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雷帕霉素能够延长多个物种的寿命，但在全生物体尺度上，其细胞类型特异性的获益与脆弱性仍不明确。在此，我们构建了雷帕霉素果蝇细胞图谱（Rapamycin Fly Cell Atlas，Rapa-FCA），这是一套覆盖雌雄两性、多个年龄阶段、18个细胞大类和181种细胞类型的果蝇全生物体单核转录组图谱。雷帕霉素引发了高度异质性的应答，对生殖、消化和神经肌肉系统的影响尤为显著，而大多数神经元群体的应答较为温和。我们在多种组织中鉴定出一条对雷帕霉素敏感的趋同衰老轨迹（Convergent Aging Trajectory，CAT），其特征为Fkbp12富集，以及与mTORC1相关的代谢程序，包括糖酵解和脂质合成。CAT高水平细胞核随年龄增长而积累，而雷帕霉素可优先减少此类细胞核，且这一效应在雌性中尤为明显，与雌性更显著的寿命延长效应一致。通过整合CAT丰度、衰老时钟预测结果和细胞核比例变化，我们绘制了雷帕霉素在不同性别和细胞类型中的衰老保护效应图谱。总之，Rapa-FCA提供了一个全生物体尺度的研究框架，用于解析雷帕霉素如何在不同性别、组织和细胞状态下重塑细胞衰老。
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摘要
雷帕霉素可延长多个物种的寿命，但其在整个生物体尺度上的细胞类型特异性益处与脆弱性仍不明确。在此，我们构建了雷帕霉素果蝇细胞图谱（Rapamycin Fly Cell Atlas，Rapa-FCA），这是一个涵盖整个生物体的单核转录组图谱，涉及雌雄两性、多个年龄阶段、18类细胞以及181种细胞类型。雷帕霉素诱导了高度异质性的响应，在生殖系统、消化系统和神经肌肉系统中表现出显著效应，而大多数神经元群体的响应较为有限。在多种组织中，我们鉴定出一种对雷帕霉素敏感的衰老趋同轨迹（Convergent Aging Trajectory，CAT），其特征是Fkbp12富集以及与mTORC1相关的代谢程序激活，包括糖酵解和脂质合成。CAT高表达细胞核会随年龄增长而积累，并优先受到雷帕霉素的减少作用，尤其是在雌性个体中；这一结果与雷帕霉素对雌性寿命延长作用更强的现象一致。通过整合CAT丰度、衰老时钟预测结果以及细胞核比例变化，我们绘制了雷帕霉素在不同性别和细胞类型中的延缓衰老保护效应图谱。总体而言，Rapa-FCA为解析雷帕霉素如何重塑不同性别、组织和细胞状态下的细胞衰老过程提供了一个覆盖全生物体的框架。
引言
衰老是一种复杂的生物学过程，其特征是机体系统和器官逐渐衰退并发生功能障碍，从而增加疾病易感性和死亡风险。随着全球人口老龄化，能够延长寿命并改善健康寿命的干预措施已成为生物医学研究的重点。在目前已知的所有干预措施中，雷帕霉素是最具潜力的干预手段之一（Jiang et al., 2025）。作为机制性雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）的抑制剂，
（mTOR）通路方面，已有研究表明，雷帕霉素可延长从酵母和蠕虫到果蝇及哺乳动物等多个物种的寿命（
Bjedov et al., 2010
；
Chen et al., 2013
；
Harrison et al., 2009
；
Kennedy and Lamming, 2016
；
Powers et al., 2006
）。雷帕霉素调节这一核心营养感知通路的能力，引发了人们将其转化应用于人类的广泛期待。
雷帕霉素在多个物种中均表现出保守的延寿效应，这提示抑制mTOR信号可能是衰老干预的核心机制。然而，与衰老相关的mTOR活性不太可能在整个机体内均匀升高。相反，在果蝇、小鼠、大鼠和人类的特定组织及细胞环境中，均观察到mTOR相关通路，尤其是由mTOR复合物1（mTORC1）调控的通路，其活性增强或失调（
Calhoun et al., 2016
；
Chen et al., 2009
；
Choy et al., 2025
；
Joseph et al., 2019
；
Leontieva et al., 2014
；
Portier et al., 2024
；
Tang et al., 2019
；
Yang et al., 2012
）。鉴于mTOR在多种年龄相关代谢紊乱和疾病中的重要作用（
Saxton and Sabatini, 2017
），明确衰老过程中mTOR活性发生变化的部位及其方式，可能有助于制定调节衰老本身的策略，并发现针对年龄相关疾病的治疗机会。
尽管雷帕霉素具有显著的延寿效应，但其作用并不适用于所有生物学环境。其影响会随剂量、给药时机、性别、组织类型及细胞状态而变化（
Bjedov et al., 2010
；
Dou et al., 2017
；
Fan et al., 2015
；
Jiang et al., 2025
；
Mannick et al., 2018
；
Wilkinson et al., 2012
）。此外，在某些情况下，长期治疗还与代谢和生殖方面的权衡代价相关（
Lamming et al., 2012
；
Liu et al., 2017
；
Zhu et al., 2019
）。这些
这些依赖于具体情境的效应提出了一个尚未解决的核心问题：雷帕霉素对机体的益处及其所致的脆弱性如何分布于不同细胞类型？更具体而言，目前仍不清楚哪些细胞类型介导其抗衰老效应，哪些细胞类型表现出中性或潜在不良反应，这些反应是源于直接的mTOR抑制还是间接的全身性重塑，性别如何影响雷帕霉素的疗效，以及哪些分子特征决定了细胞对雷帕霉素的敏感性。回答这些问题，需要在细胞分辨率下，从全机体层面对雷帕霉素的作用进行系统性研究。
黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）为应对这一挑战提供了强有力的实验模型。包括mTOR信号通路在内的核心营养感知通路，在果蝇与哺乳动物之间高度保守，而且TOR相关信号通路中的一些关键组分最早是在果蝇中得到鉴定和表征的（Montagne et al., 1999；Oldham et al., 2000；Saucedo et al., 2003；Saxton and Sabatini, 2017）。随着单细胞RNA测序技术的发展，果蝇模型如今能够以前所未有的分辨率，描绘整个机体在衰老过程中各细胞类型的特异性变化。我们的全机体单核RNA测序（snRNA-seq）平台支持构建了果蝇细胞图谱（Fly Cell Atlas，FCA），收录了成年果蝇中超过250种细胞类型（Li et al., 2022）。在此基础上，我们构建了衰老果蝇细胞图谱（Aging Fly Cell Atlas，AFCA），揭示了全机体范围内各细胞类型特异性的衰老特征（Lu et al., 2023）。
在本研究中，我们将这一平台应用于雷帕霉素干预研究。我们对衰老过程中接受雷帕霉素处理的雄性和雌性果蝇进行了全机体snRNA-seq，构建了雷帕霉素果蝇细胞图谱（Rapamycin Fly Cell Atlas，Rapa-FCA）。我们总共分析了超过505,000个高质量细胞核，涵盖
四个年龄阶段，涵盖18个主要细胞类别和180余种细胞类型。我们的分析表明，生殖系统、消化系统和神经肌肉系统是对雷帕霉素处理反应最显著的系统之一，而大多数神经元和胶质细胞类型的变化相对较小。重要的是，雷帕霉素的作用具有显著的性别二态性，这种差异可能源于Fkbp12基线表达水平的不同；Fkbp12是雷帕霉素介导mTORC1抑制所需的细胞内辅助因子。尤为值得注意的是，我们发现，来自不同发育起源的衰老细胞核趋向于一种共同的转录组状态，该状态富集mTORC1信号通路相关基因及Fkbp12表达，我们将其定义为趋同衰老轨迹（Convergent Aging Trajectory，CAT）。通过整合这种趋同反应、细胞核比例变化以及细胞类型特异性衰老时钟的预测结果，我们量化了雷帕霉素在不同细胞类型中的抗衰老保护作用。分析表明，许多雄性细胞类型在生命早期呈现中性或负面反应，但在生命后期获得保护效应；相比之下，大多数雌性细胞类型在生命早期和后期均能更稳定地获益。
总体而言，这些发现首次提供了覆盖全生物体、具有单细胞分辨率的雷帕霉素作用图谱。雷帕霉素果蝇细胞图谱（Rapa-FCA）揭示了组织特异性的获益与易损性，凸显了性别依赖性反应，并建立了一个新框架，以优化基于雷帕霉素的延寿干预。所有数据均可通过https://hongjielilab.org/rapa-fca/访问、下载和分析。
结果
构建雷帕霉素果蝇细胞图谱（Rapa-FCA）
为建立覆盖全生物体的单细胞核图谱，以评估雷帕霉素介导的衰老干预，我们首先确定了一个雷帕霉素剂量，该剂量在我们的实验条件下能够可重复地延长寿命
实验室条件。此前的果蝇研究采用了不同浓度的雷帕霉素，并报告了其对寿命的影响具有剂量、性别和情境依赖性（Bjedov et al., 2010；Schinaman et al., 2019）。在我们的实验条件下，与较高剂量（200 μM）相比，较低剂量（20 μM）对雌雄果蝇均产生了更为稳健的寿命延长效果。因此，我们选择20 μM雷帕霉素用于所有后续的Rapa-FCA图谱分析。与既往报道一致（Bjedov et al., 2010；Schinaman et al., 2019），该处理延长了雌雄果蝇的寿命，且雌性果蝇的抗衰老获益（寿命延长约12%）比雄性果蝇（约7%）更为显著（图1a）。
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图1.
