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细菌小型非编码RNA（sRNA）是转录后调控的核心因子，但由于转录噪声以及缺乏典型的编码特征，其计算识别易受到高假阳性率的影响。我们开发了一种三阶段分析流程，整合了sRNA预测（sRNA-Detect）、转录起始位点定位（TSSAR、dRNA-seq）以及Rho非依赖型终止子检测（RNIE），并将其应用于涵盖六个门、具有广泛系统发育多样性的九种细菌。序贯过滤使九种细菌的精确率提高了1.4至33倍，将候选集合最多缩减99.6%，同时能够以与参考数据库深度相一致的比例鉴定已知sRNA（在金黄色葡萄球菌中召回率为6%，在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中为33%至34%）。TSS和RIT约束构成了不受基因组大小影响的通用生物学过滤条件，能够在不同细菌类群中显著提高sRNA预测结果的富集程度。不同物种间的精确率差异反映的是数据库的不完整性，而非分析流程失效；在注释不充分的生物中未能匹配到已知记录的预测结果，更可能代表候选新型sRNA，而非假阳性。RNA-seq覆盖深度可作为评估生物学相关性的可靠辅助指标，但其解释需要考虑不同数据集之间测序深度的差异。
jonathan.perreault{at}inrs.ca
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摘要
细菌小非编码 RNA（sRNA）是转录后调控的核心因子，但由于转录噪声的存在以及缺乏典型的编码特征，其计算识别方法面临假阳性率偏高的问题。
我们开发了一套三阶段流程，整合了 sRNA 预测（sRNA-Detect）、转录起始位点定位（TSSAR，dRNA-seq）以及非 Rho 依赖性终止子检测（RNIE），并将其应用于分属六个门、在系统发育上具有广泛多样性的九种细菌。
通过逐步筛选，九个物种的精确率提高至原来的 1.4 至 33 倍，候选集合最多缩减了 99.6%；同时，已知 sRNA 的检出率反映了参考数据库的完备程度（金黄色葡萄球菌中的召回率为 6%，大肠杆菌和肠道沙门菌中的召回率为 33%–34%）。
转录起始位点（TSS）和非 Rho 依赖性终止子（RIT）约束构成了普适且不依赖于基因组大小的生物学筛选条件，可在不同细菌中显著富集 sRNA 预测结果。不同物种间精确率的差异反映了数据库的不完整性，而非流程失效；对于注释不足的生物，未能与已知条目匹配的预测结果应视为潜在的新型 sRNA，而非假阳性。RNA-seq 覆盖深度可作为衡量生物学相关性的可靠辅助指标，但其解读需要考虑不同数据集之间测序深度的差异。
引言
小 RNA（sRNA）是一类长度为 20–500 个核苷酸的非编码 RNA 分子，是细菌生理活动中转录后调控的核心因子。这些分子通过与靶 mRNA 发生碱基配对相互作用，调控多种细胞过程，包括胁迫适应、群体感应和毒力因子表达（
Storz
等，2011；Gottesman & Storz，2011）。它们的调控作用还涉及铁稳态和抗菌药物耐药性等过程，这些过程对于细菌在宿主环境中的生存至关重要（Vanderpool & Gottesman，2004；Massé & Gottesman，2002）。
细菌小RNA（sRNA）通过两种机制不同的途径发挥作用。顺式作用sRNA由靶基因的反义链转录而来，与靶标具有近乎完全的互补性，从而能够通过直接碱基配对实现精确的基因特异性调控。这种结构使其能够以极低的调控复杂度快速响应环境变化。相比之下，反式作用sRNA可来源于距离靶基因较远的基因组位点，通常与靶标仅具有有限的互补性，往往需要RNA伴侣蛋白Hfq来促进并稳定调控相互作用（Vogel & Luisi，2011）。反式作用sRNA通常协调调控包含多个靶标的调控子，从而使细胞能够对环境波动产生同步响应。
尽管大肠杆菌（Escherichia coli）和肠沙门菌（Salmonella enterica）等模式生物中的sRNA已得到广泛表征，截至2022年，两者分别有98种和118种sRNA获得实验验证（Boutet等，2022），但绝大多数细菌物种的sRNA仍缺乏深入研究。这一知识缺口源于转录组数据覆盖范围有限，以及缺少适用于不同分类群细菌的专门计算框架。弥补这一差距对于理解不同生态位中细菌的适应性、致病机制和代谢多样性至关重要。
高通量RNA测序（RNA-seq）的广泛应用彻底改变了细菌转录组学研究，使众多物种中全基因组范围的sRNA发现成为可能（Wang等，2009）。
sRNA-Detect 等计算工具利用 RNA-seq 数据，根据表达谱、覆盖均一性、长度限制及基因间区定位来鉴定候选 sRNA（Peña-Castillo et al., 2016）。然而，由于以下若干固有局限性，这些基于表达的方法始终存在假阳性率偏高的问题：
转录噪声：RNA-seq 会捕获所有被转录的区域，包括瞬时转录本、降解中间产物，以及由启动子读穿或非特异性起始产生的反义转录产物。
mRNA 加工伪影：切割产生的 mRNA 片段在长度分布和覆盖模式上均可能与真正的 sRNA 相似，尤其是当这些片段来源于高丰度转录本时。
功能不明确：在缺乏额外生物学背景信息的情况下，基于表达的方法无法区分具有调控功能的 RNA 与无功能的转录副产物。
反义转录干扰：许多预测得到的反义 sRNA 可能仅代表转录噪声，而非功能已明确的真正调控元件，或新型功能性反义 RNA。
缺乏转录背景信息，尤其是转录起始位点（TSS）和终止信号，使得真正的调控性 sRNA 难以与非特异性转录本区分开来。这一局限性对实验验证工作影响深远，因为研究人员可能会耗费大量资源来表征无功能的候选分子。
我们假设，整合多个层面的转录证据，能够在保持对真正 sRNA 的检测灵敏度的同时，显著降低假阳性率。该方法利用了基本的生物学原理：大多数真正的 sRNA 具有明确的 TSS，表明其独立的
转录单元以及确保3′端正确形成的内在终止子（Jackson et al. 2017）。
通过差异RNA测序（dRNA-seq）进行转录起始位点定位，利用初级转录本（5′-三磷酸）与加工后转录本（5′-单磷酸或5′-羟基）对5′端外切核酸酶（TEX）处理的敏感性差异，实现对转录起始位点的单核苷酸分辨率定位（Sharma et al. 2010）。
非Rho依赖性终止子（RITs）介导细菌中主要的转录终止过程。这类结构由富含GC的发夹环及其后方的富含U序列组成，可降低RNA-DNA杂交体的稳定性，从而触发RNA聚合酶暂停和转录本释放（Gusarov & Nudler 1999；d’Aubenton et al. 1991）。利用RNIE中实现的协方差模型进行计算检测（Gardner et al. 2011），可开展不依赖于一级序列保守性的同源性搜索，因为终止子结构具有典型的构型特征，即使在系统发育距离较远的物种间也可被识别。预测的sRNA下游存在典型终止子，为其属于具有明确3′端边界的真实转录单元提供了有力支持（Brenes-Álvarez et al. 2016）。
