机器学习填补跨尺度生物系统中转运蛋白动力学数据的空白

摘要

理解转运蛋白动力学对于阐明生物系统中的代谢物交换至关重要，尤其是对于处于底物梯度环境中的细胞而言。然而，转运蛋白动力学参数，即每克蛋白质的最大转运速率（Vmax）和米氏常数（Km）的预测问题尚未得到解决。在此，我们开发了首个用于预测转运蛋白Vmax和Km的化合物–蛋白质相互作用机器学习模型MMTKPred。对于经log10变换的Vmax和Km，该模型的预测性能分别为R²=0.553、RMSE=1.155 mmol/hr/g蛋白质，以及R²=0.330、RMSE=0.935 mM。此外，我们在不同生物系统尺度上验证了MMTKPred的预测能力：在分子水平上，捕捉点突变和底物变化对转运蛋白动力学的影响；在细胞水平上，实现对非模式酵母的底物敏感性代谢建模；并合理解释共培养体系中的种间底物竞争。总体而言，MMTKPred能够有效模拟从分子到多物种尺度的代谢物转运，从而为微生物细胞工厂的理性优化提供计算工具。图形摘要O_FIG O_LINKSMALLFIG WIDTH=200 HEIGHT=200 SRC="FIGDIR/small/735998v1_ufig1.gif" ALT="图1">查看大图（62K）：org.highwire.dtl.DTLVardef@492463org.highwire.dtl.DTLVardef@1f3f64borg.highwire.dtl.DTLVardef@1aef26corg.highwire.dtl.DTLVardef@adc394_HPS_FORMAT_FIGEXP M_FIG C_FIG 研究亮点O_LIMMTKPred是首个转运蛋白动力学化合物–蛋白质相互作用（CPI）模型，其Vmax和Km预测的log10尺度RMSE均约为1。C_LIO_LIMMTKPred能够捕捉点突变和底物变化对转运蛋白的影响。C_LIO_LI预测的动力学参数使代谢通量模型能够反映底物敏感性。C_LIO_LI预测的动力学参数能够解释种间底物竞争。结果。C_LI

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中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东能源研究院

，青岛，266101，

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Milan Sobota

5

牛津大学威廉·邓恩爵士病理学院

，牛津，OX1 3RE，

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Zhangyu Guo

3

天津大学合成生物与生物制造学院，合成生物学国家重点实验室，系统生物工程教育部重点实验室

，天津，300350，

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，绍兴，312300，

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Weiming Tu

6

南洋理工大学土木与环境工程学院

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Yingping Zhuang

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华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

，上海，200237，

中华人民共和国

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Shengbo Wu

3

合成生物与生物制造学院，合成生物学国家重点实验室，系统生物工程重点实验室（部

教育部），天津大学，中国天津，300350

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生物反应器工程全国重点实验室，华东理工大学，中国上海，200237

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中国科学院青岛生物能源与过程研究所，山东能源研究院，中国青岛，266101

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摘要

理解转运蛋白动力学对于阐明生物系统中的代谢物交换至关重要，尤其是对于处于底物浓度梯度中的细胞而言。然而，转运蛋白动力学参数——每克蛋白质的最大转运速率（V_max）和米氏常数（K_m）——的预测问题尚未得到解决。在此，我们开发了首个基于化合物–蛋白质相互作用、用于预测转运蛋白 V_max 和 K_m 的机器学习模型 MMTKPred。在对经 log10 变换的 V_max 和 K_m 进行预测时，该模型分别取得了 R² = 0.553、RMSE = 1.155 mmol/hr/g 蛋白质和 R² = 0.330、RMSE = 0.935 mM 的结果。此外，我们展示了 MMTKPred 在不同生物系统尺度上的预测能力：从在分子水平捕捉点突变和底物变化所调控的转运蛋白动力学，到在细胞水平支持非模式酵母的底物敏感性代谢建模，以及对……作出合理解释

共培养体系中的种间底物竞争。总体而言，MMTKPred能够有效模拟从分子尺度到多物种尺度的代谢物转运，从而为微生物细胞工厂的理性优化提供计算工具。

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图形摘要

亮点

MMTKPred是首个转运蛋白动力学化合物–蛋白质相互作用（CPI）模型，其对V_max和K_m的预测均达到约1个log₁₀单位的均方根误差（RMSE）。

MMTKPred能够捕捉点突变和底物变化对转运蛋白的影响。

预测的动力学参数使代谢通量建模能够反映底物敏感性。

预测的动力学参数能够解释种间底物竞争的结果。

• 引言

转运蛋白（如通道蛋白和载体蛋白）在很大程度上主导代谢物跨细胞膜的通量，将细胞与其环境联系起来，因此，转运蛋白动力学对于解析跨尺度生物系统中的代谢物交换至关重要¹。在工业生物过程中，转运蛋白动力学为确定底盘细胞的底物摄取速率和产物外排速率提供了定量依据，而这些速率是存在底物梯度的生物反应器的关键运行参数²。对于微生物细胞工厂而言，低效的转运蛋白往往成为生产效率的瓶颈，因此，研究人员采用了包括定向进化和理性结构设计在内的多种转运蛋白工程策略，通过增强底物摄取、胞内代谢物转移和产物外排来提高生物制造效率³˒⁴。除单个微生物细胞工厂外，由进化适应塑造的转运蛋白动力学特性还直接影响种间代谢相互作用，进而塑造微生物群落结构⁵˒⁶。因此，转运蛋白动力学在机制层面连接了