Rapa-FCA概览
a.
饲喂对照食物或添加雷帕霉素食物的雌雄果蝇的寿命分析。雷帕霉素处理始于第10天，并于第7、30、50和70天采集果蝇样本，用于构建图谱。雌性和雄性果蝇的生存曲线分别展示。雷帕霉素处理显著延长了雌性（68.9天 vs. 77.7天；p = 2.1 × 10⁻⁷；对照组n = 410，雷帕霉素组n = 409）和雄性（67.5天 vs. 71.9天；p = 0.0002；对照组n = 311，雷帕霉素组n = 326）果蝇的中位寿命。采用对数秩（Mantel-Cox）检验确定统计学显著性。
b.
全生物体单核RNA测序（snRNA-seq）分析的实验设计与流程。在不同年龄和处理条件下，分别采集雌雄果蝇的头部和躯体。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离Hoechst染色阳性的细胞核，并使用10x Genomics高通量3′基因表达平台进行捕获。
c.
Rapa-FCA各样本中获得的文库数量和高质量细胞核数量汇总。
d.
t分布随机邻域嵌入（tSNE）
Rapa-FCA细胞核的可视化，按18个主要细胞类别着色。
e.
按性别分别展示各主要细胞类别中获得的细胞核数量。饼图显示躯体和头部样本中获得的雌性与雄性细胞核的总体比例。
f.
按处理条件分别展示各主要细胞类别中获得的细胞核数量。饼图显示躯体和头部数据集中，来自对照样本和雷帕霉素处理样本的细胞核的总体比例。tSNE可视化展示了对照组和雷帕霉素处理组细胞核在整合图谱中的分布。
随后，我们构建了涵盖不同性别、年龄、组织区室和处理条件的全生物体单核RNA测序（snRNA-seq）图谱。收集年轻果蝇（第7天）作为处理前对照，并在之后的三个年龄时间点（第30天、第50天和第70天）分别收集对照组和雷帕霉素处理组果蝇。针对每种性别和实验条件，分别处理头部和躯体。通过荧光激活细胞分选（FACS）辅助分离Hoechst阳性细胞核后，我们使用10x Genomics高通量平台构建了基于液滴的snRNA-seq文库（图1b）。经质量控制后，Rapa-FCA共包含28个文库和505,731个高质量细胞核（图1c和扩展数据图1）。我们通过迁移既往图谱数据集中的标签（Li et al., 2022；Lu et al., 2023；Park et al., 2025）对细胞身份进行注释，随后使用已确立的细胞类型特异性标志物进行人工验证。该分析在成年果蝇中鉴定出18个主要细胞类别和181种细分细胞类型（图1d和扩展数据图2–3）。主要细胞类别在两种性别中均有广泛分布，而性别特异性生殖细胞类型则表现出预期的差异（图1e）。在对照组和
在雷帕霉素处理的样本中，回收的细胞核组成总体上具有可比性，从而能够系统比较不同年龄、性别和处理条件下的转录组响应（图1f）。
全身对雷帕霉素的异质性响应
为明确雷帕霉素如何重塑成年果蝇全身的基因表达，我们针对每种已注释的细胞类型，将雷帕霉素处理的果蝇与年龄和性别匹配的对照果蝇进行比较，并根据差异表达基因（DEG）的数量对细胞类型进行排序（图2a）。雷帕霉素诱导的转录变化在全身表现出高度异质性。DEG数量最多的细胞类型主要富集于外周组织，而大多数神经元和胶质细胞群的响应相对较弱。这一模式表明，在当前浓度下，雷帕霉素对外周组织的作用更强（见讨论）。在响应最显著的细胞类型中，生殖组织尤为突出，在受影响最大的前15种细胞类型中占据7种（图2a），且包括雌性和雄性特异性细胞群（图2b）。若干代谢活跃或具有收缩功能的体细胞类型，包括脂肪体、前部肠上皮细胞、绛色细胞、腹神经索（VNC）和间接飞行肌（IFM），在两种性别中也均表现出较高的DEG数量。
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图2.
雷帕霉素诱导的细胞类型和性别特异性转录组响应
a.
根据雷帕霉素处理样本与年龄和性别匹配的对照样本之间的DEG数量，对雷帕霉素响应性细胞类型进行排序。细胞类型按不同年龄和性别的平均DEG数量排序，神经元和胶质细胞群单独标示。
b.
高响应性细胞类型汇总，分类为雌性特异性、
雄性特异性，或雌雄共有。
c.
对照样本中 Fkbp12 的基础表达水平与各细胞类型中雷帕霉素诱导的转录组响应幅度之间的关系。采用皮尔逊相关系数评估差异表达基因（DEGs）总数与 Fkbp12 表达水平之间的相关性。
d.
雷帕霉素通过 Fkbp12 介导 mTORC1 抑制及部分下游转录程序的示意图。
e.
选定细胞类型中雷帕霉素诱导的差异表达基因的 KEGG 通路富集分析。
由于 Fkbp12 是雷帕霉素介导 mTORC1 抑制所必需的结合伴侣（Heitman et al., 1991；Sabatini et al., 1994），我们推测，Fkbp12 表达水平的差异可能导致不同细胞类型对雷帕霉素的响应存在差异。为检验这一可能性，我们比较了各细胞类型中对照样本的 Fkbp12 基础表达水平与雷帕霉素诱导的差异表达基因数量（图 2c）。Fkbp12 表达水平与差异表达基因数量呈正相关，且这一关联强于随机选取基因的预期关联，也强于大多数其他 FKBP 家族成员所表现出的关联（扩展数据图 4）。这些结果表明，Fkbp12 表达水平与各细胞类型中雷帕霉素相关转录组重塑的幅度有关。兼具高 Fkbp12 表达水平和高差异表达基因数量的细胞类型主要富集于生殖组织和脂肪相关组织。相比之下，尽管腹神经索（VNC）细胞和肌肉细胞的平均 Fkbp12 表达水平相对较低，但其差异表达基因数量仍然较高，提示这些组织对雷帕霉素的响应可能源于不依赖 Fkbp12 的功能或复杂的调控机制。
随后，我们考察了对雷帕霉素产生响应的细胞类型是否表现出 mTORC1 相关转录程序发生改变的证据。mTORC1
通过 sima/HIF1A 和 SREBP/SREBF1/2 等转录调控因子，调控包括糖酵解和脂质生物合成在内的多种下游代谢程序（图 2d）（Dekanty et al., 2005；Liu and Sabatini, 2020；Porstmann et al., 2008）。因此，我们利用细胞类型和性别特异性的差异表达基因（DEGs）进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。多种响应性细胞类型中均富集了 mTORC1 相关通路，其中糖酵解/糖异生在雌性和雄性中均表现出最强的富集（图 2e）。这些通路富集的细胞类型与 Fkbp12 高表达且差异表达基因数量较多的细胞类型部分重叠，支持了以下观点：对雷帕霉素敏感的细胞类型并非随机分布于整个机体，而是与特定的分子和代谢特征相关。综上，这些分析确定了生殖、代谢和神经肌肉细胞类型是雷帕霉素相关转录重塑的主要发生部位，并为后续分析 mTORC1 相关衰老特征提供了框架。
雷帕霉素减轻生殖细胞中与衰老相关的变化
为确定雷帕霉素是否能够缓解细胞类型特异性的衰老，我们首先聚焦于雌性生殖系；初步分析显示，该生殖系具有较高的 Fkbp12 表达水平，并富集了 mTORC1 相关转录程序（图 2c–e）。果蝇卵巢包含多种生殖系和体细胞类型，共同支持卵子发生在连续分化阶段中的推进（图 3a）。因此，我们筛选出生殖系细胞核，并重建了其衰老轨迹。在对照组果蝇中，生殖系细胞核形成了一条与年龄相关的谱系，该谱系与年轻细胞核总体上明显区分，且在第 50 天富集（
图3b和扩展数据图5a）。值得注意的是，雷帕霉素处理显著减少了这一衰老谱系，表明抑制mTOR可抑制这种衰老生殖系状态的积累。我们根据对照样本中的年龄分布和Leiden聚类结果定义了衰老谱系，随后量化了其在不同年龄和处理条件下的丰度。采用这一方法，我们观察到，在第50天，雷帕霉素处理果蝇的衰老生殖系谱系较同龄对照减少约35%（图3c）。
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图3.