我们对九种系统发育背景各异的细菌中的整合式sRNA预测进行了系统评估：革兰氏阳性模式菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）FZB42，以及临床上重要的医院感染病原菌艰难梭菌（Clostridium difficile）630；ε-变形菌幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）26695和空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）81116；γ-变形菌模式生物大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 MG1655和肠沙门氏菌（Salmonella enterica）ST4/74；以及具有重要环境意义的希瓦氏菌属（Shewanella）
oneidensis MR-1 和 Methylorubrum extorquens DM4。这种系统发育上的广泛跨度使我们能够评估该流程在不同基因组、调控策略和数据库覆盖水平下的性能。
通过依据转录起始位点（TSS）邻近性要求及终止子的存在情况，对预测的 sRNA 进行系统筛选，我们证明了该方法能够在保留经实验验证的候选 sRNA 的同时，大幅减少假阳性。我们的具体目标如下：
开发一种整合转录背景信息的稳健计算框架，以减少 sRNA 预测中的假阳性
在研究充分的生物中对该方法进行基准测试，以验证其有效性
将该流程应用于研究较少的细菌物种，以展示其广泛适用性
量化系统筛选带来的精确率提升
提供一个可适用于不同细菌分类群和实验条件的灵活框架
材料与方法
图 1 展示了所提出的生物信息学流程概览，说明了小非编码 RNA（sRNA）鉴定与验证的主要阶段。
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图 1：
流程展示
该工作流程首先从公共数据库中获取数据集，随后将序列比对至目标基因组。接着，通过识别转录特征来进一步筛选候选 sRNA，包括使用 TSSAR 识别转录起始位点（TSS），以及使用 RNIE 识别非 Rho 依赖性终止子（RIT）。随后进行进一步筛选，以保留高置信度候选 sRNA，最终形成用于下游分析与验证的预测 sRNA 目录。
数据收集与物种选择
我们实施了一种分层验证策略，利用研究充分的基准物种以及
以及研究较少的细菌。该方法既可利用已知的 sRNA 集合进行验证，又能展示其对研究不足的生物的适用性。
本研究选取了九种系统发育上具有多样性的细菌，涵盖六个门：三种具有充分表征的 sRNA 集合的基准物种（大肠杆菌（Escherichia coli）K-12 MG1655；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300；肠沙门菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica Typhimurium）ST4/74），以及六种代表研究不足的多样性的测试物种（幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）26695；空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）81116；Methylorubrum extorquens DM4；单胞希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）MR-1；艰难梭菌（Clostridium difficile）630Δerm；解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）FZB42）。公开可用的 RNA-seq 和差异 RNA-seq 数据集均来自 BioProject 项目（表 S1）。
测序读段比对
使用 HISAT2 2.2.1 版（Kim et al. 2015），采用默认参数，将各物种的 RNA-seq 读段比对至各自的参考基因组。使用 SAMtools 1.15 版（Li et al. 2009）将比对文件转换为 BAM 格式并进行排序。
使用 TSSAR 鉴定转录起始位点
差异 RNA-seq（dRNA-seq）利用 RNA 5′ 端对 5′ 端依赖型外切核酸酶（TEX）处理的敏感性差异。初级转录本保留 5′-三磷酸末端，能够抵抗降解，而具有 5′-单磷酸（及 5′-OH）末端的加工转录本则被选择性降解。通过比较经 TEX 处理（+TEX）与未经处理（−TEX）的文库，dRNA-seq 能够在全基因组范围内精确鉴定转录起始位点（Sharma et al. 2010）。
TSSAR 的实现
TSSAR（转录起始位点注释方案，Transcription Start Site Annotation Regime）（Sharma et al. 2010）利用泊松分布和 Skellam 分布，对 +TEX 与 −TEX 文库之间的读段起始位置计数差异进行建模，从而鉴定转录起始位点（TSS）。TSSAR 将差异评分赋予
每个基因组位置均反映了 +TEX 文库中富集的统计显著性。
关键参数
用于对 dRNA-seq 数据进行 TSSAR 分析的命令行如下：
. /TSSAR --libP I --libM I [--score I] [--fasta I] [--minPeak I] [--winSize I]
其中：
--minPeak 3：进行 TSS 判定所需的最小读段计数
--score d：+TEX 与 −TEX 文库之间的差异评分模式
--winSize 1000：峰扫描和背景估计的窗口大小
我们评估了跨越四个数量级（0 至 40,000）的 13 个离散阈值，以涵盖 TSS 统计置信度的完整动态范围。该范围包括低置信度预测（score < 100）、适用于探索性分析的中等置信度预测（100–1000）、高置信度预测（1000–2000），以及用于机制研究的极严格阈值（>2000）。几何级数式递增能够在整个置信度范围内系统评估精确率与灵敏度之间的权衡。
使用 sRNA-Detect 预测 sRNA 候选序列
算法原理
sRNA-Detect（Peña-Castillo 等，2016）基于 RNA-seq 读段比对数据所呈现的均一覆盖模式识别小 RNA 候选序列。该算法基于以下原理运行：真实的小 RNA 转录本应在其整个长度范围内呈现一致的读段覆盖，从而能够将其与片段化的 mRNA 降解产物或非特异性转录区分开来。
关键参数
用于对 RNA-seq 数据进行 sRNA-Detect 分析的命令行如下：
nextflow detect_filter_sRNA.nf --alignmentDir --annotatedGenomeFile --outputDir –output --idPrefix RCAP_rcs --minLength 20 --maxLength 500 --minHeight 10
其中：
--minLength 20：转录本的最小长度（nt）
--maxLength 500：转录本的最大长度（nt）
我们还评估了 13 个离散评分阈值。