生理功能与自然及工程生物系统的动态变化。

近年来，用于预测转运蛋白–底物特异性的机器学习（ML）模型已从类别层面的注释发展到特定底物的预测。例如，MONSTROUS 采用图神经网络对 12 类主要转运蛋白进行注释⁷，SPOT 则采用 Transformer 架构预测转运蛋白–底物配对⁸。然而，与针对酶动力学参数的化合物–蛋白质相互作用（CPI）模型的发展不同⁹，目前尚未构建出用于估计转运蛋白动力学参数 V_max（单位蛋白质的最大速率）和 K_m（米氏常数）的预测模型。鉴于上述转运蛋白动力学的重要性，以及公共生物化学数据库（如 UniProt¹⁰）中相关数据的匮乏¹¹，这一不足严重阻碍了单物种及多物种系统中代谢通量的定量分析，以及旨在提高生物生产能力的转运蛋白理性工程改造⁴。

为准确预测转运蛋白动力学，本研究利用蛋白质和化合物的预训练语言模型，以及 XGBoost 等机器学习回归模型，致力于开发首个用于预测转运蛋白 V_max 和 K_m 的 CPI 模型，即 MMTKPred。在评估模型性能后，利用 MMTKPred 预测点突变和底物变化对转运蛋白动力学的影响，在代谢建模中约束底物特异性转运能力，并从机制层面解释物种间底物竞争的结果。总体而言，本研究确立了 MMTKPred 作为生物系统中代谢物转运建模与工程改造的强大计算工具的价值。

• 方法

2.1 数据集

为构建用于预测转运蛋白 V_max 和 K_m 的 CPI 模型，本研究

本研究于 2026 年 2 月从 UniProt¹⁰、BRENDA¹² 和 SABIO-RK¹³ 收集了所有包含转运蛋白 UniProt ID、底物名称、生物体信息、EC 编号及目标值（Vₘₐₓ 或 Kₘ）的数据条目。数据集仅纳入转运过程中不修饰底物且表现出米氏动力学的转运蛋白。本研究假定，大多数转运蛋白的动力学特征可用米氏方程¹⁴合理近似。磷酸转移酶系统（PTS）因会使底物磷酸化而被排除在外；此外，PTS 不属于 EC 7 类，而属于 EC 2.7.1.- 类，该类已由酶动力学参数预测器充分表征⁹。通过 UniProt ID 查询转运蛋白序列，并从 PubChem¹⁵ 查询底物的 SMILES 字符串。所有 Vₘₐₓ 值的单位均统一为 ，所有 Kₘ 值的单位均统一为 m。合并来自 UniProt、BRENDA 和 SABIO-RK 的条目后，删除所有冗余条目。对于蛋白质序列和 SMILES 字符串相同但 Vₘₐₓ 值不同的条目，仅保留 Vₘₐₓ 最大的条目；对于蛋白质序列和 SMILES 字符串相同但 Kₘ 值不同的条目，则计算这些 Kₘ 值的几何平均值。对于包含不相连组分的 SMILES 字符串，仅保留较大的组分。所有含有金属离子的 SMILES 字符串对应条目均予以删除。最终，Vₘₐₓ 和 Kₘ 数据集分别包含 691 条和 1706 条唯一条目。

对于 Vₘₐₓ 和 Kₘ，为确保测试数据集未曾参与训练，在控制序列相似性的前提下随机划分训练集和测试集，使两组中不出现相似序列。所有蛋白质序列】【。

采用MMseqs2^16^进行聚类，相似性阈值设为50%，随后将这些聚类按照2:8的比例随机划分。V_max的训练集和测试集分别包含559条和132条记录，K_m的训练集和测试集分别包含1431条和275条记录（见补充信息（SI）中的图S1和S2）。

2.2 序列与分子特征计算

采用ESM-2（esm2_t33_650M_UR50D）^17^计算转运蛋白的序列嵌入，并利用ChemBERTa^18^根据SMILES字符串计算底物的分子嵌入（图1）。对序列嵌入和分子嵌入分别进行平均池化和最大池化，生成Seq Mean/Max和Mol Mean/Max，这些特征在本研究中被视为非工程化特征（Features（No FE），FE：特征工程）。在特征工程过程中，采用包含256个成分的主成分分析（PCA）生成降维（DR）特征：Seq Mean（DR）、Seq Max（DR）、Mol Mean（DR）和Mol Max（DR）。随后，对Seq Mean（DR）和Mol Mean（DR）进行逐元素相乘，得到CxP Mean特征；对Seq Max（DR）和Mol Max（DR）进行逐元素相乘，得到CxP Max特征。Seq Mean/Max（DR）、Mol Mean/Max（DR）以及CxP Mean/Max被视为工程化特征（Features（FE））。此外，使用RDKit^19^根据底物SMILES字符串计算了具有1024位的Morgan指纹（MFP），作为附加特征。

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图1.