雷帕霉素减弱生殖细胞中与mTORC1相关的程序
a.
雌性生殖系统及主要卵巢相关细胞群示意图，包括卵子发生各阶段的生殖系细胞群和滤泡细胞群。
b.
不同年龄和处理条件下雌性生殖系细胞核的轨迹图。
c.
年轻和衰老生殖系谱系的定义与定量。
d.
不同年龄和处理条件下雌性生殖系细胞核中糖酵解和脂质合成基因的表达。
e.
雌性生殖系细胞核中糖酵解基因表达及糖酵解模块评分的轨迹图。
f.
雄性生殖系统示意图，突出显示附腺和射精球。
g.
按糖酵解模块评分和年龄着色的雄性附腺主细胞tSNE可视化图，显示高糖酵解活性衰老细胞群的出现。
h.
不同年龄和处理条件下雄性附腺主细胞中衰老谱系的定义与定量。
i.
以不同年龄和处理条件下每日F1代子代数量衡量的雌性生殖产出。柱形表示均值±均值标准误（SEM）；**：非配对t检验，p = 0.0019。
j.
以每日F1代子代数量衡量的雄性生殖产出
在不同年龄和处理条件下。
由于雷帕霉素减少了这一衰老生殖系谱系，我们接下来考察其是否与mTORC1相关转录程序有关。在对照组生殖系细胞核中，糖酵解和脂质合成基因的表达随年龄增长而逐渐升高，与衰老相关的mTORC1相关程序激活相一致（图3d）（Chen et al., 2009；Choy et al., 2025）。雷帕霉素处理显著降低了第50天时这些基因的表达，支持雷帕霉素给药可减弱这些通路活性的观点。与这一解释一致，相较于非衰老群体，糖酵解和脂质合成基因在衰老生殖系谱系中富集（图3e和扩展数据图5b）。因此，雌性生殖系的衰老伴随着一个代谢活跃的衰老谱系的出现，该谱系以mTORC1相关转录特征为标志，且雷帕霉素处理可减少这一谱系。
接下来，我们探究雄性生殖细胞中是否也存在类似的衰老相关轨迹。我们重点研究了雄性附腺主细胞，这类细胞同样表现出较高的Fkbp12表达水平，并在雷帕霉素处理后产生较多的差异表达基因（DEG）（图2c和3f）。与雌性生殖系类似，雄性附腺主细胞中也存在一个衰老群体，其在转录层面上与年轻细胞核分离，并表现出升高的糖酵解基因表达水平（图3g）。在对照组中，这一衰老群体的丰度随年龄增长而增加，而雷帕霉素处理降低了第50天时该群体的丰度（图3h）。这些发现表明，雌雄两性的生殖相关细胞类型均可形成衰老相关转录状态，其中富集了mTORC1相关代谢程序，尽管雷帕霉素介导的缓解作用的幅度和时机
在两性之间存在差异。
鉴于雷帕霉素可减少生殖细胞中的衰老谱系，我们接下来检验了雷帕霉素处理是否能够在衰老过程中维持生殖产出。与同龄对照相比，经雷帕霉素处理的雌性产生了显著更多的F1代后代，表明衰老雌性的生殖能力得到改善（图3i）。相比之下，雷帕霉素并未显著改善雄性的生殖产出（图3j）。值得注意的是，在第30天，经雷帕霉素处理的果蝇雄性附腺主细胞中的衰老谱系比例略高于对照组，而在各年龄阶段，雷帕霉素处理后雌性生殖系中的衰老谱系比例均较低（图3c和3h）。综上，这些结果表明，雷帕霉素可减弱生殖细胞中与衰老相关且与mTORC1相关联的转录状态，并对雌性生殖系表现出更为一致的保护作用，同时伴随着雌性生殖产出的维持。
雷帕霉素对VNC和肌肉细胞的性别特异性影响
接下来，我们考察了雷帕霉素诱导的差异表达基因（DEG）数量较多、但Fkbp12表达相对较低的细胞类型，包括腹神经索（VNC）细胞和肌肉细胞（图2c）。我们推测，这些细胞类型中强烈的转录组响应可能源于少量Fkbp12高表达亚群，也可能源于雷帕霉素的间接全身性效应。为区分这两种可能性，我们首先筛选出VNC细胞核，并考察了不同年龄和处理条件下的Fkbp12表达。尽管整个VNC群体中Fkbp12的平均表达水平较低，但Fkbp12在衰老过程中出现的一个独特VNC亚群中呈富集表达（图4a和扩展数据图6a）。该衰老VNC细胞群还表现出糖酵解和脂质合成相关基因表达升高，
提示，在部分腹神经索（VNC）细胞核中，Fkbp12 的富集与 mTORC1 相关的代谢转录程序相伴出现（图 4b 和扩展数据图 6b）。
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图 4. 雷帕霉素减弱雌性偏向的 VNC 及神经肌肉衰老程序
a. VNC 细胞核中 Fkbp12 表达的 tSNE 可视化。
b. VNC 细胞核中糖酵解模块评分的 tSNE 可视化。
c. 基于高糖酵解细胞群定义衰老 VNC 谱系。
d. 不同年龄和处理条件下雌性与雄性 VNC 细胞核中衰老谱系比例的定量分析。
e. 点图展示不同性别、年龄和处理条件下 VNC 细胞核中糖酵解基因、脂质合成基因及 Fkbp12 的表达。
f. 对雌性和雄性的 VNC、间接飞行肌及肌肉细胞中雷帕霉素诱导的差异表达基因（DEGs）进行 GO 分析。
g. 不同年龄的对照组和雷帕霉素处理组雌性成虫腹部神经肌肉接头的代表性共聚焦图像。
h. 不同年龄和处理条件下雌性与雄性每条肌纤维上突触小结数量的定量分析。每个样本对 28～40 条肌纤维上的共计 357～596 个突触小结进行定量。柱状图表示均值 ± 均值标准误（SEM）；**：非配对 t 检验，p ≤ 0.01。
i. 使用 FlyPhoneDB2 分析 VNC、间接飞行肌和肌肉细胞之间的细胞间通讯。图中展示了第 30 天和第 50 天雌性果蝇雷帕霉素处理组与对照组之间存在差异的配体–受体相互作用。
j. 第 30 天和第 50 天雌性果蝇中，VNC、肌肉和间接飞行肌（IFM）区室之间受雷帕霉素调控的前 10 个配体–受体对。
k. 不同年龄和处理条件下肌肉细胞核比例的变化。
l. 不同年龄和处理条件下雌性与雄性的攀爬能力。柱状图表示均值 ± 均值标准误（SEM）；
*p ≤ 0.05，p值来自参数性非配对t检验。
因此，我们将这一糖酵解水平较高的VNC细胞群定义为衰老相关谱系，并定量分析了其在不同性别、年龄和处理条件下的丰度（图4c）。在雌性中，衰老相关VNC谱系的丰度随年龄增长而增加，雷帕霉素处理则降低了其丰度。相比之下，雄性中的相应细胞群未表现出类似的年龄相关性增加，且其丰度未因雷帕霉素处理而降低（图4d）。与此一致，在雌性VNC细胞核中，Fkbp12及mTORC1相关代谢基因的表达随年龄增长而升高，并在雷帕霉素处理后降低，而这些变化在雄性中较弱或未出现（图4e和扩展数据图6c）。这些结果表明，雷帕霉素优先减弱雌性VNC中一种与衰老相关且富集Fkbp12的代谢状态。
尽管Fkbp12的平均表达水平较低，肌肉细胞中雷帕霉素诱导的差异表达基因（DEG）数量也较多。然而，与VNC不同，肌肉细胞核中糖酵解和脂质合成相关基因的表达随年龄或处理发生的变化有限（扩展数据图6d）。这提示，肌肉中与雷帕霉素相关的转录组重塑，可能并非主要反映对肌肉内在mTORC1相关代谢程序的直接抑制。为确定其他潜在机制，我们对肌肉和VNC中雷帕霉素诱导的差异表达基因进行了基因本体（GO）分析。在雌性而非雄性中，VNC、IFM和肌肉细胞内的雷帕霉素响应基因均富集于突触及神经肌肉接头（NMJ）相关条目（图4f）。这些结果提示，雷帕霉素可能通过维持神经肌肉连接来影响雌性的肌肉衰老。
与这一可能性一致，成体腹部NMJ染色显示，经雷帕霉素处理的
