可光切换的光遗传G蛋白偶联受体实现对Gs和阻遏蛋白信号传导的可逆控制|北京沫之东生物技术有限公司

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摘要

OptoGPCR是可被光激活的G蛋白偶联受体（GPCR），用于对生理过程进行光遗传学调控。现有的大多数optoGPCR基于单稳态视蛋白构建，受到光漂白和不可逆性的限制。携带单点突变S199F的双稳态跳蛛视紫红质1（JSR1）在活性态与非活性态之间形成了约150 nm的光谱间隔，从而能够利用不同波长的光实现双向调控。在此，我们表明，JSR1-S199F具有强效且可被光逆转的抑制蛋白募集能力及Gq/i蛋白活性。随后，我们基于JSR1-S199F构建了具有Gs蛋白活性的optoGPCR，拓展了目前种类有限的双稳态Gs偶联视蛋白工具库。具体而言，我们开发了optoDRD1，这是一种嵌合型optoGPCR，可将JSR1天然的Gq/i蛋白活性重定向至多巴胺D1受体（DRD1）的Gs信号通路。通过系统筛选胞内结构域组合，我们确定了一种最佳嵌合构型，其包含来自DRD1的第二胞内环（ICL2）、第三胞内环（ICL3）、第8螺旋和C端。所得optoGPCR可在生理相关光强下被紫光（λmax = 397 nm）激活，并被绿光（λmax = 531 nm）失活。单次紫光脉冲即可驱动持续数小时的Gs信号传导，而绿光诱导的失活则可在任意时间点精确终止信号。OptoDRD1高度模拟了野生型DRD1的信号传导动力学和G蛋白选择性。与此前唯一经过表征的天然Gs偶联视蛋白JellyOp相比，optoDRD1在多个光照循环中表现出更高的信号幅度和可逆性。我们进一步证明了optoDRD1可用于在体外对Gs调控的过程进行光遗传学控制，包括胰岛素分泌，发生于人β细胞以及神经元细胞系中的信号传导调控，支持其在体内应用的潜力。JSR1的生化稳定性及其已知结构使其成为开展此类理性工程改造和未来生物物理表征的可靠骨架。总体而言，optoDRD1和JSR1-S199F扩展了optoGPCR工具库，为剖析多巴胺能信号传导、Gs介导的生理过程以及GPCR信号传导药理学开辟了新的机遇。

生物节律中心，神经科学部，生物科学学院，生物、医学与健康学院，曼彻斯特大学，M13 9PL，

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Polina Isaikina

PSI 生命科学中心，菲利根 PSI 5232，

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Xavier Deupi

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凝聚态物质理论组，PSI 科学计算、理论与数据中心，菲利根 PSI 5232，

瑞士

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瑞士

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Robert J. Lucas

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Gebhard F. X. Schertler

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摘要

光控 GPCR 是可被光激活的 G 蛋白偶联受体（GPCR），用于对生理过程进行光遗传学控制。现有的大多数光控 GPCR 均基于单稳态视蛋白，因此受到光漂白和不可逆性的限制。双稳态跳蛛视紫红质 1（JSR1）携带单点突变 S199F，在活化态和非活化态之间引入了约 150 nm 的光谱分离，从而能够利用不同波长的光实现双向调控。在本研究中，我们发现，JSR1-S199F 能够实现稳定且可逆的光控 arrestin 招募以及 Gq/i 蛋白活性调节。随后，我们以 JSR1-S199F 为基础构建了具有 Gs 蛋白活性的光控 GPCR，拓展了双稳态 Gs 偶联视蛋白这一有限的工具类别。具体而言，我们构建了 optoDRD1，这是一种嵌合光控 GPCR，可将 JSR1 的天然 Gq/i 蛋白活性重新导向多巴胺 D1 受体（DRD1）的 Gs 信号通路。通过对胞内结构域组合进行系统筛选，我们确定了一种最佳嵌合构型，其中包括来自 DRD1 的 ICL2、ICL3、螺旋 8 以及 C 端。所得光控 GPCR 可在具有生理学意义的光强下被紫光（λ_max = 397 nm）激活，并被绿光（λ_max = 531 nm）失活。单次紫光脉冲可驱动持续的 Gs 信号传导，持续时间达数】【。

数小时，而绿光失活则能够在任意时间点实现精确的信号终止。optoDRD1 高度模拟野生型 DRD1 的信号动力学和 G 蛋白选择性。与 JellyOp（此前唯一经过表征的天然 Gs 偶联视紫红质）相比，optoDRD1 在多个光照循环中表现出更高的信号幅度和更强的可逆性。我们进一步证明了 optoDRD1 在体外对 Gs 调控过程进行光遗传学控制的实用性，包括调控人 β 细胞的胰岛素分泌以及神经元细胞系中的信号传导，支持其在体内应用的潜力。JSR1 的生化稳定性及其已知结构，使其成为开展这种理性工程改造以及未来生物物理学表征的稳健支架。optoDRD1 和 JSR1-S199F 拓展了光控 GPCR 工具箱，并为解析多巴胺能信号传导、Gs 介导的生理过程以及 GPCR 信号药理学开辟了新的机遇。

引言

光遗传学是一项通过结合遗传学与光学方法，实现对细胞活动进行精确时空控制的技术。该领域主要依赖微生物来源的光敏离子通道（称为 I 型视紫红质），例如藻类通道视紫红质，来控制膜电位并调节神经元活动

。相比之下，动物视紫红质（也称为 II 型视紫红质）属于庞大且多样的 G 蛋白偶联受体（GPCR）家族。GPCR 由于在细胞信号传导中发挥关键介质作用，是生物医学研究的基石。它们通常响应神经递质和激素等细胞外刺激，并且是规模最大的药物靶标家族之一

。GPCR 的激活通常会导致异源三聚体 G 蛋白的激活。这些 G 蛋白可以是

根据α亚基的性质，可将其分为四个家族：Gs、Gi/o/t、Gq/11和G12/13。每一类都能够直接改变效应酶的活性，或通过cAMP、钙等第二信使发挥作用。因此，动物视蛋白是对光敏感的GPCR，能够调节多种细胞信号级联反应，进而影响基因表达和细胞命运，这使其成为开发下一代光遗传学工具的理想候选分子。

视蛋白通过质子化席夫碱键与赖氨酸K^7.43共价结合，从而结合视黄醛发色团的11-顺式异构体（上标表示GPCRdb残基编号方案^4）。吸收光子后，11-顺式视黄醛异构化为全反式异构体。在视觉视紫红质等单稳态视蛋白中，异构化会导致席夫碱键水解，随后视黄醛释放。因此，单稳态视蛋白必须重新装载11-顺式视黄醛才能恢复光敏性，这限制了其在体内光遗传学应用中的使用。相比之下，双稳态视蛋白主要包括无脊椎动物视蛋白以及少数非视觉型脊椎动物视蛋白，它们不会释放异构化后的全反式视黄醛。相反，它们能够吸收另一个光子，使其重新异构化为11-顺式视黄醛。因此，双稳态视蛋白是天然的分子光开关，可通过吸收特定波长的光，在非活化态和活化态之间交替转换。来自不同生物的双稳态视蛋白已被用于开发光遗传学工具^5–11。双稳态跳蛛视紫红质1（JSR1）来源于Hasarius adansoni，表现出尤为良好的应用前景，因为生化研究表明，它具有极高的稳定性、良好的表达水平，并且能够高效再生视黄醛^12,13。在野生型受体中，非活化态（11-顺式…

视黄醛）与活性光产物（全反式视黄醛）的吸收光谱发生重叠（λ_max = 535 nm）。然而，位于细胞外环2上的S199F（S^45.49^F）突变可使两条光谱完全分离：非活性状态的λ_max约为380 nm，而活性状态的λ_max约为535 nm^14。因此，JSR1-S199F可通过紫光和绿光实现可靠的开启与关闭，从而对其活性进行精确的光学控制^15。