用于预测转运蛋白V_max和K_m的MMTKPred模型示意图。Seq Mean：序列嵌入的平均池化；Seq Max：序列嵌入的最大池化；Mol Mean：分子嵌入的平均池化；Mol Max：分子嵌入的最大池化；DR：降维；CxP Mean：Seq Mean与Mol Mean的逐元素乘积；...

Mol Mean，CxP Max：Seq Max 与 Mol Max 的逐元素乘积，FE：特征工程，NoFE：不进行特征工程，MFP：Morgan 指纹，V_max：每克蛋白质的最大速率，K_m：米氏常数，[P]：每克细胞干重（DCW）中的转运蛋白质量，[S]：底物浓度。

2.3 机器学习模型构建与超参数优化

为预测转运蛋白的 V_max 和 K_m，本研究尝试了 4 种常用于化合物–蛋白质相互作用（CPI）模型或基于序列的蛋白质性质预测模型的回归模型：XGBoost、LightGBM、ExtraTrees 和 SVR²⁰˒²¹˒²²（图 1）。此外，还考察了用于模型训练和评估的 4 种不同特征组合：（1）特征（无特征工程），（2）特征（无特征工程）+ MFP，（3）特征（经特征工程处理），以及（4）特征（经特征工程处理）+ MFP（第 2.2 节）。需要注意的是，V_max 和 K_m 分别进行预测，且所有目标值均经过 log10 变换。采用 Optuna²³ 对不同机器学习模型进行超参数优化，超参数搜索空间详见补充信息（SI）中的表 S1。预测得到 V_max 和 K_m 后，即可估算遵循米氏动力学的转运过程：

q_S 为特定底物的细胞比转运速率，[P] 为每克细胞干重（DCW）中的转运蛋白质量，[S] 为底物浓度。对于经过训练和微调的转运蛋白 V_max 和 K_m 机器学习模型，通过计算各特征的 SHAP 值²⁴ 进行特征重要性分析。

2.4 基于预测转运蛋白动力学约束的通量平衡分析

传统通量平衡分析（FBA）在稳态质量守恒约束（式 3）下，通过优化目标函数（默认为生长速率 μ，式 2）计算代谢通量²⁵。为化学计量的

矩阵，v 为反应通量向量。将预测的转运蛋白动力学参数（式1）整合到 FBA 中，可约束转运能力（交换通量），并使其能够响应底物种类和浓度的变化，由此构建了转运约束通量平衡分析（TCFBA）框架。由于膜蛋白的总质量有限，转运蛋白质量之和存在上限（式4和式5）。\(q_i^s\) 为底物 \(S_i\) 的交换通量，\([P_i]\) 为单位细胞干重（DCW）对应的转运蛋白 \(P_o\) 的质量。

TCFBA 对底物浓度的敏感性也有助于开展动态 FBA²⁶，因为它可以根据底物浓度近似估计交换通量的变化。

2.5 用于种间底物竞争分析的宏基因组数据处理

本研究中，不同底物条件下的种间竞争实验结果取自 Kehe 等人于2021年发表的研究⁶，宏基因组序列也向同一来源索取。排除所有可通过磷酸转移酶系统（PTS）转运的底物（如果糖）后，选取了101组不同的种间底物竞争组合，涵盖11种细菌和9种底物。在 Kehe 等人2021年的数据集中，细菌1对细菌2的效应评分被量化为细菌2与细菌1共培养时的生长产量和细菌2单培养时的生长产量之间以 log₂ 为尺度的差值，因此，“1对2”的效应评分越负，表明细菌1的底物竞争能力越强。为鉴定转运蛋白，使用 Pyrodigal 3.7.1²⁷ 从宏基因组序列中注释蛋白质序列，随后使用 Diamond²⁹ 与 TCDB 数据库²⁸进行序列比对，以鉴定底物特异性转运蛋白。对于 Diamond 2.1.25 版本，最大命中数设置为

设为5，e-value阈值设为1e-5，其余参数均采用默认值。来自11种细菌的已注释转运蛋白序列与训练数据集中序列的平均相似性低于40%（补充信息中的图S9）。利用TCDB数据库中的转运蛋白分类编号，将底物信息映射至每个匹配命中条目。这11种细菌的所有已注释转运蛋白序列均存储于https://github.com/SizheQiu/MMTKPred/data/competition/中的bugcu_filtered_…。

