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基因组 DNA 缠绕在核心组蛋白周围形成核小体。在细胞中，核小体从常染色质到异染色质有序组织，并承担不同的基因组功能。尽管已知转录能够塑造活细胞中的染色质行为，但不同转录系统如何塑造染色质类别和核内亚区室仍不清楚。我们开发了机器学习辅助的 Repli-Histo 标记方法，用于对常染色质和异染色质类别（IA、IB、II 和 III 类）进行分类，并将其与活细胞中的单核小体成像相结合。核小体运动从常染色质到异染色质逐渐受到限制。通过 THZ1、DRB 或 α-鹅膏蕈碱抑制 RNA 聚合酶 II，可增加常染色质 IA 类和 IB 类以及核仁周围异染色质中的核小体运动，但不会增加核周区域中的核小体运动。相比之下，通过 CX-5461 抑制 RNA 聚合酶 I，可选择性地增加核仁周围 III 类异染色质中的核小体运动。本研究揭示了 Pol II 和 Pol I 转录在不同染色质类别及核内亚区室中以不同方式塑造染色质行为。图文摘要O_FIG O_LINKSMALLFIG WIDTH=200 HEIGHT=143 SRC="FIGDIR/small/736477v1_ufig1.gif" ALT="图 1">查看更大版本（52K）：org.highwire.dtl.DTLVardef@1b27ddorg.highwire.dtl.DTLVardef@d64f76org.highwire.dtl.DTLVardef@1fad7b0org.highwire.dtl.DTLVardef@1668cd5_HPS_FORMAT_FIGEXP M_FIG C_FIG
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机器学习辅助的 Repli-Histo 标记揭示活细胞中染色质运动受到不同的转录依赖性约束
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Katsuhiko Minami、Kako Nakazato、Sachiko Tamura、S. S. Ashwin、Kazuhiro Maeshima
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.05.736477
Katsuhiko Minami
1 日本遗传学研究所基因组动力学实验室，综合研究大学院大学（ROIS），日本静冈县三岛市，邮编 411-8540
2 综合研究大学院大学（SOKENDAI），日本静冈县三岛市，邮编 411-8540
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Kako Nakazato
1 日本遗传学研究所基因组动力学实验室，综合研究大学院大学（ROIS），日本静冈县三岛市，邮编 411-8540
2 综合研究大学院大学（SOKENDAI），日本静冈县三岛市，邮编 411-8540
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Sachiko Tamura
1 日本遗传学研究所基因组动力学实验室，综合研究大学院大学（ROIS），日本静冈县三岛市，邮编 411-8540
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S. S. Ashwin
3 印度甘地理工与管理学院（GITAM）大学物理系，印度班加罗尔，邮编 561203
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Kazuhiro Maeshima
1
基因组动态实验室，日本国立遗传学研究所，综合研究系统（ROIS），三岛，静冈 411-8540，
日本
2
高级研究生院，综合研究大学院大学（SOKENDAI），三岛，静冈 411-8540，
日本
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通信作者：
kmaeshim{at}nig.ac.jp
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摘要
基因组 DNA 缠绕在核心组蛋白周围，形成核小体；在细胞中，核小体由常染色质到异染色质呈不同组织状态，并具有不同的基因组功能。尽管已知转录会影响活细胞中的染色质行为，但不同的转录系统如何塑造染色质类别和细胞核亚区室，仍不清楚。我们开发了机器学习辅助的 Repli-Histo 标记方法，用于对常染色质和异染色质类别（IA、IB、II 和 III 类）进行分类，并将其与活细胞中的单核小体成像相结合。从常染色质到异染色质，核小体运动逐渐受到限制。使用 THZ1、DRB 或 α-鹅膏蕈碱抑制 RNA 聚合酶 II，会增加常染色质 IA 类和 IB 类以及核仁周围异染色质中的核小体运动，但不会增加核周异染色质中的核小体运动。相比之下，使用 CX-5461 抑制 RNA 聚合酶 I，会选择性地增加核仁周围 III 类异染色质中的核小体运动。我们的研究揭示，Pol II 和 Pol I 转录会在不同的染色质类别和细胞核亚区室中，以不同方式塑造染色质行为。
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引言
一条长 DNA 链缠绕在核心组蛋白八聚体周围，形成核小体
1
,
2
。来自电镜/超分辨率成像
3
–
10
和 Hi-C 基因组学
11
–
15
的多项证据展现了这一点。
显示在真核细胞中，核小体与其他蛋白质和 RNA 一起，在三维空间中形成具有不同表观遗传标记、并在功能上组织成不同的染色质结构域。
细胞中的染色质具有高度可变性，其范围从常染色质到异染色质，并支持多种基因组功能
16
–
19
。尽管长期以来，教科书中的典型观点认为常染色质是开放的，而异染色质则是封闭且凝缩的
20
，但近期研究表明，常染色质结构域并非完全开放，而是呈凝缩状态，只有启动子和增强子区域例外
7
,
8
,
10
,
19
,
21
–
23
。鉴于常染色质和异染色质均形成凝缩结构域，二者在物理性质上有何差异？除了它们的组蛋白修饰（例如活性和非活性修饰）以及非组蛋白组分（例如 HP1）
16
–
18
之外，它们在活细胞中的动态特征对于其功能也必然十分重要
24
–
27
。
为了在活的人细胞中特异性地观察常染色质和异染色质，我们近期开发了一种依赖复制的组蛋白标记方法，称为 Repli-Histo 标记
28
,
29
。Repli-Histo 标记利用了真核生物 DNA 复制时序的特征：常染色质在 S 期早期进行复制，而异染色质则在 S 期晚期进行复制（图 1A）。在这一过程中，复制依赖型经典组蛋白变体（如 H3.2）被沉积到新复制的核小体上。基于这些特征，在 S 期早期和晚期对新合成的 H3.2 进行脉冲标记，即可分别特异性地标记常染色质和异染色质（图 1B）。
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图 1。
机器学习辅助的 Repli-Histo 标记模式分类。
(A) 真核细胞在 S 期早期复制常染色质，随后_中文字幕