采用不同阈值评估其对预测精度的影响。较高的阈值仅保留覆盖度高度均一且表达量较高的候选序列，而较低的阈值则可纳入表达水平中等的候选序列。
后续分析所纳入的初始 sRNA 候选序列并非工具的原始输出，而是经过预筛选的集合（sRNA-Detect separate and filter annotated RNA）：与相应 GFF 文件中已注释特征（rRNA、tRNA、tmRNA、RNase_P_RNA、protein_coding）重叠的预测结果均予以剔除。
整合策略：TSS 与 sRNA 交集分析
使用 bedtools closest（Quinlan & Hall, 2010）对预测的 sRNA 候选序列与 TSS 预测结果进行交集分析，并启用链特异性设置和距离报告功能。
关键参数
用于对预测的 sRNA 进行 TSS 交集分析的命令行如下：
```text
bedtools closest -a -b -s -D ref
```
-s：链特异性
-D ref：以参考基因组为基准报告距离
该流程的一个关键参数是 TSS 距离阈值，即 sRNA 的 5′ 起始位点与 TSS 位置之间允许的最大距离。为此，我们在所有物种中统一采用 −60 bp 上游和 +20 bp 下游的“TSS 距离阈值”。这一阈值具有生物学依据：在测序前对 RNA 进行逆转录（RT）时，逆转录过程不一定能够延伸至 RNA 的 5′ 末端，因此设置 −60 bp 的容差；原则上，逆转录不应延伸至 TSS 上游，但考虑到文库复杂度或测序深度可能导致 TSS 定位精度存在技术偏差，以及潜在的注释不确定性，因此接受 +20 bp 的容差。仅保留至少具有一个 TSS，且该 TSS 的位置落在 −60 bp】【。
从候选 sRNA 预测的 5′ 起始位置上游至下游 +20 bp 范围内的序列（位于同一基因组链上）被保留用于后续分析。
RNIE 的实现
RNIE（Gardner 等，2011）使用协方差模型（covariance models，CMs）预测 Rho 非依赖型终止子。Rho 非依赖型终止子是由富含 G+C 的发夹环和其后的多聚尿苷尾组成的短基因组序列，可促使细菌 RNA 聚合酶暂停并终止转录。
两种运行模式
基因组模式
针对高通量基因组注释进行了优化，具有较快的扫描速度（约 43 kb/s）、极低的假阳性率（约 1.7 个假阳性/Mb）和 0.70 的敏感性。
基因模式
针对基因下游区域的逐一注释进行了优化，具有更高的敏感性（0.83），但扫描速度较慢（约 1 kb/s），且假阳性率较高（约 9.6 个假阳性/Mb）。
实现参数
TSS 相关的 sRNA 区间向下游延伸 150 个核苷酸，以捕获潜在的终止子区域。RNIE 使用内置协方差模型 erpin-rho.cm 运行。
关键参数
对相交的 TSS 候选序列进行 RNIE 分析时所使用的命令行如下：
```bash
perl rnie.pl -m erpin-rho.cm -f -db -outfmt 6 -evalue 1e-1 - perc_identity 95
```
关键参数
blastn-short 针对短核苷酸序列（例如小 RNA）的比对进行了优化，其采用较小的字长和经过调整的评分参数。该设置能够提高短序列匹配的检测敏感性，同时保持特异性。
为减少较弱且可能为假阳性的匹配，对所有 BLAST 结果应用了位分数过滤标准（> 60），从而确保仅保留具有显著序列同源性的比对结果。（未过滤结果见表 S4。）
阈值优化与统计分析
我们采用全面的网格搜索方法，评估了所有
在13个阈值下组合预测的sRNA与TSS评分，因此每个物种有13 × 13 = 169种组合。此外，我们还分析了未经过TSS筛选的sRNA预测结果，以确定基线性能。
对于每种参数组合，我们计算了：
在给定TSS评分下保留的TSS预测数量
在给定sRNA评分下保留的sRNA预测数量
sRNA与TSS的交集数量
经BLAST验证的候选序列数量（与已知sRNA数据库同源的交集）
在下游检测到RIT结构的sRNA数量
具有RIT结构的经BLAST验证的sRNA数量
详细结果见表S2。
精确率和召回率的计算：
精确率（P）= TP / (TP + FP)，其中：
P（精确率）= 正确预测的sRNA占所有预测sRNA的比例
TP（真阳性）= 与已知sRNA匹配的预测sRNA
FP（假阳性）= 与已知sRNA不匹配的预测sRNA
TP + FP = 预测sRNA总数
若已知精确率，则：
FP = TP × (1 − P) / P，其中FP为假阳性。
召回率 = 已检出的sRNA / 已知sRNA，其中：
已检出的sRNA = 正确预测出的已知sRNA
已知sRNA = 注释或预期的sRNA总数
结果
流程概述与检出策略
我们的流程包含三个依次进行的筛选步骤（图2）。
首先，使用sRNA-Detect从RNA-seq数据中预测sRNA候选序列。其次，根据TSSAR实验定位的TSS筛选这些预测结果，仅保留具有明确转录起始位点的转录本。第三，将保留的候选序列向下游延伸，并使用RNIE分析，以鉴定Rho非依赖性终止子。兼具这两种特征的候选序列称为最终sRNA候选序列，构成我们最终的高置信度预测结果。对于大多数数据集，初始候选序列数量高得难以逐一检查（最多约30,000个），
然而，应用过滤器后，这些数字会降低一至两个数量级。
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图2：
流程性能总结
流程图展示了sRNA发现流程的三个连续过滤阶段：（B）直方图展示了三个步骤的递进过程：初始候选集：由sRNA-Detect预测的sRNA候选序列；与TSS交集的候选集：与TSS相交的预测sRNA候选序列；最终候选集：与TSS相交且下游具有RIT的预测sRNA候选序列。
不同物种的流程性能概述
为使流程输出结果具有背景参照，我们将物种划分为两类（表S1）。
基准物种
（大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）、肠沙门氏菌（S. enterica））拥有记录较为完善的sRNA谱系，因此可以采用精确率和召回率对流程性能进行有意义的评估。初始候选集规模较大（7,812–11,019），基线精确率中等偏低（1.2%–1.9%）。依次进行TSS和RIT过滤后，候选结果得到了显著富集：
金黄色葡萄球菌
的精确率从基线的1.19%提升至3%，对应171个候选序列，这得益于SRD参考数据库的完整性。
大肠杆菌
最终精确率达到7%，同时在116个已知sRNA中检出38个（召回率为33%）。
肠沙门氏菌
在143条参考条目中检出48条（召回率为34%），如图3所示。
测试物种
（甲基杆菌（M. extorquens）、希瓦氏菌（S. oneidensis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、幽门螺杆菌（H. pylori）、空肠弯曲菌（C. jejuni）、艰难梭菌（C. difficile））的sRNA谱系在很大程度上尚未得到表征。依据这一标准，该流程表现出稳定的有效性。
甲基杆菌