• 结果

3.1 XGBoost在转运蛋白V_max预测中具有较高的准确性

在4种机器学习模型及不同特征集的比较中，XGBoost在log₁₀ V_max预测中表现更优，且特征工程未能提高预测准确性（图2A）。表现最佳的两个模型分别为使用Features (No FE)的XGBoost（R²=0.553，RMSE=1.155，MAE=0.788）和使用Features (No FE)+MFP的XGBoost（R²=0.546，RMSE=1.164，MAE=0.814）（图2B、C）。这两个模型经优化的超参数组合详见补充信息中的表S2。由于目前尚无已发表的转运蛋白V_max预测工具，本研究未在此进行模型性能比较。对使用Features (No FE)和Features (No FE)+MFP的XGBoost模型进行基于SHAP的特征重要性分析，结果均表明，最重要的特征主要为经均值池化和最大池化得到的序列特征，提示V_max的回归预测主要依赖于蛋白质序列特征（图2D、E）。相比之下，MFP未出现在使用Features (No FE)+MFP的XGBoost模型的最重要特征中（图2E），且降维后的Features (No FE)+MFP分布也表明，MFP对区分低V_max值与高V_max值的贡献很小（

补充信息（SI）中的图 S3）。不同数值范围内的性能评估表明，在高值范围（最高的 25%）内，使用特征（未经特征工程处理，No FE）的 XGBoost 表现略优；而在低值范围（最低的 25%）内，使用特征（No FE）+MFP 的 XGBoost 表现略优（图 2F）。此外，本研究发现，使用特征（No FE）的 XGBoost 能够捕捉到以下进化适应现象：微生物（酿酒酵母 S. cerevisiae 和大肠杆菌 E. coli）的转运蛋白 V_max 显著高于哺乳动物细胞（人 H. sapiens 和小鼠 M. musculus）（图 2G、H），这是因为微生物面临的营养物质竞争要激烈得多³⁰。总之，使用特征（No FE）的 XGBoost 被确定为预测转运蛋白 V_max 的最佳模型，并捕捉到了跨物种转运蛋白 V_max 差异所蕴含的进化规律。

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图 2.

转运蛋白 V_max 预测模型的性能评估。（A）分别使用特征（No FE）、特征（No FE）+MFP、特征（FE）和特征（FE）+MFP 的 XGBoost、LightGBM、ExtraTrees 和 SVR 的 R²、RMSE 和 MAE。FE：特征工程；NoFE：未经特征工程处理；MFP：摩根指纹。（B）使用特征（No FE）的 XGBoost 所预测的 log₁₀ V_max 与实验测得的 log₁₀ V_max（R²=0.553，RMSE=1.155，MAE=0.788）。（C）使用特征（No FE）+MFP 的 XGBoost 所预测的 log₁₀ V_max 与实验测得的 log₁₀ V_max（R²=0.546，RMSE=1.164，MAE=0.814）。（D）使用特征（No FE）的 XGBoost 的基于 SHAP 的特征重要性分析。（E）使用特征（No FE）+MFP 的 XGBoost 的基于 SHAP 的特征重要性分析。（F）使用特征（No FE）的 XGBoost 和使用特征（No FE）+MFP 的 XGBoost 在不同数值范围（最低的 25%、中低的 25%、中高的 25%、最高的 25%）内预测转运蛋白 log₁₀ V_max 的 RMSE 和 MAE。（G）实验测得的

以及 XGBoost 预测的（Features (No FE)）人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的转运蛋白 log₁₀ Vₘₐₓ 值。（H）人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的转运蛋白 log₁₀ Vₘₐₓ 实验值及 XGBoost 预测值（Features (No FE)）。

3.2 特征工程使 XGBoost 和 LightGBM 在转运蛋白 Kₘ 预测中优于现有模型

与转运蛋白 log₁₀ Vₘₐₓ 预测不同，特征工程提升了转运蛋白 log₁₀ Kₘ 的预测性能，其中，使用 Features (FE) 的 XGBoost 和使用 Features (FE) 的 LightGBM 被确定为表现最佳的两个模型（图 3A）。同时，降维后的 Features (No FE) 对 Kₘ 的判别能力较弱，进一步证实了特征工程的必要性（补充信息中的图 S4）。使用 Features (FE) 的 XGBoost 的预测精度为 R² = 0.330、RMSE = 0.935 mM、MAE = 0.727 mM；使用 Features (FE) 的 LightGBM 的预测精度为 R² = 0.325、RMSE = 0.939 mM、MAE = 0.727 mM（图 3B、C）。这两个模型的优化超参数组合详见补充信息中的表 S2。在特征重要性分析中，“CxP_mean”位列使用 Features (FE) 的 XGBoost 的重要性最高的特征之列，表明序列特征与分子特征的逐元素相乘（第 2.2 节）提取了有关转运蛋白–底物相互作用的有用信息（图 3D）；而使用 Features (FE) 的 LightGBM 的重要性最高的特征仅包含降维后的序列嵌入和分子嵌入（图 3E）。在已发表的 Kₘ 预测模型与本研究表现最佳的两个转运蛋白 Kₘ 预测模型的性能比较中，本研究的这两个模型均优于 UniKP³¹、CatPred³²、EITLEM³³ 和 KinForm²²（图 3F）。随后，本研究评估了这些模型的性能