晚 S 期的异染色质复制。
(B)
复制依赖性组蛋白标记（Repli-Histo 标记）的核心概念。在早期和晚期 S 期对新生组蛋白进行脉冲标记，可分别实现对常染色质和异染色质的可视化。
(C)
Repli-Histo 标记的实验方案。图（A–C）根据文献 28 改编，并进行了细微修改。
(D)
经 DAPI 染色和 Repli-Histo 标记的代表性 HeLa 细胞（从左至右依次为 IA、IB、II 和 III 类）。底行显示合并图像（青色，DAPI；红色，Repli-Histo 标记）。
(E)
基于机器学习的 Repli-Histo 标记模式分类。详见方法部分。
(F)
混淆矩阵显示机器学习预测结果与人工分类标记模式之间的对应关系。请注意，大多数细胞均落在对角线类别中，表明我们的机器学习预测能够很好地重现人工分类结果。该混淆矩阵基于来自独立生物学实验的独立测试数据集生成（n = 149 个细胞；准确率为 86.6%）。
在 Repli-Histo 标记中，首先使用非荧光 HaloTag 配体封闭与 HaloTag 融合的 H3.2（H3.2-Halo；图 S1A），该蛋白分布于整个基因组。随后，新合成的 H3.2-Halo 分子被整合至新生核小体中，并在 S 期使用荧光 HaloTag 配体进行脉冲标记（图 1C）。根据复制时序，Repli-Histo 标记将染色质分为从常染色质到异染色质的四类，即 IA、IB、II 和 III 类（图 1D；表 S1）。这些类别对应于历史上定义的复制灶 30–32。早期复制的 IA 类和 IB 类具有更明显的常染色质特征，而较晚复制的
II类和III类具有更高的异染色质特征。这些Repli-Histo类别也与Hi-C的A区室和B区室相一致，拉下实验和基因组测序结果证实了这一点
28
。Repli-Histo标记显示，局部核小体运动从IA类到III类逐渐受到更多限制
28
。
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图S1。
机器学习辅助的Repli-Histo标记模式分类验证。
(A)
使用抗组蛋白H3.1/H3.2抗体（左）和抗HaloTag抗体（右）对HeLa细胞裂解物中组蛋白H3.2-HaloTag进行Western blot检测（泳道2）。
(B)
训练过程中，代表性模型在各训练轮次中的训练损失和验证损失。
(C)
展示机器学习预测结果与THZ1处理的HeLa细胞人工分类结果之间差异的混淆矩阵。
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表S1：
Repli-Histo标记的标记模式
此类染色质及其核小体运动特征在活细胞中是如何受到调控并得以维持的？转录可能是塑造这些类别内染色质行为的因素之一。包括我们在内的既往研究表明，活性RNA聚合酶II（Pol II）转录会限制染色质运动，而抑制转录或耗竭Pol II则会增强局部染色质运动
5
,
33
–
39
。然而，染色质在整个基因组范围内具有高度异质性。常染色质和异染色质在复制时序、组蛋白修饰、核内定位以及物理性质等方面均存在差异。因此，目前尚不清楚转录是否会以相对均一的方式限制整个基因组范围内的染色质运动，或者这种限制是否会因不同的染色质类别和核内亚区室而有所差异。
在本研究中，我们
我们开发了机器学习辅助的 Repli-Histo 标记分类方法，以客观地识别 Repli-Histo 模式，并将其与单核小体成像相结合，考察转录如何影响活细胞中不同染色质类别的染色质运动。使用 Pol II 抑制剂 THZ1、DRB 和 α-鹅膏蕈碱后，我们发现 Pol II 转录会限制常染色质的运动，并有助于维持核仁周围异染色质的组织。相比之下，使用 CX-5461 抑制 RNA Pol I（Pol I）转录，则会选择性地增加核仁周围 III 类异染色质中的核小体运动。这些结果揭示了在活细胞中，不同染色质类别和核内亚区室的染色质运动受到不同的 Pol II 和 Pol I 依赖性约束。
结果
基于机器学习的 Repli-Histo 标记模式分类
利用我们近期开发的 Repli-Histo 标记方法，我们根据复制时序在活 HeLa 细胞中观察到四类染色质（IA、IB、II 和 III 类）（图 1A-D）^28,29。在此前的研究中，这些 Repli-Histo 标记模式是通过人工方式分类的。为提高分类的客观性、可扩展性和可重复性，我们开发了一种基于机器学习的 Repli-Histo 标记模式分类器（图 1E）。该分类器能够成功区分四类染色质，验证准确率为 90.5%（图 S1B），与一种相关方法的结果一致^40。所得模型还能够成功分类来自独立生物学实验的独立测试数据集，其结果与人工分类一致（图 1F；测试准确率为 86.6%）。该分类器也适用于经药物处理的细胞，从而能够比较不同实验条件下的结果（图 S1C）。下文将 Repli-Histo 标记
结合该分类器进行机器学习辅助的 Repli-Histo 标记。
机器学习辅助的 Repli-Histo 单核小体成像绘制了不同染色质类别中的局部核小体运动
为评估常染色质和异染色质中的核小体运动，我们将机器学习辅助的 Repli-Histo 标记与单核小体成像相结合（图 2A）。使用不同的 HaloTag 配体进行双色 Repli-Histo 标记，可以同时观察 Repli-Histo 标记模式及其对应的单个核小体：使用高浓度 TMR 观察标记模式，而使用极低浓度的 JF646 或 JFX650^41,42 对单个核小体进行稀疏标记。采用倾斜照明显微镜，可以照亮单个细胞核内的薄层光学切片（图 2A）^43,44；我们观察到每种染色质类别中的单个核小体均呈清晰的荧光点，并以每帧 50 ms 的速度记录其运动，共记录 200 帧，总时长为 10 s（图 2B；另见影片 S1–S4）。每个 JF646（或 JFX650）荧光点均显示出单步光漂白现象，证实其代表整合于单个核小体中的单个 H3.2-Halo-JF646（或 JFX650）分子（图 2C）。随后，使用 u-track 软件^45 对单个荧光点进行追踪，以获得核小体运动轨迹（图 2D）。荧光标记的 H3.2-Halo-JF646 荧光点的位置测定精度为 10.9 nm（图 S2A）。
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图 S2。
四类染色质区域中的局部核小体运动。
（A）
JF646 标记核小体的位置测定精度。FA 固定的 HeLa 细胞中，n = 10 个核小体在 XY 平面内相对于质心的核小体位移分布。拟合高斯分布所得的 SDx 和 SDy】【。
功能分别为 10.3 nm 和 10.9 nm。
(B)
图 2E 中 MSD 的双对数图。对这些曲线进行线性拟合，并显示根据拟合直线计算得到的异常指数值。
(C)
角度分布分析示意图。
(D)
（左）不对称系数（AC）示意图。详见方法部分。（右）布朗运动粒子的角度分布［引自文献 46］。
(E)
活 HeLa 细胞中 IA、IB、II 和 III 类核小体的运动角度分布（数据来自图 2E）。底部显示其 AC 值。
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图 2.