许多光遗传学应用需要调节视蛋白的内在特性，例如颜色调谐或G蛋白信号传导选择性。这些改造可产生具有定制化信号传导特征的工程化光敏G蛋白偶联受体（optoGPCRs）^6,15,16。改变G蛋白选择性最广泛采用的方法是构建嵌合型光敏G蛋白偶联受体。这类嵌合受体以动物视蛋白作为光敏核心，并将另一种G蛋白偶联受体的胞内结构域移植其中，因为胞内表面对于选择性识别G蛋白至关重要。早期的开创性研究采用了单稳态牛视紫红质与人β_2肾上腺素能受体（β2AR）^16。随后，研究人员结合已有的结构信息，改进了光敏G蛋白偶联受体的设计^17。首个双稳态嵌合型光敏G蛋白偶联受体将人黑视蛋白与谷氨酸受体mGluR6结合起来^18。

目前大多数可用的光敏G蛋白偶联受体工具可激活Gi或Gq蛋白。JSR1也不例外，可通过人Gq和Gi介导信号传导^19。相比之下，与Gs偶联的视蛋白较为罕见^20–22，目前尚无双稳态光敏G蛋白偶联受体工具能够对Gs的激活实现精确且可逆的时间控制。鉴于Gs通路调节多种生理功能，例如运动活动、认知与学习^23、心血管调控^24以及血糖调节^25，拓展Gs偶联型光敏G蛋白偶联受体的种类

这代表着拓展光遗传学工具功能性应用范围的重要一步。

在此，我们报告了JSR1及其S199F突变体的细胞信号传导数据、G蛋白选择性以及arrestin募集特性。此外，我们还描述了optoDRD1，这是一种嵌合型光控GPCR，通过将JSR1-S199F的光敏核心与人多巴胺D1受体（DRD1）的胞内结构域相结合而构建。DRD1是一种在纹状体神经元中大量表达的、与Gs偶联的受体

。我们发现，optoDRD1表现出与野生型DRD1受体相似的信号传导特征和响应动力学。它能够在HEK293T细胞和Neuro-2a细胞中实现Gs信号传导的光依赖性激活（385 nm）和失活（540 nm）。因此，optoDRD1为通过设计药物专一性激活的Gs偶联设计型受体（DREADDs）

提供了一种替代方案，使研究者能够利用光作为触发因素，对cAMP介导的信号传导进行精确的时空控制。

结果

JSR1野生型（WT）和JSR1-S199F突变体的光谱及信号传导特性表征

JSR1是一种双稳态视紫红质，也是我们设计光控GPCR时所采用的工程化支架。

图1a

展示了我们的设计策略：利用JSR1-S199F颜色调谐单点突变的光开关机制

，并通过嫁接人源Gs偶联受体的胞内结构域，将其信号传导特性由Gq/Gi改变为Gs。在实验中，我们使用了9-

顺式

-视黄醛；与天然的11-

顺式

-视黄醛异构体相比，9-

顺式

-视黄醛具有更高的化学稳定性且更易获得

。对于JSR1-WT

、

和JSR1-S199F，使用9-

顺式

-视黄醛均会使暗态的吸收峰发生约15–30 nm的蓝移。采用绿光使其失活后，这种蓝移消失

（

图1b

）

，这表明

全反式视黄醛的光异构化优先再生11-顺式异构体，而非9-顺式异构体，这与先前关于JSR1-S199F^14和JSR1-WT^12的报道一致。经纯化并以9-顺式视黄醛重构的JSR1-S199F，其基态（λ_max = 365 nm）与活性光产物（λ_max = 540 nm，图1b）呈现出明显的光谱分离。随后使用绿光照射，吸收峰最大值移回至新的基态，且该状态主要含有11-顺式视黄醛（λ_max = 385 nm），与上述异构化过程一致。因此，JSR1-S199F可通过不同波长的光反复、可逆地激活（385 nm）和失活（525 nm）。

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图1.

基于JSR1-S199F突变体和人源Gs受体的光控GPCR嵌合体设计，以及嵌合体生成前JSR1-S199F突变体的天然紫外-可见吸收和信号传导特性

工程设计策略示意图。目标是构建一种能够双向调控活性的Gs信号传导型光控GPCR。嵌合型光控GPCR的数据将在后续图中展示。

以9-顺式视黄醛重构的纯化JSR1-S199F的紫外-可见光谱。暗态显示λ_max = 365 nm（黑线）。使用紫光（385 nm，约10^16 photons cm^-2）照射后，发色团的吸收峰部分移至λ_max = 540 nm（紫色），同时在365 nm处仍保留部分吸收；随后使用绿光（525 nm，约10^16 photons cm^-2）照射，吸收峰移回失活态的吸收峰λ_max = 385 nm（绿色）。

在BRET G蛋白激活实验中JSR1-S199F的信号传导特征，显示在使用385 nm（10^15.5 photons cm^-2）、525 nm（10^15.5 photons cm^-2）的光照射1 s后，Gq和Gi活性，

以及385 nm（10^15.5 photons cm^-2）。数据表示来自一次代表性实验中三个技术重复的均值 ± SEM。与JSR1-WT的比较及动力学分析见图S1。

JSR1天然偶联于跳蛛Gq蛋白^29；既往研究表明，其能够激活人源Gq通路^15，并可在纯化蛋白样品中与人源Gi和Gq蛋白偶联^19。为确认重组表达的JSR1-WT和JSR1-S199F能够通过人源Gi和Gq传导信号，我们首先利用生物发光指示剂水母发光蛋白（aequorin）评估Gq介导的细胞内Ca^2+升高。JSR1和JSR1-S199F均引发了幅度相近的Ca^2+反应（图S1a-b）。此外，我们采用基于生物发光共振能量转移（BRET）的G蛋白激活检测方法，评估Gq、Gi和Gs之间的G蛋白选择性（图1c和图S1c-d）^30,31。JSR1-S199F能够强烈激活Gi和Gq蛋白（图1c）。相比之下，与JSR1-S199F（Δratio = 0.4，图S1c）相比，JSR1-WT表现出强烈的Gi激活（Δratio = 0.2），但Gq反应显著降低（Δratio = 0.05）。然而，结合动力学显示，对于两种变体，Gq的结合速度约为Gi的两倍（图S1c-d），这表明S199F突变增强了Gq信号传导的幅度，但并未显著影响结合动力学^31。BRET检测进一步证实，JSR1-S199F的活性可被绿光关闭，并随后通过紫光重新激活（图1c）。

光控GPCR的设计

已有研究报道了若干经工程化改造的、对光敏感的可扩散配体结合型GPCR，即光控GPCR（optoGPCR）或光控视紫红质受体（optoXR）^9,16,17,32,33。然而，将这些设计扩展至新的受体组合并非易事，而且通常】【。

需要进行大量筛选和优化。我们的工程化策略建立在这些既有方法的基础上，并结合实验结构和预测结构来评估所设计嵌合体的质量。

我们的初始设计以 JSR1-WT 为基础，因为其非活性态和与 G 蛋白结合的活性态实验结构均已获得¹²,¹⁹。我们将 JSR1 的 G 蛋白结合界面替换为与 Gs 偶联的 β2 肾上腺素能受体（β2AR）、多巴胺 D1 受体（DRD1）、腺苷 A2B 受体（AA2BR）、血清素 7 受体（5HTR7）、痕量胺相关受体 9（TAAR9）、促黄体生成素受体（LSHR）和 JellyOp 受体的相应界面，设计了一系列嵌合体。除 JellyOp 外，这些受体与 Gs 蛋白形成复合物的结构均已解析（PDB ID：8GG0、7JV5、8HDP、7XTC、8IW9、7FIH）。JellyOp 是目前表征最充分的天然 Gs 偶联视蛋白，其第三胞内环（ICL3）此前已被用于与其他双稳态视蛋白构建 Gs 偶联嵌合体⁹,³⁴。因此，我们纳入了一种由 JSR1 与 JellyOp 的 ICL3（5.60–6.34）构成的此类嵌合体作为对照³⁴。对于其他设计，我们选择了一组多样化的受体，既包括具有较长胞内环（ICL）和 C 端的受体（DRD1、β2AR 和 5HT7R），也包括序列较短的受体（AA2BR、TAAR9 和 LSHR，表 S1）。

