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信号受体可通过回收至细胞内或随细胞外囊泡（EVs）分泌的方式离开纤毛，后者被称为胞外出芽。调控胞外出芽的机制目前仍不清楚。在本研究中，我们利用定量蛋白质组学分析，鉴定出Hedgehog信号受体Smoothened（SMO）是纤毛来源EVs的主要载荷之一。令人意外的是，促进SMO在纤毛中积累的配体显著抑制了SMO被装载至EVs中，表明胞外出芽可选择性地装载处于特定构象状态的SMO。我们进一步发现，装载至EVs中的SMO受到广泛的K63连接型泛素链修饰。阻止SMO泛素化或选择性去除SMO上的K63连接型泛素链，均显著减少了SMO随EVs的分泌，并导致SMO在纤毛内积累。综上，这些结果表明，K63连接型泛素链是纤毛胞外出芽的分选信号，并提示非活性SMO的泛素依赖性装载有助于Hedgehog信号传导过程中SMO的动态再分布。
K63连接的泛素链标记非活性Smoothened，使其被包装入纤毛细胞外囊泡 | bioRxiv
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K63连接的泛素链标记非活性Smoothened，使其被包装入纤毛细胞外囊泡
Mingli
Zhu
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Yash
Raj
，
Gary A.
Bradshaw
，
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David U.
Mick
，
Marian
Kalocsay
，
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Maxence V.
Nachury
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735856
Mingli Zhu
1
加利福尼亚大学旧金山分校眼科学系；加利福尼亚州 94143
，
美国
2
加利福尼亚大学旧金山分校史密斯心血管研究所；加利福尼亚州 94143
，
美国
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Yash Raj
1
加利福尼亚大学旧金山分校眼科学系；加利福尼亚州 94143
，
美国
2
加利福尼亚大学旧金山分校史密斯心血管研究所；加利福尼亚州 94143
，
美国
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Gary A. Bradshaw
3
哈佛医学院系统生物学系系统药理学实验室；波士顿
，马萨诸塞州 02115，
美国
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David U. Mick
4
萨尔大学医学院医学生物化学与分子生物学系分子信号传导中心；洪堡
，
德国
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Marian Kalocsay
3
哈佛医学院系统生物学系系统药理学实验室；波士顿
，马萨诸塞州 02115，
美国
5
实验放射肿瘤学系，
得克萨斯大学 MD 安德森癌症中心；美国得克萨斯州休斯敦，邮政编码 77030
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Maxence V. Nachury
1
加利福尼亚大学旧金山分校眼科学系；美国加利福尼亚州，邮政编码 94143
2
加利福尼亚大学旧金山分校史密斯心血管研究所；美国加利福尼亚州，邮政编码 94143
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maxence.nachury{at}ucsf.edu
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摘要
信号受体可通过回收到细胞内或随细胞外囊泡（EV）分泌这两种途径离开纤毛，后一过程称为外胞出芽（ectocytosis）。调控外胞出芽的机制仍不清楚。在此，我们利用定量蛋白质组学分析，鉴定出 Hedgehog 信号通路受体 Smoothened（SMO）是纤毛来源 EV 的主要货物之一。令人意外的是，促进 SMO 在纤毛中积累的配体强烈抑制其被包装进入 EV，这表明外胞出芽选择性地包装处于特定构象状态的 SMO。我们进一步发现，被包装进入 EV 的 SMO 带有大量 K63 连接型泛素链修饰。阻止 SMO 泛素化或选择性去除 SMO 上的 K63 连接型泛素链，均显著减少了 SMO 随 EV 分泌，并导致 SMO 在纤毛内积累。综上，这些结果表明，K63 连接型泛素链是纤毛外胞出芽的分选信号，并提示非活性 SMO 的泛素依赖性包装有助于 Hedgehog 信号传导过程中 SMO 的动态再分布。
引言
纤毛是暴露于细胞表面的特化细胞器，其发挥着一种
在信号通路的组织与信号转导中发挥关键作用¹–³。Hedgehog（Hh）信号转导的核心是对G蛋白偶联受体（GPCR）Smoothened（SMO）在纤毛内积累的调控⁴。控制纤毛内SMO丰度的一种机制是BBSome介导的回运，在此过程中，鞭毛内运输（IFT）系统与BBSome复合物将膜蛋白从纤毛运回细胞内。在未受刺激的细胞中，SMO持续进出纤毛，单分子成像研究表明，这种组成性输出由BBSome介导⁵˒⁶。Hh通路的激活抑制SMO回运，从而促进其在纤毛内积累⁵–⁷。K63连接的泛素（K63Ub）链的受调控缀合，为GPCR提供了供泛素识别蛋白TOM1L2和CFAP36识别的标记，随后由BBSome和IFT系统将其移出纤毛⁹–¹³；这种修饰通常与内体–溶酶体分选有关⁸。
GPCR以活性依赖性方式离开纤毛的另一种途径，是被包装进从纤毛膜出芽形成的细胞外囊泡（EV）中，这一过程称为纤毛胞外出芽¹⁴–¹⁶。这一在进化上保守的过程，不仅可在超出回运能力时清除多余的纤毛物质¹⁷–²⁰，还可能促进交配²¹˒²²、趋化²³和免疫逃逸²⁴等过程中的细胞间通信。然而，检验纤毛胞外出芽生理重要性的一个主要障碍在于，其潜在机制仍在很大程度上尚未得到阐明。因此，纤毛胞外出芽是否参与纤毛内SMO丰度的动态调控，仍不得而知。
更根本的是，我们尚不清楚胞外出芽如何
相关分子机器选择货物并将其包装至纤毛细胞外囊泡（EV）中。由于膜运输过程中的货物选择通常由翻译后修饰决定，泛素化因而成为一种颇具吸引力的候选分选信号。尽管泛素化作为BBSome介导的纤毛回收过程中的分选信号已得到充分证实，但泛素是否也指导货物选择性装载至纤毛EV中，目前仍不清楚。
在本研究中，我们鉴定出SMO是哺乳动物细胞纤毛EV的主要货物之一，并证明其包装至EV中需要K63连接的泛素链。我们进一步发现，胞外出芽选择性地包装不具备信号传导能力的SMO形式。这些发现揭示了胞外出芽与BBSome介导的回收过程之间出人意料的机制共性，并提示胞外出芽有助于Hedgehog信号传导过程中SMO的动态再分布。
结果
纤毛EV的蛋白质组分析揭示候选货物及胞外出芽调控因子
为深入了解信号依赖性纤毛胞外出芽的机制，我们采用定量蛋白质组学系统鉴定纤毛EV的组成。我们选择小鼠IMCD3细胞作为模型系统，因为该细胞能够准确重现纤毛运输和信号传导机制。与既往研究¹⁷一致，通过差速超速离心可在小型EV（sEV）组分中检测到纤毛膜标志物ARL13B；而在Cep164⁻/⁻细胞中，通过遗传手段消除纤毛后，sEV组分中的ARL13B随之消失，但广泛存在于EV中的标志物CD9的分泌不受影响（图S1A）。为鉴定经纤毛分泌至EV中的蛋白质，我们首先采用Cilia-APEX2系统²⁵,²⁶，在EV产生前选择性地对纤毛内的蛋白质进行生物素标记，并
从sEV中分离生物素化蛋白（图S1B）。该方法鉴定出129种蛋白，其中包括鞭毛内运输复合物B（IFT-B）的多个亚基、IFT驱动蛋白kinesin-2以及BBSome复合物。
第二种方法基于蛋白质相关性谱分析，利用了纤毛蛋白回收受损时（如在Ift27⁻/⁻细胞中）纤毛胞外出芽增加，而纤毛缺失时（如在Cep164⁻/⁻细胞中）该过程不发生的特点。采用定量串联质量标签（TMT）质谱法²⁷–²⁹，对野生型（WT）、Cep164⁻/⁻和Ift27⁻/⁻各四个重复样本的sEV蛋白质组进行谱分析（图1A），发现一个蛋白簇符合纤毛sEV的预期特征（Ift27⁻/⁻ ≫ WT > Cep164⁻/⁻）（图1B和图S1C）。
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图1.