雌性的突触小结数量仍高于同龄对照，而雄性则未表现出显著差异（图4g–h）。随后，我们使用细胞间通讯分析工具FlyPhoneDB2，探究VNC、IFM及肌肉细胞之间潜在的配体–受体相互作用（Qadiri et al., 2025）。该分析发现，雷帕霉素处理后，30日龄雌性中存在150项差异性细胞通讯，50日龄雌性中存在42项差异性细胞通讯（图4i和补充表1）。在这些相互作用中，我们筛选出了神经肌肉细胞类型间排名前10的配体–受体对（图4j）。值得注意的是，已得到充分表征的神经肌肉接头（NMJ）配体–受体对Neurexin-1（Nrx-1）–Neuroligin-1（Nlg1）（Banovic et al., 2010）在经雷帕霉素处理的30日龄雌性中表现出更高的相互作用评分和表达水平，而雄性中未观察到这一现象（扩展数据图6e）。这些发现支持雷帕霉素对NMJ维持相关分子程序的作用具有雌性偏向性。
最后，我们探究了雷帕霉素对神经肌肉特征的保护是否伴随着更广泛的肌肉衰老抑制。与我们先前的AFCA分析一致，雌雄对照果蝇的肌细胞核数量均随年龄增长而下降；然而，这种细胞丢失的动态过程呈现出显著的性别二态性。雌性的肌细胞核数量在30日龄后显著减少（图4k）。雷帕霉素成功阻止了这一下降，而这种细胞层面的保护进一步体现为老龄雌性攀爬能力的显著改善（图4l）。相比之下，雄性果蝇的肌细胞核数量和攀爬能力直至30日龄仍保持稳定，随后才在更晚的日龄出现急剧下降。因此，雄性衰老的这一特征掩盖了生命早期的
雷帕霉素在雄性中的功能性益处（图4k和4l）。综上，这些结果揭示了药物介导的衰老保护具有根本性的性别特异性机制：雷帕霉素通过协同抑制腹神经索（VNC）中富集Fkbp12且与mTORC1相关的代谢状态，并有效维持调控神经肌肉接头（NMJ）完整性和运动功能的程序，改善雌性的神经肌肉衰老。
雷帕霉素缓解趋同衰老轨迹（CAT）
生殖细胞和VNC中存在对雷帕霉素敏感的衰老细胞群，这提示这些细胞群可能共享一种与衰老相关的转录程序。为检验这一假设，我们在此前定义的三个衰老谱系（雌性生殖系细胞、雄性附腺主细胞和VNC细胞核）中，分别鉴定了衰老与非衰老群体之间的差异表达基因（图5a）。对这些谱系特异性表达特征取交集后，鉴定出469个在三个衰老群体中均发生一致变化的基因，其中包括291个共同上调基因和178个共同下调基因（图5b和扩展数据图7a）。基因本体（GO）分析显示，共同上调基因富集于糖酵解、细胞质翻译、线粒体电子传递、蛋白质稳态和超氧自由基清除等过程，而共同下调基因则富集于蛋白质磷酸化、mRNA剪接及细胞形态相关过程（图5b）。这些共有特征表明，来自不同组织的衰老细胞核趋同于一种共同的转录状态，其涉及的变化并不仅限于糖酵解。
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图5.
衰老过程中对雷帕霉素敏感的高CAT细胞核的积累
a.
突出显示不同……中的衰老谱系
三种代表性细胞类型：雌性生殖系细胞、雄性附腺主细胞和腹神经索（VNC）细胞。
b.
共有CAT基因特征的鉴定。维恩图汇总了三种代表性细胞类型中衰老细胞谱系内一致上调或下调的基因。GO富集分析展示了共同上调和共同下调基因所富集的生物学过程。
c.
全身数据集中CAT评分的tSNE可视化，其中突出显示了若干细胞类型。
d.
全身图谱中CAT高评分细胞核的tSNE可视化。
e.
不同年龄和处理条件下，雌性生殖系细胞和雄性附腺主细胞中CAT高评分细胞核的比例。
f.
不同性别、年龄和处理条件下，全身CAT高评分细胞核的比例。
g.
不同细胞类型和性别中，CAT高评分细胞核与非CAT细胞核中糖酵解相关基因及
Fkbp12
的表达。
h.
热图汇总了不同细胞类型、年龄和性别的对照样本中CAT高评分细胞核的比例，以及雷帕霉素处理相关的CAT高评分细胞核比例变化。
接下来，我们探究这一共有转录程序能否在整个机体中识别出类似的衰老相关细胞核。基于469个共有差异表达基因（DEGs），我们将一种反复出现的衰老相关转录状态定义为趋同衰老轨迹（Convergent Aging Trajectory，CAT）。对于每个细胞，我们根据共同上调和共同下调基因集的综合富集程度计算CAT评分（方法和
扩展数据图7b–c
）。高CAT评分不仅出现在用于定义该特征的衰老细胞谱系中，还见于其他细胞类型，包括射精球、上皮细胞和间接飞行肌（IFMs）（
图5c
）。随后，我们根据CAT评分的分布定义了CAT高评分细胞核，并量化了它们在不同年龄、性别和处理条件下的丰度（
图5d
及扩展
数据图7d）。在雌性生殖系细胞和雄性附腺主细胞中，CAT高水平细胞核随年龄增长而增多，并在雷帕霉素处理后减少，与人工定义的衰老细胞谱系模式高度吻合（图5e、3c和3h）。在整个生物体水平上，CAT高水平细胞核也随年龄增长而积累，并在给予雷帕霉素后减少；与雄性相比，雌性的CAT高水平细胞核比例更高，且雷帕霉素相关的降幅更大（图5f）。
为确定CAT高水平细胞核是否与mTORC1相关代谢程序有关，我们比较了不同细胞类型中CAT高水平细胞核与非CAT细胞核的糖酵解基因表达。在多种细胞类型中，CAT高水平细胞核的糖酵解基因表达均高于非CAT细胞核，同时其Fkbp12表达也升高（图5g及扩展数据图7e–f）。这些特征与此前观察到的雷帕霉素响应性衰老细胞群富集mTORC1相关转录程序的结果一致，并提示CAT高水平细胞核代表一种对雷帕霉素敏感性较高的衰老相关状态。CAT高水平细胞核的占比在不同细胞类型间存在显著差异，其中生殖、消化及肌肉相关细胞类型的CAT高水平细胞核比例通常较高（图5h）。然而，雷帕霉素介导的CAT丰度变化也因组织而异：生殖和肠道细胞类型中的CAT高水平细胞核显著减少，而骨骼肌中的变化则较为温和。综上，这些结果将CAT界定为一种在多种细胞类型中出现、对雷帕霉素敏感的共有衰老相关转录状态，并为在单细胞核水平上量化mTORC1相关衰老及雷帕霉素介导的衰老保护作用提供了框架
分辨率。
汇聚性衰老轨迹可在独立的衰老图谱中重复验证
为评估 CAT 高水平细胞核是否代表一种可重复检出的衰老相关状态，而非 Rapa-FCA 数据集特有的特征，我们将 CAT 特征应用于此前构建的阿尔茨海默病果蝇细胞图谱（AD-FCA）数据集中的对照样本（Park et al., 2025）。尽管 AD-FCA 与 Rapa-FCA 在遗传背景、培养温度和寿命动态方面存在差异，但在对照果蝇的多种细胞类型中仍检测到了 CAT 高水平细胞核，且其比例随年龄增长而升高（扩展数据图 8）。这一模式在雄性生殖相关细胞类型中尤为明显，包括副腺和射精球细胞，与 Rapa-FCA 中观察到的 CAT 随龄积累现象一致（图 5h 和扩展数据图 8）。AD-FCA 中同样观察到了性别差异：与雄性相比，雌性的 CAT 高水平细胞核比例更高，且随龄升高出现得更早。综上，这些结果表明，在独立的全生物体衰老数据集中均可重复检测到 CAT 高水平细胞核，支持 CAT 代表一种普遍的衰老相关转录状态，而非仅限于雷帕霉素处理实验的特征。
性别及细胞类型特异性抗衰老效应的多模态定量分析
尽管 CAT 高水平细胞核比例可作为对雷帕霉素敏感、与 mTORC1 相关的衰老状态的定量指标，但雷帕霉素也可能通过 CAT 丰度未能充分反映的机制缓解细胞衰老。因此，我们将上述基于 CAT 的测量方法与另外两项细胞类型层面的衰老指标相整合：转录组衰老时钟预测值和回收细胞核比例（Buckley et al., 2023；Lu et al., 2023）。对于每个
在测量过程中，首先根据各年龄对照样本确定衰老相关变化（衰老效应），随后通过比较雷帕霉素处理样本与同龄对照样本，估计雷帕霉素对这些变化的缓解作用（抗衰老效应）（图6a）。该框架使我们能够比较雷帕霉素是否使各细胞类型偏离或趋近其正常的衰老相关轨迹。
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图6.