利用 GPCRdb 中的 GPCR–G 蛋白界面图谱³⁵,³⁶，我们从所有可获得的人类 A 类 Gs 偶联受体实验结构中提取了受体与 G 蛋白之间的接触信息，并排除了融合构建体（n = 186）。不同 Gs 偶联受体与 Gs 蛋白形成的接触具有异质性。仅考虑至少在 20% 的结构中存在的相互作用时，我们在第一胞内环（ICL1）中鉴定出 1 个保守接触，在 ICL2 中鉴定出 10 个，在 ICL3 中鉴定出 14 个，以及在……处鉴定出 4 个

跨膜螺旋7（TM7）与螺旋8的连接处（图S2）。受体C末端形成的潜在接触通常无法在结构中得到解析，因此被排除在分析之外。然而，已有研究表明，C末端参与受体信号传导^37，包括受体自抑制^38、G蛋白偶联受体激酶（GRK）和阻遏蛋白的募集^39，以及受体定位^40。

基于上述分析，在设计光控GPCR嵌合体时，我们决定完全替换ICL2、ICL3（包括TM5和TM6的相邻部分）、ICL4、螺旋8以及C末端（图2a）。这一策略类似于先前针对其他嵌合视蛋白所采用的方法^16,17,33；与仅交换ICL3相比，该策略能够更完整地重建G蛋白信号传导，而后者此前已被证明可诱导一定程度的Gs信号响应^34。对于JSR1-β2AR嵌合体，我们采用了Tichy等人^17在β2AR与牛视紫红质之间所描述的优化设计。尽管ICL1包含一个保守的G蛋白接触位点，但由于既往研究报道，将其引入嵌合体可能导致受体不稳定并降低表达水平^16,41，因此在设计中将其排除。我们对用于嵌合体设计的所有受体序列进行了比对，并交换了ICL2（3.49–4.38）、ICL3（5.60/61–6.37/40）、ICL4、螺旋8以及C末端（7.53至末端）之间的环区（图2a；表S2）。JSR1-DRD1嵌合体的具体嫁接位置及序列比对如图2b所示。为保持结构完整性，在可能的情况下，我们确保各结构域连接处存在重叠。因此，我们在参与G蛋白结合的保守基序之后直接交换氨基酸序列^42。

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图2 |

嵌合体设计策略与评估。

JSR1嵌合体示意图，其中ICL2、ICL3、ICL4、螺旋8及C端（CT）被替换为Gs偶联受体的相应序列（粉色），以改变其天然信号传导特性。

JSR1、DRD1及JSR1-DRD1嵌合体中被替换区域的序列比对。

JSR1-DRD1-miniGs复合物的AF模型。左侧模型按序列来源着色（深蓝色：JSR1；粉色：DRD1；灰色：miniGs），右侧模型按pLDDT评分（AF预测的置信度）着色。

补充9-顺式视黄醛的不同嵌合体经OptoWell（519 nm，10¹⁷光子·cm⁻²）刺激后产生的cAMP响应最大幅度；所示数据已扣除暗信号，并相对于JellyOp响应进行归一化（n = 6，来自两次生物学重复）。箱体边界表示第25至第75百分位数，须线表示最小值和最大值。使用11-顺式视黄醛获得的数据见图S4，代表性时间分辨数据见图S5。

我们利用AlphaFold（AF），通过预测嵌合受体与miniGs（一种经工程改造的最小化Gs形式⁴⁴）的复合物，构建了嵌合受体活性态模型，并针对每种设计测试了多个位置略有偏移的结构域连接位点。我们采用两项置信度指标评估各模型：逐残基置信度（pLDDT），用于确认跨膜α螺旋架构保持完整，尤其是在移植连接位点处（图2c）；以及界面质量（ipTM）评分。基于这些评分（表S2–S4）及其与实验测定结构的相似性，我们筛选出用于实验表征的设计方案。

信号传导特性的评估

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这表明，受体失活足以使 arrestin 解离，并可能恢复受体反应性。将 JSR1 的胞内区域逐一替换为 DRD1 对应区域后发现，各结构域对 arrestin 招募的作用各不相同（图 3f 和 g）。仅替换 C 端（c1）会降低 arrestin 2 的招募，而对 arrestin 3 的影响很小，这提示 C 端存在同工型选择性相互作用。替换 ICL3（c2）几乎完全消除了两种 arrestin 同工型的招募，表明 ICL3 是 JSR1 中主要的 arrestin 结合界面；这与 ICL3 在 A 类 GPCR 中作为主要 arrestin 对接位点的既有认识一致。变体 c3 和 c4 几乎没有光诱导的 arrestin 招募，说明仅进行这些替换不足以赋予受体类似 DRD1 的 arrestin 结合能力。相较之下，加入 ICL2（c5）可显著提高基础 arrestin 招募水平（图 3f 和 g），提示 ICL2 或可提供额外的 arrestin 结合界面，或通过变构作用稳定具有较高 arrestin 亲和力的受体构象。值得注意的是，c5 的 arrestin 招募特征与 DRD1 最为相似，这与我们的 cAMP 数据一致。DRD1 和 c5 的基础 arrestin 结合水平均较高，且刺激并未使招募水平显著高于这一基线。这种较高的基础招募水平可能反映了无激动剂时 arrestin 与受体之间存在高亲和力相互作用，而这可能限制光或配体诱导反应的动态范围。

完全优化的嵌合体设计（c5）包含 ICL2、ICL3、螺旋 8 和 C 端，其光诱导 cAMP 反应与配体激活的 DRD1-WT 相当。该设计是

与 JSR1-DRD1 构建体（图 2）相同，唯一的区别在于，c5 基于可光切换的 JSR1-S199F 突变体，而非 JSR1-WT。鉴于其最优的信号转导特性，我们将 JSR1-S199F-DRD1 c5（ICL2+ICL3+H8+CT）命名为 optoDRD1。在确定最优嵌合体设计后，我们进一步研究了获得功能性受体所必需的视黄醛异构体。

对不同视黄醛异构体的测试表明，9-顺式视黄醛可提供最佳初始条件，使受体处于完全失活状态，并可通过紫光激活、绿光失活，实现反复切换。相比之下，补充 11-顺式或全反式视黄醛会使受体处于部分或完全激活状态（图 S6、S11）。然而，在首次施加绿光脉冲使受体失活后，由这些异构体重构的受体表现出与由 9-顺式视黄醛重构的 optoDRD1 相同的特性，并可通过紫光和绿光反复开启和关闭（图 S11a）。对补充视黄醛（10 µM）后的时间进程分析表明，cAMP 水平随时间逐渐升高，且升高幅度取决于异构体类型：全反式视黄醛引起的升高最为显著，11-顺式视黄醛也可引起升高，而 9-顺式视黄醛仅引起轻微升高（图 S11b）。我们推测，optoDRD1 并非直接结合 11-顺式视黄醛，而是优先结合由 11-顺式视黄醛在室温水溶液中异构化产生的全反式视黄醛。以下观察支持这一推测：对于补充 11-顺式和全反式视黄醛的细胞，首次以 385 nm 或 525 nm 光照射均会降低其 cAMP 水平，这与预先形成的激活态发生失活相一致；而补充 9-顺式视黄醛的细胞在受到 385 nm 光刺激后，则表现出预期的活性升高（图 S11b，

f–h）。优先结合全反式视黄醛可能有利于体内应用，因为全反式视黄醛广泛存在于全身，而11-顺式视黄醛的合成仅限于视网膜色素上皮细胞。

在确定optoDRD1为首选构建体后，我们进一步表征了其光谱敏感性和信号转导特性，并将其与天然DRD1受体进行了比较。

optoDRD1的光谱敏感性

为确定控制optoDRD1所需的波长和光强，我们采用异源表达系统中的作用光谱测定了其光谱敏感性⁴⁷（图4）。对表达JSR1-S199F及Ca²⁺指示剂水母发光蛋白（Aequorin），或表达optoDRD1及cAMP指示剂GloSensor的HEK293T细胞，分别使用六种波长、不同光强的光进行刺激，以生成辐照度-反应曲线。

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图4.