纤毛EV的定量蛋白质组谱分析。
A. 蛋白质组谱分析工作流程示意图。将WT IMCD3细胞、纤毛形成缺陷（Cep164⁻/⁻）细胞和纤毛蛋白回收缺陷（Ift27⁻/⁻）细胞培养至接近汇合，随后进行20小时血清饥饿处理，以诱导纤毛形成和EV释放。通过差速超速离心从培养上清液中纯化EV³⁹。裂解小型EV（sEV）组分，使用SP3磁珠进行纯化⁴⁰，再通过胰蛋白酶珠上酶解释放肽段。每个sEV样本均使用一种独特的串联质量标签（TMT）进行标记。随后将所有样本混合，采用同步前体离子选择MS³方法对肽段进行质谱鉴定和定量。每种基因型均分析四个生物学重复。
B. sEV蛋白质组的双向层次聚类分析。将某一样本中给定蛋白的TMT信号除以所有样本中该蛋白TMT信号的总和，计算其相对丰度。配色方案的
相对丰度显示于右下角（以百分比表示）。所有鉴定出的蛋白质均显示在热图中。与纤毛相关的两个 sEV 簇以放大视图展示，其中每条细线代表一种蛋白质，粗线代表该簇中所有蛋白质的平均值。
C
. 纤毛 sEV 簇的示意图。根据蛋白质已知的定位和功能，将其划分为不同亚组。在 Cilia-APEX2 sEV 蛋白质组中鉴定出的蛋白质以粗体显示。
纤毛 sEV 簇主要包含已知的纤毛蛋白，涵盖 IFT-A、IFT-B、BBSome 和驱动蛋白-2 的几乎所有亚基、动力蛋白-2 的马达亚基，以及少量过渡区蛋白和纤毛膜蛋白（图 1C）。与先前发现 EV 从纤毛顶端出芽的研究¹⁴,¹⁵,³⁰一致，大多数已知定位于纤毛顶端的蛋白质均存在于纤毛 EV 簇中。纤毛 sEV 簇中超过三分之一的蛋白质属于 Cilia-APEX2 sEV 蛋白质组，包括 SMO、ARL13B、SMO 的泛素连接酶复合物 MEGF8/MGRN1³¹，以及由 HRS 与 STAM 或其近缘旁系同源蛋白 STAM2 组成的 ESCRT-0 复合物。综上，这些蛋白质组学方法表明，纤毛 sEV 簇代表了经统计学验证的、IMCD3 细胞经由纤毛分泌的 EV 的蛋白质组。
除纤毛 sEV 的特征谱（Ift27⁻/⁻ ≫ WT > Cep164⁻/⁻）外，sEV 蛋白质组谱分析方法还揭示了一个仅具有纤毛依赖性的 sEV 蛋白簇（WT ∼ Ift27⁻/⁻ > Cep164⁻/⁻）（图 1B 和 S1C）。纤毛 sEV 簇中，已知纤毛蛋白占 55%，在 Cilia-APEX2 sEV 蛋白质组中鉴定出的蛋白质占 36%；相比之下，在该簇中，不足 3% 的蛋白质
纤毛依赖性 sEV 簇中的蛋白质为已知纤毛蛋白，且不足 6% 存在于 Cilia-APEX2 sEV 蛋白质组中。这些结果表明，尽管纤毛依赖性 sEV 簇中这些蛋白质的分泌可能依赖于纤毛，但它们并非经由纤毛分泌。值得注意的是，纤毛依赖性 sEV 簇包含 ESCRT-I 和 ESCRT-III/VPS4 复合物的多个亚基。可能经由非纤毛途径分泌的纤毛依赖性 sEV 的存在，凸显了联合使用多种纤毛缺失细胞和回收缺陷细胞来界定纤毛 sEV 蛋白质组的重要性。
SMO 的胞外出芽受其构象状态调控
为验证质谱分析结果，我们构建了稳定表达中等水平 FLAG 或 NanoLuciferase（NLuc）融合 SMO 的细胞系（图 S2A），并证实 SMO^FLAG 和 SMO^NLuc 的信号依赖性及 BBSome 依赖性纤毛动态变化（图 S2B，另见图 3F 和 H）与内源性 SMO 一致³²。我们对来自野生型（WT）、Cep164⁻/⁻ 和 Ift27⁻/⁻ 细胞的 sEV 进行了免疫印迹分析，检测 SMO^FLAG 或 SMO^NLuc、ARL13B、通用 EV 标志物 CD9 以及内质网标志物 GP96（图 2A 和 S2C）。分泌比率（sEV 中检测到的总量与细胞内总量之比，见方法）的测定结果显示，约 2% 的 SMO^FLAG 或 SMO^NLuc 被分泌至 sEV 中。与我们的定量蛋白质组学结果一致，SMO 和 ARL13B 的分泌均严格依赖于纤毛，而 CD9 的分泌则不依赖于纤毛；当回收功能受损时，前两者的分泌比率升至近 5%。这些结果表明，SMO 被高效选择并包装至纤毛 EV 中。
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图 2.