机器学习辅助的 Repli-Histo 单核小体成像绘制了不同染色质类别中核小体的局部运动图谱。
(A) 单核小体成像示意图。（左）对 S 期 HeLa 细胞进行 Repli-Histo 标记。（右）在随后的 G2 期，使用斜照明显微成像系统观察经 Repli-Histo 标记的细胞。少量 H3.2-Halo 用 JF646 或 JFX650（洋红色）标记，用于单核小体成像；其余部分则用 TMR（绿色）进行密集标记，以显示标记模式。该面板改编自文献 28，并作了修改。(B) 经 Repli-Histo 双颜色标记的 HeLa 细胞中的 IA、IB、II 和 III 类区域。从上至下依次为：标记模式（密集 TMR）、单核小体（稀疏 JF646）以及单核小体位移热图。(C) 五个代表性核小体（H3.2-Halo-JF646）的单步光漂白。横轴表示光漂白前后的时间。(D) 活 HeLa 细胞中追踪到的 IA 类（红色）、IB 类（橙色）、II 类（绿色）和 III 类（蓝色）染色质内单核小体的代表性轨迹。(E) MSD 曲线（细胞间均值 ± 标准差）
活 HeLa 细胞中 IA 类（红色，n = 52）、IB 类（橙色，n = 17）、II 类（绿色，n = 49）和 III 类（蓝色，n = 31）单个核小体的运动。需要注意的是，染色质标记模式由我们的机器学习流程确定并分类（图 1E-F）。MSD 指数和 AC 值引自图 S2B 和 E。
正如我们先前的研究所报道的，核小体的运动从 IA 类到 III 类逐渐受到更多限制（图 2E）。异染色质类别（II 类和 III 类）中的核小体比常染色质类别（IA 类和 IB 类）中的核小体受到更强的运动限制。MSD 指数 α 也沿着这一染色质类别轴逐渐降低：IA 类为 0.47，IB 类为 0.43，II 类为 0.37，III 类为 0.28（图 S2B）。我们考察了单个核小体运动角度（运动矢量）的分布（图 S2C），并计算了不对称系数（AC）值（图 S2D）46,47。异染色质程度更高的染色质类别中的核小体具有更强的回拉力（即更小的 AC 值；图 S2E）。这些结果与我们先前的发现高度一致28，进一步支持了基于机器学习的染色质类别分类方法的可靠性（图 1E-F）。
THZ1 抑制 RNA Pol II 可增强局部核小体运动
为探究转录如何影响各类别中的染色质行为，我们使用 THZ1 处理细胞。THZ1 是一种 CDK7 的共价抑制剂；CDK7 参与 RNA Pol II（Pol II）CTD 的磷酸化和转录起始48。包括我们自身研究在内的既往研究表明，转录会限制活细胞中的染色质运动5,33–39,49。对 RNA Pol II CTD 丝氨酸 5 磷酸化（Ser5P）进行免疫染色后发现，THZ1 处理可使其显著降低；Ser5P 是一种与转录起始相关的标志物（图 3A-B）。
一致地，THZ1显著抑制了全局RNA合成，这通过5-乙炔基尿苷（EU）掺入量降低得到验证（图3C-D）。与先前的单核小体成像研究结果一致[33]，通过稀疏H3.2-Halo单核小体成像测定发现，THZ1增加了全基因组范围内的核小体运动（图S3A）。
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图S3。
THZ1处理增加HeLa细胞中的局部核小体运动。
(A)
经1 µM THZ1（红色）或DMSO（黑色）处理的HeLa细胞中，平均核小体运动的MSD曲线（±细胞间SD）。每种处理条件下均分析了n = 30个细胞。
(B)
图3E中MSD值的双对数图。对各曲线进行了线性拟合。图中还显示了根据拟合直线计算得到的反常指数值，以及通过运动角度分布分析获得的AC值。
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图3。
RNA聚合酶II抑制增强了不同染色质类别中的局部核小体运动。
(A)
通过免疫荧光检测的活性Pol-II标志物Ser5P水平在RNA聚合酶II抑制剂THZ1处理后显著降低。作为对照，还显示了未经处理细胞和DMSO处理细胞的结果。从上至下依次为：DAPI染色、抗RNA聚合酶II Ser5磷酸化（Pol-II Ser5P）免疫荧光以及Repli-Histo标记。
(B)
未经处理细胞（n = 201个细胞）、DMSO处理细胞（n = 213个细胞）和THZ1处理细胞（n = 184个细胞）中Pol-II Ser5P水平的定量分析。
(C)
THZ1处理后的转录水平还通过将5-EU掺入新生RNA进行了验证。利用点击化学反应，通过Alexa Fluor 488吡啶基叠氮化物检测掺入的5-EU。
(D)
未经处理细胞（n = 134个细胞）、DMSO处理细胞（n = 193个细胞）和THZ1处理细胞（n = 169个细胞）中5-EU荧光强度的定量分析。
(E)
MSD曲线（±细胞间SD），其大小规律为...
IA（DMSO，n = 16；THZ1，n = 12）、IB（DMSO，n = 15；THZ1，n = 15）、II（DMSO，n = 17；THZ1，n = 13）和III（DMSO，n = 7；THZ1，n = 10）中的单个核小体在DMSO（虚线）或THZ1（实线）处理细胞中的MSD，时间范围为0.05至0.5 s。MSD指数和AC值见图S3B。
（F）图（E）中各细胞在0.5 s时的MSD。***：P = 1.0 × 10⁻⁴（IA；DMSO与THZ1比较），P = 5.2 × 10⁻⁵（IB；DMSO与THZ1比较），P = 5.5 × 10⁻⁵（II；DMSO与THZ1比较）。N.S.：P = 0.12（III；DMSO与THZ1比较）。数据采用双侧Kolmogorov-Smirnov检验。
（G）将II类和III类染色质进一步划分为核仁相关区域（核仁）和核周区域（周边），并分别进行分析。
（H）II类染色质中核仁相关和核周相关单个核小体的MSD曲线（细胞间± SD）。***：P = 5.5 × 10⁻⁵（核仁；DMSO与THZ1比较）；N.S.：P = 0.58（周边；DMSO与THZ1比较），采用双侧Kolmogorov-Smirnov检验。
（I）III类染色质中核仁相关和核周相关单个核小体的MSD曲线（细胞间± SD）。**：P = 0.0017（核仁；DMSO与THZ1比较）；N.S.：P = 0.63（周边；DMSO与THZ1比较），采用双侧Kolmogorov-Smirnov检验。
随后，我们用THZ1处理Repli-Histo标记细胞2 h，并进行机器学习辅助的Repli-Histo单核小体成像。在随后的G2期观察四类染色质中的局部核小体运动（图2A；影片S1–S4）。抑制Pol II转录后，IA类和IB类中的局部核小体运动显著增强（图3E–F、S3B；影片S5–S8）。
THZ1对核周和核仁周围异染色质中的核小体运动具有不同影响
有趣的是，THZ1处理显著增强了I类染色质中的核小体运动。
II 类异染色质（图 3E-F）。III 类异染色质中的核小体运动也略有增加，但差异无统计学显著性（图 3E-F）。为更详细地考察这一现象，我们将 II 类和 III 类异染色质划分为核周区域和核仁周围区域（图 3G），并分别分析其中的核小体运动。与既往报道一致，在对照条件下（DMSO），同一染色质类别内不同区域的核小体运动相似（图 3H-I）^28,29。与常染色质不同，THZ1 处理未影响 II 类和 III 类核周异染色质中的局部核小体运动；这些区域大多对应于核纤层相关结构域（LADs）^50（右，图 3H-I）。相反，THZ1 显著增加了核仁周围异染色质中的核小体运动；该区域富集核仁相关结构域（NADs）^51（左，图 3H-I）。这些结果表明，Pol II 抑制对核周和核仁周围异染色质运动的影响不同。
Pol II 转录限制常染色质运动，并有助于维持核仁周围的异染色质
为检验这些结果是否具有普遍性，我们使用另外两种 Pol II 抑制剂 DRB 和 α-鹅膏蕈碱（α-AM）开展了类似实验。DRB 抑制 P-TEFb 复合物中的 CDK9 激酶；该激酶可使 Pol II 最大亚基 RPB1 的 C 末端结构域中的 Ser2 磷酸化^52,53。DRB 还会使延伸中的 Pol II 复合物从染色质上解离^54。α-AM 则通过结合 Pol II 催化活性位点附近的区域，更直接地抑制 Pol II^55，并诱导 RPB1 降解^56。对 RPB1 Ser5P 进行免疫染色显示，DRB 或 α-AM 处理后其信号显著降低（图 4A-B 和图 S4C），证实这些……
抑制剂有效地抑制了 Pol II 转录。
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图 4．
Pol II 转录限制常染色质，并有助于维持核仁周围的异染色质。
(A)
通过免疫荧光检测的活性 Pol II 标志物 Ser5P 水平显著降低。作为对照，还展示了未经处理的细胞（引自图 3A）和经 DMSO 处理的细胞。从上至下依次为：DAPI 染色、抗 RNA 聚合酶 II Ser5 磷酸化（Pol II Ser5P）免疫荧光以及 Repli-Histo 标记。
(B)
未经处理细胞（n = 201 个细胞）、经 DMSO 处理细胞（n = 188 个细胞）和经 DRB 处理细胞（n = 205 个细胞）中 Pol II Ser5P 水平的定量分析。
(C)
通过将 5-EU 掺入新生 RNA，进一步验证了 DRB 处理后的转录水平。通过点击化学反应，使用 Alexa Fluor 488 吡啶基叠氮化物检测所掺入的 5-EU。未经处理的对照组引自图 3C。
(D)
