，这些相互作用伙伴可诱导生物分子凝聚体的形成及聚簇。E）对（D）中各组分进行荧光漂白后恢复（FRAP）分析，显示凝聚体内部具有液态动力学特性。对图示白色圆形区域进行漂白，并监测荧光恢复。F）对（E）中的FRAP进行定量分析。比例尺，10 μm。
在其他系统中，包括Nck-1⁵⁵˒⁵⁶和Grb-2⁵⁷–⁵⁹在内的SH2衔接蛋白可与肌动蛋白网络相关蛋白连接，例如Arp2/3激活因子Wasp，或Ras/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）Sos1，从而形成生物分子凝聚体⁶⁰。支持凝聚体形成的多价相互作用源于多个磷酸酪氨酸结合位点和多个蛋白质结合
支架蛋白和效应蛋白中的结构域（通常为SH3结构域和富含脯氨酸的基序）。总体而言，这些相互作用会诱导相分离和生物分子凝聚体的形成。事实上，我们在SYG-1邻近标记数据中发现了秀丽隐杆线虫的WSP-1和SOS-1（表S2）。我们推测，类似的机制可能参与SYG-1突触的形成，这或许可以解释在体内观察到的磷酸化分子聚集现象（图5A-D）。为检验这一可能性，我们利用重组蛋白，在支持性脂质双层（SLB）上于体外重构了SYG-1尾部的信号传导。我们将纯化的His₈标记SYG-1尾部组装到含有2%DGS-NTA脂质的SLB上，以重构SYG-1的正常取向（图6B和图S5A）。随后，我们加入SRC-1和SRC-2激酶以及ATP，使SYG-1尾部发生磷酸化（图6B）。通过NCK-1的SH2结构域与其结合，确认了该磷酸化过程（图6C）。接下来，我们加入可能的SH2衔接蛋白NCK-1和SEM-5的全长形式，以及WSP-1。将这些组分加入SLB上的未磷酸化SYG-1尾部后，未观察到任何变化（图6D和图S5C）。然而，磷酸化的SYG-1尾部与NCK-1或SEM-5中的任一种以及WSP-1共同存在时，会在SLB上形成大量生物分子凝聚体（图6D和图S5C）。通过荧光漂白后恢复（FRAP）实验检测发现，凝聚体中的每种组分均具有高度动态性（图6E-F和图S5D）。我们无法制备全长RIN-1，而仅加入其SH2结构域不足以形成凝聚体（图S5E）。单独加入NCK-1、SEM-5或WSP-1均无法形成凝聚体，这进一步证实了多价相互作用的必要性（图S5F）。
）。这些数据表明，磷酸化的 SYG-1 尾部及其结合伙伴能够通过多价相互作用驱动的生物分子凝聚体形成而聚集。
为确定这一机制在体内是否重要，我们删除了已鉴定出的 SYG-1 接头蛋白，以阻止凝聚体形成。由于 SEM-5 是必需的，我们对 *Nck-1* 和 *rin-1* 进行了遗传缺失，并利用 ZF 降解系统^61 在 HSN 中特异性降解 SEM-5 蛋白。首先，我们在 *nck-1Δ sem-5-ZF* 双突变体和 *nck-1Δ sem-5-ZF rin-1Δ* 三突变体中，对 SH2^nck-1 SYG-1 磷酸化传感器进行了成像，发现磷酸化 SYG-1 簇消失了（图 7A–B）。磷酸化分子可能仍然存在，但其水平低于该传感器的荧光检测限。这一结果证实，SH2 接头蛋白对于 SYG-1 凝聚体在体内形成簇是必需的。
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图 7：诱导 SYG-1 凝聚体的 SH2 结构域效应蛋白对 HSN 突触的形成与功能至关重要。
A）所示突变体中 SH2^nck-1-mNeonGreen SYG-1 磷酸酪氨酸传感器的共聚焦显微成像。BFP 在细胞质中表达。比例尺，5 μm。B）对 A 中 SH2^nck-1-mNeonGreen 的 HSN 荧光强度进行定量。**，p < 0.0001。C）所示突变体中 HSN 突触形成的表型，使用内源性标记的 SYD-2 活性区标记物。BFP 在细胞质中表达。D）对 C 中 HSN 突触标记物的荧光强度进行定量。**，p < 0.0001。E）所示突变体的产卵实验。将 1 日龄成虫在 1 小时内产下的卵分为原肠胚期、逗号期至 2 倍期以及 3 倍期。产卵时胚胎发育阶段较晚表明 HSN 神经回路功能受损。每种基因型 N > 300。比例尺，5 μm。
最后，
我们测试了磷酸化 SYG-1 凝聚体是否对 SYG-1 在突触形成中的功能至关重要。我们在 SH2 结构域衔接蛋白突变体中，利用 SYD-2 活性区标记物对 HSN 突触形成进行了成像。Nck-1Δ、sem-5-ZF 和 rin-1Δ 等位基因均被发现会对 HSN 突触形成产生中等程度的影响（图 7C–D）。组合突变体进一步加剧了这种影响，导致突触形成严重缺失，这与我们最初的 syg-1(10YF) 突变相似（图 7C–D）。产卵实验进一步证实，突触形成缺陷影响了 HSN 回路功能（图 7E）。综上，这些数据表明，通过 SH2 结构域衔接蛋白形成的磷酸化 SYG-1 凝聚体对于 HSN 突触形成和功能至关重要。