SMO 是纤毛 EV 的主要货物。
接近汇合的 WT、Cep164⁻/⁻ 和 Ift27⁻/⁻
将稳定表达 SMO-FLAG-NLuc（SMO^NLuc）的 IMCD3 细胞进行血清饥饿处理，并使细胞外囊泡（EV）分泌持续进行 20 h。
A.
从培养上清液中制备小型细胞外囊泡（sEV），并对细胞裂解液和 sEV 组分进行 FLAG、ARL13B、CD9 和 GP96 的免疫印迹检测。SMO^NLuc 和 ARL13B 的分泌比率显示于免疫印迹图下方。所有免疫印迹均上样 10 μg 细胞裂解液（相当于总样品的 0.1–0.19%）。检测 SMO 和 ARL13B 时，上样 P100 组分的 30%；检测 CD9 和 GP96 时，上样其 10%。
B.
对细胞进行 FLAG 和乙酰化微管蛋白（纤毛）染色，并以散点图展示 FLAG 通道中的纤毛荧光强度。在本图及所有散点图中，粗横线表示中位数，虚线表示第一和第三四分位数。每个细胞系分析 N = 50 根纤毛；au，任意单位。图下方显示代表性纤毛图像。比例尺，1 μm。SMO^NLuc 的纤毛胞外出芽指数以柱状图展示。
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图 3.
非活性形式的 SMO 经纤毛分泌至 EV 中。
A.
基于 NanoLuc 荧光素酶的 SMO 分泌检测示意图。将 IMCD3-[SMO-FLAG-NLuc] 细胞培养至接近汇合，随后进行血清饥饿处理，以诱导纤毛形成及纤毛 EV 释放。使用 Nano-Glo 荧光素酶检测试剂测定培养上清液和细胞中的荧光素酶活性。
B.
信号传导对 SMO^NLuc 分泌的调控。将接近汇合的 IMCD3-[SMO-FLAG-NLuc] 细胞进行血清饥饿处理 20 h。向细胞中加入新鲜饥饿培养基，其中分别添加 20% Shh 条件培养基、200 nM SAG、5 μM 环巴胺、200 nM SANT-1 或溶剂对照，并使 EV 产生持续进行 4 h。测定培养上清液及细胞中的 SMO^NLuc 水平
使用NanoLuc测定法进行检测。同时，将培养于盖玻片上并接受相同处理的细胞固定并染色，以测定纤毛内SMO^NLuc的水平。每个蓝点代表一次实验测得的SMO^NLuc纤毛胞外出芽指数。N = 4次独立实验。星号表示非配对t检验的显著性水平。**p < 0.0001；p < 0.005。
C–D. Shh对内源性SMO分泌的调控。将接近汇合的NIH-3T3细胞进行血清饥饿处理，并在添加或不添加20% Shh条件培养基的条件下处理20 h。
C. 从培养上清液中制备小型细胞外囊泡（sEV），并对细胞裂解液和sEV组分中的SMO、ARL13B、CD9和GP96进行免疫印迹检测。抗SMO抗体的验证见图S2F。所有免疫印迹均上样20 μg细胞裂解液（相当于总样品的0.3%）。检测SMO和ARL13B时，上样P100组分的20%；检测CD9和GP96时，上样P100组分的10%。
D. 对细胞中的SMO和乙酰化微管蛋白（纤毛）进行染色，并以散点图展示SMO通道中的纤毛荧光强度。每种条件下分析的纤毛数N = 30–36。图表下方展示代表性纤毛图像。比例尺，1 μm。以柱状图展示SMO的纤毛胞外出芽指数。
E–F. SAG对SMO^FLAG分泌的调控。将接近汇合的IMCD3-[SMO-FLAG]细胞进行血清饥饿处理，并在添加或不添加200 nM SAG的条件下处理20 h。
E. 从培养上清液中制备sEV，并对细胞裂解液和sEV组分中的FLAG、ARL13B、CD9和GP96进行免疫印迹检测。所有免疫印迹均上样细胞裂解液总量的0.2%。检测SMO和ARL13B时，上样P100组分的30%；检测CD9和GP96时，上样P100组分的10%。
F. 对细胞中的FLAG和乙酰化微管蛋白（纤毛）进行染色，并测定纤毛荧光强度，所用通道为
将 FLAG 通道信号绘制为散点图。每种条件下分析的纤毛数 N = 50。图下方展示代表性纤毛图像。比例尺，1 μm。将 SMO^FLAG 的纤毛胞外出芽指数绘制为柱状图。
G–H.