未经处理细胞（n = 134 个细胞）、经 DMSO 处理细胞（n = 173 个细胞）和经 DRB 处理细胞（n = 211 个细胞）中 5-EU 强度的定量分析。
(E)
在经 DMSO（虚线）或 DRB（实线）处理的 HeLa 细胞中，从 0.05 s 至 0.5 s，IA（DMSO，n = 76；DRB，n = 52）、IB（DMSO，n = 55；DRB，n = 44）、II（DMSO，n = 54；DRB，n = 58）和 III（DMSO，n = 22；DRB，n = 17）区域内单个核小体的 MSD 曲线（细胞间 ± SD）。MSD 指数和 AC 值引自图 S4B。
(F)
(E) 中每个细胞在 0.5 s 时的 MSD。较大的菱形表示每个重复实验中的平均值。*：P = 2.5 × 10⁻¹⁶（IA；DMSO 对 DRB），P = 1.5 × 10⁻⁷（IB；DMSO 对 DRB），P = 1.0 × 10⁻¹³（II；DMSO 对 DRB）。：P = 0.0014（III；DMSO 对 DRB）。数据采用双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验。
(G)
核仁相关和核周边相关单个核小体的 MSD 曲线（细胞间 ± SD），位于类别……
II型染色质。***：P = 2.6 × 10^-15（核仁；DMSO与DRB比较），N.S.：P = 0.70（周边区域；DMSO与DRB比较），采用双侧Kolmogorov-Smirnov检验。
(H) III类染色质中与核仁和周边区域相关的单个核小体的MSD曲线（细胞间±SD）。***：P = 1.1 × 10^-5（核仁；DMSO与DRB比较），N.S.：P = 0.075（周边区域；DMSO与DRB比较），采用双侧Kolmogorov-Smirnov检验。
(I) 通过免疫荧光监测，THZ1处理显著降低了HeLa细胞中的H3K27me3水平。（左）代表性图像。从上到下依次为：DAPI染色、抗H3K27me3免疫荧光以及合并图像（青色，DAPI；红色，H3K27me3）。（右）左图中H3K27me3水平的定量结果。
(J) THZ1处理未显著降低H3K9me3水平。（左）代表性图像。从上到下依次为：DAPI染色、抗H3K9me3免疫荧光以及合并图像（青色，DAPI；红色，H3K9me3）。（右）左图中H3K9me3水平的定量结果。
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图S4.
各种RNA Pol II抑制剂通常会增加局部核小体的运动。
(A) 用100 µM DRB处理的HeLa细胞（红色；n = 32）或DMSO处理的HeLa细胞（黑色；n = 29）中，核小体平均运动的MSD曲线（细胞间±SD）。
(B) 图4E中MSD的双对数图。对曲线进行了线性拟合。图中还显示了根据拟合直线计算得到的反常指数值，以及通过运动角度分布分析获得的AC值。
(C)（左）通过免疫荧光监测，Pol II抑制剂α-鹅膏蕈碱（α-AM）显著降低了Pol II Ser5P水平。作为对照，同时展示了经1×PBS处理的细胞。从上到下依次为：DAPI染色、Pol II Ser5P免疫染色以及合并图像。（右）左图中Pol II Ser5P水平的定量结果。
(D)
在 PBS 处理组（虚线）或 α-AM 处理组（实线）细胞中，0.05 至 0.5 s 内 IA 类（PBS，n = 24；α-AM，n = 18）、IB 类（PBS，n = 9；α-AM，n = 13）、II 类（PBS，n = 27；α-AM，n = 31）和 III 类（PBS，n = 7；α-AM，n = 7）单个核小体的 MSD 曲线（± 细胞间 SD）。同时显示 MSD 指数和 AC 值。
(E)
(D) 中各细胞在 0.5 s 时的 MSD。较大的菱形表示各次重复实验的均值。***：P = 2.9 × 10⁻⁴（IA 类；PBS 与 α-AM 比较），P = 3.0 × 10⁻³（IB 类；PBS 与 α-AM 比较），P = 2.8 × 10⁻⁵（II 类；PBS 与 α-AM 比较）。N.S.：P = 0.58（III 类；PBS 与 α-AM 比较）。数据采用双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验。
(F)
II 类染色质中与核仁及核周区域相关的单个核小体的 MSD 曲线（± 细胞间 SD）。***：P = 5.0 × 10⁻⁵（核仁；PBS 与 α-AM 比较）；N.S.：P = 0.26（核周区域；PBS 与 α-AM 比较）。采用双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验。
(G)
III 类染色质中与核仁及核周区域相关的单个核小体的 MSD 曲线（± 细胞间 SD）。N.S.：P = 0.053（核仁；PBS 与 α-AM 比较），P = 0.99（核周区域；PBS 与 α-AM 比较）。采用双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验。
与使用 THZ1 得到的结果一致，DRB 处理显著增强了 IA 类和 IB 类常染色质中的核小体运动（图 4E-F、图 S4A-B）。此外，DRB 处理也增强了 II 类和 III 类异染色质中的核小体运动。为进一步考察这一效应，我们分别分析了 II 类和 III 类染色质中核周区域及核仁周围的核小体运动（图 4G-H）。我们再次发现，DRB 处理仅显著增强了核仁周围异染色质中的核小体运动，而核周区域的异染色质未发生变化。值得注意的是，α-AM 处理也得到了非常相似的结果（图 S4C-G）。
此外，我们
在表达 H3.2-HaloTag 的人 RPE-1 细胞中观察到了一致的结果（图 S5A）^28。THZ1 处理提高了 IA 类和 IB 类常染色质中的核小体运动，也提高了核仁周围 II 类异染色质中的核小体运动；而与核仁相关的 III 类异染色质也呈现相同趋势（图 S5B–D）。Pol II 转录对染色质约束的差异性影响似乎是人细胞中的一种普遍特征。
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图 S5。
THZ1 处理提高 RPE-1 细胞中的局部核小体运动。
(A)
使用抗 HaloTag 抗体（上）和抗组蛋白 H3.1/H3.2 抗体（下）检测 RPE-1 细胞裂解液中组蛋白 H3.2-HaloTag 的 Western blot 结果（泳道 2）。
(B)
DMSO 处理（虚线）或 THZ1 处理（实线）的 RPE-1 细胞中，IA 类（DMSO，n = 23；THZ1，n = 16）、IB 类（DMSO，n = 18；THZ1，n = 14）、II 类（DMSO，n = 22；THZ1，n = 12）和 III 类（DMSO，n = 11；THZ1，n = 16）单个核小体在 0.05 至 0.5 s 内的 MSD 曲线（± 细胞间标准差）。同时显示 MSD 指数和 AC 值。
(C)
RPE-1 细胞 II 类染色质中，与核仁相关及与核周边相关的单个核小体的 MSD 曲线（± 细胞间标准差）。**：双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验，P = 5.8 × 10⁻³（核仁；DMSO 与 THZ1 比较）；N.S.：P = 0.49（核周边；DMSO 与 THZ1 比较）。
(D)
RPE-1 细胞 III 类染色质中，与核仁相关及与核周边相关的单个核小体的 MSD 曲线（± 细胞间标准差）。N.S.：双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验，P = 0.16（核仁；DMSO 与 THZ1 比较）；N.S.：P = 0.96（核周边；DMSO 与 THZ1 比较）。值得注意的是，由于 III 类细胞是在 S 期晚期进行标记的，成像时处于 G2 期的 III 类细胞较少，这可能反映了 RPE-1 细胞的 G2 期相对较短^80。因此，该类别的样本量为
更小。
接下来，我们探究了为何抑制 Pol II 后核仁周围的异染色质运动增加。为深入了解这一问题，我们检测了 THZ1 处理后与异染色质相关的组蛋白标记 H3K9me3 和 H3K27me3。THZ1 显著降低了 H3K27me3 信号，而 H3K9me3 信号基本保持不变（图 4I-J）。H3K27me3 的这种选择性降低表明，抑制 Pol II 会扰动与 H3K27me3 相关的兼性异染色质，包括核仁周围的异染色质，这可能导致这些区域的核小体运动增强。综上，我们的研究结果表明，Pol II 转录限制 IA 类和 IB 类常染色质，同时也参与维持核仁周围的异染色质。抑制 Pol II 转录后，核仁周围的异染色质发生改变，其核小体运动随之增强。
RNA Pol I 转录选择性地限制核仁周围的 III 类异染色质
鉴于我们发现 Pol II 转录不仅影响常染色质，也影响异染色质行为，接下来我们探究 RNA Pol I（Pol I）转录如何影响染色质行为。为此，我们使用 RNA Pol I 抑制剂 CX-5461 处理 Repli-Histo 标记的细胞⁵⁷˒⁵⁸。经验证，CX-5461 处理显著抑制了核仁中的 RNA 合成，表现为 EU 掺入量降低（图 5A-B）。此外，CX-5461 处理后，作为核仁致密纤维组分标记物的纤维蛋白免疫染色信号降低（图 5A、C），提示 CX-5461 扰乱了核仁组织结构。
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图 5.