通过HEK293T细胞中的光谱敏感性测定评估optoDRD1的光敏感性。

a）对六种不同波长、每种波长下十种不同光强所诱导的信号转导反应进行Govardovskii列线图拟合。所得激活和失活的λ_max分别为397 ± 1.08 nm和531 ± 1.25 nm。

b）用于记录作用光谱的CoolLED pE4000光源各照射波长的功率谱。

c–d）在指定波长下，以10¹¹至10¹⁶·⁵ photons cm⁻²的光子通量照射受体1 s所得的剂量-反应曲线，分别用于（c）受体激活，以及（d）预先用525 nm、10¹⁶ photons cm⁻²的光照射1 s使受体激活后的受体失活。

e–f）根据所确定的λ_max计算有效光子通量，并据此对剂量-反应曲线（来自c–d）进行归一化。数据表示三次生物学重复的均值 ± 均值标准误（SEM）。

JSR1-S199F 的基态激活光谱的 λ_max 为 389 ± 0.54 nm（图 S12），与纯化蛋白的最大吸收波长（λ_max = 385 nm）一致，证实其光谱特性在细胞环境中得以保留。optoDRD1 的基态激活光谱的 λ_max 为 397 ± 1.08 nm，呈现轻微红移（图 4a、c、e），这可能反映了嵌合胞内区域所引起的视黄醛结合口袋微环境的细微变化。optoDRD1 活性态的失活光谱的 λ_max 为 531 ± 1.25 nm（图 4a、d、f）。值得注意的是，635 nm 光照也能使 optoDRD1 失活，但需要更高的光强，这与在吸收光谱尾部进行刺激的情况一致。这拓宽了实验应用中可兼容光源的范围。

激活峰与失活峰之间相隔约 130 nm，在采用 1 s 光照脉冲时，两种状态转换均在约 10¹⁶ 光子 cm⁻² s⁻¹（约 5 mW cm⁻²）下达到饱和，表明 optoDRD1 可在生理条件下可实现的光强下受到双向控制，且两个控制波长之间的光谱串扰极小。

optoDRD1 的信号传导动力学特征与 G 蛋白选择性

为确定光激活的 optoDRD1 是否能够重现 DRD1 的信号传导特征，我们比较了二者的动力学和 G 蛋白选择性特征。我们首先考察了 cAMP 响应的时间动态，将 optoDRD1 与经 DRD1 特异性激动剂非诺多泮激活、并经拮抗剂 SKF83566 失活的 DRD1 进行比较。两种受体均表现出相近的激活速率，并可维持数小时的信号传导，其动力学参数在定量上相似（图 5a–b，表 S6）。

作为比较，我们测试了

JellyOp 是已报道可与 Gs 偶联的另一种被采用的视蛋白²²。尽管 JellyOp 能产生强烈的初始激活，其信号在 15 分钟内便开始衰减（图 5c），凸显了嵌合设计在维持类似天然 DRD1 的信号传导动力学方面的优势。

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图 5.

optoDRD1 的 G 蛋白选择性及动力学。比较 optoDRD1、DRD1 和 JellyOp 在 HEK293 细胞中的 cAMP 信号响应特征（a–c）。

optoDRD1 的响应曲线：深蓝色曲线（“On”）表示使用 385 nm 光进行单次激活。粉色曲线（“On-Off-On”）对应依次使用 385 nm、525 nm 和 385 nm 光进行刺激（光子通量均为 10¹⁶ 光子 cm⁻²）。

DRD1 的响应曲线：深蓝色曲线（“On”）表示 10 nM 非诺多泮（激动剂）的作用。粉色曲线（“On-Off-On”）表示追加 100 nM SKF83566（拮抗剂）处理（T = 36 min），随后加入 1 μM 非诺多泮（T = 81 min）的作用。

以 9-顺式视黄醛重构的 optoDRD1 和 JellyOp 的响应曲线，在虚线所示时间点给予一次持续 1 s 的刺激（10¹⁶ 光子 cm⁻²）。a–c 中的曲线表示一个代表性数据集中三次技术重复的均值 ± 均值标准误（SEM）。

所示受体在 HEK293 细胞中的 Gsx 测定结果汇总，光刺激剂量为 10¹⁶ 光子 cm⁻²。通过减去未刺激条件下的响应，对响应曲线进行归一化，随后计算刺激后响应达到最大值之后五个数值的平均值。再将各受体的这些数值归一化至 0–1。数据表示三次生物学重复的均值 ± SEM（灰色虚线）。

Gsx 测定中 optoDRD1 的剂量–响应曲线，展示响应至少达到最大响应 0.1 倍的 G 蛋白。

BRET G 蛋白激活测定中的 optoDRD1，显示

分别以385 nm（10¹⁶光子·cm⁻²）、525 nm（10¹⁶光子·cm⁻²）和385 nm（10¹⁶光子·cm⁻²）光照射1 s后的Gs活性。数据表示一次代表性实验中三次技术重复的均值 ± 均值标准误（SEM）。

g）

通过基于BRET的G蛋白活化测定评估的optoDRD1 G蛋白选择性，数据以均值 ± SEM表示（n = 6）。

随后，我们在缺乏内源性Gαs蛋白的HEK293S细胞⁴⁹中，采用Gsx测定⁴⁸评估了optoDRD1的G蛋白选择性谱。该测定通过改变Gαs的C末端而非检测天然G蛋白相互作用来探究选择性，因此反映的是相对选择性模式，而非绝对偶联偏好。DRD1对Gs的活性最高，其次为Gsz，对Gso、Gst和Gs15的活性较弱（图5d）。OptoDRD1呈现出相似的选择性谱，并以DRD1所具有的Gs主导模式选择性激活G蛋白。相比之下，JSR1-S199F对Gsi和Gsqjs（具有跳蛛Gq的C末端）的活性均超过50%，而optoDRD1对这两者均未表现出可检测的激活作用。为使用天然G蛋白确认其Gs选择性，我们采用了基于BRET的G蛋白活化测定，结果显示其仅对Gs具有活性，而与Gq和Gi均无可检测的偶联。与此一致，水母发光蛋白测定中也未检测到Gq活化（图S13）。综上，这些G蛋白谱分析证实，optoDRD1既重现了天然DRD1以Gs为主的偶联特征，也重现了其更广泛的选择性模式。

不同细胞类型中的OptoDRD1

为评估optoDRD1在HEK293细胞之外更广泛的适用性，我们在胰腺β细胞和一种神经元细胞系中测试了其功能；在这两种细胞环境中，Gs介导的cAMP信号传导均具有已得到充分证实的生理作用。我们首先考察了optoDRD1能否调节胰岛素