的初始候选集包含29,947个候选序列，若逐一进行验证将难以实现；经过筛选后，最终候选数减少至112个，降幅达到99.6%，同时检出已提交参考数据中的7条sRNA中的1条（召回率为14%）。
希瓦氏菌
由……减少至……
候选序列数量从6,137个减少至163个（减少97.3%）。对于艰难梭菌（*C. difficile*），候选序列数量从452个减少至22个，精确率为86%。幽门螺杆菌（*H. pylori*）和空肠弯曲菌（*C. jejuni*）的初始候选序列数量分别为536个和319个，经过筛选后分别减少至32个和34个（精确率分别为22%和9%，两者的召回率均达到14%）（图3）。对于所有测试物种，经过筛选的候选序列集均构成了一个具有优先级且具有生物学依据的候选短名单，可用于实验验证。
精确率–召回率权衡
连续进行TSS和RIT筛选后，候选序列集减少了89%–99%，同时保留了已知sRNA的良好召回率（图4）。在所分析的物种中，肠道沙门氏菌（*S. enterica*）和大肠杆菌（*E. coli*）表现出最高的召回率，分别检出约34%和33%的已知sRNA。然而，两者的精确率相对较低（约为7%–8%），这反映出筛选后仍保留了大量候选序列。相比之下，艰难梭菌（*C. difficile*）在维持中等召回率（约14%）的同时，实现了最高的精确率（约59%），表明其候选序列保留过程具有较强的选择性。
空肠弯曲菌（*C. jejuni*）表现出中等水平的性能，召回率约为14%，精确率为9%。幽门螺杆菌（*H. pylori*）的召回率最低（约7%），但实现了相对较高的精确率（约22%），这表明其筛选策略较为保守，仅保留了少量但富集程度较高的候选序列。氧化硫硫杆菌（*S. oneidensis*）和甲基杆菌（*M. extorquens*）的精确率较低，但召回率分别约为12%和14%。
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图3：三个筛选阶段和九个物种中的精确率变化
精确率（预测结果中与已知sRNA相匹配的比例）展示了流程三个连续阶段的结果：基线sRNA-Detect预测（Baseline）、基线预测结果与TSS的交集（+TSS），以及进一步进行RIT筛选（+TSS+RIT）。
图 4：
性能权衡：召回率与精确率
召回率（x 轴）= 检出的已知 sRNA 百分比。精确率（y 轴）= 经 BLAST 判定，与相应物种中的已知 sRNA 同源（至少 95%_identity）的预测结果所占百分比。
总体而言，依次应用 TSS 和 RIT 筛选器有效缩小了候选搜索空间，同时保留了相当比例的已知 sRNA。在若干物种中观察到的精确率提升表明，将转录起始位点证据与内在终止子预测相结合，能够优先去除假阳性候选，同时保留具有生物学相关性的 sRNA。
利用 RNA-seq 数据验证最终候选
为评估计算预测结果的转录证据支持情况，我们通过读段覆盖度分析，将最终的潜在候选 sRNA 与 RNA-seq 数据进行比对；具体而言，计算每个候选的平均读段深度，并将其用作表达水平的定量指标。随后，根据平均深度阈值将候选分为四个等级：高表达、中度表达、低表达和表达较差；其中，表达较差的候选 RNA-seq 证据不足，可能属于计算伪影。
如图 5 所示，经验证的 sRNA 候选在不同物种中的分类分布差异显著，反映了测序深度与 sRNA 内在生物学特性的共同影响。平均深度最高的物种数据集——
H. pylori
（2524.4 reads/position）、
C. difficile（
1999 reads/position）、
S. enterica
（287.7 reads/position）和
E. coli
（354.9 reads/position）——其柱形图中高表达 sRNA 占主导地位，表明较深的覆盖度能够使读段稳定累积至 ≥50-read 阈值以上。
达到高置信度判定所需的阈值。相比之下，中等测序深度的数据集，如 *C. jejuni*（156.7 reads/position），以及低测序深度的数据集，如 *Shewanella*（32.3 reads/position）和 *Methylorubrum*（41 reads/position），弱表达候选所占比例较高。这表明真实的 sRNA 转录本确实存在，但覆盖度不足，未能达到分类阈值；这反映的是测序深度造成的假象，而非表达的真正缺失。
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图 5：
九种细菌中 sRNA 的分类与 RNA-seq 覆盖深度的关系
根据平均测序深度，将 sRNA 候选分为四个置信等级：高表达（≥50 reads/position，黑色）、中等表达（10–50 reads，中深灰色）、弱表达（2–10 reads，中浅灰色）和低表达（<2 reads，近白色灰色）。每个柱形代表各物种的候选总数（应用 TSS 和 RIT 筛选后）；颜色表示各置信等级所占的比例。物种按候选总数从上到下递减排列。
为评估预测准确性与候选保留率之间的权衡，对计算预测结果采用了逐步严格的筛选，评分阈值范围为 0 至 40,000（图 S1）。
值得指出的是，若一开始就将分析范围限定于高评分预测结果，那么在应用转录单元筛选之前，部分候选便会被过早剔除。有效的 sRNA 在验证阶段可获得 RNA-seq 覆盖度的支持。
在图 6.A 中，*E. coli* 的候选数量随评分阈值升高而逐步减少，从阈值为 0 时的 598 个降至阈值为 2000 时的 34 个（减少 94%）。关键的是，
在整个阈值范围内，精确率持续稳步提升，从得分为 0 时的 7% 上升至得分为 2000 时的 29%。这种持续提升表明，得分较高的预测结果更有可能对应真实注释的 sRNA，说明评分算法能够有效捕捉与真实 sRNA 生物学特征相关的信号。相反，召回率随严格程度逐级提高而逐渐降低，从阈值为 0 时的 33% 降至阈值为 2000 时的约 9%。
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图 6：
得分阈值对最终 sRNA 发现结果的影响：注释充分与注释不足的物种
比较大肠杆菌 K-12（A）和空肠弯曲菌（B）中最终保留的候选数量、精确率，以及各物种已知 sRNA 的召回率百分比。（所有物种的结果见补充材料中的图 S2。）
与此形成鲜明对比的是，空肠弯曲菌（图 6B）表现出截然不同的筛选响应，体现了在功能注释有限且 RNA-seq 测序深度较低的生物体中进行预测所面临的挑战。随着阈值升高，候选集不断缩减：候选数量从得分为 0 时的 34 个降至得分为 1500 时的 0 个。然而，召回率从阈值为 0 时的 14% 骤降至得分为 100 时的 4.5%，并在得分为 1500 时降至零。
召回率的骤降表明，尽管精确率指标有所提升，严格筛选仍会从候选集中剔除许多真实 sRNA。
这些观察结果以及所有物种的比较结果（图 7）支持在所有物种的主流程分析中采用得分阈值 0，以降低过早舍弃潜在重要候选的风险。
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图 7：