RNA Pol I 在局部限制核仁相关异染色质，但不影响其他染色质区域。
(A)
RNA Pol I 抑制剂 CX-5461 处理降低新生 RNA】【。
HeLa 细胞核仁内的转录通过点击化学进行 5-EU 标记验证。核仁组织结构的扰动通过抗纤维蛋白免疫荧光验证。从上到下依次为：DAPI 染色、5-EU、抗纤维蛋白免疫荧光、合并图像（蓝色，DAPI；绿色，5-EU；红色，纤维蛋白）。
（B 和 C）
对（A）中 5-EU 和纤维蛋白水平进行定量。
（D）
DMSO（虚线）或 CX-5461（实线）处理细胞中，IA（DMSO，n = 38；CX-5461，n = 35）、IB（DMSO，n = 28；CX-5461，n = 15）、II（DMSO，n = 47；CX-5461，n = 44）和 III（DMSO，n = 12；CX-5461，n = 29）中单个核小体在 0.05 至 0.5 s 内的 MSD 曲线（± 细胞间标准差）。MSD 指数见图 S6A。
（E）
（D）中各细胞在 0.5 s 时的 MSD。大菱形表示各重复实验的均值。N.S.：P = 0.77（IA；DMSO 与 CX-5461 比较），P = 0.59（IB；DMSO 与 CX-5461 比较），P = 0.096（II；DMSO 与 CX-5461 比较）。*：P = 0.048（III；DMSO 与 CX-5461 比较）。数据采用双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验。
（F）
III 类染色质中核仁相关和核周相关单个核小体的 MSD 曲线（± 细胞间标准差）。采用双侧 Kolmogorov-Smirnov 检验：***：P = 4.3 × 10⁻⁵（核仁；DMSO 与 CX-5461 比较）；N.S.：P = 0.71（核周；DMSO 与 CX-5461 比较）。
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图 S6。
CX-5461 处理扰动了与核仁相关的 III 类异染色质组织结构。
（A）
图 5D 曲线中 MSD 的双对数图。对曲线进行线性拟合。图中标出了根据拟合直线计算得到的反常扩散指数。
（B）
CX-5461 处理部分破坏了 III 类异染色质焦点与核仁的关联。图中以代表性的 III 类标记 HeLa 细胞核为例。从左到右依次为：DAPI 染色、Repli-Histo 标记、
抗NPM1免疫荧光（核仁GC组分）及合并图像（洋红色，Repli-Histo标记；绿色，NPM1）。（右）左侧面板中黄色线段上NPM1（绿色）和Repli-Histo标记（洋红色）的强度线扫描曲线。请注意，CX-5461处理后，与核仁相关的Repli-Histo焦点部分由核仁内部移至核仁外部。
(C)
通过二值化图像的重叠（交集系数；详见方法）评估核仁相关的III类区域与NPM1聚集体的共定位。
(D)
定量共定位系数（交集系数）。逐像素计算核仁相关III类像素中与NPM1阳性区域重叠的比例。分析了n = 11个细胞（DMSO）和n = 13个细胞（CX-5461）。黑色横线表示细胞间的均值。***：双侧Mann-Whitney U检验，P = 1.0 × 10⁻⁴。
随后，我们在CX-5461处理2 h后，进行了机器学习辅助的Repli-Histo单核小体成像。与抑制Pol II不同，CX-5461并未显著增加IA、IB或II类中的核小体运动，但使III类染色质的运动略有增加（图5D–E、S6A）。进一步细分III类区域后发现，这一变化主要出现在核仁区域，而核周区域则无显著变化（图5F）。与此一致，CX-5461处理后，III类异染色质焦点与NPM1阳性区域的重叠显著减少（图S6B–D）。这些结果表明，Pol I转录在核仁周围局部限制III类异染色质。
因此，抑制Pol II和Pol I会引起不同的染色质类别及核内亚区室响应：Pol
II抑制会影响常染色质和核仁周围的异染色质，而Pol I抑制则选择性影响核仁周围的III类异染色质。
讨论
本研究开发了机器学习辅助的Repli-Histo标记方法，并将其与单核小体成像相结合，以考察活细胞中不同染色质类别的核小体运动。我们此前的Repli-Histo研究表明，核小体的局部运动从早期复制的常染色质（IA类和IB类）到晚期复制的异染色质（II类和III类）逐渐受到限制
28
,
29
。本研究以基于机器学习的分类器取代人工分类，对Repli-Histo标记模式进行了客观分类（
图1E-F
），并比较了不同扰动条件下的染色质行为。该方法揭示了转录依赖的物理约束在全基因组范围内对核小体运动产生不同影响。Pol II抑制增强了常染色质类别及核仁周围异染色质中的核小体运动，而Pol I抑制则选择性增强了核仁周围III类异染色质中的核小体运动。这些发现拓展了Repli-Histo标记的用途：它不再仅是一种绘制常染色质和异染色质物理性质的方法，也成为剖析染色质类别特异性和核内亚区室特异性调控机制的平台。
Pol II转录如何限制转录活跃区域——IA类和IB类常染色质中的核小体运动？尽管其机制尚不清楚，但有几种可能性。第一种可能是，活跃的Pol II通过松散连接使染色质在整体上得到物理稳定
33
，这与经典的转录工厂模型相符
59
,
60
。近期研究表明，活跃的Pol
II、Mediator及其他转录因子形成动态簇/液滴，这可能是通过相分离或相关过程实现的
61
–
66
。这些转录凝聚体被认为能够与转录中的染色质区域结合并对其施加物理约束，从而支持高效转录及转录调控。事实上，BRD4-NUT转录凝聚体通过乙酰化组蛋白限制了邻近核小体的运动
67
。另一项理论研究提出，转录RNA聚合酶II产生的主动机械力可通过富含基因的染色质发生瞬时有序化来抑制染色质运动
68
。最后，转录产生的RNA分子本身也可能有助于限制染色质。核RNA是带负电荷的长链聚合物，并可与RNA结合蛋白共同形成富含RNA的网状结构或凝胶样结构，从而影响染色质构象
69
。这类依赖RNA的核内结构可能有助于形成转录依赖性的染色质运动约束。
我们还发现，Pol II转录有助于维持核仁周围的异染色质，但不能维持核周边的异染色质。值得注意的是，THZ1、DRB和α-AM这三种药物在Pol II转录机制中的主要作用靶点各不相同，分别为CDK7、CDK9和Pol II催化亚基，但它们产生了相似的反应，从而验证了我们的结果。因此，晚复制异染色质在物理性质上并非均一：核周边异染色质与LAD相关，可能受到依赖核纤层的系留作用以及富含H3K9me3的组成型异染色质机制的约束。相比之下，核仁周围的异染色质富含NAD，并嵌入核仁/核仁周围环境中。在我们的实验中，THZ1
H3K27me3信号降低，而H3K9me3信号基本保持不变。这表明，Pol II抑制优先扰乱与H3K27me3相关的兼性异染色质，包括核仁周围的兼性异染色质，而不是在全局范围内破坏富含H3K9me3的异染色质。因此，Pol II抑制后核仁周围核小体运动增加，可能反映了与核仁/核仁周围组织相关的兼性异染色质所受到的物理约束减弱。事实上，核仁中的Pol II本身可能参与核仁组织结构的维持
70
。
Pol I抑制产生了不同于Pol II抑制的响应。Pol I抑制剂CX-5461抑制了核糖体RNA（rRNA）的合成
57
，并扰乱了NPM1阳性核仁的组织结构
58
,
71
，但并未显著增加IA类、IB类和II类中的核小体运动。相反，其影响主要表现于核仁周围的III类异染色质。由于由Pol I转录的rRNA能够维持核仁组织结构，rRNA可能限制与核仁相关的晚复制III类异染色质。Pol I抑制会诱导纤维中心（FC）组分凝聚并分离至周边，形成球形的“核仁帽”
58
；而Pol II抑制则促使FC组分去凝聚，形成丝状的“核仁项链”
72
。事实上，我们观察到，CX-5461处理后，核仁周围的III类异染色质部分从NPM1阳性小体中解离；该小体代表核仁最外层的颗粒组分（图S6B-D），进一步支持了由rRNA依赖性核仁组织结构介导的物理约束。