全机体范围内雷帕霉素介导的抗衰老作用的系统性测量
a.
衰老效应和抗衰老效应计算方法的示意图。
b.
基于对照样本的伪批量表达谱训练的细胞类型特异性转录组衰老时钟模型的预测性能。
c.
对照样本和雷帕霉素处理样本中腹神经索（VNC）细胞及肌肉细胞的预测转录组年龄。采用Wilcoxon秩和检验评估雷帕霉素处理样本与对照样本之间预测年龄的差异。
d.
不同性别、年龄和处理条件下选定细胞类型的预测转录组年龄中位数，突出显示对雷帕霉素反应的细胞类型依赖性和性别依赖性。
e.
不同细胞类型、年龄和性别的ΔclockAge热图。
f.
不同细胞类型、年龄和性别的ΔnucleusRatio热图。
g.
代表性细胞类型中三种经尺度缩放的抗衰老测量指标（ΔCAT ratio、ΔclockAge和ΔnucleusRatio）的比较。
h.
不同细胞类型、年龄和性别的综合Δage评分热图。蓝色表示较强的雷帕霉素相关抗衰老作用，红色则表示有限或潜在不利的年龄相关变化。
i.
小提琴图展示雌性和雄性细胞类型图谱中综合Δage评分的总体分布。采用Wilcoxon秩和检验；P < 0.01（*），P < 0.001（**）。
j.
性别特异性 CAT 积累及雷帕霉素介导的 CAT 抑制的工作模型。雌性果蝇中，对雷帕霉素敏感的 CAT 高水平细胞核的积累范围更广，且雷帕霉素处理后 CAT 的缓解程度更强；相比之下，雄性果蝇的响应更依赖于时间和细胞类型。
为预测生物学年龄，我们使用对照样本的伪批量表达谱训练了细胞类型特异性的衰老时钟模型（Buckley et al., 2023）。这些模型在雌性和雄性的各类细胞中均表现出较强的预测性能（图 6b）。随后，我们将训练好的模型应用于雷帕霉素处理样本，并将 ΔclockAge 计算为雷帕霉素处理样本与年龄匹配的对照样本之间的预测年龄差值，其中负值表示雷帕霉素处理后的预测年龄更年轻。该分析揭示了雷帕霉素相关年龄变化存在显著的性别差异。在雌性的腹神经索（VNC）和肌肉细胞中，雷帕霉素在所考察的两个处理年龄均降低了预测年龄，而雄性中相应细胞类型的效应较弱，甚至表现为预测年龄增加（图 6c）。通过比较预测年龄中位数和 ΔclockAge 值，我们在其他细胞类型中也观察到了这种偏向雌性的预测年龄降低现象（图 6d–e 和扩展数据图 9a）。值得注意的是，雷帕霉素处理后，许多雄性细胞类型在第 30 天的预测年龄增加，而大多数细胞类型在第 50 天的预测年龄降低，提示雄性中雷帕霉素相关的抗衰老保护作用可能比雌性更具年龄依赖性。
接下来，我们使用回收细胞核比例作为细胞类型层面衰老特征的一项正交指标。对于每种细胞类型，我们将 ΔnucleusRatio 计算为雷帕霉素处理样本与
年龄匹配的对照样本，并结合对照果蝇中观察到的年龄相关变化方向来解读这一变化（图6f，见方法）。在各细胞类型中，ΔnucleusRatio表明，雷帕霉素相关效应在30日龄时强于50日龄时，尤其是在雌性中（扩展数据图9B）。在30日龄雌性中，肠上皮吸收细胞、肌肉细胞和生殖系细胞群的效应最强。其中，生殖系细胞和肌肉细胞在两个日龄均表现出一致的雷帕霉素相关衰老缓解效应，支持其对雷帕霉素具有持续响应性。
最后，我们整合了这三项抗衰老指标，以比较雷帕霉素在不同细胞类型、性别和日龄中的效应。各项指标均被缩放至统一范围，从而能够在同一框架内比较CAT降低、转录组年龄变化和细胞核比例变化（图6f–i及扩展数据图9c）。该分析揭示了雷帕霉素相关衰老缓解的不同模式。雌性生殖系细胞在全部三项指标上均表现出较强的抗衰老效应，表明其对雷帕霉素具有广泛敏感性。雌性肌肉细胞的CAT降低幅度有限，但基于转录组年龄和细胞核比例指标可见明显的衰老缓解，这与上述神经肌肉效应一致。相比之下，雄性射精球细胞中CAT高水平细胞核减少，转录组年龄降低，但细胞核比例变化很小，提示不同的检测指标反映了雷帕霉素响应的不同方面。
总体而言，综合Δage评分识别出三种主要模式：雌雄两性中的多种细胞类型，如消化系统细胞类型和生殖系统细胞类型，均表现出一致的抗衰老响应；雌性表现出的雷帕霉素相关获益强于
雄性在多项测量指标中均表现出这一特征；早期雷帕霉素治疗对许多雄性细胞类型的年龄相关变化影响有限，甚至可能产生不利影响，而雌性细胞类型在不同年龄阶段均表现出更一致的保护效应。
总体而言，Rapa-FCA 提供了首个覆盖全生物体的雷帕霉素作用单核图谱。通过明确组织特异性获益、生物学易损性以及性别依赖性反应，本研究建立了一个用于优化延寿干预的综合框架。这些基础性见解和多模态分析策略广泛适用于基础研究、临床前研究以及更广泛的单细胞转录组学研究领域。
讨论
CAT 界定了一种对雷帕霉素敏感的趋同衰老状态
我们的 Rapa-FCA 揭示了细胞衰老中一个出乎意料的复杂层面。尽管不同细胞类型沿各自独特的轨迹衰老，但来自不同组织的一部分衰老细胞核会趋向一种共同的转录状态，我们将其称为趋同衰老轨迹（Convergent Aging Trajectory，CAT）。CAT 高水平细胞核富集了与 mTORC1 相关的转录程序，包括糖酵解和脂质代谢，并且在增殖、生殖或代谢需求较高的组织（如生殖系统和消化系统）中最为丰富。重要的是，经雷帕霉素处理的果蝇中，CAT 高水平细胞核的丰度降低，提示 CAT 代表一种对雷帕霉素敏感的衰老相关状态。这一效应在雌性中更为显著，与雌性果蝇对雷帕霉素表现出更强的转录组和机体水平反应相一致。
除经典的 mTORC1 相关通路外，不同细胞类型中的 CAT 高水平细胞核还表现出其他共同的转录特征（图 5b–c）。这些特征包括以下方面的变化：
线粒体电子传递、细胞质翻译、蛋白质稳态以及氧化应激应答程序。这些特征表明，CAT并非仅是一种糖酵解状态，而是一种涉及代谢重编程和应激适应的更广泛的衰老相关细胞状态。包括NAD+和α-酮戊二酸在内的多种寿命相关代谢物在衰老过程中水平下降或发生失调（Chin et al., 2014; Gomes et al., 2013; Massudi et al., 2012; Shahmirzadi et al., 2020），提示CAT高水平细胞核可能通过营养感知、线粒体活性和氧化还原稳态的协同变化，促成年龄相关的代谢漂移。未来，整合代谢组学、蛋白质组学和功能测定，对于确定CAT高水平细胞核是直接驱动这些代谢变化，还是反映细胞对年龄相关应激的适应，将具有重要意义。
Fkbp12是雷帕霉素介导mTORC1抑制所必需的主要结合伴侣，其富集为CAT高水平细胞核与雷帕霉素敏感性之间提供了机制性联系。在不同细胞类型中，Fkbp12表达与雷帕霉素诱导的转录应答幅度呈正相关，且CAT高水平细胞核同时表现出Fkbp12表达升高和mTORC1相关代谢程序增强。这种协同富集表明，CAT不仅是一种衰老相关转录状态，还是一种具备雷帕霉素应答潜能的细胞状态。在这一模型中，衰老促进多种组织中代谢活跃、Fkbp12高表达细胞核的出现，从而形成一种可被雷帕霉素抑制的共同分子易感性。
综上，这些发现支持这样一种模型：雷帕霉素并非对所有细胞类型均一地发挥作用，而是
优先抑制外周细胞类型中一种趋同的衰老相关细胞状态，其特征是Fkbp12表达升高以及mTORC1相关代谢活性增强。该模型为雷帕霉素如何在组织和衰老轨迹多样的情况下产生全身性抗衰老保护作用提供了一种可能的解释：雷帕霉素可能并非针对细胞身份本身，而是作用于易感细胞中反复出现的共同衰老状态。因此，CAT既为理解雷帕霉素介导的寿命延长提供了机制框架，也提供了一种实用的细胞状态读出指标，可用于识别整个机体中对雷帕霉素敏感的衰老细胞群体。
不同细胞类型中雷帕霉素疗效的决定因素
哪些因素会影响雷帕霉素对不同细胞类型的疗效？首先，组织可及性可能影响雷帕霉素反应的幅度。雷帕霉素是一种分子量较大（914.2 Da）的疏水性化合物，水溶性有限；哺乳动物研究表明，雷帕霉素及其类似物穿透血脑屏障的能力可能有限（Brandt et al., 2018; Gonzales et al., 2025; Song et al., 2025）。与这一可能性一致，Rapa-FCA显示，脑神经系统中的转录变化较小，而外周细胞类型则表现出更强的重塑。然而，本研究并未直接测量药物可及性。因此，未来需要开展组织特异性的药代动力学测量，以确定有限的雷帕霉素暴露是否导致特定组织（包括头部神经元群体）的转录反应性降低。