在EndoC-βH5®人β细胞中的分泌，该细胞系在生理特性和功能上与天然人胰腺β细胞高度相似⁵⁰。已知包括GLP-1R和GIPR在内的Gs偶联受体可通过依赖cAMP的机制增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）²⁵（图6a）。与未受光刺激的对照相比，光刺激使经9-顺式视黄醛重构的optoDRD1介导的胰岛素释放量增加至1.5倍（图6b）。在无光刺激条件下，经全反式视黄醛重构的细胞的胰岛素释放量也出现相近幅度的升高，这与此前在HEK细胞中观察到的全反式视黄醛的激动剂活性一致（图S11）。在葡萄糖刺激前即刻施加绿光，与未失活条件相比，并未降低经全反式视黄醛重构的细胞的胰岛素分泌量（图6b）。这可能反映了cAMP的衰减速度慢于快速的第一时相胰岛素分泌反应；后者在接触葡萄糖后的前5分钟内达到峰值⁵¹，因此尽管受体已失活，cAMP水平仍维持升高。

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图6.

optoDRD1在其他细胞类型中的活性。

a）

示意图展示了胰腺β细胞中葡萄糖依赖性胰岛素释放的机制，该过程可通过Gs信号传导得到增强（腺苷酸环化酶（AC）、蛋白激酶A（PKA）、ATP敏感性钾通道（K_ATP）、电压依赖性钙通道（VDCC））。

b）

optoDRD1的激活增强了人胰腺β细胞（EndoC-βH5®）在葡萄糖刺激下的胰岛素释放。所有条件下均采用11 mM葡萄糖进行刺激，以福斯可林（FSK）作为阳性对照，光照（紫光或绿光）条件由柱形颜色表示（空载体（EV）；**P < 0.0001，*P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05）。P值

采用单因素方差分析（ANOVA）及 Tukey 多重比较检验进行确定；每组 n = 3–6 个生物学重复。

在 Neuro-2a 细胞中，optoDRD1 对光激活和光失活均表现出强烈的 cAMP 响应。细胞与 2 μM 9-顺式视黄醛孵育，并在 T = 2 min 和 T = 79 min 时接受 385 nm 光照，在 T = 40 min 时接受 525 nm 光照（10¹⁶ 光子·cm⁻²）。数据为一组代表性数据集的均值 ± 均值标准误（SEM），n = 2。

接下来，我们通过测量 Neuro-2a 细胞中的 cAMP 水平，考察 optoDRD1 在神经元细胞环境中是否具有相似的功能。optoDRD1 在 385 nm 光刺激下可逆地激活 cAMP 信号传导，并在绿光照射下失活，其动力学特征与 HEK293T 细胞中的相当（图 6c，表 S6）。然而，11-顺式视黄醛在不同细胞类型中表现出不同的行为。在 HEK293T 细胞中，11-顺式视黄醛在暗条件下激活受体，因此必须先通过绿光使其失活，才能检测到光激活响应。相比之下，在 Neuro-2a 细胞中，11-顺式视黄醛仅引起受体部分激活，因此无需预先接受绿光照射即可直接进行光激活（图 S11c–e）。这一差异并不影响 optoDRD1 在该细胞类型中用于光控 cAMP 调节的效用，但其机制基础仍有待进一步研究，并且可能反映了视黄醛代谢的细胞类型特异性差异。

讨论

在本研究中，我们开发了 optoDRD1，这是一种双稳态光控 G 蛋白偶联受体（optoGPCR），可重现 DRD1 的信号传导特征，并实现对 Gs 信号传导的双向光控。尽管双稳态光开关视蛋白的主要优势在于可通过光照控制其失活，但目前大多数工程化 optoGPCR 仍采用激活后会发生光漂白的单稳态视蛋白³³。我们

因此，我们选择了具有双稳态和光开关特性的 JSR1-S199F 点突变体作为构建嵌合体的视蛋白骨架¹⁴。JSR1 的基态和活化态结构均已解析，使其成为开展理性工程改造的理想视蛋白¹²˒¹⁹。与现有基于单稳态视蛋白、介导 Gs 信号转导的 optoGPCR 相比，我们设计的 optoDRD1 具有多项优势。具体而言，(i) 它不会发生光漂白；(ii) 它能够实现可逆控制；(iii) 它可利用广泛存在于全身的全反式视黄醛形成功能性视色素，而 11-顺式视黄醛的组织分布有限，主要存在于视网膜中⁵²˒⁵³。

OptoDRD1 可由紫光（λ_max = 397 nm）激活，并由绿光（λ_max = 531 nm）失活，且具有较高的光敏感性（EC₅₀ ≈ 10¹⁵ 光子·cm⁻²·s⁻¹，约 0.5 mW·cm⁻²），其敏感性约为 ChR2 等常用微生物视蛋白的 100 倍⁵⁴˒⁵⁵，这一敏感性范围与现有的体内光遗传学实验范式相适配。激活 optoDRD1 所需的短波长光对组织的穿透能力弱于红光，且可能带来更高的光毒性风险，这构成了其用于深部组织时的一项实际局限。双光子激活技术的最新进展已证明，对紫外光敏感视蛋白进行深部组织刺激是可行的⁶˒⁵⁶。因此，OptoDRD1 可能适用于双光子激活，从而在活体内实现更深的组织穿透和单细胞级空间分辨率⁵⁷。

迄今为止，双稳态光开关型 optoGPCR 的大多数体内应用均采用 Gi 或 Gq 偶联的视蛋白⁶–⁸˒¹⁵。JellyOp 仍是应用最广泛的 Gs 偶联型 optoGPCR，并已被用于通过光刺激激活心脏中的 Gs 信号转导⁵⁸。然而，其信号开始……

正如我们的检测结果所证实的那样，其活性会在15分钟内衰减，因此需要进行多次光刺激，以维持对下游信号通路的持续调控

。此外，JellyOp无法通过光照反复开启和关闭，因为在信号自然衰减之前使用紫外光使其失活，会导致其在数分钟内无法再次激活

。相比之下，optoDRD1克服了这些局限性，能够在任意时间点实现激活与失活，并可维持Gs活性数小时，其动力学特征与配体激活的DRD1高度匹配

（图5）

。该持续活性与刺激后DRD1和optoDRD1均表现出的极少量arrestin募集相一致，这表明在我们的实验条件下，arrestin介导的脱敏对信号终止的贡献很小。DRD1和optoDRD1均观察到的较高基础arrestin募集水平，可能会缩小激动剂诱导募集的可检测动态范围。因此，既往研究显示激动剂刺激后DRD1会募集arrestin，而本研究结果与之存在差异，这可能反映了实验条件或受体表达水平的不同

。此外，通过绿光照射，可以在任意预设时间点选择性且迅速地终止optoDRD1信号传导，从而能够精确解析受体介导信号传导的时间过程。

为证明optoDRD1的生理相关性，我们考察了其调节内源性Gs介导过程的能力。我们证明，在人原代样胰腺β细胞（EndoC-βH5®）中，激活的optoDRD1能够增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌。这一效应既可通过将optoDRD1与9-

顺式

-视黄醛重构后，再利用紫光激活来实现，因为

以及直接补充全反式视黄醛的 optoDRD1（图6）。尽管在葡萄糖刺激前立即给予紫光激活，足以增加胰岛素释放，但在刺激前直接使其失活并未显著减少胰岛素释放，这可能反映了与快速的胰岛素第一时相反应相比，cAMP 的衰减相对缓慢；胰岛素第一时相反应在暴露于葡萄糖后的前五分钟内达到峰值⁵¹。此外，这些结果证实，结合全反式视黄醛足以激活 optoDRD1。虽然这有利于在缺乏可用 11-顺式视黄醛的组织中形成具有功能的视蛋白，但也表明需要在实验前用绿光使受体失活，以确保其不会产生非预期的活性。在实际操作中，可通过短暂的绿光预照射步骤来解决这一问题，确保受体在刺激前处于非活性基态。