比较了表现最佳的两个模型与CatPred在不同log₁₀ Kₘ取值区间内的预测表现，发现使用特征（经特征工程处理，FE）的XGBoost和LightGBM在中间50%和最低25%的取值区间内，预测误差均低于CatPred（图3G）。对于跨物种转运蛋白Kₘ，测试数据集中的实验Kₘ值未显示出显著的物种间差异（补充信息中的图S5）。综上，使用特征（FE）的XGBoost在转运蛋白Kₘ预测中达到了更高的准确性。

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图3.

转运蛋白Kₘ预测的模型性能评估。（A）XGBoost、LightGBM、ExtraTrees和SVR分别使用特征（未经特征工程处理，No FE）、特征（No FE）+MFP、特征（FE）及特征（FE）+MFP时的R²、RMSE和MAE。FE：特征工程；NoFE：未经特征工程处理；MFP：Morgan指纹。（B）实验log₁₀ Kₘ与使用特征（FE）的XGBoost预测的log₁₀ Kₘ（R²=0.330，RMSE=0.935 mM，MAE=0.727 mM）。（C）实验log₁₀ Kₘ与使用特征（FE）的LightGBM预测的log₁₀ Kₘ（R²=0.325，RMSE=0.939 mM，MAE=0.727 mM）。（D）基于SHAP的使用特征（FE）的XGBoost特征重要性分析。（E）基于SHAP的使用特征（FE）的LightGBM特征重要性分析。（F）UniKP、CatPred、EITLEM、KinForm、使用特征（FE）的XGBoost以及使用特征（FE）的LightGBM的R²和RMSE。（G）使用特征（FE）的XGBoost、使用特征（FE）的LightGBM以及CatPred在不同取值区间内预测转运蛋白log₁₀ Kₘ的RMSE和MAE。

3.3 预测的转运蛋白动力学能够反映点突变和底物变化的影响

在对MMTKPred的性能评估表明其对Vₘₐₓ和Kₘ的预测误差均接近一个数量级后，本研究进一步评估了其针对突变的外推能力

转运蛋白及多种底物。我们首先采用 MMTKPred 预测点突变对以下 3 种转运蛋白转运效率的影响：(1) 人（H. sapiens）易化葡萄糖转运蛋白成员 9（SLC2A9）³⁴；(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）多药耐药性 ABC 转运蛋白（BmrA）³⁵；(3) 大肠杆菌（E. coli）苯丙氨酸通透酶（PheP）³⁶（图 4A–D）。所有 V_max 预测均由 XGBoost 使用特征（未进行特征工程，No FE）完成（第 3.1 节）。由于 SLC2A9、BmrA 和 PheP 最大转运效率的计量单位与本研究中 V_max 的单位不同，且无法相互换算，因此我们只能定性评估模型是否预测出了 V_max 的变化趋势。对于 SLC2A9 的 3 种单点突变，模型准确预测了 I335V、W110A 和 W110F 导致的 V_max 降低（图 4A）。实验数据和预测结果均表明，E474D、E474Q 和 E474F 突变会降低 BmrA 的转运活性（图 4B）。33 种 PheP 突变体的预测 V_max 与实验测得的相对活性呈显著正相关（图 4C）。对于 PheP 中 16 个保守脯氨酸残基的脯氨酸至丙氨酸替换，预测 V_max 与实验相对活性的变化趋势高度一致，尤其是 P341A 替换导致的活性大幅下降（图 4D）。总体而言，该模型能够反映单点突变对转运蛋白转运效率的影响。

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图 4.