条件依赖性 sRNA
S. enterica ST4/74中的表达
两个互补的维恩图比较了鼠伤寒沙门氏菌（*Salmonella enterica* serovar Typhimurium）ST4/74中五个实验数据集的sRNA检测结果。（A）过滤前的原始sRNA-Detect预测结果。（B）经过流程过滤后的候选结果（TSS + RIT）。所分析的五个数据集包括：中对数生长期（MEP）、早期稳定期（ESP）、晚期稳定期（LSP）、SPI-2诱导条件（InSPI2），以及由22种综合环境条件合并而成的数据集（POOL）（Kröger等，2013）。
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图8：
S. enterica中sRNA检测方法的基准评估——精确率与召回率
比较8种已发表的sRNA检测流程与本研究方法在sRNA检测方面的精确率和召回率表现。每个点代表一种方法的运行结果。符号说明：（白色圆圈）= 已发表的工具；（黑色菱形）= 本研究方法。已发表的工具包括ANNOgesic、APERO、DETR’PROK、GL、Nuss、TLA、Rockhopper和sRNA-Detect。本研究展示的是过滤后的结果。该图中的精确率按照P = Models/Total predicted计算，与本研究采用的计算方式一致。
条件依赖性转录塑造鼠伤寒沙门氏菌中的sRNA发现
为评估不同生长条件下sRNA表达的差异，研究人员分析了来自BioProject PRJNA215033（Kröger等，2013）的鼠伤寒沙门氏菌ST4/74在五种实验样品中的RNA测序数据：中对数生长期（MEP）、早期稳定期（ESP）、晚期稳定期（LSP）、SPI-2诱导条件（InSPI2），以及由22种不同环境条件衍生的混合样品（POOL）。为捕获条件特异性的表达模式，研究流程针对每种条件分别独立执行。
在所有条件下，共鉴定出1225个独特基因座，凸显了其复杂性与可塑性。
sRNA 图谱。在这些候选序列中，只有 135 个在所有条件下均被稳定检测到，构成了一个规模相对较小、组成型表达的 sRNA 核心集合。相比之下，423 个位点严格表现为条件特异性，其余候选序列则在部分条件间共享，表明其表达模式具有梯度性或依赖于特定情境。不同条件下检测到的位点数量差异显著：如图 7 所示，POOL 中的数量最多（785 个），其次为 ESP（669 个）、InSPI2（659 个）、LSP（506 个）和 MEP（443 个）。然而，POOL 中观测到的高检出量主要反映了多个环境信号的汇总，而非生物学上协调一致的转录程序有所增加。
过滤后聚焦于条件特异性 sRNA 时，可以观察到更具启发性的模式。ESP 中独有候选序列的数量最多（165 个），显著高于其他条件，包括 POOL（104 个）、LSP（66 个）、InSPI2（47 个）和 MEP（41 个）（图 7）。
值得注意的是，合并数据集虽然提高了总体检测灵敏度，但似乎会通过整合不同的转录状态而削弱条件特异性。因此，在 POOL 中检测到的 sRNA 可能反映的是累积表达，而非分条件解析的调控。
这些观察结果与该研究此前报道的条件特异性转录起始位点（TSS）分布密切吻合（Kröger et al., 2013），进一步支持了转录起始是 sRNA 产生的主要决定因素这一观点。富含独有 TSS 的条件（如 ESP，共 34 个候选序列）往往会产生更多条件特异性 sRNA。
总体而言，这些结果揭示了 sRNA 发掘中的一个基本权衡：尽管合并数据集能够最大限度地提高灵敏度并俺去也
扩大可检测的谱系范围，而对单个条件进行分析对于解析调控特异性并揭示具有生物学意义的 sRNA 表达模式至关重要。
流水线相对于现有工具的定位（以 *S. enterica* 为案例）
对于*Salmonella enterica*，Leonard 等人于 2019 年在文献中评估了多种 sRNA 预测工具，包括 ANNOgesic、APERO、DETR’PROK、GL、Nuss、TLA、Rockhopper 和 sRNA-Detect。
这些方法在召回率和特异性之间呈现出不同的权衡：表现最佳的工具在其参考 sRNA 集合上的召回率约为 0.75–0.83，但代价是每个物种会产生数百至数千个预测转录本。例如，仅 sRNA-Detect 就能在 *S. enterica* 中预测出 17,662 个转录本，其中只有 71 个对应于已知 sRNA，从而显著增加了人工筛选和实验验证的负担。
在此背景下，将我们的多层次流水线应用于 *S. enterica* 后，从 Leonard 等人于 2019 年报道的 84 个模型中找回了 47 个已知 sRNA，同时将最终候选集合缩减至 809 个区域。换言之，与 sRNA-Detect 的原始输出相比，该方法在保持已知 sRNA 召回率为 0.5 的同时，将需要检查的转录本数量减少了近 100 倍。良好的召回率与有限的候选数量相结合表明，系统整合转录起始位点（TSS）和 Rho 非依赖型终止子，能够将 sRNA-Detect 这种灵敏度较高但特异性有限的工具，转化为特异性更强且更易于开展实验验证的分析流水线。
讨论
从原始预测到显著候选
基于表达的工具（如 sRNA-Detect）在灵敏度方面表现出色，但在特异性方面存在不足：它们会预测出数千个短转录本，而假阳性数量会随之增长】【。
预测结果随基因组大小显著变化。在 *S. oneidensis* 的基因组（4.97 Mb）中，99% 的预测结果均为噪声；在 *S. enterica*（4.88 Mb）中，假阳性率高达 88%。我们的流程不对统计阈值进行调优，而是依据转录机制施加两条普适的生物学规则：候选序列必须与实验绘制的转录起始位点（TSS）重叠，因为独立基因从启动子处起始转录；同时必须具有 Rho 非依赖性终止子（RIT），因为功能性转录本需要明确的 3′ 端边界。
这种逐步筛选在九种系统发育多样的物种中均显著提高了精确率，但提升幅度及其含义在两类生物之间存在根本差异：一类物种的初始预测集很大（*S. aureus*：11,019；*E. coli*：9,335；*S. enterica*：7,812；*M. extorquens*：29,947；*S. oneidensis*：6,137），基线精确率极低（0.03–1.96%）；另一类物种则由 sRNA-Detect 生成规模较小的预测集（*H. pylori*：536；*C. jejuni*：319；*C. difficile*：452），基线精确率相对较高（2.82–42.04%）。这种差异并非偶然，而是反映了全基因组转录复杂性的根本差别，以及基于表达的工具可检测到的伪转录信号密度。不过，在这两类物种中，TSS 和 RIT 筛选均持续富集了真阳性，并减少了候选序列数量。
预测集较大的物种：大幅减少噪声
对于 sRNA-Detect 生成数千至数万个候选序列的生物体而言，由于预测空间远大于已知 sRNA 的数量，基线精确率必然较低。
金黄色葡萄球菌 USA300 是一个典型例子：初始候选序列共 11,019 个，其中仅有 1.19%】【。