总之，机器学习辅助的Repli-Histo标记揭示，转录依赖性的染色质约束存在差异。
活细胞中的染色质类别和细胞核亚区室之间。需要强调的是，所有扰动均在 Repli-Histo 标记之后进行，因此，在实施扰动之前，常染色质/异染色质标记已经建立，从而确保了不同条件之间能够进行可靠比较。我们得出结论：Pol II 转录约束常染色质，并有助于维持核仁周围的异染色质；而 Pol I 转录则局部约束核仁周围的 III 类异染色质。这些发现支持这样一种模型：染色质行为不仅受到常染色质/异染色质属性的调控，还受到转录系统和细胞核亚区室环境的调控。因此，Repli-Histo 标记为解析基因组功能如何与活细胞中染色质的物理行为相耦联提供了一个有力框架。
方法
细胞系
表达带有 HaloTag 标签的内源性人 H3.2 的 HeLaS3⁷³ 和 RPE-1（CRL-4000；ATCC）细胞按照先前所述方法²⁸建立，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下，于补充了 10% 胎牛血清（F7524；Sigma-Aldrich）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）（D5796-500ML；Sigma-Aldrich）中培养。
Repli-Histo 标记
复制依赖性组蛋白标记（Repli-Histo 标记）按照先前所述方法²⁸进行。首先，将表达内源性 H3.2-HaloTag 的非同步细胞置于补充了 10 µM 7-溴-1-庚醇（7BRO，B1852；Tokyo Chemical Industry）⁷⁴的培养基中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 60 min。随后，用不含 7BRO 的培养基洗涤细胞 3 次。洗去 7BRO 后，立即将细胞置于补充了 100 nM HaloTag TMR 配体的培养基中孵育 30 min。随后，细胞被洗涤三
用 1× HBSS 洗涤数次后，用 10 µM 7BRO 处理 30 min，以封闭任何残留的未反应 HaloTag 位点。随后，按照下述方法用化学抑制剂处理细胞。最后，用 1.85% 甲醛（064–00406；Wako）固定细胞 15 min，用 0.5% Triton X-100（T-9284；Sigma-Aldrich）透化处理 5 min，并用 0.5 µg/mL DAPI（10236276001；Roche）染色 5 min，随后将细胞包埋于 PPDI 中［20 mM HEPES（pH 7.4）、1 mM MgCl₂、100 mM KCl、78% 甘油和 1 mg/mL 对苯二胺（PPDI，695106-1G；Sigma-Aldrich）］。
化学处理
为抑制转录，按照上述方法进行 Repli-Histo 标记的细胞分别用转录抑制剂处理：100 μM 5,6-二氯苯并咪唑-1-β-D-核糖呋喃苷（DRB）（D1916-10MG；Sigma-Aldrich）处理 2 h，100 μg/mL α-鹅膏蕈碱（α-AM；010-22961；Fujifilm Wako）处理 2 h，以及 1 μM THZ1⁴⁸（CS-3168；ChemScene）处理 2 h。为抑制 RNA 聚合酶 I，细胞用 1 μM CX-5461（CS-0568；ChemScene）处理 2 h。
基于机器学习的图像分类
为表征所标记区域的复制时序，根据既往研究³¹，将 Repli-Histo 标记所呈现的模式（历史上称为复制灶）分为四类（IA、IB、II 和 III）。
为将 Repli-Histo 标记模式自动分类为四类（IA、IB、II 和 III），我们开发了一个基于 ResNet18 架构⁷⁵的深度学习流程。该流程由三个主要部分组成：数据处理、图像预处理和模型架构（图 1E）。首先，按照上述方法对处于异步状态的 HeLa 细胞进行 Repli-Histo 标记，并收集 381 张细胞核图像用于模型开发。数据集被划分为训练集（265 张图像，占 70%）和验证集（116 马会）
图像子集（30%）。数据使用 PyTorch 的 DataLoader 按每批 32 个样本进行处理。图像预处理采用 torchvision transforms。图像被转换为 8 位灰度图像（输出通道数 = 1），并调整至 224 × 224 像素。每张图像的像素值被重新缩放至 0–255。训练数据增强包括随机水平翻转、随机旋转（±10 度）以及随机调整尺寸裁剪（缩放因子为 0.8–1.0）。处理后的图像被转换为张量，并使用均值和标准差均为 0.5 的参数进行归一化。模型基于预训练的 ResNet18 架构，并作了相应修改。第一层卷积层调整为适用于单通道灰度输入（7 × 7 卷积核、64 个输出通道、步幅 = 2、填充 = 3）。网络包含 dropout（P = 0.7）、批量归一化层，以及修改后的最终全连接层，用于输出四个类别。训练使用 Adam 优化器⁷⁶，学习率为 0.0001，采用交叉熵损失函数，训练 50 个周期。使用验证子集对训练后的模型进行验证（验证准确率：90.5%）。最后，将该模型应用于来自独立生物学实验的测试数据集（149 个细胞；测试准确率：86.6%）。我们确认，模型预测的标注模式与人工分类结果一致（图 1F）。
Western 印迹
细胞在 Laemmli 上样缓冲液⁷⁷中裂解，该缓冲液补充了 10% 2-巯基乙醇（133-1457；Wako）；随后于 95 °C 孵育 5 min，使蛋白质变性。取相当于每孔 1 × 10⁵ 个细胞的细胞裂解液进行 SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（检测组蛋白时使用 12.5% 的凝胶）。进行 Western 印迹时，将凝胶中分离的蛋白质转移至一块…
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（IPVH00010；Millipore）通过半干式转膜仪（BE-320；BIO CRAFT）进行转膜。用5%脱脂奶粉（190-12865；Fujifilm Wako）封闭后，采用小鼠抗H3.1/H3.2抗体（1:1000；CEC-006；Cosmo Bio）或小鼠抗HaloTag抗体（G9281；Promega，1:1,000）对膜结合蛋白进行检测，随后使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG抗体（170-6516；Bio-Rad，1:5,000）进行孵育。通过化学发光反应（WBKLS0100；Millipore）检测条带，并使用EZ-Capture MG（AE-9300H-CSP；ATTO）采集图像。
间接免疫荧光
免疫染色按照此前所述方法进行
78
，所有步骤均在室温下完成。细胞用PBS中的1.85% FA固定15 min，随后在HMK［20 mM HEPES（pH 7.5）、1 mM MgCl
2
和100 mM KCl］中用50 mM甘氨酸处理5 min，再用HMK中的0.5% Triton X-100透化5 min。用HMK清洗两次，每次5 min后，细胞在HMK中的10%正常山羊血清（NGS，143-06561；Wako）中孵育30 min。细胞在HMK中1% NGS配制的稀释一抗中孵育1 h，一抗包括小鼠抗RNAPII磷酸化Ser5抗体（由H. Kimura教授提供，1:1000）、小鼠抗H3K27me3抗体（由H. Kimura教授提供，1:1000）、抗fibrillarin抗体（ab4566；Abcam，1:500）和抗NPM1抗体（B0556；Sigma，1:1000）。为检测H3K9me3，细胞在Can Get Signal
®