环巴胺对 SMO^FLAG 分泌的调控。将接近汇合的 IMCD3-[SMO-FLAG] 细胞进行血清饥饿处理，并在添加或不添加 5 μM 环巴胺（Cyc）的条件下处理 20 h。免疫印迹（G）按 E 中所述方法进行；细胞染色、荧光测量及纤毛胞外出芽指数的计算（H）均按 F 中所述方法进行。
接下来，我们探究 Ift27⁻/⁻ 回收缺陷突变体中 SMO 分泌增加是否仅由回收受阻时纤毛内 SMO 含量增加所致。如果纤毛内所有 SMO 分子被包装进入细胞外囊泡（EV）的概率相同，那么分泌至 EV 中的 SMO 量将与纤毛内 SMO 的含量成正比。为确定纤毛内单个 SMO 分子被包装进入 EV 的可能性，我们将 EV 中检测到的 SMO 量按纤毛内 SMO 的荧光信号进行归一化，得到纤毛胞外出芽指数。SMO^FLAG 和 SMO^NLuc 的胞外出芽指数在 Ift27⁻/⁻ 与野生型（WT）细胞中相近（图 2B 和 S2D），表明强制使 SMO 在纤毛内积累本身并不影响其胞外出芽效率。
SMO 胞外出芽的通量相对较高，提示该过程可能参与 SMO 的信号依赖性转运。为简化不同条件下 SMO 分泌量的测定，我们利用发光检测直接测定培养上清液和细胞中的 SMO^NLuc（图 3A）。荧光素酶测定能够忠实反映纤毛胞外出芽，因为在 Cep164⁻/⁻ 细胞中去除纤毛后，SMO^NLuc 的分泌量降至原来的五分之一以下（图 S2E）。为
为确定SMO的分泌是否受其活性调控，我们使用天然配体Sonic Hedgehog（Shh）、SMO激动剂SAG或SMO拮抗剂环巴胺和SANT-1处理细胞。当细胞接受环巴胺、SAG或Shh处理时，SMO^NLuc的胞外出芽指数降低了75%至90%，而SANT-1处理则使该指数小幅升高（图3C）。
值得注意的是，环巴胺可使纤毛内积聚与激活相解耦，因为这种SMO配体在阻断Hedgehog通路活性的同时，会促进SMO在纤毛内积聚³³˒³⁴。因此，所有促进SMO在纤毛内富集的配体，无论其是否能够激活SMO，均降低了SMO^NLuc被包装进入细胞外囊泡（EV）的可能性。我们采用常规EV制备方法，并检测3T3细胞中的内源性SMO，对这些结果进行了验证；3T3细胞是一种被广泛认可的用于研究Hh应答的细胞系³⁵。在该细胞系中，使用Shh激活Hedgehog通路使内源性SMO的纤毛胞外出芽指数降低了82%，证实通过天然方式激活SMO可显著抑制其在纤毛处被包装进入EV（图3C–D）。
我们在IMCD3-[SMO-FLAG]细胞系中采用常规EV制备方法，检测了SAG和环巴胺对SMO^FLAG分泌的影响，发现这两种配体尽管对其下游信号传导的作用相反，但均可促进SMO在纤毛内积聚，并使SMO的纤毛胞外出芽指数降低超过92%（图3E–I）。我们注意到，环巴胺（图3E）、SAG（图3G）或Shh（图3I）处理均不影响ARL13B的分泌。同样，纤毛小型细胞外囊泡（sEV）蛋白簇中的其他蛋白，包括EVC、HRS和STAM2，其分泌比率在SAG处理后均未发生显著变化（图S2G）。
……的显著降低
当SMO与促进其纤毛滞留的配体结合时，其纤毛胞外出芽效率的变化与Ift27⁻/⁻细胞中SMO纤毛胞外出芽效率保持不变的情况形成对比（图2B和S2D）。这些结果表明，获得能够支持纤毛富集的构象会显著降低SMO在纤毛处被包装进入小型细胞外囊泡（sEV）的可能性。我们得出结论：纤毛胞外出芽机制优先选择尚未采取能够支持纤毛滞留构象的SMO分子。
K63连接型泛素链是SMO分泌进入sEV所必需的
我们注意到，sEV组分中相当一部分SMO呈现为高分子量拖尾，提示其发生了多聚泛素化（图2A和S2C）。事实上，从sEV组分中免疫沉淀SMO后，检测到大量与SMO相关联的K63连接型泛素链（图4A）。此外，使用USP2（一种广谱去泛素化酶）或AMSH（一种特异性识别K63连接的去泛素化酶）处理sEV裂解液，均使SMO拖尾减少至相似程度（图4B），表明sEV中连接于SMO的泛素链以K63连接为主。
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图4.
SMO的泛素化是其分泌进入sEV所必需的。
A.
EV中SMO的泛素化。收集接近汇合且经血清饥饿处理的Ift27⁻/⁻ IMCD3细胞，以及野生型（WT）和Ift27⁻/⁻ IMCD3-[SMO-FLAG]细胞所产生的sEV并进行裂解，使用抗FLAG树脂捕获SMO^FLAG，随后对洗脱液进行免疫印迹检测，检测FLAG、泛素（Ub）和K63连接型泛素链（UbK63）。
B.
sEV的去泛素化酶处理。收集Ift27⁻/⁻ IMCD3-[SMO-FLAG]细胞所产生的sEV，裂解后用2 μM USP2或2 μM AMSH处理。对样品进行免疫印迹检测，检测FLAG、UbK63、Ub和ARL13B。高分子量部分的相对强度
对SMO^FLAG的高分子量拖尾条带进行了定量，结果如图所示。
C. 胞质侧赖氨酸去除（cK0）对SMO分泌的影响。从稳定表达SMO^FLAG或SMO^FLAG cK0的Ift27^−/− IMCD3细胞中制备小型细胞外囊泡（sEV）。对细胞裂解液和sEV组分进行免疫印迹检测，检测指标为FLAG、ARL13B、CD9和GP96。所有免疫印迹均上样20 μg细胞裂解液（占总样品的0.42%–0.55%）。检测SMO和ARL13B时，上样P100组分的25%；检测CD9和GP96时，上样P100组分的10%。对SMO^FLAG和ARL13B的分泌比率以及SMO^FLAG的纤毛胞外出芽指数进行了定量，结果如图所示。
D. 胞质侧赖氨酸去除（cK0）对纤毛中SMO水平的影响。将稳定表达SMO^FLAG或SMO^FLAG cK0突变体的Ift27^−/− IMCD3细胞用200 nM SAG处理或不处理，随后对FLAG和乙酰化微管蛋白（纤毛）进行染色，并以散点图展示纤毛中FLAG通道的荧光强度。N = 146–163根纤毛，来自3次独立实验；星号表示非配对t检验的显著性水平。ns，无显著差异（p = 0.10）。***，p < 0.001。au，任意单位。图下方展示了代表性纤毛图像。比例尺，1 μm。
K63连接的泛素链指导膜运输过程中的分选决策，主要将膜蛋白靶向至溶酶体进行降解，同时也标记GPCR，使其从纤毛中回收⁹˒¹⁰。为确定泛素化是否标记SMO并使其被包装入纤毛细胞外囊泡，我们将SMO胞质侧的所有赖氨酸残基突变为精氨酸（cK0），以消除SMO的泛素化。与野生型SMO相比，SMO^cK0的分泌比率降低了20倍以上（图4C），而ARL13B或CD9的分泌未受影响。相应地，阻断SMO泛素化使纤毛中的SMO水平升高了近10倍。
在 Ift27⁻/⁻ 回收缺陷突变体中，纤毛内 SMO^cK0 水平达到接近经 SMO 激动剂 SAG 处理后所见的最高水平（图 4D）。
为专门检验 K63Ub 连接在将 SMO 分选至胞外囊泡（EV）中的作用，我们将 AMSH 的催化结构域与 SMO 融合（图 5A）。AMSH 使 SMO 分泌量降低至原来的 1/5–1/10，而催化失活的 AMSH 未改变 SMO 的分泌量（图 5B）。同样，阻断 SMO 的胞外出芽释放导致纤毛内 SMO 水平显著升高（图 5C），其中纤毛内 SMO-AMSH 达到通常在 SAG 处理细胞中观察到的水平（图 S3）。阻断回收并未进一步提高纤毛内 SMO-AMSH 的水平（图 5C 和图 S3），表明去除 SMO 上的 K63Ub 链会同时阻断胞外出芽释放和回收。这些结果共同表明，K63Ub 链是将 SMO 包装入纤毛胞外囊泡的标记。
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图 5.