初始精确率较低，但逐步筛选将候选项减少至 171 个（减少 98.4%），同时检出 88 个已知 sRNA 中的 5 个（召回率 6%）；最终精确率为 3%，提升了 2.5 倍。同样，M. extorquens DM4 的初始预测数为 29,947 个（基准精确率 0.03%），是九个物种中初始集合最大的，这反映了其基因组较大（7.0 Mb）且转录组注释有限。筛选后，候选项减少至 112 个（减少 99.6%），检出 7 个已知 sRNA 中的 1 个（召回率 14%）；最终精确率为 1%，提升了 33 倍。E. coli K-12 MG1655 和 Salmonella enterica ST4/74 也呈现相同趋势：二者的初始预测数分别为 9,335 和 7,812 个，基准精确率分别为 1.96% 和 1.42%；筛选后，最终候选项分别为 598 和 809 个，最终精确率均为 7%，分别检出 116 个已知 sRNA 中的 38 个（召回率 33%）和 143 个中的 48 个（召回率 34%）。Shewanella oneidensis MR-1 和 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 也同样受益，候选项减少幅度均超过 97%，最终精确率为 1–2%。
候选预测集较小的物种——基准精确率已较高
相比之下，H. pylori、C. jejuni 和 C. difficile 的初始候选项少得多（分别为 536、319 和 452 个），这直接解释了它们相较于候选集较大的物种为何具有更高的基准精确率。这并不意味着 sRNA-Detect 在这些生物体中的性能本身更优，而更可能反映了转录复杂性较低、基因组规模较小（分别为 1.67、1.64 和 4.11 Mb），或在所分析的条件下可检测到的伪转录信号密度较低。
Clostridioides difficile 的基准精确率为所有物种中最高，达到 42.04%（452 个初始预测中有 190 个与已知 sRNA 匹配）；筛选后则升至 59%，随后
通过连续筛选，最终保留 22 个候选 sRNA，性能提高 1.4 倍，检出 14 个已知 sRNA 中的 2 个（召回率为 14%）。
幽门螺杆菌在经 RIT 筛选的 32 个候选中，最终精确率达到 22%，较 5.78% 的基线提高 3.8 倍；在 81 个已知 sRNA 中检出 6 个（召回率为 7%）。
空肠弯曲杆菌在 34 个候选中，最终精确率达到 9%，较 2.82% 的基线提高 3.2 倍；在 22 个已知 sRNA 中检出 3 个（召回率为 14%）。值得注意的是，这些物种的绝对倍数提升较小，反映的是其基线本已较高，而非筛选流程效果较弱。
数据库参考信息与性能差异
九个物种的召回率差异显著，而这种差异更多反映了注释深度，而非筛选流程的性能。不同物种的数据库资源差异巨大：大肠杆菌 K-12 有 116 个经验证的 sRNA；肠沙门氏菌有 143 条记录；金黄色葡萄球菌的 SRD（金黄色葡萄球菌调控 RNA 数据库）收录了 88 个不同条目；幽门螺杆菌的 BSRD 收录了 81 条记录。这些生物已历经数十年的深入转录组研究，包括多轮 RNA-seq、dRNA-seq 和实验验证（Storz et al. 2011；Sharma et al. 2010），因此其参考集足够全面，可用于有意义的召回率基准评估。
相比之下，甲基杆菌属 extorquens DM4 在 RiboGap 中仅有 7 个已表征的 sRNA。这并不意外：该物种受到的转录组研究相对较少，非模式 α-变形菌中的 sRNA 注释远落后于肠杆菌（Boutet et al. 2022）。对表征充分的细菌开展的全基因组调查表明，对于基因组大小相近的生物，几十个至一百多个 sRNA 较为常见（Sharma et al. 2010），这意味着……
M. extorquens DM4 中已收录的 7 条条目仅占其真实 sRNA 组成的一小部分。这一注释缺口直接解释了表面上的低召回率：与真实但尚未注释的 sRNA 相匹配的流水线预测结果，在面对不完整的参考集时，必然会被判定为假阳性。
同样，C. jejuni（来自人工整理文献的 22 条 sRNA）、B. amyloliquefaciens（BSRD 中的 28 条条目）以及 S. oneidensis（17 条已注释 sRNA）均代表了研究不足的基因组，其 sRNA 发掘工作相对滞后。对于这些物种，未匹配的预测结果代表了有待实验验证的真实发现，而非流水线错误；这为发现新的 sRNA 基因提供了机会，而这种机会在基于精确率的指标中从结构上是不可见的。
通过阈值校准捕获差异性终止子
默认的 RNIE（Infernal 协方差）模型基于代表性较强的细菌谱系进行校准，因此无法识别物种特异性的 Rho 非依赖型终止子变体。将 cmsearch 的得分阈值从默认值 16 放宽至 4 后，9 个生物体中的 sRNA 候选数量均有所增加。值得注意的是，这一放宽策略重新检测出了 M. extorquens DM4 中的 sRNA1969；该 sRNA 此前已在本实验室通过实验得到验证（Boutet，2023），但在默认严格性条件下无法被检测到。这一结果为如下假设提供了直接的实证支持：当检测模型应用于在其训练数据中代表性不足的生物体时，放宽阈值能够挽救那些系统性地被排除在外、但在生物学上真实存在的 sRNA；同时，扩大的候选集并非完全由假阳性组成。
候选数量扩增的幅度在不同生物体之间存在差异，这与其相对于 RNIE 训练集的系统发育距离以及核苷酸组成偏倚均相一致。
扩增幅度最大的是 迷人片在线观看
AT 偏好性在 *H. pylori* 中尤为显著（增加 32 倍），在 *E. coli* 和 *S. enterica* 等肠杆菌中也较为明显（扩增约 3 倍）；而在 *C. jejuni* 中则仅有轻微变化，尽管其基因组大小与 *H. pylori* 相近。这可能反映出 *C. jejuni* 对 Rho 依赖型终止的依赖程度更高，因此由 RNIE 检测到的 Rho 非依赖型终止子结构密度较低。尽管已有研究记载细菌中存在 Rho 依赖型终止机制（Ciampi 2006），但对 *C. jejuni* 中终止途径使用情况的全基因组定量研究仍然有限。
表达深度与多条件分析
在 RNIE 得分阈值为 4 时，RNA-seq 覆盖深度成为衡量扩增候选集中的 sRNA 生物学相关性的可靠指标。在全部九个物种中，35.7% 的 sRNA 候选（2101 个中的 750 个）符合高表达标准（平均深度 ≥50 条 reads/位置）。
使用 samtools coverage 对由 TSS 和 RIT 界定的区域计算每个候选的平均覆盖深度，并采用 ≥50 条 reads/位置作为阈值，以确定是否具有高置信度的转录支持。该阈值为绝对值，而非经数据集归一化后的值，因此解读时应注意这一点。平均深度最高的数据集——*H. pylori*（2524 条 reads/位置）、*C. difficile*（1999 条 reads/位置）、*E. coli*（355 条 reads/位置）和 *S. enterica*（288 条 reads/位置）——均以超过 ≥50 条 reads/位置阈值的候选为主。不过需要指出，此处的“高表达”类别反映的是测序覆盖深度，而非内在的生物学表达水平；不同 RNA-seq 项目之间的覆盖深度也有所差异。相较之下，覆盖深度较低的数据集，如 *S. oneidensis*（32 条 reads/位置）和 *M. extorquens*（41 条 reads/位置），其高表达候选的比例则较大】【。