其次，雷帕霉素的疗效很可能取决于各细胞状态中Fkbp12-mTORC1靶标结合的程度。雷帕霉素通过
Fkbp12，且CAT高表达细胞核中Fkbp12及mTORC1相关代谢程序呈现协同富集。因此，CAT丰度较高的细胞类型，如生殖和消化系统细胞群，可能含有更大比例具备雷帕霉素响应相关分子特征的细胞。在此背景下，CAT可作为一种可测量的转录读出指标，用于识别最有可能对雷帕霉素产生响应的细胞类型和细胞状态。
第三，雷帕霉素的疗效还可能取决于CAT高表达细胞核与其他衰老相关特征之间的关系。CAT界定了一种内在的衰老相关状态，雷帕霉素可在多种细胞类型中直接减弱这一状态，但仅凭CAT降低尚不能完全解释某些保护作用。例如，雌性肌肉细胞中CAT的降低幅度有限，但转录组年龄、细胞核比例的维持、NMJ相关程序以及攀爬表现均表明其具有明确的抗衰老保护效应。这一模式提示，雷帕霉素可能在某一细胞区室（如VNC）中抑制CAT高表达状态，同时通过改变神经肌肉通讯或细胞间通讯，间接使与之相连的组织获益。对于源于组织间相互作用、而非纯粹由细胞自主性状态产生的衰老特征，这种CAT相关串扰可能尤为重要。
综上，组织可及性、Fkbp12-mTORC1相关的细胞响应性，以及CAT与其他衰老特征之间的相关串扰这三个层面，为理解雷帕霉素为何在某些细胞类型中产生显著的抗衰老保护效应，而在其他细胞类型中仅产生有限或彼此解耦的响应提供了一个框架。该框架有助于统一解释Rapa-FCA中的两项观察结果：雷帕霉素优先抑制多种生殖和消化
细胞类型，但也可在降低CAT之外改善衰老相关特征。
衰老与寿命延长中的系统性性别二态性
性别是决定衰老轨迹及对抗衰老干预反应的主要因素（Jiang et al., 2025）。雷帕霉素提供了一个明确的例子：尽管它能延长两性的寿命，但其对雌性的益处通常更为显著。既往研究提出了若干可能的作用机制，包括药物暴露、基础mTORC1活性、肠道稳态、自噬、生殖及全身代谢方面的性别差异（Bjedov et al., 2010；Fan et al., 2015；Harrison et al., 2009；Miller et al., 2014；Regan et al., 2016, 2022）。我们的Rapa-FCA进一步拓展了这些观察结果，表明性别二态性内嵌于细胞状态层面。雌性果蝇在多种组织中积累了更多CAT高水平细胞核，而这些细胞核富集了Fkbp12及mTORC1相关代谢程序。雷帕霉素处理后，雌性中CAT高水平细胞核的优先减少提示，雷帕霉素在雌性中更显著的疗效，至少部分可能源于一种对雷帕霉素敏感的衰老状态的更多积累。因此，雌性获益更为显著，可能不仅仅是由于整体药理学差异，还因为其具有更广泛的Fkbp12高表达、mTORC1相关的细胞基础，可供雷帕霉素发挥作用。
相比之下，雄性对雷帕霉素的反应似乎更依赖于时间和细胞类型。若干雄性细胞类型在较早年龄阶段表现出的转录组反应有限，甚至不利，而在生命后期则出现更强的抗衰老效应。这一模式提示，雄性衰老可能较少由早期CAT积累主导，可能涉及对mTORC1抑制不太敏感的机制，或
可能受到雄性特异性生殖与代谢程序的影响。更广泛地说，这些发现或有助于解释为何不同的延寿干预措施表现出不同的性别偏倚：当某项干预的分子靶点与某一性别中富集的衰老相关细胞状态相契合时，该干预可能发挥最佳效果。因此，Rapa-FCA 提供了一个框架，使研究得以超越将性别仅作为描述性变量的层面，转而识别影响干预效力的具有性别偏倚的细胞状态；这是推动精准衰老科学以及研究发病率或进展存在性别偏倚的年龄相关疾病的重要一步。
精准衰老干预：从分子通路到细胞状态
大多数抗衰老策略都是围绕调控衰老的基因、通路或衰老标志而开发的，例如营养感知、蛋白质稳态、线粒体功能、细胞衰老和干细胞维持（Guarente et al., 2024；Kroemer et al., 2025）。这一以通路为中心的框架已取得丰硕成果，但衰老最终表现为不同组织中异质性的细胞变化。因此，同一种干预可能产生有益、中性或不利的作用，具体取决于特定机体背景下存在的细胞类型或细胞状态。我们的 Rapa-FCA 支持一种互补性框架，即不仅依据衰老干预的分子靶点，还依据其所改变的细胞状态来评估干预。在这一背景下，CAT 代表一种可测量的衰老相关状态，出现在多种细胞类型中，表现为 Fkbp12 及 mTORC1 相关代谢程序的富集，并可通过雷帕霉素处理而减少。因此，CAT 可作为一种细胞状态读出指标，用于识别对雷帕霉素敏感的衰老细胞群体，并评估 mTORC1 抑制在何处具有
最有可能产生抗衰老效应。
这一细胞状态视角可能有助于完善精准衰老科学。全生物体单细胞分析不再假定靶向某一通路的干预会在整个生物体内产生一致作用，而是能够揭示哪些衰老相关状态受到治疗抑制、保持不变，或可能因治疗而加剧。对于雷帕霉素而言，CAT高水平细胞核的减少表明，靶向与mTORC1相关的细胞状态可在多种组织中产生协同效应，尤其是在雌性中。更广泛地说，类似分析可用于其他干预措施，以确定其作用对象是CAT样状态、不同的性别偏倚性衰老状态、衰老样细胞群、干细胞状态，还是组织特异性应激程序。此类比较可为联合治疗提供合理依据：干预措施的配对不仅应基于其靶向不同通路，还应基于其作用于互补的衰老相关细胞状态。由此，Rapa-FCA建立了一个框架，推动抗衰老干预从基于通路的策略转向以细胞状态为指导的设计。
Rapa-FCA：研究雷帕霉素相关调控的资源
雷帕霉素–mTORC1轴在寿命调控中的保守作用，凸显了在细胞分辨率下理解其对整个生物体影响的重要性。Rapa-FCA整合了超过500,000个细胞核和181种已注释细胞类型的年龄、性别、组织、细胞类型及治疗信息，为此提供了资源。该图谱支持系统鉴定雷帕霉素响应基因、具有性别偏倚的干预效应、年龄依赖性治疗反应，以及细胞类型特异性的衰老轨迹。除单个基因的表达变化外，
Rapa-FCA 为研究药理学干预如何重塑整个机体的细胞架构提供了一个平台，涵盖对雷帕霉素敏感的衰老细胞状态的直接抑制、通过细胞间通讯介导的间接重塑，以及干预响应的组织特异性局限。通过揭示雷帕霉素作用的范围及其边界，Rapa-FCA 为设计更具靶向性、兼顾性别差异并以细胞状态为依据的衰老保护策略奠定了基础。
经费资助
H.L. 是 CPRIT 癌症研究学者（RR200063），并获得美国国立卫生研究院（NIH；U01 AG086143、DP2AT013275）、Longevity Impetus Grant、Ted Nash Long Life Foundation、Welch Foundation 及 Hevolution/AFAR Foundation 的资助。C.-Y.L. 和 A.-L.H. 获得 NSTC 112-2926-I-A49A-503-G、113-2926-I-A49A-502-G 和 AS-ASSA-113-03 的资助。T.J. 获得 NIH/NIDDK F31DK141194-01A1 研究奖学金资助。NP 实验室的研究工作获得 NIH U01 AG086143 和霍华德·休斯医学研究所的资助。本项目获得贝勒医学院流式细胞分析与细胞分选核心平台的支持，该平台由 CPRIT 核心设施支持项目（CPRIT-RP240432）及 NIH（CA125123 和 ODO36336）提供经费资助，并得到 Joel M. Sederstrom 的专业协助。
作者贡献