除可用作工程化支架外，JSR1-S199F 本身也表现出值得单独关注的信号传导特性。尽管 JSR1 主要被表征为 Gq 偶联受体，我们发现它在人细胞中还可通过 Gi 通路传导信号，并以高效、光依赖且可逆的方式募集 arrestin 2 和 arrestin 3。对不同嵌合体的分析显示，JSR1 的 ICL3 是募集 arrestin 3 所必需的。在 ICL3 的柔性区域中，一个包含两个丝氨酸、一个谷氨酸和一个天冬氨酸残基的序列基序（SxxSxED）可能有助于高效募集 arrestin，因为 arrestin 结合界面通常富含负电荷，例如磷酸化丝氨酸所提供的负电荷。用绿光使 JSR1-S199F 失活，可以迅速逆转 arrestin 的募集。由于

抑制蛋白的募集不仅在受体脱敏和内化中发挥核心作用，还参与信号级联反应的启动，因此，确定JSR1-S199F驱动的抑制蛋白募集是否会引发ERK1/2激活等抑制蛋白依赖性效应，将具有重要意义。JSR1-S199F的双稳态特性在这一背景下尤为有利，因为它能够在无需竞争性配体的情况下启动和终止抑制蛋白信号传导，而这些配体可能无法接触到已内化的受体。因此，结合其与Gi和Gq的偶联能力，JSR1-S199F有望成为一种多功能光遗传学骨架，用于在精确的时空控制下解析抑制蛋白介导的信号传导。

光控GPCR工程改造的主要挑战之一是，与天然受体相比，其信号传导效率较低³³，这可能同时反映了较低的表达水平和较低的G蛋白激活效率。在本研究中，cAMP信号幅度高度依赖于作为亲本的Gs偶联受体。在基于A类（视紫红质样）GPCR构建的七种工程化嵌合体中，只有JSR1-DRD1嵌合体表现出较高的信号传导效率（图2）。值得注意的是，AF分析显示，optoDRD1在受体–G蛋白界面的预测置信度评分高于其他嵌合体。由于这一计算指标与实验测得的信号传导效率密切相关，我们提出，基于AF的结构评估可作为一种有用工具，用于指导GPCR嵌合体设计，并确定优先进行实验验证的候选构建体。与既往GPCR工程改造研究¹⁶,⁴¹,⁶²一致，我们的JSR1-S199F-DRD1变体表明，包含胞内环2（ICL2）、胞内环3（ICL3）、第8螺旋和C端，足以重建类似天然受体的cAMP信号传导以及类似DRD1的抑制蛋白

募集。各元件均发挥独特作用：ICL3 启动 Gs 偶联并消除强烈的 arrestin 相互作用，C 末端维持信号传导的持续时间，螺旋 8 增大 cAMP 响应幅度，而 ICL2 则进一步增强 Gs 偶联及基础状态下的 arrestin 结合。

DRD1 已成为构建视蛋白嵌合体的一种尤为适合的受体。此前，Morri 等人在对牛视紫红质 optoGPCR 进行大规模筛选时纳入了 DRD1，并同时替换了 ICL1、ICL2、ICL3 和 C 末端。所获得构建体的 cAMP 依赖性信号强度在其全部构建体中位居前列⁶²。然而，该 optoDRD1 表现出较高的基础活性，提示存在异常的组成型信号传导⁶²。另一个牛视紫红质–DRD1 嵌合体也已成功应用于小鼠伏隔核，并介导了对社交互动的行为效应⁶³。最近，Zhou 等人利用牛视紫红质和黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的 DRD1 构建了 optoDRD1⁴¹。其优化设计保留了牛视紫红质的 ICL1，并在螺旋 8 中引入了额外的 DRD1 来源残基（7.56–8.49）。该 optoDRD1 的信号传导特征与果蝇天然 DRD1 一致，并实现了对活体运动和学习行为的光学控制⁴¹。然而，这些既往设计均以单稳态视蛋白为骨架。我们的 optoDRD1 在这些设计的基础上取得了进展，实现了光触发的双向控制，即激活与失活，解决了既往设计中报道的基础活性过高问题，同时在 HEK293 细胞和神经母细胞瘤 Neuro-2a 细胞系中均保持了强劲的信号传导。能够在任意时间点利用绿光使信号传导失活，提供了一种类似拮抗剂的调控方式，从而能够对 Gs 通路进行精确的时间调控，尚未

此前已可通过现有视蛋白实现。

OptoGPCR通过GPCR信号通路调控细胞系统，而非通过I型视蛋白介导的离子通道电导，因此能够对特定GPCR信号通路进行具有时空精确性的分析。尽管光开关配体，例如可逆膜锚定的MP-D1^ago或光开关型血清素^64,65，原则上无需表达重组受体即可实现类似的精确控制，但OptoGPCR具有独特优势：其表达可靶向特定细胞类型和组织；其功能不受内源性配体影响，也不受光开关配体与脱靶受体发生非特异性结合的影响；此外，光激活无需给药，从而减少了全身性脱靶效应。与专门由设计药物激活的设计受体（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs，DREADDs）不同，后者通常用于研究神经系统中的GPCR激活^66，OptoGPCR无需给予配体即可对受体的激活和失活进行更精确的时间控制，因此是解析特定GPCR通路的有价值工具^33。因此，究竟选择基于配体、光药理学还是OptoGPCR的方法，应根据具体研究的实验要求加以确定。

综上，这些结果确立了optoDRD1作为首个兼具光谱可逆性、高光敏感性和类似天然受体信号动力学的双稳态、Gs选择性OptoGPCR。此外，我们证明JSR1-S199F能够以光敏感的方式强烈募集arrestin 2和arrestin 3，并且通过绿光使受体失活，可以迅速逆转这种募集。optoDRD1所提供的光介导Gs信号控制，可能特别适用于研究...

涉及学习和记忆的多巴胺能神经元通路、帕金森病模型，以及由 Gs 介导的外周器官功能，例如胰腺 β 细胞的胰岛素分泌。因此，OptoDRD1 为 optoGPCR 工具箱增添了一种重要工具，可用于以精确的时空分辨率解析 Gs 介导的信号传导。

材料与方法

cDNA 构建体

本研究所构建的蛋白质序列列于补充数据中。GPCR 开放阅读框由 TwistBioscience 合成，并通过 KpnI 和 XbaI 酶切位点克隆至哺乳动物表达载体 pcDNA3.1+ 中（氨基酸序列见补充信息）。构建体包含 GPCR 的开放阅读框及 C 端 1D4 表位标签（TESTQVAPA），该标签通过 GS 连接肽（BamHI 酶切位点）与 GPCR 相连。DRD1 的编码序列基于 NM_000794.5。JSR1 基因经人源密码子优化，并以携带 N 端 SNAP 标签的形式表达（见补充信息）。按照制造商说明，使用含 GC 缓冲液的 Phusion® 高保真 PCR 预混液（NEB）对 JSR1 基因及其嵌合体进行定点诱变，以引入 S199F 突变。JellyOp 构建体（Addgene 质粒编号 41432）此前已有描述⁵⁹。使用 pGloSensor-22F cAMP 质粒（Promega，E2301），通过生物发光报告 cAMP 水平。Gsx 嵌合体的使用方法如前所述⁴⁸。使用质粒 AG10-11S-CAAX、AK1-114-bArrestin1 和 AK1-114-bArrestin2 测定间接 arrestin 招募，具体方法如前所述⁶⁷。为检测细胞内 Ca²⁺ 水平，使用 pcDNA5/FRT/TO mtAeq 质粒⁶⁸，该质粒表达对 Ca²⁺ 敏感的发光水母发光蛋白。所有质粒在使用前均经测序验证。