讨论
本研究发现，突触黏附分子 SYG-1 的胞质酪氨酸磷酸化对于其介导突触形成的功能至关重要。我们确定 SRC-1 和 SRC-2 酪氨酸激酶负责这一磷酸化过程，并发现磷酸化的 SYG-1 在体内组织成簇。SH2 结构域衔接蛋白和 WSP-1 的结合诱导了这种聚簇，并由一种基于凝聚体的机制驱动。这些凝聚体对于体内的突触组装和回路功能至关重要。
基于凝聚体的黏附分子聚簇与激活
通过多价结合伙伴形成的 SYG-1 凝聚体，与此前已表征的基于 Nephrin 的凝聚体⁵⁶以及基于免疫突触的凝聚体⁵⁷,⁶²具有同源性。由磷酸化 Nephrin、SH2 衔接蛋白 Nck-1 和 Wasp 之间形成的凝聚体，有助于将膜上的黏附分子募集到这些簇中，进而促进肌动蛋白聚合和下游信号传导⁶³,⁶⁴。Nephrin 胞质尾部的三个酪氨酸残基是
对信号传导至关重要^52。SYG-1与Nephrin是远缘直系同源蛋白，但两者的胞内尾部序列已发生分化，酪氨酸残基位点未见明确保守性。然而，其作用机制和结合伙伴似乎是保守的，这凸显了这些凝聚体对两种分子功能的重要性。同样，T细胞受体磷酸化可通过Grb-2（秀丽隐杆线虫SEM-5的直系同源蛋白）和Sos1触发凝聚体形成^57。因此，基于凝聚体的聚集机制似乎广泛存在于多种受体和黏附分子发挥作用的细胞环境中。
这些凝聚体可能具有多种功能后果。首先，凝聚体形成所促成的聚集可能扩大处于活化状态的黏附分子群体^55。Nephrin凝聚体可提高Wasp和Arp2/3效应因子的停留时间，从而增加F-actin的组装。除此之外，T细胞受体还通过凝聚体介导的动力学校对机制，区分短暂相互作用与持续时间较长的相互作用^59,65。我们的证据表明，SYG-1中只有一小部分亚群通过酪氨酸磷酸化而被激活，并组织成基于凝聚体的簇。大量SYG-1仍未发生磷酸化，但通过与其胞外结合伙伴SYG-2结合而定位于轴突的突触区。因此，凝聚体的形成可能使活化的SYG-1群体聚集成信号簇，有效启动突触前结构的形成。大量SYG-1为何未被磷酸化激活，目前尚不清楚。SYG-1与其结合伙伴SYG-2之间的强结合^41，可能对维持HSN轴突突触区域的机械稳定性至关重要。
多个突触的协调
凝聚体
突触已成为多种凝聚体的富集热点，包括活性区凝聚体⁸˒¹¹、突触囊泡池凝聚体¹²以及突触后致密区凝聚体¹⁵˒⁵⁶。随着我们发现突触黏附分子凝聚体，明确这些凝聚体是否以及如何相互作用、以及这些相互作用如何影响功能，将至关重要。针对 RIM 和 RIM-BP 活性区凝聚体与突触囊泡凝聚体开展的实验表明，两者可能不相混溶⁶⁶，突触囊泡则在二者边界处交接。黏附分子凝聚体也可能同样无法与其他凝聚体混合，而只是与其相邻。或者，如 Teneurin 和 Latrophilin 的研究所提示的那样³³˒³⁴，这些凝聚体也可能发生混合，甚至可能为突触核心凝聚体的形成提供种子。直接观察突触凝聚体的形成或许能解答这些问题，但由于其尺度仅为纳米级，观察和操纵天然的体内凝聚体仍然颇具挑战。
突触形成中的肌动蛋白网络成核
我们在此鉴定出的 SYG-1 凝聚体网络含有 NCK-1、SEM-5/Grb2 以及 Arp2/3 激活因子 WSP-1。我们还鉴定出 Ras 鸟嘌呤核苷酸交换因子 RIN-1，它是磷酸化尾部的互作蛋白；但由于无法纯化这一大型蛋白，我们未能测试其是否具有形成凝聚体的活性。此前研究还发现，WRC 复合物可与 SYG-1 的尾部结合⁴²。这些互作蛋白提示，肌动蛋白网络的形成可能是 SYG-1 介导突触前结构形成的下一步。黏附分子在多种情境下都与 F-肌动蛋白网络相连⁶⁷˒⁶⁸，这表明这可能是一条常见通路。
事实上，突触中存在多种肌动蛋白网络⁶⁹˒⁷⁰，其中包括活性区⁷¹和突触后致密区⁷²处的分支状肌动蛋白网络。此外，肌动蛋白构成的笼状结构还环绕着……
突触囊泡池凝聚体
73
。形成这些 F-actin 网络的发育时序尚不清楚。F-actin 网络的形成可能是黏附分子作用下突触形成的初始步骤
74
。事实上，大规模解聚 F-actin 网络会严重抑制突触形成
75
。这引出了一个问题：SAM 诱导的肌动蛋白网络如何与突触形成相联系？此前在秀丽隐杆线虫（*C. elegans*）中的研究发现，肌动蛋白结合蛋白 Neurabin NAB-1 可将 F-actin 与活性区组分 SYD-1 及突触形成联系起来
75