概念构思：T.-C.L.、C.-Y.L. 和 H.L.；单核 RNA 测序（snRNA-seq）：C.-Y.L. 和 Y.Q.；计算分析：T.-C.L.、Z.Y.、B.S.、T.J. 和 M.Q.；研究实施：T.-C.L.、C.-Y.L.、Y.-J.P.、N.A.、E.H.、N.P.、A.-L.H. 和 H.L.；数据门户与 Rapa-FCA 网站：T.-C.L. 和 H.L.；初稿撰写：T.-C.L.、C.-Y.L. 和 H.L.；审阅与编辑：全体作者；研究指导：H.L.；经费获取：H.L.。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
数据、代码和材料可用性
原始 FASTQ
文件、表达矩阵以及包含细胞类型注释的处理后 h5ad 文件均可在 NCBI/GEO 获取（登录号 GEO：GSE322571）。代码已在 GitHub 上公开：
https://github.com/MeshifLu/RapaFCA
。所有已注释数据亦可通过以下网站进行可视化、下载和自定义分析：
https://hongjielilab.org/rapa-FCA/
。有关更多信息以及资源、材料和试剂的申请，请联系 Hongjie Li（
hongjie.li{at}bcm.edu
）。
材料与方法
果蝇样本与寿命分析
在首只果蝇羽化后的第 3 天，收集两个野生型果蝇品系（w1118 处女雌蝇与 OreR 雄蝇）杂交产生的 F1 代果蝇，并在 25°C、12 小时明暗交替条件下，使用标准玉米粉-糖蜜培养基（Li 培养基）继续饲养 3 天以进行交配。随后将雄蝇与雌蝇分开置于不同笼中（每笼 110 只），进行衰老实验。在寿命分析中，每 2–3 天更换一次培养基并记录死亡果蝇数量。第 7 天，将果蝇转移至对照培养基（二甲基亚砜，DMSO，0.1%）或含雷帕霉素的培养基。将雷帕霉素（LC Laboratories）溶解于 DMSO（二甲基亚砜）中，配制成 20 mM 储备液，并加入培养基至终浓度为 20 μM。将不同日龄果蝇的头部和躯体收集至 1.5 ml 无 RNase 离心管中，经液氮速冻后保存于 −80°C。
单核 RNA 测序（snRNA-seq）
按照此前描述的方案提取细胞核（
McLaughlin et al., 2022
）。使用 BD FACSAria III 分选仪收集 Hoechst 阳性细胞核，包括所有多倍体细胞核。每次 10x Genomics 实验分选 15万–20万个细胞核，并于 4°C、1000 × g 条件下离心 10 分钟。将细胞核重悬于 80 μl 含 0.5% BSA 和 RNase 的 1× PBS 中
抑制剂。使用血细胞计数板计数后，上样45,000–55,000个细胞核，以达到每个样本20,000个细胞核的目标量。按照10x Genomics的说明，使用Chromium Next GEM Single Cell 3’ HT Reagent Kits v3.1（Dual Index）构建文库。最终文库在Illumina NovaSeq X Plus平台上采用PE150模式进行测序（Novogene Cooperation Inc.），测序深度约为每个细胞核30,000–50,000条读段。为注释细胞身份，我们将Rapa-FCA与此前生成的FCA、AFCA和AD-FCA数据集进行整合，并将AD-FCA中的细胞类型标签转移至雷帕霉素数据集（Li et al., 2022；Lu et al., 2023；Park et al., 2025）。随后，使用已确立的细胞类型特异性标志物对这些注释进行人工验证。
snRNA-seq数据处理与质量控制
snRNA-seq数据采用我们此前在AFCA和AD-FCA研究中建立的计算流程进行处理（Lu et al., 2023；Park et al., 2025）。使用Cell Ranger v6.1.2，并结合为果蝇细胞图谱（Fly Cell Atlas）生成的pre-mRNA GTF文件，将原始FASTQ文件比对至黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）参考基因组（FlyBase 6.31版）（Li et al., 2022）。使用CellBender v0.2.2去除环境RNA污染（Fleming et al., 2023），并使用scDblFinder v1.8.0识别和去除潜在的双细胞（Germain et al., 2022）。
去除UMI数少于400或检测到的基因数少于200的细胞核。在少于3个细胞核中被检测到的基因不纳入下游分析。此外，若细胞核的基因数或UMI数高于中位数加10倍中位绝对偏差，或其线粒体转录本比例超过5%，也予以去除。下游分析使用Scanpy v1.8.2进行（Wolf et al., 2018）。
鉴定
雷帕霉素响应基因
为鉴定雷帕霉素响应基因，将雷帕霉素处理样本与年龄、性别、组织和细胞类型均匹配的对照样本进行比较。采用 Scanpy 中实现的 Wilcoxon 秩和检验进行差异表达分析。将错误发现率（FDR）低于 0.05 的基因定义为雷帕霉素响应差异表达基因。
通路富集与 GO 分析
通路富集分析采用 KEGG 及其果蝇特异性通路注释进行（Kanehisa and Goto, 2000）。使用 GSEApy（Fang et al., 2023）对每种细胞类型中的差异表达基因进行分析。为评估与 mTORC1 相关的转录程序，我们重点关注预期会因雷帕霉素介导的 mTORC1 抑制而受到抑制的通路，包括糖酵解/糖异生、脂肪酸生物合成以及不饱和脂肪酸生物合成。与雷帕霉素诱导的激活相关的通路，包括自噬和溶酶体通路，则单独进行分析。
糖酵解模块评分通过 Scanpy 中的 score_genes() 函数计算。糖酵解基因集来源于雌性生殖系糖酵解通路中富集的基因，包括 Eno、Gapdh1、CG32444、Pgm1、Pgi、Aldh、Pgk、Hex-A、Tpi、Ald1、AcCoAS、PyK、Pglym78 和 Gapdh2。
GO 富集分析采用 GOATOOLS v1.2.3 进行（Klopfenstein et al., 2018）。对特定年龄、性别、处理条件和细胞类型比较所得的差异表达基因列表进行检验，以鉴定富集的 GO 生物过程术语。基因关联文件取自 FlyBase FB2019_06。
生殖系 snRNA-seq 轨迹分析
选取雌性生殖系细胞和 16 细胞期生殖系囊细胞进行轨迹分析。由于生殖系亚型较为复杂，
Rapa-FCA 与 FCA、AFCA 和 AD-FCA 数据集进行了整合，以提高聚类和注释的分辨率。利用 FCA 卵巢数据集中的标记基因信息对生殖系亚型进行注释。采用 Scanpy 实现的基于分区的图抽象方法 PAGA（Wolf et al., 2018）对生殖系轨迹进行了分析。
雌性繁殖力
将处于所需年龄、饲养于含对照食物或添加雷帕霉素食物的寿命笼中的雌性果蝇，转移至装有标准实验室食物的试管中（每个样本 N>35）。雌性果蝇产卵 3 天后移除。12–15 天后，对每个试管中的子代数量进行计数。在产卵期间死亡的雌性果蝇被排除在分析之外。
雄性繁殖力
交配前，将雄性果蝇饲养于含对照食物或添加雷帕霉素食物的寿命笼中，直至达到所需年龄。随后，将单只雄性果蝇（每个样本 N > 45）分别与两只年轻的野生型处女雌蝇进行交配，交配在装有标准实验室食物的试管中进行。在 25°C 下交配 48 小时后，将雌性果蝇分离至独立试管中（每管一只雌蝇），并在 25°C 下培养 2 天以产卵。随后移除已交配的雌性果蝇，并在室温下培养 12–15 天后记录子代数量。雄性繁殖力以两只雌性果蝇产生的子代平均数量计算。在交配期间死亡的任何果蝇均从分析中删失。
神经肌肉细胞类型之间的细胞间通讯分析
为考察雷帕霉素相关的神经肌肉细胞类型之间潜在细胞间通讯变化，从身体数据集中筛选出腹神经索（VNC）、肌肉细胞和间接飞行肌细胞。差异配体-受体人片在线观看
使用 FlyPhoneDB2（Qadiri 等，2025）推断雷帕霉素处理组与对照组果蝇的细胞间相互作用。将 P < 0.05 或差异相互作用评分绝对值大于 1.5 的配体–受体对视为在雷帕霉素处理后受到差异调控。