细胞培养

HEK293T 细胞、HEK293s ΔGs KO 细胞⁴⁹

或Neuro-2a细胞在37°C、5% CO₂条件下，使用含4.5 g L⁻¹ D-葡萄糖、丙酮酸钠和L-谷氨酰胺的Dulbecco改良Eagle培养基（BioConcept）培养，并添加10%胎牛血清（FBS；Sigma-Aldrich）及青霉素/链霉素（PANBiotech，浓度分别为100 U/mL和0.01 mg/mL）。

转染

按照制造商的操作规程，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）对细胞进行瞬时转染。4–6 h后更换为新鲜培养基，并根据需要补充视黄醛。视黄醛在昏暗红光条件下加入，此后所有细胞操作均严格在该条件下进行。对于在12孔板或24孔板中进行的转染，使用Versene（biowest）或胰蛋白酶使细胞脱附，随后将其重新分配至96孔板中，每孔100 µL。

免疫细胞染色

转染后6 h，将细胞以每孔1.25 × 10⁵个细胞的密度接种于24孔板中经聚-D-赖氨酸（Thermo Fisher Scientific）包被的玻璃盖玻片上。转染后24 h，使用PBS配制的4%多聚甲醛（Sigma-Aldrich）固定细胞，并用0.1 µg/mL DAPI染色10 min。使用PBS配制的1% NP40对细胞进行透化处理5 min，随后用TBST配制的1% BSA封闭30 min。使用封闭缓冲液将浓度为3.5 mg/mL的1D4-Rho小鼠抗体（Cell Essentials, Inc）按1:1000稀释，并与细胞孵育1 h。用PBS洗涤后，将细胞与按1:1000稀释的Alexa Fluor 594偶联抗小鼠二抗（MedChemExpress）孵育。使用Gelvatol将盖玻片封固于载玻片上，并避光保存。使用Leica Stellaris显微镜观察样品。在特定带通滤光片组下采集图像，并使用彩色合成图像。

蛋白质免疫印迹

将HEK293T细胞以每……2.5 × 10⁵个细胞的密度接种

于转染前24 h将细胞接种于24孔板的各孔中。使用相应视蛋白的表达载体转染细胞，每孔总DNA用量为250 ng。24 h后，用Versene消化液使细胞脱附，并用冰冷的PBS离心收集细胞。将细胞置于含Benzonase核酸酶的PBS中孵育15 min，加入上样缓冲液后上样至Bio-Rad Mini-PROTEAN TGX凝胶，随后使用快速转膜系统将蛋白转移至膜上，并用含3% BSA的TBST封闭1 h。将膜置于封闭液中，与以1:1000稀释的1D4-Rho小鼠抗体（3.5 mg/mL，Cell Essentials, Inc）孵育1 h。用TBST洗膜后，与以1:1000稀释的HRP偶联山羊抗小鼠二抗（Invitrogen）孵育。

JSR1-S199F的纯化及紫外–可见吸收光谱测定

使用杆状病毒在Hi5昆虫细胞中表达JSR1-S199F蛋白，与9-顺式视黄醛孵育过夜以完成重构，用LMNG增溶后，在昏暗红光条件下使用Strep-Tactin XT树脂进行亲和纯化，并用0.05 mg/mL自制人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶洗脱。在分析型体积排阻色谱（SEC）运行过程中，使用HPLC Infinity II二极管阵列检测器WR（货号G7115A；Agilent，美国加利福尼亚州）记录紫外–可见吸收光谱。在20°C下，将10 µL纯化受体注入预先用SEC缓冲液（20 mM HEPES，pH 6.5，300 mM NaCl，100 µM TCEP，0.001% LMNG）平衡的Zenix-C SEC300色谱柱（4.6 × 150 mm；SEPAX Technologies，美国特拉华州）。

光照

使用pE-4000 CoolLED产生持续1 s的光刺激，光强和波长如图注所示（10¹¹至10¹⁶·⁵光子·cm⁻²）。通过调节光强控制器并使用不同的中性密度滤光片（ND1–4，Thorlabs, Inc）获得所需光强。使用光谱辐射计独立测量光刺激的功率。

SpectroCAL MKII（Cambridge Research Systems）或使用 S130VC 薄型光电二极管功率传感器，紫外扩展型硅，200–1100 nm，500 pW0–50 mW（Thorlabs, Inc）。或者，使用 OptoWell（Opto Biolabs）在特定波长下对细胞照射 30 s，光子剂量约为 10¹⁶–10¹⁷ photons cm⁻²：368 nm（0.49 mW cm⁻²）、461 nm（2.74 mW cm⁻²）、519 nm（1.0 mW cm⁻²）。

BRET G 蛋白活化测定

将 HEK293T 细胞接种于 24 孔板中（每孔 2.5 × 10⁵ 个细胞，于转染前 24 h 接种），并使用编码相应视蛋白（250 ng）、Gα 亚基（250 ng）、Gβ-split Venus 和 Gγ-split Venus 亚基（各 50 ng）以及 GRK3-nLuc（12.5 ng）的质粒表达载体进行瞬时转染⁶⁹。转染后 6 h，将细胞从培养板上解离，重悬于补充了 2 μM 视黄醛的 0.5 mL DMEM 培养基中，分装至 96 孔板（每孔 100 μL），并在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜。发光测量前 2 h，将培养基更换为补充了 1% FBS 和 2 μM 视黄醛的无酚红 L-15 培养基（Thermo Fisher Scientific）。测量前 10 min，加入用 PBS 稀释的 NanoGlo 活细胞底物（Promega）（1:400）。使用 Optima FLUOStar 酶标仪（BMG）测量各孔，并通过配备 CoolLED 的定制内部闪光装置进行光刺激（1 s，10¹⁶ photons cm⁻²）。以 530 nm 与 450 nm 处测得信号的比值计算 BRET 比值。将所有数据除以刺激前的平均值及对照条件（除受体 DNA 外，其余组分均相同）下的数值，进行归一化。

GloSensor cAMP 测定

转染前 24 h，将 HEK293T 细胞以每孔 2.5 × 10⁵ 个细胞的密度接种于 24 孔板中。使用相应视蛋白的表达载体与

pGloSensor-22F cAMP质粒⁷⁰，比例为1:1，每孔总DNA量为500 ng。转染6 h后，用Versene将每孔细胞解离，并重悬于额外补加2 μM视黄醛的0.5 mL培养基中，分装至96孔板（每孔100 μL），于37°C孵育过夜。测量前1 h，将培养基更换为检测缓冲液［含L-谷氨酰胺的无酚红L-15培养基（Gibco）、1% FBS、2 μM视黄醛和2 mM D-荧光素（MedChemExpress）］，并于室温避光放置。随后将细胞转移至酶标仪（PHERAStar，BMG）中；在记录Gi介导的cAMP抑制性反应时，加入1 μM福斯可林（Sigma-Aldrich）以提高cAMP水平。记录适当的基线后，将细胞从酶标仪中取出，进行光照或配体刺激，然后放回酶标仪，记录后续发光强度的变化。为定量分析反应，对每个生物学重复减去其刺激前基线值，进行归一化处理。

Gsx检测

Gsx检测的操作流程与GloSensor cAMP检测相同，不同之处在于使用HEK293s ΔGs KO细胞，并在转染时额外加入5 ng相应的Gsx G蛋白嵌合体DNA⁴⁸。添加视黄醛时，同时加入125 ng/mL百日咳毒素（Sigma-Aldrich）。通过减去未刺激条件下的数值对反应曲线进行归一化，随后计算刺激后反应达到最大值后的5个数值的平均值。将每种受体的这些数值归一化至0至1之间。