。去除 NAB-1 会影响 HSN 中的突触形成，但影响程度不及去除 SYG-1，提示还有其他组分参与其中。要厘清黏附分子、肌动蛋白网络与突触形成之间的联系，还需进一步研究。
方法
秀丽隐杆线虫方法
秀丽隐杆线虫（*C. elegans*）品系（表 S4）饲养于铺有 OP50 大肠杆菌（*Escherichia coli*）的线虫生长培养基平板上。N2 Bristol 用作野生型参考品系。通过生殖腺显微注射构建转基因品系，注射浓度为 50 ng/μL（*Pegl-6*），并共同注射 50 ng/μL 的 *Podr-1::RFP* 或 *Punc-122::RFP* 标记物。采用三甲基补骨脂素/紫外线诱变法将阵列整合到基因组中。产卵实验使用第 1 天的成年雌雄同体，将其转移至新平板上产卵 1 小时。随后立即将所产虫卵的发育阶段划分为原肠胚期、逗号期至二折期，以及三折期。
构建体与克隆
所有构建体（表 S5）均采用重叠寡核苷酸，通过等温组装法构建。SYG-1 尾部 10YF 和 7YF 突变序列由 TwistBio 合成，并克隆至 pSK 载体中。经过秀丽隐杆线虫密码子优化的
3xFLAG-2xTEV-SNAP和TurboID盒由TwistBio合成，并克隆至pSK载体中。将三个相同的NCK-1 SH2结构域序列分别进行密码子优化，以便与mNeonGreen序列一起合成，并组装至含有egl-6的3,527个核苷酸启动子的pSM载体中。
从cDNA扩增SRC-1、SRC-2、SYG-1尾部、NCK-1、SEM-5、WSP-1和RIN-1序列，并组装至pET15、pMal-c2、pHis8-tev和pHis-MBP-tev载体中，用于细菌表达。从cDNA扩增zif-1基因，并克隆至含有egl-6的3,527个核苷酸启动子的pSM载体中，用于在HSN中特异性降解带有ZF标签的蛋白质⁶¹。所有构建体均经测序验证。
秀丽隐杆线虫的CRISPR-Cas9基因组编辑
通过向生殖腺显微注射CRISPR-Cas9蛋白复合物，对内源性基因组进行修饰⁷⁶。注射混合液包含1.525 μM ALT-R Cas9、5 μM示踪RNA和gRNA复合物（Integrated DNA Technologies），以及5 μM单链DNA（用于缺失）或25–100 ng/μL PCR扩增的修复模板（用于插入）。ssDNA修复模板的设计使其在缺失区域两侧各包含75个碱基对（bp）的同源序列。SYG-1(10YF)和SYG-1(7YF)修复模板使用含有两侧基因组100 bp同源序列的超长寡核苷酸（Integrated DNA Technologies），以pNM286和pNM434载体为模板进行PCR扩增。SYG-1-TurboID和SYG-1-FLAG-tev-SNAP构建体修复模板使用含有两侧基因组100 bp同源序列的超长寡核苷酸（Integrated DNA Technologies），以pNM207和pNM366载体为模板进行PCR扩增。CRISPR–Cas9修复模板对原间隔序列邻近基序（PAM）位点进行突变，或在gRNA结合位点内改变四个或更多核苷酸；两种情况下均保留
氨基酸序列。向导RNA以ALT-R crRNA的形式合成（Integrated DNA Technologies）。所有基因组编辑均通过PCR和测序验证。
显微成像与图像处理
图像使用Nikon AX-R NSPARC超分辨率共聚焦系统采集，该系统配备60×、数值孔径为1.46的物镜以及405、488、561和640 nm激光器。HSN图像采集自L4中期雌雄同体线虫，其发育阶段根据外阴形态确定。突触强度的定量分析在Fiji/ImageJ中对扣除背景后的总和投影图像进行。为便于图表展示，将任意单位的强度值归一化至100%。代表性HSN图像为最大强度投影图像。荧光漂白后恢复（FRAP）实验通过使用相应的激发激光对每个凝聚体内的一个点进行漂白，并随时间监测荧光恢复。FRAP曲线经背景扣除和光漂白校正后计算得到，并归一化至100%以供展示。
体内磷酸化位点鉴定
将SYG-1-FLAG-tev-SNAP品系培养于500 mL添加了OP50大肠杆菌的Complete S Basal液体培养基中。线虫用M9缓冲液洗涤3次，随后逐滴加入液氮中快速冷冻。使用低温研磨仪（Cole-Parmer Freezer/Mill）将冻滴研磨成细粉。研磨后的样品在冰上解冻，并加入等体积含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的2× RIPA缓冲液，使最终组成为50 mM Tris（pH 8）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% SDS、1% NP-40、1 mM Na₃VO₄、60 mM β-甘油磷酸钠、2.5 mM 焦磷酸钠、50 mM NaF、1 mM PMSF和2 mM 苯甲脒。使用超声破碎仪（Fisherbrand 120 sonic dismembrator）以100%振幅对样品进行两次超声处理，每次1分钟，两次处理之间进行冷却，随后以4100 × g离心5分钟，以