预测点突变和底物对转运蛋白 V_max 和 K_m 的影响。(A) 野生型和突变型 SLC2A9 的实验与预测 log₁₀ V_max。实验 V_max 的单位为 pmol/(卵母细胞·20 min)。SLC2A9：

来自人（H. sapiens）的易化葡萄糖转运蛋白成员9。（B）野生型及突变型BmrA的实验相对活性（%）与预测的log₁₀ V_max。BmrA：来自枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的多药耐药性ABC转运蛋白。（C）野生型及突变型PheP的实验相对活性（%）与预测的log₁₀ V_max。PheP：大肠杆菌（E. coli）的苯丙氨酸通透酶；PCC：皮尔逊相关系数。（D）脯氨酸被丙氨酸替换的PheP的实验相对活性（%）与预测的log₁₀ V_max。（E）野生型及突变型GltPh的实验与预测log₁₀ K_m。GltPh：来自堀越氏热球菌（Pyrococcus horikoshii）的钠-天冬氨酸同向转运蛋白。（F）支架区域发生单点突变的GltPh的实验与预测log₁₀ K_m。（G）SLC6A14针对不同氨基酸的实验与预测log₁₀ K_m。SLC6A14：来自人（H. sapiens）的钠/氯依赖性氨基酸转运蛋白。蓝线：实验值；橙线：预测值；*：p值<0.05；：p值<0.01；*：p值<0.001。

关于转运蛋白的K_m，我们使用MMTKPred分别预测了点突变对堀越氏热球菌（Pyrococcus horikoshii）钠-天冬氨酸同向转运蛋白（GltPh）的影响³⁷，以及底物变化对人（H. sapiens）钠/氯依赖性氨基酸转运蛋白（SLC6A14）的影响³⁸（图4E–G）。所有K_m预测均由XGBoost使用特征（FE）完成（第3.2节）。在螺旋发夹、支架和转运结构域核心区域发生点突变的GltPh，其预测K_m与实验K_m呈显著正相关，但数值误差仍然较大（log₁₀ RMSE>2）（图4E）。与另外两个区域相比，模型对支架区域突变所引起的K_m变化具有更高的预测准确性（图4E，补充信息中的图S6和S7）。对于13个

对于 SLC6A14 转运的不同氨基酸，该模型准确预测了底物特异性的 K_m（log10 RMSE=0.41），并识别出亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸为亲和力最高的底物（图 4G）。总体而言，MMTKPred 能够有效预测点突变和底物变化对转运蛋白动力学的调控作用，从而支持对候选转运蛋白和营养源进行高通量计算机模拟筛选，以优化微生物细胞工厂。

3.4 预测的转运蛋白动力学参数支持底物敏感型代谢建模

在验证了 MMTKPred 对单点突变和底物变化引起的转运蛋白动力学变化的预测能力后，本研究进一步评估了其在代谢通量建模中的适用性。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）和马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是两种广泛使用的非模式酵母，但均缺乏酶和转运蛋白的定量动力学数据⁳⁹。将转运约束通量平衡分析（TCFBA）与 MMTKPred 预测的转运蛋白动力学参数相结合（第 2.4 节），可克服这一局限，从而以较低成本模拟它们在不同碳源上的生长和代谢（图 5）。所使用的基因组尺度代谢模型分别为解脂耶氏酵母的 iYali v4.1.2⁴⁰ 和马克斯克鲁维酵母的 iSM996⁴¹。考虑到转运蛋白 V_max 和 K_m 的预测误差（第 3.1 节和第 3.2 节），将膜转运蛋白的上限设为较宽松的 0.5⁴²。首先，根据后续案例研究的需要，利用补充信息表 S3 中的信息，预测了不同碳源对应的转运蛋白 V_max 和 K_m（补充信息图 S8）。随后，预测了解脂耶氏酵母和马克斯克鲁维酵母利用不同碳源时的生长速率，并将其与 Mukhtar 等人提供的实验生物量产率进行比较，

2018⁴³和 Goshima 等，2013⁴⁴（图5A、B）。静态 TCFBA 预测的解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）生长速率定量反映了以生物量得率衡量的碳源偏好，即葡萄糖和麦芽糖是其生长的优选碳源（图5A）。静态 TCFBA 还准确识别出葡萄糖、半乳糖和甘露糖是马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）生长的最优碳源，但低估了其利用蔗糖时的生长速率（图5B）。简而言之，结合 MMTKPred 预测的转运蛋白动力学参数，TCFBA 能够准确确定底物特异性的生长动力学。

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图5.

利用不同碳源的解脂耶氏酵母和马克斯克鲁维酵母的转运约束代谢建模。（A）解脂耶氏酵母利用木糖、葡萄糖、麦芽糖和果糖时的预测生长速率与实验测得的生物量得率。（B）马克斯克鲁维酵母利用葡萄糖、半乳糖、木糖、木糖醇、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖和甘油时的预测生长速率与培养24小时后的 OD₆₀₀。（C）解脂耶氏酵母利用葡萄糖时生物量积累和底物消耗的预测值与实验值。（D）解脂耶氏酵母同时利用葡萄糖和甘油时生物量积累和底物消耗的预测值与实验值。（E）马克斯克鲁维酵母利用葡萄糖时生物量积累和底物消耗的预测值与实验值。（F）马克斯克鲁维酵母利用半乳糖时生物量积累和底物消耗的预测值与实验值。Exp：实验值；Pred：预测值。