攀爬实验
使用攀爬装置（Park 等，2025）测量果蝇的攀爬能力。实验前一天，将寿命实验笼中日龄为 7、10、20、30、40 或 50 天的果蝇分组转入小瓶中。进行攀爬实验时，将果蝇轻轻转移至攀爬装置的长瓶中（每瓶 20–25 只，每个样本共 80–100 只）。轻敲攀爬装置，使所有果蝇落至瓶底，随后录像 10 秒。每组进行 5 次攀爬，每次攀爬之间让果蝇休息 1 分钟。使用 ImageJ 测量每只果蝇在第 10 秒时的攀爬高度。使用 GraphPad Prism 绘制每个时间点 4–5 组样本的数据。
成虫神经肌肉接头（NMJ）染色与成像
使用 Vannas 弹簧剪（FST，15000-00）和镊子，在 1× PBS 中解剖制备果蝇腹部背侧铺片。将铺片置于 0.2 ml PCR 八联管中，在室温下用 4% PFA 固定 20 分钟，并用 1× PBS 洗涤。固定后，小心去除脂肪体组织，以暴露背侧肌肉。去除脂肪体后，将铺片置于用封闭缓冲液（含 5% 正常山羊血清和 0.3% Triton X-100 的 1× PBS）配制的小鼠抗 CSP 抗体（DSHB，货号 DCSP-1，1:20）中，于 4℃ 染色过夜。用 0.3% PBST 充分洗涤铺片，随后使用 Alexa Fluor® 488 AffiniPure® 驴抗小鼠 IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch，货号 715-545-151，1:250）和 Alexa Fluor® 594 AffiniPure™ 山羊抗辣根过氧化物酶（HRP）抗体（Jackson ImmunoResearch，货号 123-585-021，1:250）进行染色，所用溶液为
在室温下于封闭缓冲液中孵育2小时。使用DAPI（1:1000）在室温下对细胞核染色10分钟。将解剖展片封固于SlowFade™ Gold抗荧光淬灭封片剂（Invitrogen，#S36936）中，使用Leica STELLARIS 5共聚焦显微镜以0.8 μm的层间距采集Z轴序列图像。使用ImageJ将Z轴序列图像进行最大强度投影合并（Image-Stacks-Z projection-Max Intensity）。神经肌肉接头（NMJ）分析在第4腹节（A4）右侧半体节进行。利用抗CSP抗体标记的突触前囊泡信号对突触扣数量进行定量。使用抗HRP抗体显示轴突，并使用DAPI确认肌纤维。每个样本至少计数300个突触扣。将突触扣总数除以肌纤维数量，计算每条肌纤维的平均突触扣数量。
CAT评分的计算及CAT高评分细胞核的分类
使用包含不同年龄谱系的细胞类型，鉴定与非衰老谱系相比在衰老谱系中富集或减少的基因。采用Wilcoxon秩和检验进行差异表达分析。将假发现率（FDR）< 0.01的基因定义为衰老谱系特异性差异表达基因（DEGs）。分别对雌性生殖系细胞、雄性附腺主细胞和腹神经索（VNC）细胞核中鉴定出的衰老谱系上调及下调差异表达基因取交集，以确定共有的CAT相关基因。
对于每个细胞核，分别计算共同上调和共同下调的CAT基因的对数归一化表达值的平均值。CAT评分为共同上调基因的平均表达量与共同下调基因的平均表达量之差。分别在身体和头部数据集中，考察对照与雷帕霉素处理样本、不同性别及不同年龄的CAT评分分布。CAT评分高于……的细胞核
高于相应分布的均值加两个标准差的细胞核被归类为 CAT 高水平细胞核。
利用衰老时钟模型计算 ΔclockAge
采用伪批量 BootstrapCell 策略，使用对照样本训练细胞类型特异性的衰老时钟模型（Buckley et al., 2023）。对于每种细胞类型、性别和年龄组，将随机选取的 15 个细胞核或 5% 的细胞核的 UMI 读数相加，生成一个伪批量 BootstrapCell，随后使用 Scanpy 进行对数归一化。对每种细胞类型、性别和年龄组重复此过程 100 次。
使用 sklearn 软件包，利用对照样本生成的 BootstrapCell 训练 Lasso 回归模型。Lasso 惩罚参数固定为 alpha = 1.0，max_iter = 10000，tol = 1e-4。采用决定系数 R² 评估模型性能。训练完成后，将对照样本和雷帕霉素处理样本的 BootstrapCell 表达谱输入相应的细胞类型特异性衰老时钟模型，以获得预测年龄。ΔclockAge 计算为雷帕霉素处理样本的预测年龄中位数与年龄及性别匹配的对照样本的预测年龄中位数之差。ΔclockAge 为负值表明，雷帕霉素处理后的预测转录组年龄更年轻。采用 Wilcoxon 秩和检验评估对照样本与雷帕霉素处理样本之间预测年龄的差异。
通过 ΔnucleusRatio 衡量对细胞核比例的抗衰老作用
对于每个样本，将归属于某一细胞类型的细胞核数量除以从相应样本中获取的细胞核总数，计算细胞类型特异性的细胞核比例。按年龄、性别、处理和组织区室分别对样本进行分析。对于每种细胞类型，
首先，通过将老龄对照果蝇样本与相应的第7天处理前基线进行比较，确定对照果蝇中细胞核比例的年龄相关变化（衰老效应，图6a）。将雷帕霉素处理样本归一化至同一第7天基线，随后通过比较归一化后的雷帕霉素处理组数值与归一化后的同龄对照组数值，计算雷帕霉素相关变化（抗衰老效应，图6a）。
为确定这一变化代表抗衰老效应还是有害效应，依据对照果蝇中观察到的衰老变化方向，对雷帕霉素相关变化的方向进行判定。如果雷帕霉素使细胞核比例向与对照组年龄相关变化相反的方向改变，则认为该效应具有抗衰老作用。如果雷帕霉素使细胞核比例沿对照组年龄相关变化的相同方向进一步改变，则认为该效应会加剧衰老或可能有害。例如，由于对照果蝇的肌肉细胞核比例随年龄增长而下降，因此，在雌性果蝇中，雷帕霉素处理后相对于同龄对照组的这一比例升高被解释为具有保护作用（图4k）。
雷帕霉素抗衰老效应的多模态比较
为比较采用不同方法测得的雷帕霉素相关抗衰老效应，将ΔCAT比例、ΔclockAge和ΔnucleusRatio缩放至统一范围。对于每项测量指标，分别确定其最大绝对值，并使用该最大绝对值对数值进行归一化，得到介于−1至1之间的评分。这种缩放使得能够跨方法比较不同细胞类型、年龄和性别中的雷帕霉素相关变化。通过对这三项指标缩放后的数值取平均值，计算综合Δage评分
测量值，其中负值表示雷帕霉素相关的抗衰老保护作用较强，正值则表示与年龄相关的变化有限或可能具有不利影响。
致谢
我们感谢 Bellen 实验室和 Li 实验室的成员提供富有洞见的建议并参与讨论。我们还感谢 Jiaye Chen 在数据门户建设早期提供的帮助及相关讨论。感谢 Weiwei Dang 对稿件提出意见。感谢 Shelby Yu-Hsiu Lu 为 CAT 标志设计作出的贡献。
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Tzu-Chiao
Lu
，
Chung-Yi
Liang
，
Ye-Jin
Park
，
Niccole
Auld
，
Tyler
Jackson
，
Zhiyong
Yin
，
Erin
Harrison
，
Bo
Sun
，
Mujeeb
Qadiri
，
Norbert
Perrimon
，
Ao-Lin
Hsu
，
Yanyan
Qi
，
Hongjie
Li
bioRxiv
2026.07.02.736117；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736117
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关键词：雷帕霉素 · 细胞衰老 · 单核转录组 · 性别差异 · 趋同衰老轨迹 · mTORC1信号通路
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.736117v1?rss=1