去除碎屑。将所得含有SNAP标签SYG-1的裂解液与SNAP-capture磁珠（NEB）于4°C孵育过夜，使其共价结合。随后将磁珠煮沸10分钟，使所有蛋白质变性，再进行充分的严格洗涤，以去除未结合的物质：用8 M尿素-T缓冲液（8 M尿素、10 mM Tris，pH 8.0、0.2% Tween-20）洗涤两次，用强去污剂缓冲液（2% SDS、1%脱氧胆酸钠、10 mM Tris，pH 8.0）洗涤两次，用1 M KCl-T缓冲液（1 M KCl、10 mM Tris，pH 8.0）洗涤两次，再用TBS（10 mM Tris，pH 8.0、150 mM NaCl）洗涤五次。每次洗涤时，均将磁珠旋转孵育10分钟后再进行磁分离，并频繁将磁珠转移至新的离心管中。
取少量样品，用TEV蛋白酶于16°C酶切过夜，以解除其与磁珠的共价连接。将该样品在4–12% Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上进行电泳，转移至PVDF膜，使用小鼠抗FLAG一抗（Thermo Scientific FG4R）和山羊抗小鼠二抗（Thermo Scientific 35518）进行免疫印迹检测，并使用LI-COR Odyssey CLx扫描仪成像。
在富集磷酸肽之前，对磁珠结合的样品进行还原、烷基化处理，并用AspN+GluC酶解过夜。采用二氧化钛（TiO₂）和铁离子固定化金属亲和色谱（Fe-IMAC）两种富集方法回收磷酸肽。首先，按照制造商的操作规程，使用1 mg Titansphere Phos-TiO Tip（GL Sciences）进行富集。收集未结合的流出液和洗涤液，用GL-Tip SDB柱（GL Sciences）脱盐后，再按照文献⁷⁷所述，使用自制Fe-IMAC微柱进一步富集。合并两次富集所得的洗脱液。
肽段分离使用Thermo Scientific Vanquish Neo超高效液相色谱（UHPLC）系统，以直接进样模式运行
模式。将样品加载至长度为50 cm、内径为75 µm的毛细管色谱柱。以0.300 µL/min的恒定流速进行分离，采用60 min的阶梯梯度，乙腈比例由1%升至65%。
质谱数据采用配备纳升级电喷雾电离（NSI）源的Orbitrap Exploris 480质谱仪在正离子模式下采集。数据采集采用数据依赖采集（DDA）模式，主扫描之间的循环时间为3 s。MS1全扫描以轮廓模式采集，扫描范围为m/z 350–1500，Orbitrap分辨率为90,000。选择电荷态为2–6且强度超过8,000的前体离子进行高能碰撞解离（HCD）。采用4 m/z的隔离窗口分离前体离子，并在30%的归一化碰撞能量（NCE）下进行碎裂。MS2扫描在Orbitrap中以质心模式采集，分辨率为30,000，设定起始质荷比为m/z 120。MS2归一化自动增益控制（AGC）目标值为300%，离子注入时间设为自动。启用动态排除，使前体离子在被选择1次后排除10 s。
使用Thermo Scientific Proteome Discoverer（版本3.2.0.450）处理原始LC-MS/MS文件，并采用混合搜索算法策略进行磷酸化蛋白质组学分析。使用Sequest HT和MS Amanda 3.0并行检索数据库，检索数据库由自定义FASTA数据库（Syg1.fasta）与常见污染物数据库（PD_Contaminants_2015_5.fasta）合并而成。检索参数设定为AspN+GluC酶切，最多允许3个漏切位点，前体离子质量容差为20 ppm，碎片离子质量容差为0.02 Da。采用固定阈值评分对肽段-谱图匹配（PSM）进行验证，
并使用 IMP-ptmRS 计算磷酸化位点定位概率，位点概率阈值设为 75%。随后，将高置信度的肽谱匹配（PSM）整合至共识工作流程中，采用严格的简约原则进行蛋白质分组、肽段/蛋白质假发现率（FDR）过滤，并通过 Proteome Discoverer 蛋白质注释服务器进行自动功能注释。数据已通过 PRIDE 合作数据库提交至 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD083086。
TurboID 介导的邻近标记