随后，针对（1）利用葡萄糖和甘油的解脂耶氏酵母⁴⁵，以及（2）利用葡萄糖、半乳糖和乳糖的马克斯克鲁维酵母⁴⁶，进行了动态 TCFBA。对于解脂耶氏酵母因葡萄糖耗尽而从指数生长期向稳定期的转变，定量地

可通过动态 TCFBA 进行表征，但由于低估了葡萄糖消耗速率，预测生长曲线与实验生长曲线之间出现了偏差（图 5C）。动态 TCFBA 模拟了葡萄糖和甘油共代谢过程中的二次生长现象，尽管甘油利用速率被显著低估（图 5D，补充信息中的图 S9A）。对于马克斯克鲁维酵母（K. marxianus），模拟得到的半乳糖和葡萄糖利用过程中的生长曲线及底物消耗曲线与实验测量结果高度一致（图 5E、F），但乳糖利用速率被低估（补充信息中的图 S9B）。解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）利用甘油和马克斯克鲁维酵母利用乳糖时的预测误差（补充信息中的图 S9），很可能是由于转运蛋白 V_max 和 K_m 的训练数据集中这两种底物的代表性不足所致。简言之，采用预测的底物特异性交换通量约束的 TCFBA，能够使基于约束的代谢建模充分响应异质性营养条件。

3.5 预测的转运蛋白动力学解释种间底物竞争结果

除单一微生物细胞工厂外，本研究还探索了 MMTKPred 在共培养体系中的预测能力。鉴于 MMTKPred 能够捕捉由进化适应引起的跨物种 V_max 变异（第 3.1 节），本研究尝试利用预测的转运蛋白动力学参数（V_max 和 K_m）来解释种间底物竞争结果（第 2.5 节）。将某细菌物种的宏基因组序列中所有已注释的底物特异性转运蛋白的预测 V_max/K_m 之和，作为该物种的预测底物竞争评分，该评分显示出一种

与实测种间效应评分呈显著负相关（图6A）。预测的转运蛋白 V_max/K_m 值可解释53.5%的种间底物竞争结果，并且对于涉及大多数细菌物种（如弗氏柠檬酸杆菌、伊扎德布蒂奥菌）和底物（如丙氨酸、丝氨酸）的竞争，能够实现较高的预测准确率（图6B、C）。例如，该模型准确预测了27组丙氨酸种间竞争中的18组结果（图6C，补充信息中的图S10）。若排除甘油竞争（MMTKPred的训练数据集中不包含甘油），竞争结果的预测准确率可达61.4%。对所有底物的实验测定与预测底物竞争胜率进行分析，并重点分析竞争次数最多的丙氨酸和谷氨酰胺（补充信息中的图S10），结果表明，模型大幅高估了韩国假单胞菌的竞争力，而低估了产气克雷伯菌和路德维希肠杆菌的竞争力，这是预测误差的主要来源（图6D）。总体而言，MMTKPred预测的转运蛋白动力学参数能够从机制层面解释种间底物竞争结果，有助于混合菌种培养的调控，从而促进多物种细胞工厂的理性设计。

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图6.

利用估算的转运蛋白 V_max 和 K_m，预测选自Kehe等人⁶研究、涵盖11种细菌和9种碳源的种间底物竞争结果。（A）针对不同底物，预测的 log₁₀(V_max/K_m) 之和与种间效应评分之间的相关性（p值<1×10⁻³）。（B）各物种营养竞争结果的预测准确率。（C）预测

各底物种间竞争结果的准确性。（D）各物种在所有底物、仅丙氨酸和仅谷氨酰胺条件下的实验与预测底物竞争胜率。***：p值<0.001。

• 讨论

转运蛋白动力学对于跨尺度生物系统中代谢物转运的定量分析、建模和工程改造至关重要，其研究范围涵盖单个转运蛋白装置至种间代谢相互作用。鉴于转运蛋白动力学的重要性及实验数据的匮乏，亟需建立转运蛋白V_max和K_m的预测模型，以填补这一迄今尚未得到探索的知识空白。因此，本研究分别采用ESM-2和ChemBERTa对转运蛋白序列和底物分子进行编码（第2.2节），并尝试了4种不同的回归模型，构建了首个转运蛋白V_max和K_m预测工具MMTKPred（第2.3节）。模型评估表明，XGBoost在V_max（R²=0.553，RMSE=1.155，MAE=0.788）和K_m（R²=0.330，RMSE=0.935 m，MAE=0.727 m）预测中均为最佳回归模型，而序列和分子特征工程使MMTKPred的性能优于其他K_m预测工具（第3.1节和第3.2节）。此外，MMTKPred能够捕捉转运蛋白V_max跨物种变异中蕴含的进化信息（第3.1节）。

在模型评估之后，本研究利用MMTKPred预测点突变和底物变化对转运蛋白动力学的调节作用，展示了其作为计算工具的潜力，可用于转运蛋白的筛选与工程改造，以优化微生物细胞工厂³（第3.3节）。在代谢建模方面，结合预测转运蛋白动力学参数的TCFBA填补了