SMO 分泌至小型胞外囊泡（sEV）需要 UbK63 链。
A.
靶向去泛素化策略示意图。
（B–C）
强制去泛素化对 SMO 胞外出芽释放的影响。
B.
从稳定表达 SMO^FLAG、SMO^FLAG-AMSH 或 SMO^FLAG-AMSH^✝（催化失活的 E38A 突变体）的野生型（WT）和 Ift27⁻/⁻ IMCD3 细胞中制备 sEV。对细胞裂解液和 sEV 组分进行免疫印迹分析，检测 FLAG、ARL13B、CD9 和 GP96。检测 SMO 和 ARL13B 时，对 20 μg 细胞裂解液（占总样品的 0.36%–0.76%）及 20% 的 P100 组分进行免疫印迹分析。检测 CD9 和 GP96 时，对 10 μg 细胞裂解液（占总样品的 0.18%–0.38%）及 5% 的 P100 组分进行免疫印迹分析。图中展示了 SMO^FLAG 和 ARL13B 的分泌比率以及 SMO^FLAG 的纤毛胞外出芽指数的定量结果。
C.
对细胞进行 FLAG 染色
以及乙酰化微管蛋白（纤毛），并以散点图展示 FLAG 通道中的纤毛荧光强度。N = 150 根纤毛，来自 3 次独立实验；星号表示非配对 t 检验的显著性水平。ns，无显著性差异（p = 0.201）。，p < 0.01；*，p < 0.001。au，任意单位。图下方展示了代表性纤毛图像。比例尺，1 μm。
讨论
K63 连接的泛素链作为纤毛胞外出芽的分选信号
我们的研究发现，K63 连接的泛素链是纤毛胞外出芽的分选信号。尽管已知泛素化参与 ARRDC1 介导的微囊泡的生物发生³⁶–³⁸及其他膜运输过程，但其在纤毛细胞外囊泡（EV）货物选择中的作用此前尚不明确。我们发现，被包装进入纤毛 EV 的 SMO 分子受到大量 K63 连接的泛素链修饰，而阻止 SMO 泛素化或选择性去除 SMO 上的 UbK63 链，均可显著抑制其通过 EV 分泌。综上，这些结果确立了泛素化作为一种分子信号的作用，可将货物标记为经纤毛胞外出芽排出的对象。
鉴定出 UbK63 链是胞外出芽的分选信号，这一点尤为值得关注，因为同一种修饰也引导 G 蛋白偶联受体（GPCR）从纤毛中回收⁹˒¹¹。因此，纤毛两条主要输出途径的货物选择依赖于共同的分子标记。这一发现揭示了回收与胞外出芽在机制上存在出乎意料的共通之处。我们发现 UbK63 链可作为胞外出芽的分选信号，这有助于解释为何与泛素（Ub）融合的纤毛 GPCR 会从回收缺陷细胞的纤毛中消失¹¹；然而，同一种翻译后修饰既促进货物分选进入纤毛 EV，又促进其回收，这一发现提出了一个难题。
若干
这些模型或可解释同一种泛素信号如何介导两条不同的输出途径。回收与胞外出芽可能通过不同的泛素识别蛋白，竞争同一泛素化货物池。在这种情形下，回收通常会将大多数泛素化蛋白从纤毛中移除，而当局部泛素化货物的浓度超过回收能力时，胞外出芽则可能成为更受青睐的途径。另一种可能是，泛素修饰本身的其他特征，如链结构、链长度或相关结合伙伴，可能使货物倾向于进入其中一条途径。最后，除泛素化以外的其他修饰也可能将货物导向某一途径。要区分这些可能性，需要鉴定在纤毛胞外出芽过程中识别泛素化货物的分子机器。
受调控的泛素化可能是胞外出芽过程中选择性识别货物的基础
既往研究已证实，纤毛胞外出芽能够选择性地将信号受体从纤毛中移除¹⁷。我们的发现进一步提示了可能构成这种选择性基础的分子机制。我们发现，促进SMO滞留于纤毛的配体，无论其激活还是抑制下游Hedgehog信号传导，均会强烈抑制SMO被包装进入细胞外囊泡（EV）。因此，胞外出芽并非仅仅随纤毛内SMO丰度的变化而变化。相反，它优先选择尚未形成能够使其滞留于纤毛的构象的那部分SMO分子。
我们的研究确定，SMO是IMCD3和NIH-3T3细胞中纤毛来源EV的主要货物之一，在16小时内，多达细胞内SMO总量的5%被分泌至纤毛来源EV中。结合非活性SMO被优先包装这一现象，如此可观的转运通量提示，
胞外出芽对选择性清除纤毛中未被保留的SMO分子具有重要作用。
据提出，SMO的不同构象之间存在动态平衡，而这些构象驻留于纤毛内的能力有所不同³³,³⁴。我们发现，促进SMO在纤毛内保留的配体，无论使其处于活性形式（Shh、SAG）还是非活性形式（环巴胺），均会显著抑制SMO从纤毛中的胞外出芽。因此，不具备纤毛驻留能力的SMO被优先包装，提示胞外出芽参与了Hedgehog信号传导过程中SMO的动态再分布。更广泛地说，这些发现提示，选择性泛素化可能提供了一种生化机制，用于区分同一受体的不同构象状态，并将这种区分与货物分选进入细胞外囊泡（EV）的过程相耦联。
一种已提出的纤毛内SMO受调控泛素化机制涉及泛素连接酶WWP1¹⁰。该连接酶与Hedgehog受体Patched1相关联，而Hedgehog依赖性的Patched1从纤毛中移除会降低SMO的泛素化水平。然而，这一模型难以解释环巴胺或SAG的作用，因为二者均通过直接作用于SMO来促进其在纤毛内积累，而非通过经典的Patched1抑制及其从纤毛中移除的途径。这些观察结果支持存在能够直接识别不具备纤毛内保留能力的SMO分子的泛素化机器。
在此背景下，纤毛来源EV的蛋白质组中存在跨膜泛素连接酶复合物MEGF8/MGRN1这一发现值得关注。MEGF8/MGRN1可促进SMO泛素化及其从细胞表面移除³¹，因此可能是标记非活性SMO分子以使其被清除的候选因子。
从纤毛中移除。阐明泛素化机制如何区分SMO的不同构象状态，对于理解纤毛膜组成如何得到主动维持至关重要。
结论
总之，我们的研究发现，SMO是纤毛胞外囊泡（EV）的主要货物，并确立了K63连接的泛素链作为分选信号，介导SMO被包装进入EV。SMO通过外胞出芽途径排出的通量相当可观，且非活性SMO被优先包装，这表明外胞出芽有助于在Hedgehog信号传导过程中动态调控纤毛内SMO的丰度。更广泛而言，回收与外胞出芽均依赖UbK63链，揭示了这两条主要纤毛输出途径之间出乎意料的机制联系，同时也提出了一个问题：泛素化货物如何被分配至这两条途径？解决这一问题将为理解纤毛外胞出芽与回收机制如何选择并移除纤毛中的信号受体提供重要见解。
材料与方法
本研究使用的所有试剂与资源均列于表S1。
质粒