TurboID 邻近标记按照先前描述的方法进行⁷⁸,⁷⁹。将 SYG-1-TurboID 品系和对照品系培养于补充大肠杆菌（E. coli）MG1655 作为食物来源的完全 S Basal 液体培养基中。在培养的最后 2 小时加入终浓度为 1 mM 的生物素，并于 25°C 孵育。用 M9 缓冲液洗涤线虫 3 次，然后逐滴加入液氮中快速冷冻。使用低温研磨仪（Cole-Parmer Freezer/Mill）将冷冻液滴研磨成细粉。将研磨后的样品置于冰上解冻，并加入等体积含蛋白酶抑制剂的 2× RIPA 缓冲液，使最终组成为 50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% SDS、1% NP-40、1 mM PMSF 和 2 mM 苯甲脒。使用超声破碎仪（Fisherbrand 120 sonic dismembrator）以 100% 振幅对样品进行两次超声处理，每次 1 分钟，两次处理之间进行冷却，随后以 4100 × g 离心 5 分钟以去除碎屑。在层析系统（Cytiva Akta Go）上使用 Zeba 脱盐柱（Thermo Scientific）去除裂解液中过量的生物素。随后，将裂解液通过 HisTrap 柱，以去除所用 AX7884 遗传背景中带有 His₆ 标签的内源性生物素化蛋白。向每份样品中加入链霉亲和素磁珠（Thermo Scientific Streptavidin T1），于 4°C 孵育过夜。磁珠
用2% SDS洗涤缓冲液洗涤两次，用TBS-T缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl，0.2% Tween-20）洗涤一次，用1 M KCl-T洗涤缓冲液（1 M KCl，50 mM Tris–HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，0.2% Tween-20）洗涤两次，用0.1 M Na₂CO₃-T缓冲液（0.1 M Na₂CO₃，0.2% Tween-20，pH 11.5）洗涤两次，用2 M尿素-T缓冲液（2 M尿素，10 mM Tris，pH 8.0，0.2% Tween-20）洗涤两次，最后用TBS缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，150 mM NaCl）洗涤五次。每次洗涤时，磁珠均在旋转条件下孵育10分钟，然后进行磁分离，并频繁将磁珠转移至新的试管中。
肽段在以单柱模式运行的Bruker nanoElute2系统上进行分离，使用PepSep色谱柱（长度10 cm，内径75 μm，粒径1.9 μm），柱温维持在40°C。色谱洗脱以0.50 μL/min的恒定流速进行，总采集时间为62.33 min。液相色谱系统与timsTOF HT质谱仪（Bruker Daltonics）在线联用，并通过timsControl（v7.0.0.4）进行控制。数据非依赖性采集（dia-PASEF）在正离子模式下进行，以1.00 Hz的速率采集m/z 100–1700范围内的全扫描质谱（滚动平均次数：10）。dia-PASEF隔离窗口方案覆盖m/z 460–1000的前体离子质量范围及−1/K₀约为0.88–1.20 V·s/cm²的离子淌度范围，设置为三个对角线式m/z–1/K₀阶梯带（m/z 460–660、670–870和880–1000）。关键TIMS调谐参数包括：漏斗1射频电压为300.0 Vpp，漏斗2射频电压为200.0 Vpp，多极杆射频电压为200.0 Vpp，低质量截止值为m/z 200.00，碰撞射频电压为1500.0 Vpp，传输时间为60.0 μs，预脉冲储存时间为12.0 μs，离子能量为5.0 eV，默认碰撞能量为10.0 eV。质谱以棒状谱和轮廓谱模式保存，并以Tuning Mix ES-TOF为参照进行质量校准。
（批内）。
采用 Spectronaut（版本 21.0.260703.94842）的 directDIA 模式（directDIA+ Deep 工作流程）处理数据非依赖性采集（DIA）文件。使用 Pulsar 搜索引擎，针对包含 29,021 条蛋白质条目的 uniprotkb_c_elegans_AND_model_organism_2025_07_31 蛋白质数据库进行检索。酶切特异性设定为 Trypsin/P，最多允许 2 个漏切位点，肽段长度范围为 7–52 个氨基酸。检索策略配置为 PTM Probing Search，每条肽段最多允许 3 个可变修饰。鉴定阈值设定为：前体层面和全实验蛋白质层面的错误发现率（FDR）Q 值均为 0.01，单次运行蛋白质层面的 Q 值阈值为 0.05。前体后验错误概率（PEP）和蛋白质 PEP 阈值分别设定为 0.2 和 0.75。单肽段命中蛋白质的鉴定遵循按去修饰肽段序列定义的分层单肽段命中蛋白质 FDR 规则。采用突变策略动态生成诱饵，并使用神经网络预测的碎片离子来源。使用 IDPicker 算法自动进行蛋白质推断。