交换通量的蛋白质成本，并使模型能够响应底物种类及其浓度的变化（第3.4节），而大多数酶约束代谢模型尚不具备这一能力⁴⁷，从而推动了异质营养条件下微生物细胞工厂代谢数字孪生的发展。此外，利用预测的转运蛋白动力学参数对种间底物竞争进行机制建模，将定量代谢物转运建模拓展至共培养层面（第3.5节），表明MMTKPred可用于设计多物种细胞工厂的调控策略⁴⁸˒⁴⁹。

尽管取得了上述进展，MMTKPred仍存在若干局限，制约了转运蛋白动力学参数的预测精度。V_max和K_m预测误差的log10 RMSE均接近1，因此，由于误差传播，式（1）和V_max/K_m的误差在理论上对应的log10 RMSE约为∼，导致动态代谢建模（第3.4节）和种间底物竞争预测（第3.5节）不够准确。限制预测精度的主要瓶颈在于，与DLTKcat数据集的16249条记录相比⁵⁰，训练数据集规模较小，且V_max和K_m值的分布不均衡（补充信息中的图S1和S2）。过采样和损失重加权算法（如SMOTE⁵¹）可以缓解分布不均衡问题，但MMTKPred训练数据集中稀有取值区域的记录数量过少，难以使这些算法发挥作用（补充信息中的图S1和S2）。此外，从数据库中整理获得的实验数据若存在不准确之处，也会损害模型性能⁵²。因此，利用高通量转运蛋白测定方法获取稀有取值区域的V_max和K_m实测值，

同时，严格的数据质量控制也是进一步提高转运蛋白动力学预测准确性所必需的。另一个不足是忽略了影响转运蛋白构象并进而影响转运动力学的环境因素（如 pH）⁵³。纳入转运蛋白测定的元数据有助于将环境因素考虑在内，然而，目前从数据库中整理得到的大多数转运蛋白测定结果均缺乏此类信息。理想化的米氏动力学假设也限制了 MMTKPred 的适用性，因为某些转运蛋白表现出复杂的动力学机制（如希尔动力学）⁵⁴，但目前相关训练数据的匮乏使其尚无法被纳入模型。可以预期，在未来研究中解决上述局限性将显著提升 MMTKPred 的性能。

综上所述，本研究构建了首个用于预测转运蛋白动力学参数 V_max 和 K_m 的 CPI 模型，预测误差接近一个数量级，并展示了其在跨尺度生物系统中的预测能力，为异质营养条件下底盘细胞的代谢数字孪生构建，以及面向理性菌株工程的交换通量精准调控提供了启示。

作者贡献

Sizhe Qiu 博士：概念构思、数据整理、正式分析、研究实施、方法学、可视化、初稿撰写；Milan Sobota：数据整理、正式分析；Zhangyu Guo：数据整理、可视化；Weiming Tu 教授：审阅与编辑；Yingping Zhuang 教授：项目管理、监督指导、审阅与编辑；Shengbo Wu 教授：项目管理、监督指导、审阅与编辑；Guan Wang 教授：项目管理、监督指导、审阅与编辑。

利益冲突

声明

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性声明

代码和数据已公开，可通过以下链接及补充信息获取：

https://github.com/SizheQiu/MMTKPred

致谢

本研究获得国家重点研发计划（资助编号：2024YFA0920300）、国家重点研发计划（资助编号：2024YFA0920200）、国家自然科学基金（资助编号：22578122）、山东省泰山学者计划（资助编号：tspn202408281）、上海市自然科学基金（资助编号：25ZR1402110）、上海市探索者计划（基础研究资助）（资助编号：25TS1401100）、上海市青年科技英才扬帆计划（资助编号：21QA1402400）以及江苏省重大科技专项（资助编号：BG2025044）的资助。

已声明的资助方信息

国家重点研发计划

，2024YFA0920300

，2024YFA0920200

国家自然科学基金

，22578122

山东省泰山学者计划

，tspn202408281

上海市自然科学基金

，25ZR1402110

上海市青年科技英才扬帆计划

，21QA1402400

江苏省重大科技专项

，BG2025044

脚注

https://github.com/SizheQiu/MMTKPred

缩略语

CPI

化合物–蛋白质相互作用；

DCW

细胞干重；

FBA

通量平衡分析；

FE

特征工程；

Kₘ

米氏常数；

MAE

平均绝对误差；

ML

机器学习；

PCC

皮尔逊相关系数；

PTS

磷酸转移酶系统；

R²

R平方，即决定系数；

RMSE

均方根误差；

Vₘₐₓ

每克蛋白质的最大反应速率

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关键词：转运蛋白动力学 · 机器学习 · 动力学参数预测 · 化合物–蛋白质相互作用 · 代谢通量建模 · 种间底物竞争

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.735998v1?rss=1