为进行细菌表达，扩增小鼠SMO（第560–793位氨基酸）编码序列，并通过常规克隆方法将其克隆至pGPS1（GST-HRV3C-Stag-）和pET-28(+)（6xHis-Thrombin-T7tag）载体中。
通过PCR扩增FLAG标记的小鼠SMO（Addgene，质粒编号164532）和FLAG标记的小鼠SMO（cK0）（Addgene，质粒编号164545）的编码序列，并将其克隆至pCrysB-FRT-DEST载体中。通过PCR扩增NanoLuciferase（由金斯瑞合成）、AMSH催化结构域及其催化失活突变体⁹的编码序列，并将其克隆至pCrysB-FRT-SMO-FLAG载体中。
为在IMCD3 Flp-In细胞中敲除Cep164，按照此前描述的方法²⁵，将靶向小鼠Cep164第8外显子的gRNA克隆至pX459V2.0-eSpCas9(1.1)中。
细胞
细胞培养
本研究使用的所有稳定细胞系均由亲本IMCD3-FlpIn细胞系（由美国加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学Peter K. Jackson惠赠）改造获得。IMCD3-FlpIn细胞在DMEM/F12培养基（11330-057；Gibco）中培养，培养基中补充10%胎牛血清（FBS；100-106；Gemini Bio-products）、100 U/mL青霉素-链霉素（400-109；Gemini Bio-products）和2 mM L-谷氨酰胺（400-106；Gemini Bio-products）。通过在不含FBS的培养基中进行血清饥饿处理16至24 h，诱导纤毛形成。
3T3-FlpIn细胞系（Thermo R76107）在DMEM培养基（ThermoFisher，11995-065）中培养，培养基中补充10% FBS、100 U/mL青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1×非必需氨基酸（Cytiva SH30238.01）。通过在不含FBS的培养基中进行血清饥饿处理16至24 h，诱导纤毛形成。
转染与稳定细胞系的构建
为构建表达SMO融合蛋白的稳定细胞系，按照文献41所述，使用XtremeGene9（Roche），通过反向转染法将编码Flp重组酶的质粒（pOG44）与基于FRT的质粒共同转染至IMCD3 Flp-In细胞中。通过杀稻瘟菌素抗性筛选稳定转化细胞，筛选浓度为4 μg/mL。
为在IMCD3 Flp-In细胞中对Cep164进行基于CRISPR的基因组编辑，使用pX459衍生载体瞬时表达Cas9和向导RNA，并用嘌呤霉素筛选转染细胞。通过有限稀释法分离克隆，并通过免疫荧光筛选缺乏纤毛的克隆。
抗体与药物
免疫荧光实验使用了以下小鼠单克隆抗体：抗乙酰化微管蛋白抗体（克隆6-11B-1；Sigma-Aldrich；1:500）、抗FLAG抗体（克隆M2，F1804；Sigma-Aldrich；1:1000）。
免疫荧光实验使用了以下兔多克隆抗体：抗SMO抗体（本研究；1:500）。
以下单克隆
免疫印迹使用了以下抗体：抗FLAG抗体（小鼠；克隆M2，F1804；Sigma-Aldrich；1:1000）、抗ARL13B抗体（小鼠；ab136648；Abcam；1:500）、抗CD9抗体（大鼠；sc-18869；Santa Cruz；1:1000）、抗GP96抗体（大鼠；ADI-SPA-850-D；Enzo；1:1000）、抗SMO抗体（Maike De La Roche惠赠；1:500）。
以下试剂按所示浓度使用：200 nM SAG、5 μM环巴胺、200 nM SANT-1。环巴胺溶于乙醇，SAG和SANT-1溶于DMSO。
显微成像
固定样品成像
对于固定样品成像，将50,000个细胞接种于经酸洗的直径为12 mm的1.5号盖玻片（12-545-81；Thermo Fisher Scientific）上，培养24 h，然后在实验处理前进行20至24 h的血清饥饿处理。处理后，用PBS配制的4%多聚甲醛（50-980-487；Thermo Fisher Scientific）于37 °C固定细胞15 min。随后，在IF缓冲液［PBS中添加0.1% Triton X-100、5%正常驴血清（017-000-121；Jackson ImmunoResearch Laboratories）和3%牛血清白蛋白（BP1605-100；Thermo Fisher Scientific）］中对细胞进行通透处理。然后，将细胞与用IF缓冲液稀释的一抗在室温下孵育1 h，用IF缓冲液洗涤三次，再与用IF缓冲液稀释的二抗（Jackson ImmunoResearch Laboratories）孵育30 min。随后，用IF缓冲液洗涤细胞三次，并用Hoechst 33258（H1398；Molecular Probes）对DNA进行染色。再用PBS洗涤细胞两次，并使用Fluoromount-G（17984-25；Electron Microscopy Sciences）将盖玻片封固于载玻片上。
使用配备63×/1.4 NA油浸物镜的LSM 700（Zeiss）或LSM 900（Zeiss）共聚焦显微镜，或配备60×/1.4 NA油浸物镜的Nikon AX NSPARC显微镜对细胞进行成像。以0.5 μm的间隔采集Z轴图像堆栈。
图像分析
所有分析均将文件从 LSM700/900 或 Nikon AX NSPARC 工作站导入 ImageJ/Fiji（美国国立卫生研究院）进行。
纤毛信号的测量
对固定细胞中的纤毛信号（所有图中的所有蛋白质）进行定量时，均采用最大强度投影。纤毛荧光强度使用以下公式测量：
其中，\(F_{\mathrm{cilia\_measured}}\) 为在包含整根纤毛的掩膜内检测到的纤毛总荧光，\(F_{\mathrm{background}}\) 为在邻近区域测得的荧光。使用 ImageJ 沿纤毛长轴绘制一条宽度为 3 像素的线作为掩膜，测量 \(F_{\mathrm{cilia\_measured}}\)；将相同的掩膜向侧方平移 2～3 像素，在邻近区域测量 \(F_{\mathrm{background}}\)。所有测量均采用积分密度。