呈现出较弱的表达比例，这表明真实的 sRNA 转录本确实存在，但测序覆盖度不足以超过分类阈值，这更可能是测序深度造成的假象，而非真正缺乏表达。
为评估条件依赖性的 sRNA 表达情况，该流程分别应用于来自鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）ST4/74 的五个转录组数据集（BioProject PRJNA215033；Kröger 等，2013）：指数生长中期（MEP）、稳定生长期早期（ESP）、稳定生长期晚期（LSP）、SPI-2 诱导条件（InSPI2），以及由 22 种不同环境条件汇总而成的混合样本（POOL）。
在全部五种条件下，共鉴定出 1225 个独特位点，揭示了鼠伤寒沙门氏菌 sRNA 图谱的广度与可塑性。其中，仅有 135 个（11%）位点同时存在于全部五种条件中，构成了一个规模较小的组成型表达核心。与之形成鲜明对比的是，423 个位点（35%）具有严格的条件特异性，即仅在一种条件下被检测到，而在其他所有条件下均未被检测到，这表明可检测到的 sRNA 库中，大多数成员受到条件调控，而非组成型表达。在各单独条件之间，检测到的位点数量存在显著差异：POOL 检出的位点数量最多（785 个），其次为 ESP（669 个）、InSPI2（659 个）、LSP（506 个）和 MEP（443 个）。POOL 数据集独特地捕获了 104 个在其他四种单独条件中均未检测到的位点，这反映出 22 种环境中汇聚的微弱或瞬时转录信号，在任一单独分析的条件下均低于检测阈值。
条件特异性分析显示，ESP 具有数量最多的独特候选位点（165 个），显著高于 InSPI2（47 个）、LSP（66 个）、MEP（41 个）和 POOL（104 个）。这种富集的
ESP 特异性 sRNA 的出现与营养限制转变过程中广泛的转录重编程相一致，也印证了 Kröger 等人（2013）的发现：在所有已分析条件中，ESP 产生的独特转录起始位点数量最多。这进一步表明，转录起始是决定条件特异性 sRNA 出现的主要因素。
尽管汇总数据集最大限度地提高了整体检测灵敏度，但与单个生长阶段相比，其条件特异性反而有所降低。POOL 中较高的位点数量反映的是 22 种环境下信号的累积，而非协调一致的转录程序，这使得对仅在该数据集中检出的候选 sRNA 进行功能解读更加困难。单一标准实验室条件——这是非模式生物研究中最常见的实验设计——所能检测到的 sRNA 仅占全部可检测种类的 36%（MEP：443/1225）至 55%（ESP：669/1225）。这表明，全面发现 sRNA 在结构上受到实验条件覆盖广度的限制。这些发现强调，对于肠道沙门氏菌（*S. enterica*）这类对环境变化有响应的生物而言，涵盖多种生理状态的多重转录组分析并非可有可无，而是实现近乎全面 sRNA 编目的必要条件。
局限性与未来研究方向
尽管该流程具有较强的稳健性，其适用范围仍受到若干因素限制。首先，dRNA-seq 数据的可用性仍然有限；对于缺乏此类数据的生物，除非能从其他来源获得通过实验或计算方法推导的 TSS 列表，否则无法利用 TSS 定位。其次，RIT 检测假设 sRNA 主要由 Rho 非依赖性终止子终止；对于依赖 Rho 终止或具有非典型终止子结构的生物，可能
遭受系统性低估，这一点可能由 *C. jejuni* 的情况体现：尽管其初始预测集较小，精确率提升幅度却有限（最终精确率为 9%），这表明问题可能在于终止子检测受限，而非表达相关噪声。第三，条件采样仍至关重要：即使经过优化的流程，也无法发现未在所分析条件下表达的 sRNA，因此，单一生长条件策略的最高完整度被限制在约 40%。第四，BSRD、NCBI、Rfam 和 RiboGap 中仍存在数据库缺口，导致方法学精确率与参考数据不完整性相混淆，并系统性低估研究不足生物体中的真实召回率。
未来的 sRNA 发现应采用若干互补策略。针对多种条件开展多重 RNA-seq——涵盖营养、氧化、渗透压及模拟宿主环境的胁迫条件——可扩大可检测的 sRNA 集合，并揭示条件特异性调控程序，正如
Kröger 等人（2013）
所示。通过 iRIL-seq 或 CLIP-seq 进行直接相互作用图谱绘制（
Holmqvist 等人，2016
），可为预测结果提供不依赖序列同源性的正交功能验证。未来版本的流程应纳入专门用于检测 Rho 依赖性终止特征的计算工具，以弥补此类终止模式普遍存在的生物体中 sRNA 认知方面的系统性缺口。
结论
本研究提出了一套系统框架，通过逐步整合转录背景来改进细菌小调控 RNA（sRNA）的预测。通过将 sRNA 检测与转录起始位点（TSS）定位及 Rho 非依赖性终止子（RIT）识别相结合，我们证明，在维持……的同时，可大幅减少假阳性预测。
在系统发育差异显著的细菌物种中，稳健地恢复经实验表征的小 RNA（sRNA）。
该流程在九种细菌中将精确率提高了 1.4 至 33 倍，并将规模从 319 至 29,947 个候选对象不等的初始候选集，缩减为 22 至 809 个在生物学上易于处理的优先候选对象。跨物种比较得出的一个基本发现是，基线精确率主要取决于初始预测集的规模，而非物种间固有的生物学差异。初始预测集较小的生物体——H. pylori（536 个）、C. jejuni（319 个）和 C. difficile（452 个）——表现出较高的基线精确率（2.82–42.04%），这仅仅是因为已知 sRNA 与预测总数之比更为有利。相反，基因组较大或转录背景较复杂、因而产生数万个预测结果的物种——M. extorquens（29,947 个）、S. aureus（11,019 个）和 E. coli（9,335 个）——尽管具有数量相当或更多的真实 sRNA，基线精确率却很低（0.03–1.96%）。正确解读流程性能时，这一区别至关重要：基线精确率较低的物种自然会表现出更大的倍数提升，而候选集较小的物种自然会达到更高的最终绝对精确率；但在这两种情况下，该流程都能持续富集真阳性并剔除噪声。
Clostridioides difficile 的最终绝对精确率最高，达到 59%（初始预测 452 个，最终候选 22 个；提升 1.4 倍）；M. extorquens DM4 的倍数提升最大，达到 33 倍（初始预测 29,947 个，最终候选 112 个；减少 99.6%），并检出 7 个已知 sRNA 中的 1 个（召回率 14%）。Staphylococcus aureus USA300 展现出强劲的候选……
