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通过计算设计酶所能催化的反应种类日益增多，但其催化效率通常仍远低于天然生物催化剂。定向进化能够缩小这一差距，且往往通过对催化作用影响并不明显的突变来提高活性。在此，我们通过比较从头设计的 Kemp 消除酶及其进化变体的基态与过渡态构象系综，剖析定向进化改善其催化性能的机制。大规模分子动力学模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）反应能垒计算揭示了调控反应活性的细微但重要的差异。模拟表明，反应通过一种特定的类过渡态构象进行，其特征是催化碱基团的去溶剂化以及有序的活性位点电场。能垒与质子转移反应能高度相关，表明配体结合复合物中催化碱基团的去溶剂化提高了其质子亲和力，从而降低了反应能垒。进化提高了基态构象系综中反应活性构象的占比，使达到过渡态所需的重组最小化。进化后，类过渡态构象的形成对蛋白质造成的扰动更小，蛋白质仍能保持协调运动。这与进化过程中出现负活化热容的现象一致。高效催化需要与过渡态相似的基态构象系综；酶设计在追求与过渡态的几何和静电互补性的同时，也应将其作为目标。
计算方法已能够设计催化越来越多种反应的酶，但所获得的催化效率通常仍远低于天然生物催化剂。定向进化能够缩小这一差距，且往往通过对催化作用具有非显而易见影响的突变来提高活性。在本研究中，我们通过比较从头设计的 Kemp 消除酶及其进化变体的基态与过渡态构象系综，剖析了定向进化改善该酶催化性能的机制。大规模分子动力学模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）反应能垒计算揭示了调控反应活性的细微但重要的差异。模拟表明，反应经由一种特定的类过渡态构象进行，其特征是催化碱的去溶剂化以及有序的活性位点电场。反应能垒与质子转移的反应能高度相关，这表明配体结合复合物中催化碱的去溶剂化提高了其质子亲和力，从而降低了反应能垒。进化提高了基态系综中反应性构象的占比，最大限度地减少了达到过渡态所需的重组。进化后，类过渡态构象的形成对蛋白质造成的扰动更小，使其能够维持协同运动。这与进化过程中出现负活化热容的现象一致。高效催化需要一个与过渡态相似的基态系综；酶设计应在追求与过渡态的几何和静电互补性的同时，将此作为目标。
作者声明不存在利益冲突。
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关键词：计算酶设计 · 定向进化 · Kemp消除酶 · 类过渡态构象 · 活性位点电场 · QM/MM计算
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.09.09.750330v1?rss=1