通过峰面积积分在 MS1 层面进行定量，并纳入离子淌度峰提取。进行背景噪声去除和干扰校正（要求至少包含 2 个 MS1 离子和 3 个 MS2 离子）。按去修饰肽段序列对肽段进行分组，并根据 Protein Group ID 定义蛋白质组。采用 Top N 策略（最少 1 条、最多 3 条肽段），以肽段定量值的均值计算主组定量值。未进行跨运行归一化。采用不假定方差齐性的非配对 t 检验进行条件间差异丰度检验，使用一个
Q值阈值为0.05，候选筛选的Log2比值截断值为0.58。启用翻译后修饰（PTM）位点定位，最低概率阈值设为0.75。数据已通过PRIDE合作数据库提交至ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD083086。
使用显著富集蛋白列表（Q值 < 0.05且Log2(TurboID:Control比值) > 1），通过WormEnrichr⁸⁰,⁸¹进行GO分析。
重组蛋白的表达与纯化
重组蛋白在Rosetta2(DE3)大肠杆菌细胞中表达。将培养物在TB培养基中培养至对数生长期（OD₆₀₀ = 1.5），加入0.4 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），于18 °C诱导过夜。使用含50 mM Tris（pH 8）、150 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇和0.1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的缓冲液裂解细胞。对于需用NHS酯荧光染料标记的蛋白，为确保兼容性，改用50 mM磷酸钠（pH 8）缓冲液。将裂解液以50,000 × g离心，使不溶性组分沉淀。首先使用HisTrap或MBPTrap柱（Cytiva）通过亲和层析纯化蛋白，必要时于16 °C用TEV蛋白酶切割过夜，随后使用Superdex Increase 200或Superdex Increase 75体积排阻色谱柱（Cytiva）进一步精纯。使用截留分子量为3,000或10,000的离心式蛋白浓缩器（Thermo Scientific）浓缩蛋白。在室温下用NHS酯染料（Lumiprobe Alexa-488、Alexa-546或Alexa-647 NHS酯）标记蛋白1 h，随后通过透析去除过量染料。
SYG-1胞内尾部构建体的溶解性相对较差，因此需要采用改良流程。按照上述方法进行裂解和离心后，回收沉淀组分，并在补加6 M的裂解缓冲液中重新溶解
盐酸胍和10%甘油。将溶解后的样品结合至HisTrap柱，并在柱上复性至含20 mM磷酸钠（pH 8）、150 mM NaCl、5 mM β-巯基乙醇和10%甘油的缓冲液中。使用500 mM咪唑洗脱蛋白，随后按上述方法通过体积排阻色谱（SEC）进一步纯化，缓冲液中同样含有10%甘油。
激酶活性测定
体外激酶反应体系包含1 μg底物、1 μg SRC-1/SRC-2激酶、0.1 mM ATP和2 μCi γ-³²P-ATP（Revvity），反应缓冲液含40 mM Tris（pH 7.5）、20 mM氯化镁、2 mM氯化锰、25 μM原钒酸钠和50 μM DTT。样品在30 °C下孵育45 min。加入LDS上样缓冲液终止反应，随后在12% Bis-Tris凝胶上进行电泳，并在干燥前使用考马斯亮蓝SimplyBlue（Invitrogen）染色。将干燥后的凝胶与BAS-IP磷屏（Cytiva）一同置于曝光盒中过夜，随后使用Typhoon FLA 9500系统（GE Healthcare Life Sciences）在635 nm激发波长下成像。在支撑脂质双层上进行激酶活性测定时，使用上述缓冲液，但不添加放射性标记ATP，SRC-1和SRC-2激酶的浓度各为1 μM，并在室温下孵育至少30 min。
