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基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的RNA修饰分析是表观转录组学的核心技术，但不同实验室和仪器平台之间的定量比较尚缺乏完善的标准化。本研究在首届人类RNA组项目（Human RNome Project）研讨会期间开展了一项由研究共同体推动的基准评测，旨在系统评估核糖核苷质谱分析流程的跨平台重现性。我们采用相同的分析柱和梯度、标准化RNA样本及共享试剂，比较了使用不同数据采集策略的四极杆、飞行时间和Orbitrap液相色谱-质谱平台对核苷的定量结果。尽管各系统的色谱分离具有高度重现性，但不同平台对特定核苷的质谱响应特性差异显著，限制了相对信号强度的直接比较。这些响应差异随分析物种类和浓度范围而变化，表明仅统一色谱条件不足以实现可迁移的定量分析。采用稳定同位素标记内标（SILIS）进行归一化，显著降低了平台和方法依赖的响应差异，并提高了大多数受评估修饰的结果一致性。对于部分修饰，外部校准提高了qTOF与Orbitrap分析流程之间的一致性，但未能完全消除系统间残余差异。基于上述发现，我们提出了源自基准评测的建议，以协调RNA修饰的相对和绝对定量，并就校准设计、质量控制和数据报告提供指导。本研究为可重现的核苷LC-MS/MS分析流程提供了方法学框架，并为大规模表观转录组比较研究奠定了基础。
统一化核苷质谱分析实现可重复的跨平台 RNA 修饰定量 | bioRxiv
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Dedon，
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Vivian
Cheung，
Stefanie
Kaiser
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.17.739095
Jan Felix Dalwigk
1
德国法兰克福歌德大学药物化学研究所，Max-von-Laue-Str. 9，60438 法兰克福，德国；
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Kira Kerkhoff
1
德国法兰克福歌德大学药物化学研究所，Max-von-Laue-Str. 9，60438 法兰克福，德国；
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Oskar Knittelfelder
2
德国不来梅 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG，Fahrenheitstr. 4，28359 不来梅，德国；
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Robert Ross
3
赛默飞世尔科技，美国马萨诸塞州列克星敦市 Maguire 大道 10 号，邮编 01450；
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Maria Cristina Petrella
4
基因组调控中心（CRG），巴塞罗那科学技术研究所，Dr Aiguader 街 88 号，西班牙巴塞罗那，邮编 08003；
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Anna Kusnierczyk
5
伯尔尼大学，瑞士 RNA 质谱平台，化学、生物化学与药学系，Freiestrasse 3，瑞士伯尔尼，邮编 3012；
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Tulsi Bhandari
6
辛辛那提大学，美国俄亥俄州辛辛那提，邮编 45221；
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Aurore Attina
7
临床蛋白质组学平台，IRBM CHU St.-Eloi，法国蒙彼利埃；
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Alicia Burkard
8
约翰内斯·古腾堡大学，药学与生物医学科学研究所，Staudingerweg 5，德国美因茨，邮编 55128；
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Carolina Bras-Costa
9
华盛顿大学医学院生物化学与分子生物物理学系，美国密苏里州圣路易斯；
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Michael S. DeMott
10
麻省理工学院生物工程系，美国马萨诸塞州剑桥，邮编 02139；
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Kitty Johnson
11
德国马尔堡菲利普大学药学系药物生物学与生物技术研究所，35037 Marburg，德国；
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Xenia Kerkhoff-Bernaciak
12
德国多特蒙德工业大学数学系，Vogelpothsweg 87，44227 Dortmund，德国；
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Jennifer Kist
6
美国辛辛那提大学，Cincinnati，OH 45221，美国；
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Ken Koegel
13
德国慕尼黑大学化学系化学表观遗传学研究所，Butenadt Strasse 5-13，81377 Munich，德国；
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Martina Kraemer
8
德国约翰内斯·古腾堡大学药学与生物医学科学研究所，Staudingerweg 5，55128 Mainz，德国；
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Ricardo Moreno-Ballesteros
14
英国邓迪大学生命科学学院蛋白质磷酸化与泛素化研究组，Dow Street，DD1 5EH Dundee，英国；
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Ganna Podoprygorina
8
德国约翰内斯·古腾堡大学药学与生物医学科学研究所，Staudingerweg 5，55128 Mainz，德国；
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Kaley Simcox
15
美国密歇根大学分子、细胞与发育生物学系，Ann Arbor，MI 48109，美国
斯泰茨；
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Oezge Simsir
13
慕尼黑大学化学系化学表观遗传学研究所，Butenadt Strasse 5–13，81377 慕尼黑，德国；
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Anton Skriba
16
捷克科学院有机化学与生物化学研究所，Flemingovo namesti 542/2，布拉格6，捷克共和国；
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Sam Wein
17
图宾根大学计算机科学系，Maria-von-Linden-Strasse 6，72076 图宾根；
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Hana Cahova
16
捷克科学院有机化学与生物化学研究所，Flemingovo namesti 542/2，布拉格6，捷克共和国；
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Benjamin A. Garcia
9
华盛顿大学医学院生物化学与分子生物物理学系，美国密苏里州圣路易斯；
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Mark Helm
8
约翰内斯·古腾堡大学药学与生物医学科学研究所，Staudingerweg 5，55128 美因茨，德国；
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David Alexandre