免疫染色免疫反应增强液（NKB601；TOYOBO）中用小鼠抗H3K9me3抗体（由H. Kimura教授提供，1:1000）进行孵育，以提高免疫反应的特异性。用HMK清洗四次后，细胞与稀释的二抗孵育，二抗为山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488（1:500，A-11006；Thermo Fisher Scientific），或山羊抗小鼠IgG
在HMK中的1% NGS（或Enhancer Solution）中加入Alexa Fluor 647（1:500，A-21235；Thermo Fisher Scientific）孵育1 h，随后用HMK洗涤4次。对于固定细胞中的DNA染色，将0.5 μg/mL DAPI加入细胞中孵育5 min，随后用HMK洗涤。染色后的细胞封固于PPDI中。
EU标记与检测
EU掺入实验采用Click-iT RNA Alexa Fluor 488 Imaging Kit（C10329；Thermo Fisher Scientific），并结合Alexa Fluor 488 picolyl azide（C10637；Thermo Fisher Scientific）进行。化学处理期间，将细胞与500 μM EU孵育1 h。随后用1.85% FA固定细胞15 min，并用0.5% Triton X-100透化5 min。按照制造商说明，通过点击反应对掺入的EU进行标记，随后使用Click-iT反应洗涤缓冲液（C10329；Thermo Fisher Scientific）进行淬灭。最后，细胞用0.5 μg/mL DAPI染色5 min，并封固于PPDI中。
固定样品的荧光显微镜观察
使用配备Olympus UPLXAPO 60×物镜（NA 1.42）的Delta Vision Ultra（GE Healthcare）采集固定细胞的图像堆栈。采集厚度为0.2 µm的光学切片。在校正色差后，提取每个细胞核中部附近聚焦最佳的光学切片。图像分析使用Fiji/ImageJ完成。
为定量Repli-Histo标记的核内信号强度，使用Fiji/ImageJ基于Huang模糊阈值法对DAPI染色的细胞核区域进行分割，并测量DAPI及其他所有通道的细胞核总像素强度（任意单位，arb. unit）和细胞核平均强度（任意单位，arb. unit）。每项实验的样本数见相应图注。
单核小体显微成像
进行单核小体成像时，将已建立的细胞系培养于经聚-L-赖氨酸（P1524-500MG；Sigma-Aldrich）包被的玻底培养皿（3970-035；Iwaki）中。在37 °C、5% CO₂条件下，用40 pM HaloTag TMR配体对H3.2-Halo分子进行荧光标记，持续20 min。用Hank’s平衡盐溶液（1× HBSS，H1387；Sigma-Aldrich）洗涤细胞三次，随后在不含酚红的DMEM（21063–029；Thermo Fisher Scientific）中孵育2 h以上，再进行活细胞成像。
进行Repli-Histo标记时，首先按照上述方法用10 µM 7BRO处理异步细胞。随后用不含7BRO的培养基洗涤细胞三次，再用2 nM HaloTag TMR配体与300 pM HaloTag JFX650配体（或5 nM HaloTag JF646配体）的混合物进行30 min脉冲标记。用培养基洗涤三次后，再次用10 µM 7BRO处理细胞30 min，以封闭所有剩余的未反应HaloTag位点。最后，经化学抑制剂处理后，对细胞进行活细胞成像。
单核小体成像按照先前报道的方法进行²⁸。使用活细胞培养腔和数字气体混合器（STXG-WSKMX-SET；Tokai Hit），在显微镜下维持细胞培养条件（37 °C、5% CO₂及湿度）。使用倒置Nikon Eclipse Ti2显微镜、配备100 mW 561 nm和140 mW 637 nm激光系统的ILE 400激光合束器（Andor），以及sCMOS ORCA-Fusion BT相机（C15440-20UP，Hamamatsu Photonics）观察单核小体。通过物镜（100× PlanApo TIRF，NA 1.49；Nikon），使用561/637 nm激光激发活细胞中经荧光标记的组蛋白，并分别在582–626/676–786 nm波段进行检测。配备TIRF单元的斜照明系统
（Nikon）用于激发细胞核内局部薄层区域中的标记组蛋白分子，并降低背景噪声。在连续照明条件下，使用 NIS Elements 软件（AR v5.30.03 64 位，Nikon）以每帧 50 ms 的速度连续采集图像。
为确定单核小体光点的定位精度，我们对化学固定的细胞进行了单核小体成像。将生长在聚-L-赖氨酸包被的玻底培养皿中的荧光标记细胞，用溶于 1×PBS 的 2% 甲醛于 37 °C 固定 15 min，随后用 1×PBS 洗涤三次。之后按上述方法进行单核小体成像。
单核小体追踪分析
图像处理、单分子追踪和单核小体运动分析的方法已在此前报道⁵。使用 Fiji/ImageJ，通过滚动球背景扣除法（滚动球半径：50 像素）扣除所采集的连续 TIFF 图像中的背景噪声信号。手动提取图像中的细胞核区域。随后，将每幅图像中受衍射极限限制的荧光光点拟合为高斯函数，以获得其分布中心，并使用 u-track（MATLAB 软件包⁴⁵）追踪其运动轨迹。为确定甲醛（FA）固定细胞中 H3.2-HaloTag 核小体的定位精度，将核小体相对于其轨迹质心在 x 和 y 方向上的位移分布（n = 10 个分子）拟合为高斯函数。各次实验计算得到的定位精度见图 S2A。
在单核小体运动分析中，使用 Python 根据荧光光点的运动轨迹计算其位移和均方位移（MSD）
脚本。最初计算得到的均方位移（MSD）为二维值。为获得三维值，将二维值乘以1.5（即由4Dt转换为6Dt）。将计算得到的MSD拟合至亚扩散模型MSD(t) = 6D·t^α，其中α为反常扩散指数（0 < α < 1）。使用Python对单核小体MSD进行统计分析。
II/III类染色质区域的分割
为提取与S期晚期复制焦点共定位的单核小体轨迹（图3G），我们按照先前描述的方法²⁸对S期晚期复制的染色质区域进行分割。首先，使用ImageJ的带通滤波功能处理经10帧（0.5 s）平均的TMR图像，将大结构滤除阈值设为30像素，小结构滤除阈值设为5像素。随后，使用Otsu法对滤波后的图像进行二值化。将膨胀2像素后的二值掩膜定义为S期晚期复制焦点区域。按照先前描述的方法²⁸˒⁶⁷，根据轨迹的质心（即xy坐标的时间平均值），提取位于焦点区域内的已检测单核小体斑点。分类后的轨迹用于后续分析。
III类染色质与核仁的共定位
我们通过针对NPM1的免疫荧光染色，评估III类染色质与核仁的关联；NPM1是核仁最外层区室（颗粒组分）的标志物。为提取NPM1区域，我们首先使用ImageJ的顶帽滤波器（半径 = 20像素）处理原始图像，随后使用高斯模糊滤波器（σ = 1.5像素）进行降噪。采用最大熵法对滤波后的图像进行二值化，然后腐蚀2像素，以抵消高斯模糊滤波器引起的区域扩张。所得二值区域（包括孔洞）被
定义为 NPM1 阳性核仁。III 类染色质采用 Repli-Histo 标记法进行标记。采集的图像使用 ImageJ 带通滤波器进行处理，其中大结构滤除阈值设为 12 像素，小结构滤除阈值设为 1.8 像素。随后，采用 Otsu 法对滤波后的图像进行二值化。所得二值掩膜定义为 III 类染色质区域。
为考察 III 类区域与 NPM1 小体的共定位情况，我们合并了二者的二值化图像，并逐像素计算核质中 III 类像素与 NPM1 阳性区域重叠的比例。交集系数计算为重叠像素数除以核质中 III 类像素总数。该分析使用 Python 的 Scikit-image 库完成［https://scikit-image.org/docs/0.25.x/auto_examples/applications/plot_co…］。
角度分布分析