体外磷酸化位点鉴定由MS Bioworks完成。从凝胶中切取磷酸化的SYG-1尾部，使用10 mM二硫苏糖醇（DTT）还原，以50 mM碘乙酰胺进行烷基化，并在37 °C下用胰蛋白酶（Promega）消化4 h。使用与Thermo Fisher Orbitrap Fusion Lumos质谱仪联用的Waters M-Class HPLC，通过纳升液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）分析样品。将肽段加载至捕集柱，并以350 nL/min的流速经75 μm分析柱洗脱。两根色谱柱均填充Luna C18树脂（Phenomenex）。质谱仪以数据依赖模式运行，Orbitrap在MS和……采集时的半峰全宽（FWHM）分辨率分别为60,000和15,000。
分别用于 MS/MS。启用 APD，仪器以 3 s 为一个周期进行 MS 和 MS/MS 采集。该数据集可在 MassIVE（MSV000102872）获取。
体外结合实验
将 1 μg 纯化的 SYG-1 尾部在激酶缓冲液（25 mM Tris，pH 8，0.5 mM ATP，20 mM 氯化镁，2 mM 氯化锰和 50 μM DTT）中结合至 10 μL Ni-IMAC 树脂（Thermo Scientific）。在部分样品中，加入 SRC-1 和 SRC-2 激酶各 1 μg。样品于 23°C 孵育过夜，以进行磷酸化。随后加入各 1 μg 的纯化 SH2 结构域，结合 2 小时。洗涤三次以去除未结合的物质，随后将样品在 4–12% Bis-Tris 凝胶上进行电泳，并使用 SimplyBlue SafeStain（Thermo Scientific）染色。
支撑脂质双层
在经过彻底清洁的 22 mm 方形玻璃盖玻片（VWR）上形成支撑脂质双层（SLB）⁸²。盖玻片依次在 2% Hellmanex III 溶液、双蒸水（ddH₂O）、100% 乙醇和再次使用的 ddH₂O 中进行超声预清洗。随后进一步清洁：在 70°C 的 1 M 氢氧化钾和 7.5% H₂O₂ 混合溶液中孵育 10 分钟，用 ddH₂O 冲洗，再在 70°C 的 2 M HCl 和 7.5% H₂O₂ 混合溶液中孵育 10 分钟，用 ddH₂O 冲洗，最后用氮气流吹干盖玻片。将由 97.5% DOPC、2% DGS-NTA 和 0.5% DOPE-PEG5000（Avanti Research）组成的脂质混合物真空干燥，然后用 SLB 缓冲液（25 mM Tris，pH 7.5，300 mM KCl，1 mM MgCl₂）复水，使脂质终浓度达到 1 mg/mL。通过剧烈涡旋振荡获得多层囊泡，进行五次冻融循环后，经 100 nm 滤膜（Avanti Research）挤出 11 次，获得小单层囊泡。成像腔室由经切割的 200 μL PCR 管制成，切割位置为
顶部和底部用紫外光固化胶（Thorlabs）粘附于清洗后的盖玻片上。向腔室中加入30 μL脂质体混合液和终浓度为1 μM的CaCl₂，在37°C下孵育30分钟，形成支持脂质双层（SLB）。用含25 mM Tris（pH 7.5）和150 mM NaCl的缓冲液每次150 μL洗涤五次，以去除多余脂质体并置换缓冲液，全程使SLB浸没于缓冲液中以保持水合状态。向SLB中加入100 nM的SYG-1尾部，孵育30分钟以使其结合。每次用150 μL缓冲液洗涤五次，去除未结合的SYG-1尾部。配制2倍浓度的衔接蛋白组合样品，并将其加入已结合SYG-1尾部的SLB中，使终浓度达到1 μM，随后立即进行成像。
统计分析与可重复性
在GraphPad Prism 9中，对HSN强度数据进行标准单因素方差分析（ANOVA），并进行事后Tukey多重比较检验。柱状图显示所有数据点、均值以及表示95%置信区间的误差线。每个数据点均为来自一只独立动物的测量值。所有成像数据均通过至少两次成像实验予以确认。体内磷酸化位点鉴定进行了两次生物学重复。实验品系和对照品系的TurboID实验均进行了三次生物学重复。
作者贡献
研究构思：Shenghan Wu和Nathan A. McDonald。
经费获取：Nathan A. McDonald。
研究实施：Shenghan Wu、Nicole A. Morales、Daniel R. Li和Nathan A. McDonald。
方法设计：Shenghan Wu和Nathan A. McDonald。
项目管理：Nathan A. McDonald。
研究指导：Nathan A. McDonald。
论文撰写——初稿：Shenghan Wu和Nathan A. McDonald。
论文撰写——审阅与编辑：Shenghan Wu、Nicole A. Morales、Daniel Li和Nathan A. McDonald。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