候选数量从 11,019 个降至 171 个（减少 98.4%），并检出 88 个已知 sRNA 中的 5 个（召回率为 6%），最终精确率为 3%。在 598 个候选中，大肠杆菌 K-12 MG1655 检出 116 个已知 sRNA 中的 38 个（召回率为 33%），最终精确率为 7%；在 809 个候选中，肠沙门氏菌 ST4/74 检出 143 个已知 sRNA 中的 48 个（召回率为 34%），最终精确率为 7%——这是观察到的最高召回率，与这两种细菌拥有规模较大且经过精心整理的参考数据库相符。
TSS 和 RIT 过滤的稳健性不受基因组大小和系统发育关系影响，反映的是生物学原理，而非针对特定生物进行的参数调优。依次应用这些过滤器，可优先去除转录噪声——包括降解产物、异常起始和启动子通读——同时保留符合典型启动子结构和 3′ 转录终止特征的真阳性结果。
将 RNIE 的比特分数阈值从默认参数放宽至 -T 4 后，检出了此前未能发现的 sRNA，包括在 M. extorquens 中经实验验证的 sRNA1969，从而验证了这一假设：标准化的终止子模型可能无法识别物种特异性变体。对于在终止子模型训练数据集中代表性不足的非模式生物，这类校准或许是必要的折中方案，可扩展该流程在细菌系统发育范围内的适用性。
不同物种间精确率的差异与初始预测集规模及参考注释的完整性均相关，而非源于方法失效。H. pylori（81 个 BSRD sRNA）、E. coli（116 个 sRNA）、S. enterica（143 个 sRNA）和 S. aureus（88 个 SRD sRNA）经过数十年的转录组研究，已形成丰富的参考集；而 M. extorquens（7 条 RiboGap 记录）、C. jejuni（22 个 sRNA）、S. oneidensis（17 个 sRNA）和 B. amyloliquefaciens（28…
BSRD 条目所代表的是研究不足的基因组；由于参考集不完整，其真实召回率会被系统性低估。这些生物中的表观精确率较低，很可能反映了分析流程检出了参考集不完整所遗漏的真实 sRNA。这一区分至关重要：对于注释稀疏的生物，未匹配的预测结果意味着发现新 sRNA 基因的机会，而非分析流程失效的证据。
RNA-seq 表达深度是衡量 sRNA 生物学相关性的可靠次级指标，但其解释取决于数据集。每碱基读数 ≥50 的候选序列表现出稳定高于噪声阈值的表达；而跨物种比较则需要考虑不同项目间测序深度的差异。对 S. enterica 五种条件下的数据进行多条件分析发现，在 1225 个独特位点中，仅有 135 个（11%）在所有条件下均被检出，另有 423 个位点（35%）严格呈现条件特异性。这表明，要全面发现 sRNA，必须采用多重转录组学策略，覆盖多种生理环境；无论算法多么精细，这都是所有预测流程固有的结构性限制。
整合 TSS 和 RIT 约束，可直接应对表达量驱动型工具已知的局限：sRNA-Detect 单独使用时，会在 S. enterica 中预测出 7812 个转录本，其基线精确率仅为 1.42%（其中 111 个与已知 sRNA 匹配）。我们的分析流程在将最终候选数量降至 809 个的同时，仍保持了 34% 的召回率，从而使高通量实验验证切实可行。与已发表工具的对比基准测试证实，系统性地纳入转录上下文标记，优于侧重灵敏度的替代方法，并取得了更优的精确率—召回率】【。
尤其是对于非模式生物而言的权衡。
然而，该流程的适用范围受到一些根本性限制。dRNA-seq 数据的可获得性仍然有限，而主要依赖 Rho 依赖性终止的生物（其中可能包括 C. jejuni）表现出较低的终止子恢复密度。由转录后加工产生的 sRNA，包括 tRNA 衍生片段和 UTR 衍生 RNA，不具有独立的 TSS 和 RIT 特征，因此无法通过该框架检测。在单一条件下，条件特异性表达使理论上的最高发现率被限制在约 40%。
未来的研究应着重开展以下工作：（1）在多种不同条件下开展多重 RNA-seq，以扩展可获取的 sRNA 谱系；（2）通过 iRIL-seq 或 CLIP-seq 进行直接互作图谱绘制，以实现正交功能验证；（3）纳入对 Rho 依赖性终止的检测；（4）整合基于实验验证 sRNA 训练的机器学习分类器；以及（5）将靶标预测与候选分子评估相结合，在不依赖序列同源性的情况下揭示其生物学意义。
总之，转录背景标志物（TSS 和 RIT）构成了适用于细菌系统发育多样性的、普适且不依赖序列的生物学筛选标准。将二者依次整合，能够在保持对真实调控分子敏感性的同时，显著提高 sRNA 预测的精确性，从而为改进细菌 RNA 注释以及在难以获得密集参考注释的研究不足生物中发现新型调控元件，提供一个具有普适性的框架。
作者贡献
Sinda Elhedi：流程设计、数据分析、论文撰写。Kadidia Dite Selly N’Diaye：提供 Methylorubrum extorquens 的数据。J. Perreault：监督、论文撰写。
利益冲突
作者声明不存在任何利益冲突。
数据可用性
本研究所使用的全部 RNA-seq 数据集均可通过 NCBI GEO 和 ENA 数据库公开获取；登录号见表格。脚本和数据库可在 GitHub 获取：
https://github.com/sindaelhedi/sRNA_TSS_RIT_pipeline.git
致谢
本研究得益于加拿大数字研究联盟（Digital Research Alliance of Canada，前身为 Compute Canada）提供的计算资源。本研究部分经费由 NSERC Discovery Grant（RGPIN-2025-06433）、Fondation Armand-Frappier 和 CRIPA 资助。
基金资助信息
NSERC Discovery Grant
Fondation Armand-Frappier
CRIPA
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《用于鉴定细菌中小型非编码RNA（sRNA）候选物的流程》
Sinda Elhedi，
Kadidia Dite Selly N’Diaye，
Jonathan Perreault
bioRxiv
2026.07.02.735529；
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.735529
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《用于鉴定细菌中小型非编码RNA（sRNA）候选物的流程》
Sinda Elhedi，
Kadidia Dite Selly N’Diaye，
Jonathan Perreault
bioRxiv
2026.07.02.735529；
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.735529
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关键词：细菌小非编码RNA · RNA-seq分析 · 转录起始位点 · Rho非依赖型终止子 · sRNA预测 · 假阳性过滤
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