角度分布分析按照文献 46 所述方法进行。对于在 xy 平面上追踪获得的单个核小体的连续点集 \(\{(x_0,y_0),(x_1,y_1),\cdots,(x_n,y_n),\cdots\}\)，我们将数据转换为一组位移向量，\(\Delta \mathbf{r}_n=(x_{n+1}-x_n,\ y_{n+1}-y_n)^{\mathrm{t}}\)。随后，计算两个向量 \(\Delta \mathbf{r}_n\) 与 \(\Delta \mathbf{r}_{n+1}\) 之间的夹角。我们对实验中每条轨迹的所有点均进行了上述处理。使用我们编写的 Python 程序⁷⁹绘制归一化极坐标直方图。角度分布按 \(2\pi\) 进行归一化，其数值对应于概率密度。
经费资助
本研究获得了日本学术振兴会（JSPS）及日本文部科学省（MEXT）科学研究费补助金（KAKENHI；JP22H04925（PAGS）、JP24H00061 和 JP25K24664），以及武田科学振兴财团的资助。
资助 K. Maeshima。K. Minami 曾为 SOKENDAI 特别研究员（JST SPRING JPMJSP2104）和 JSPS 特别研究员（JP23KJ0998）。K.N. 为 JSPS 特别研究员（JP26KJ1223）。K. Minami 获得 JSPS 海外研究奖学金和山田科学振兴财团的资助。
作者贡献
K. Minami 和 K. Maeshima 设计了本研究。K. Minami 和 K. N. 开展了实验，包括细胞构建、成像和分析。S.S.A.、K. Minami 和 K.N. 开发了用于 Repli-Histo 标记的机器学习方法。S.T. 和 K. Maeshima 完成了部分生化实验并绘制了部分示意图。K. Minami 和 K. Maeshima 撰写了稿件，所有作者均提供了意见。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
数据与材料可用性
评估本文结论所需的全部数据均包含在本文和/或补充材料中。轨迹分类和角度分布分析脚本可通过以下链接获取：
https://zenodo.org/records/12672197
。机器学习脚本可通过以下链接获取：
https://doi.org/10.5281/zenodo.21186176
。
补充视频图注
视频 S1。
经 0.02% DMSO 处理、具有 IA 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 IA 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的 JFX650 标记单个核小体的视频（50 毫秒/帧）。图像使用 sCMOS ORCA-Fusion BT（滨松光子学）采集。请注意，清晰且彼此充分分离的 JFX650 光点呈现单步光漂白特征（图 2C），表明每个光点代表单个核小体中的一个 H3.2-Halo-JFX650 分子。比例尺：5 µm。
视频 S2。
经 0.02% DMSO 处理、具有 IB 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 IB 类 Repli-Histo 标记模式
标记。（右）相应的 JFX650 标记单核小体的动态影像（50 ms/帧）。比例尺：5 µm。
视频 S3。
经 0.02% DMSO 处理、具有 II 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 II 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的 JFX650 标记单核小体的动态影像（50 ms/帧）。比例尺：5 µm。
视频 S4。
经 0.02% DMSO 处理、具有 III 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 III 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的 JFX650 标记单核小体的动态影像（50 ms/帧）。快速扩散的光点为游离的 H3.2-Halo，我们仅关注稳定整合到核小体中的 H3.2-Halo 的行为。比例尺：5 µm。
视频 S5。
经 1 µM THZ1 处理、具有 IA 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 IA 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的 JFX650 标记单核小体的动态影像（50 ms/帧）。比例尺：5 µm。
视频 S6。
经 1 µM THZ1 处理、具有 IB 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 IB 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的 JFX650 标记单核小体的动态影像（50 ms/帧）。比例尺：5 µm。
视频 S7。
经 1 µM THZ1 处理、具有 II 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 II 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的 JFX650 标记单核小体的动态影像（50 ms/帧）。比例尺：5 µm。
视频 S8。
经 1 µM THZ1 处理、具有 III 类 Repli-Histo 标记的 HeLa 细胞。（左）采用密集 TMR 标记显示的 III 类 Repli-Histo 标记模式。（右）相应的单个
用JFX650标记的核小体。快速扩散的亮点为游离的H3.2-Halo，我们仅关注稳定整合于核小体中的H3.2-Halo的行为。比例尺：5 µm。
致谢
我们衷心感谢K. M. Marshall博士对本稿的审阅与指正。感谢J. Hernandez先生提供初步结果，感谢S. Ide博士提供技术协助。感谢H. Kimura博士提供H3K9me3、H3K27me3及RNA Pol II抗体。最后，感谢Maeshima实验室全体成员提出的宝贵讨论意见和持续支持。
已声明的资助方信息
日本学术振兴会
，JP22H04925（PAGS）
，JP24H00061
，JP25K24664
，JP23KJ0998
，JP26KJ1223
，JSPS海外研究奖学金
日本科学技术振兴机构
，JPMJSP2104
山田科学振兴财团，
武田科学振兴财团，
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美国马萨诸塞州剑桥市哈佛大学分子与细胞生物学系，邮编02138。
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揭示活细胞中染色质运动受转录依赖性约束的显著差异
Katsuhiko
Minami
，Kako
Nakazato
，Sachiko
Tamura
，S. S.
Ashwin
，Kazuhiro
Maeshima
bioRxiv
2026.07.05.736477；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.05.736477
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Katsuhiko
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Ashwin
，Kazuhiro
Maeshima
bioRxiv
2026.07.05.736477；
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https://doi.org/10.64898/2026.07.05.736477
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