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图S1。
SYG-1
胞质尾部突变体仍定位于 HSN 突触区。
内源性 GFP 标记的 SYG-1 突变体的共聚焦显微图像。BFP 在胞质中表达。比例尺，5 μm。
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图 S2。
SYG-1 胞质尾部的
体内
磷酸化酪氨酸质谱图。
通过 SYG-1-SNAP 下拉实验获得的七个酪氨酸磷酸化位点的质谱图（
图 2A–B
及表 S1）。
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图 S3。
SRC-1 和 SRC-2 在
体外
使 SYG-1 胞质尾部发生酪氨酸磷酸化。
A）SYG-1 胞内尾部示意图，标出了通过质谱鉴定的
体外
激酶测定（
图 4C
）中的磷酸化酪氨酸位点。完整数据见表 S3。B）
体外
激酶测定，使用纯化的重组 SRC-1、SRC-2 及所示 SYG-1 尾部突变体。
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图 S4。
SYG-1 磷酸化酪氨酸传感器不影响突触形成。
A）表达或不表达 SH2
nck-1
-mNeonGreen 时的 HSN 突触形成表型，使用内源性标记的活性区标志物 SYD-2 进行可视化。比例尺，5 μm。B）对（B）中 HSN 突触标志物荧光强度的定量分析。****，p < 0.0001。
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图 S5。
支撑脂质双层的其他实验条件。
A–B）与支撑脂质双层结合的 SYG-1 尾部的光漂白后荧光恢复（FRAP）实验。对所示白色圆形区域进行光漂白，并监测荧光恢复情况。观察到显著的荧光恢复，表明已形成具有流动性的脂质双层。C）在有或无 SRC-1/2 介导的磷酸化条件下，向结合了 SYG-1 尾部的支撑脂质双层（SLB）中加入 SEM-5 和 WSP-1。D）对（C）中各凝聚体组分进行光漂白后荧光恢复（FRAP）分析，揭示了凝聚体内部的液态动力学特性。E）加入 SH2
将 RIN-1 和 WSP-1 添加至结合有 SYG-1 尾部的支撑脂质双层（SLBs），并设置有或无 SRC-1/2 磷酸化的条件。F）将 NCK-1、SEM-5、SH2^RIN-1 或 WSP-1 分别单独添加至经 SRC-1/2 磷酸化、结合有 SYG-1 尾部的 SLBs。未观察到凝聚体。比例尺：10 μm。
表 S1. SYG-1 的体内磷酸化肽段。
表 S2. SYG-1-TurboID 邻近标记。
表 S3. SRC-1 和 SRC-2 在体外对 SYG-1 尾部的磷酸化位点。
表 S4. 本研究使用的秀丽隐杆线虫（C. elegans）品系。
表 S5. 本研究使用的质粒。
致谢
我们感谢 de Bono 实验室惠赠 AX7884 品系，感谢 McDonald 实验室成员对稿件的审阅并提出宝贵意见，以及 Ludyanna Lebon 和 Rakesh Singh 博士在质谱实验中提供的专业知识与支持。部分品系由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）提供，该中心由美国国立卫生研究院（NIH）科研基础设施项目办公室资助（P40 OD010440）。质谱实验在佐治亚理工学院系统质谱核心平台完成，该平台获得 NIH S10 OD038327 资助。本研究获得授予 N.A.M. 的 NIH R00 NS123233 项目资助。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写。
已声明的资助方信息
美国国立卫生研究院，https://ror.org/01cwqze88，R00 NS123233，S10 OD038327
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Shenghan
Wu
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Li
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2026.08.25.747070;
doi:
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