18
临床蛋白质组学平台，IRBM CHU St.-Eloi，法国蒙彼利埃；
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Katharina Hoefer
11
马尔堡菲利普大学，系】【。
药学部，药学生物学与生物技术研究所，35037 马尔堡，德国；
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Sebastian Leidel
5
伯尔尼大学，瑞士 RNA 质谱平台，化学、生物化学与药学系，Freiestrasse 3，3012 伯尔尼，瑞士；
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Patrick A Limbach
6
辛辛那提大学，美国俄亥俄州辛辛那提，邮编 45221；
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Eva Novoa
19
基因组调控中心（CRG），巴塞罗那科学技术研究所，Dr Aiguader 88，巴塞罗那 08003，西班牙；
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Eduard Sabido
4
基因组调控中心（CRG），巴塞罗那科学技术研究所，Dr Aiguader 88，巴塞罗那 08003，西班牙；
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Sabine Schneider
20
慕尼黑路德维希-马克西米利安大学，化学系，化学表观遗传学研究所，Butenandtstrasse 5-13，德国慕尼黑 81377；
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Philippe Wolff
21
斯特拉斯堡大学，法国国家科学研究中心（CNRS），RNA 结构与反应性研究所，67084 斯特拉斯堡，法国；
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Peter Dedon
10
麻省理工学院，生物工程系，美国马萨诸塞州剑桥，邮编 02139；
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Vivian Cheung
22
布朗大学分子生物学、细胞生物学与生物化学系，美国罗得岛州普罗维登斯市 Ship Street 70 号，邮编 02903
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Stefanie Kaiser
1
歌德大学法兰克福分校药物化学研究所，德国法兰克福 Max-von-Laue-Str. 9，邮编 60438；
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通讯作者：
stefanie.kaiser{at}pharmchem.uni-frankfurt.de
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通过 LC-MS/MS 进行 RNA 修饰分析是表观转录组学的核心技术，然而，不同实验室和仪器平台之间的定量比较尚未得到充分标准化。在首届 Human RNome Project 研讨会期间，我们开展了一项由学界共同推动的基准研究，以系统评估核糖核苷质谱工作流程在不同平台之间的可重复性。我们采用相同的分析柱和梯度、标准化的 RNA 样品以及共享试剂，比较了采用不同数据采集策略的四极杆、飞行时间和 Orbitrap 平台液相色谱-质谱系统对核糖核苷的定量结果。
尽管不同系统之间的色谱分离具有高度可重复性，但核糖核苷特异性的质谱响应行为在不同平台之间存在显著差异，从而限制了相对信号强度的直接比较。这些响应差异随分析物种类和浓度范围而变化，表明仅实现色谱条件的协调一致并不足以使结果具有可转移性。
定量分析。稳定同位素标记内标（SILIS）归一化显著降低了平台和方法依赖性的响应差异，并提高了大多数所评估修饰之间的一致性。外部校准提高了部分修饰在 qTOF 和 Orbitrap 工作流程之间的一致性，但未能完全消除系统间残留差异。
基于这些发现，我们提出了源自基准评估的建议，用于协调相对和绝对 RNA 修饰定量，包括对校准设计、质量控制和数据报告的指导。总体而言，本研究为可重复的核苷 LC-MS/MS 工作流程提供了方法学框架，并为大规模比较性表观转录组学研究奠定了基础。
利益冲突声明
3O.K. 是 Bruker Daltonics GmbH & Co. KG 的员工；4 R.R. 是 Thermo Fisher Scientific 的员工；18S.W. 是 OpenMS Inc. 的首席执行官。OpenMS Inc. 是一家宾夕法尼亚州非营利组织，支持 OpenMS 项目的开发。
版权
本预印本的版权所有者为作者/资助方，其已授予 bioRxiv 永久展示该预印本的许可。
本文依据以下许可协议公开：
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发布于 2026 年 7 月 23 日。
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统一化核苷质谱分析实现可重复的跨平台 RNA 修饰定量
Jan Felix Dalwigk，Kira Kerkhoff，Oskar Knittelfelder，Robert Ross，Maria Cristina Petrella，Anna Kusnierczyk，Tulsi Bhandari，Aurore Attina，Alicia Burkard，Carolina Bras-Costa，Michael S. DeMott，Kitty Johnson，Xenia Kerkhoff-Bernaciak，Jennifer Kist，Ken Koegel，Martina Kraemer，Ricardo Moreno-Ballesteros，Ganna Podoprygorina，Kaley Simcox，Oezge Simsir，Anton Skriba，Sam Wein，Hana Cahova，Benjamin A. Garcia，Mark Helm，David Alexandre，Katharina Hoefer，Sebastian Leidel，Patrick A Limbach，Eva Novoa，Eduard Sabido，Sabine Schneider，Philippe Wolff，Peter Dedon，Vivian Cheung，Stefanie Kaiser
bioRxiv
2026.07.17.739095；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.17.739095
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Jan Felix Dalwigk，Kira Kerkhoff，Oskar Knittelfelder，Robert Ross，Maria Cristina Petrella，Anna Kusnierczyk，Tulsi Bhandari，Aurore Attina，Alicia Burkard，Carolina Bras-Costa，Michael S. DeMott，Kitty Johnson，Xenia Kerkhoff-Bernaciak，Jennifer Kist，Ken Koegel，Martina Kraemer，Ricardo Moreno-Ballesteros，Ganna Podoprygorina，Kaley Simcox，Oezge Simsir，Anton Skriba，Sam Wein，Hana Cahova，Benjamin A. Garcia，Mark Helm，David Alexandre，Katharina Hoefer，Sebastian Leidel，Patrick A Limbach，Eva Novoa，Eduard Sabido，Sabine Schneider
Philippe
Wolff
，
Peter
Dedon
，
Vivian
Cheung
，
Stefanie
Kaiser
bioRxiv
2026.07.17.739095；
DOI：
https://doi.org/10.64898/2026.07.17.739095
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关键词：RNA修饰定量 · 核苷质谱分析 · LC-MS/MS · 跨平台重现性 · 稳定同位素内标 · 表观转录组学
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