使用 GraphPad Prism 将纤毛荧光强度 \(F_{\mathrm{cilia}}\) 绘制为散点图。每个点代表一个独立数据点，图中展示了所有数据点。实线和虚线分别表示中位数和四分位距。
EV 相关方法
小型细胞外囊泡的制备
小型细胞外囊泡（sEV）按照文献 39 所述方法制备，并作少量修改。将 IMCD3 细胞接种于 15 cm 培养皿中，使用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM/F12 培养基培养至接近汇合。随后，将培养基更换为不添加 FBS 的 DMEM/F12 培养基，以诱导纤毛形成及纤毛来源细胞外囊泡的释放。20～24 h 后收集培养基，并按照图 1A 所示流程纯化细胞外囊泡。首先，将培养上清液转移至 50 mL 锥形离心管中。用 10 mL PBS 轻柔冲洗培养皿，并将冲洗液转移至该锥形离心管中。其次，将锥形离心管于 4 ℃、300 × g 条件下离心 10 min。
以去除细胞体。随后，将上清液（S3）转移至新的50 mL锥形离心管中，于4 ℃、2000 × g离心20 min，以去除细胞碎片（P2）。所得上清液（S2）随后在Beckman SW-32水平转子中于4 ℃、10,000 × g离心40 min，以沉淀大型细胞外囊泡（EV）（P10）。所得上清液（S10）随后在SW-32转子中于4 ℃、100,000 × g离心90 min。用PBS洗涤沉淀，并在Beckman SW-55水平转子中于4 ℃、100,000 × g离心90 min。最终的P100沉淀即为小型细胞外囊泡（sEV）组分。
通过常规EV纯化和蛋白质印迹法测定分泌比率及纤毛胞外出芽指数
采用免疫印迹法分析纯化的sEV（P100）和细胞裂解液。为计算蛋白质的分泌比率，测量细胞裂解液和EV组分免疫印迹中的蛋白质条带强度，减去空白泳道中相同面积区域的背景强度，并将背景校正后的强度按比例换算至各组分的总量。分泌比率计算如下：
其中，I为在细胞裂解液或EV组分中测得的、经背景校正的蛋白质条带强度；LP为各组分的上样比例，即上样体积除以该组分的总体积。
为计算SMO的纤毛胞外出芽指数，在用于制备EV分离所需上清液的15 cm培养皿中放置一片盖玻片。在针对SMO进行免疫印迹的EV组分中测量经背景校正的条带强度，并在盖玻片上的细胞中测量经背景校正的纤毛SMO平均水平。纤毛胞外出芽指数计算如下：
其中，I为
在 EV 组分中测得的蛋白质条带经背景校正后的强度；LP 为上样至凝胶的 EV 所占比例；F_cilia 为纤毛中 SMO 经背景校正后的平均荧光强度。
通过 NanoLuc 测定检测 SMO^NLuc 的分泌
将稳定表达 SMO^NLuc 的 IMCD3 细胞接种于 96 孔板或 24 孔板中，在补充 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基中培养至接近汇合。随后，将培养基更换为不含 FBS 的 DMEM/F12，以诱导纤毛形成及纤毛 EV 的释放。24 h 后，按照制造商说明，使用 Nano-Glo® Luciferase Assay System（Promega N1110）进行 NanoLuc 荧光素酶测定。如图 3A 所示，将饥饿培养基和细胞加入复溶后的 Nano-Glo® Luciferase Assay Reagent 中，并使用多功能酶标仪（BioTek Cytation 5）测定总荧光素酶活性。
通过 NanoLuc 测定检测分泌比率和纤毛外出芽指数
为计算 SMO^NLuc 的分泌比率，通过 NanoLuc 测定分别检测细胞裂解液和培养上清液中 SMO^NLuc 的生物发光强度。SMO 分泌比率定义为饥饿培养基中检测到的总生物发光强度 B 除以细胞裂解液中检测到的总生物发光强度。
其中，B 为通过 NanoLuc 测定在细胞裂解液和培养上清液中测得的 SMO^NLuc 生物发光强度；LP 为用于 NanoLuc 测定的各组分所占比例。
我们注意到，通过对培养上清液进行荧光素酶测定得到的 SMO^NLuc 分泌比率（图 S2E）高于通过对 sEV 组分进行免疫印迹测定得到的分泌比率（图 2A），这可能反映出采用差速法纯化 sEV 时，含 SMO 的 sEV 未能被完全回收
超速离心。
为计算 SMO^NLuc 的纤毛胞外出芽指数，对盖玻片上的细胞进行与用于制备 NanoLuc 测定所分析的培养上清液的细胞相同的处理。通过 NanoLuc 测定检测培养上清液中 SMO^NLuc 的生物发光强度，并测量盖玻片上细胞中经背景校正的纤毛 SMO 平均水平。纤毛胞外出芽指数按如下方式计算：
其中，B 为通过 NanoLuc 测定检测的培养上清液中 SMO^NLuc 的生物发光强度；LP 为各组分中用于 NanoLuc 测定的比例；F_cilia 为纤毛中经背景校正的 SMO 平均荧光强度。
Shh 的制备
含 Shh 的条件培养基由 HEK239T-EcR-Shh 细胞制备，该细胞携带稳定整合的表达构建体，可在蜕皮激素诱导型启动子的控制下表达小鼠 Shh^42。将细胞培养至 80% 汇合度后，将培养基更换为不含胎牛血清（FBS）但添加了 5 μM ponasterone A 的 DMEM 或 DMEM/F12，收集 48 h 的条件培养基，随后用 0.22 μm 滤膜（EMD Millipore）过滤。通过使用 NIH-3T3 Light-II 报告细胞检测不同稀释度的条件培养基，确定 Shh 的效价；该报告细胞中稳定整合了由 GLI 驱动表达的萤火虫荧光素酶和组成型表达的海肾荧光素酶^35。刺激后，按照制造商说明，使用 Dual-Luciferase® Reporter Assay System（Promega E1960）进行双荧光素酶测定。使用 Passive lysis buffer 裂解细胞，并使用多模式酶标仪（BioTek Cytation 5）测量萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。作为条件培养基的最小用量