间接阻遏蛋白募集检测

采用分体式荧光素酶检测系统测量阻遏蛋白募集，其中大片段（11s）通过CAAX基序锚定于质膜，而阻遏蛋白则以小片段进行标记

片段（114）。在测量前24 h，将HEK293T细胞在24孔板中进行转染，每孔总DNA量为500 ng，三种质粒（11s-CAAX、114-arrestin和受体质粒）的比例为1:1:1。转染后6 h，使用Versene将各孔细胞解离，并重悬于额外补充2 μM视黄醛的0.5 mL培养基中，随后分装至96孔板（每孔100 μL），于37°C孵育过夜。测量前1 h，将培养基更换为检测缓冲液［含L-谷氨酰胺的无酚红L-15培养基（Gibco），补充1% FBS和2 μM视黄醛］，并将细胞置于室温下避光保存。测量前10 min，加入用PBS稀释的NanoGlo活细胞底物（Promega），稀释比例为1:200。使用PHERAStar酶标仪（BMG）测量各孔的发光信号，并使用CoolLED进行光刺激（1 s，10¹⁶光子·cm⁻²），或加入10 μM激动剂进行刺激。为计算倍数变化，将发光值归一化至未刺激对照孔的平均值。

水母发光蛋白钙离子检测

转染前24 h，将HEK293T细胞以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种于12孔板中。以1:1的比例，用编码相应视蛋白和mtAeq的载体对细胞进行瞬时转染，每孔DNA用量为500 ng⁶⁸）。转染后6 h，将各孔细胞解离，并重悬于额外补充2 μM 11-顺式视黄醛的1 mL培养基中，随后分装至96孔板（每孔100 μL），于37°C、5% CO₂条件下孵育过夜。发光测量前2 h，将培养基更换为无酚红L-15培养基（Thermo Fisher Scientific），并补充1% FBS、2 μM 11-顺式视黄醛和10 μM腔肠素-H（AG Scientific）。使用Optima测量水母发光蛋白的生物发光信号

使用 FLUOStar 酶标仪（BMG）测量，总时长为 2 分钟。在进行 10 s 基线测量后，利用集成的内部光刺激装置，以六种不同波长的光刺激细胞（通过 CoolLED 施加 1 s 光脉冲，强度范围为 10^11.5 至 10^16 光子·cm⁻²）。

视蛋白光子敏感性峰值的计算

测量暗参考值，并对其他孔施加六种不同波长、强度范围为 10^11.5 至 10^16.5 光子·cm⁻²、持续时间为 1 s 的闪光刺激。对于 JSR1-S199F，采用水母发光蛋白（Aequorin）钙检测法；对于 optoDRD1，采用 GloSensor cAMP 检测法。为测量活性态的失活光谱，我们先用饱和强度的 525 nm 光预激活细胞，待 cAMP 水平达到平台期后，再测量其对不同波长光的响应。将数据相对于刺激前基线进行归一化，提取每次光刺激的最大响应，并将其归一化至 0 至 1。采用非线性优化方法确定视蛋白的 λ_max 值：利用 Govardovskii 模板列线图⁴⁷重新计算有效光子通量值，并将响应与这些数值进行迭代拟合，以最小化残差。

葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）测定

按照制造商的说明，将 EndoC-βH5® 细胞（Human Cell Design）接种于 96 孔板中（每孔 1 × 10⁵ 个细胞），并在同一孔中培养四周。细胞解冻六天后，使用 0.16 µl Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染 50 ng DNA（EV 或 OptoDRD1）。转染四小时后，将培养基更换为添加了 2 µM 视黄醛的饥饿培养基，培养 24 h。次日进行 GSIS 测定，首先将培养基更换为不含葡萄糖、添加了 2 µM 视黄醛的 βKREBS 缓冲液，1 h 后，细胞

采用11 mM葡萄糖，并额外加入10 µM FSK或给予385 nm或525 nm光照（10¹⁶光子·cm⁻²）进行刺激。40分钟后收集培养基，并将细胞置于推荐的生长培养基中培养。一周后重复上述完整流程，以获得更多重复样本。为测定胰岛素含量，将刺激后收集的培养基用热灭活胎牛血清（FBS，经检测不含胰岛素）稀释50至250倍，并按照制造商说明，使用人胰岛素ELISA试剂盒（Crystal Chem）进行测定。根据标准曲线计算数值，并乘以稀释倍数。

统计分析

使用GraphPad Prism 8软件进行数据分析和绘图。数据以均值±均值标准误（SEM）表示。对于归一化的时间分辨信号传导测定数据，采用最小二乘回归法，使用平台期后接单相缔合或单相衰减模型进行拟合。对于剂量–反应实验，将数据归一化，并采用非线性曲线拟合方法，拟合log（激动剂或抑制剂浓度）与反应的三参数曲线。采用普通单因素方差分析（ANOVA），结合Tukey多重比较检验确定P值（**P < 0.0001、*P < 0.001、**P < 0.01、*P < 0.05被认为具有统计学显著性；P > 0.05被认为无统计学显著性（ns））。

AlphaFold2和3预测

使用AlphaFold2和3预测受体–miniG蛋白复合物模型。图中展示的所有预测结果均使用AF3（https://alphafoldserver.com/）生成。通过自定义Python脚本，从所提供的json文件中提取参数。我们提取了接触概率评分高于0.4的残基，随后计算了接触数量、接触概率的平均值，以及

A链（GPCR）和B链（G蛋白）残基的预测比对误差（PAE）值。

资助

本研究获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划框架下提供的资助（“ERC SOL”，协同资助协议编号951644，获资助者为G.F.X.S.），以及苏黎世大学向D.W.提供的GRC差旅资助（2024_Q1_TG_077）。

作者贡献

D.W.和G.F.X.S.设计了本研究。D.W.、R.M.、A.P.和H.R.开展了实验。D.W.、R.M.和A.P.分析了数据。D.W.、X.D.、R.M.、P.I.和G.F.X.S.在全体作者的意见基础上撰写了论文。

利益冲突

G.F.X.S.声明，他是leadXpro AG和InterAx Biotech AG两家公司的联合创始人兼科学顾问。其他作者声明不存在利益冲突。

数据与材料可用性

本研究中生成或分析的所有数据均包含在本篇已发表论文及其补充信息文件中。图中展示的所有数据均可在Summary_Data.xlsx中获取。

补充材料清单

氨基酸序列图S1至S13 表S1至S6 Summary_Data.xlsx

致谢

我们感谢Raimund Dutzler教授、博士共同指导D.W.的博士学位论文，并感谢苏黎世生命科学研究生院的生物分子结构与机制博士项目。我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）下属的美国国家眼科研究所提供11-顺式视黄醛。我们感谢Asuka Inoue教授、博士惠赠HEK293S GNAS/L细胞系。用于抑制蛋白募集测定的质粒由Philipp Berger博士惠赠。我们感谢Akihisa Terakita教授、博士和Mitsumasa Koyanagi教授、博士就JSR1的S199F突变提出意见。

已声明的资助方信息

欧洲研究理事会

，951644

大学（名称未完）

苏黎世，2024_Q1_TG_077

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用于可逆调控 Gs 和抑制蛋白信号传导的光可切换 optoGPCR

Deborah Walter, Richard McDowell, Polina Isaikina, Andreea Pantiru, Hiruttika Ravimohan, Xavier Deupi, Robert J. Lucas, Gebhard F. X. Schertler

bioRxiv 2026.07.01.735182；

doi: https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735182

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用于可逆控制 Gs 和抑制蛋白信号传导的光可切换型 optoGPCR

Deborah

Walter

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Richard

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Andreea

Pantiru

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Hiruttika

Ravimohan

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Deupi

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Schertler

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2026.07.01.735182；

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https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735182

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关键词：光遗传学 · G蛋白偶联受体 · 双稳态视蛋白 · Gs信号传导 · 抑制蛋白募集 · 受体嵌合工程

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.01.735182v1?rss=1

来源出处

可光切换的光遗传G蛋白偶联受体实现对Gs和阻遏蛋白信号传导的可逆控制 https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.01.735182v1?rss=1