产生饱和响应所需的浓度为10%，而在图3B–D和图S2F中，使用20%的浓度以最大程度地激活该通路。
免疫沉淀
将Ift27⁻/⁻细胞、野生型（WT）细胞及稳定表达SMO-FLAG的Ift27⁻/⁻细胞培养至接近汇合，随后进行24 h血清饥饿处理，以诱导纤毛形成及纤毛细胞外囊泡（EV）的释放。收集培养上清液，并加入1 mM N-乙基马来酰亚胺以抑制去泛素化酶活性。采用差速超速离心法从培养上清液中纯化小型细胞外囊泡（sEV），随后在冰上用免疫沉淀（IP）缓冲液裂解sEV。IP缓冲液组成为50 mM Tris（pH 8.0）、150 mM NaCl、1% NP-40，并添加蛋白酶抑制剂（1 mM AEBSF、0.8 mM 抑肽酶、15 mM E-64、10 mg/mL 贝司他丁、10 mg/mL 胃蛋白酶抑制剂A和10 mg/mL 亮肽素）及1 mM N-乙基马来酰亚胺。通过与M2琼脂糖珠（A2220-1ML，Sigma-Millipore）在4 ℃孵育2 h，捕获SMO-FLAG。用IP缓冲液洗涤三次后，在LDS上样缓冲液中于37 ℃孵育10 min，洗脱结合的蛋白质。
去泛素化酶处理
将Ift27⁻/⁻ IMCD3 [SMO-FLAG]细胞培养至接近汇合，随后进行24 h血清饥饿处理，以诱导纤毛形成及纤毛EV的释放。采用差速超速离心法从培养上清液中纯化sEV，在冰上用DUB缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，1% NP-40，25 mM KCl，5 mM MgCl₂，1 mM DTT）裂解sEV样品，并用2 μM USP2或2 μM AMSH⁴³˒⁴⁴在37 ℃处理裂解后的sEV 1 h。随后将样品与LDS上样缓冲液混合，并于37 ℃孵育10 min。
免疫印迹
将细胞从培养板上刮取至裂解缓冲液（0.5% v/v Triton X-100、0.1% w/v SDS、0.3 M NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、25 mM Tris-HCl，pH 7.5）中，缓冲液中添加蛋白酶抑制剂（1 mM AEBSF、0.8 mM 抑肽酶、15 mM E-64、10
mg/mL Bestatin、10 mg/mL 胃蛋白酶抑制剂 A 和 10 mg/mL 亮肽素），并将裂解液与 LDS 上样缓冲液（247 mM Tris-HCl、2% w/v LDS、10% w/v 甘油、0.51 mM EDTA、0.22 mM 考马斯亮蓝 G250、0.175 mM 酚红，pH 8.5）混合。细胞外囊泡（EV）样品直接用 LDS 上样缓冲液裂解。向样品中加入 20 mM DTT（用于检测 CD9 和 GP96 的样品除外），并于 37 °C 孵育 10 min。将样品上样至 4–12% SDS-PAGE 凝胶（GenScript 或 Invitrogen），并使用 Criterion Blotter 湿转槽（Bio-Rad）转移至 PVDF 膜。膜在以 TBST 配制的 10% SeaBlock（Thermo Scientific）或 5% 奶粉（Bio-Rad）中于室温封闭 1 h，随后于 4 °C 与一抗孵育过夜。与 HRP 偶联的二抗或 HRP–蛋白 A（Jackson ImmunoResearch）孵育后，使用 ECL 或 Atto 化学发光检测试剂盒（Pierce）显影，并使用 Chemidoc Touch 系统（Bio-Rad）成像。
抗 SMO 抗体
由 Prosci（加利福尼亚州波威）制备针对小鼠 SMO 的兔多克隆抗血清。使用与 GST 融合的 SMO 蛋白片段（第 560–793 位氨基酸）免疫兔，该片段对应于不含第 8 螺旋的 SMO 胞质 C 端尾部。将六组氨酸标签融合的 SMO[560–793] 共价固定于琼脂糖凝胶微球（CNBr-Sepharose，Cytiva），制成亲和层析柱，从末次采血所得的抗血清中亲和纯化抗体。
纤毛来源 EV 的 APEX 标记与蛋白质组学分析
APEX 标记按照既往描述的方法进行²⁵,²⁶。将表达纤毛定位 APEX2（NPHP3[1–203]-APEX2）或对照 APEX2（NPHP3[1–203]G2A-APEX2）的 IMCD3 Ift27⁻/⁻ 细胞高密度接种，并通过血清饥饿诱导纤毛形成。细胞用 0.5 mM 生物素-酚预孵育 120
分钟，通过加入1 mM H₂O₂标记3分钟，随后用淬灭缓冲液（添加10 mM抗坏血酸钠、10 mM叠氮化钠和5 mM Trolox的1× PBS）洗涤细胞以终止反应。将细胞重新置于添加SAG的DMEM/F12培养基中，并放回37 °C培养2小时，使细胞外囊泡（EV）继续产生。收集培养上清液并进行小型细胞外囊泡（sEV）纯化。裂解sEV组分，使用链霉亲和素-琼脂糖微珠捕获生物素化蛋白。对捕获的蛋白进行珠上胰蛋白酶消化，并通过LC-MS²进行鉴定和定量。使用Preview和Byonic（ProteinMetrics）分析数据，进行基于谱图计数的定量。将缺失的谱图计数（SpC = 0）以0.2填补，以计算cilia-APEX2/control-APEX2比值。将两个样本中SpC均小于4的已鉴定蛋白从列表中排除。将cilia-APEX2/control-APEX2比值≥4的蛋白定义为Cilia-APEX2 sEV蛋白质组的候选蛋白。
sEV的TMS-MS分析
SP3微珠结合与消化
采用改良的SP3微珠方案⁴⁰处理纯化的细胞外囊泡，以进行蛋白质组学分析。使用含50 mM HEPES和50 mM NaCl的溶液将裂解液稀释至终体积250 μL。向样本中加入新鲜配制的1 M DDT水溶液，使其终浓度为5 mM，将样本置于振荡器上，在60 °C、1,000 rpm条件下振荡30分钟。冷却至室温后，加入以50 mM碳酸氢铵新鲜配制的400 mM碘乙酰胺溶液，使其终浓度为20 mM，对还原后的蛋白进行烷基化，避光反应30分钟。加入1 M DTT水溶液至终浓度50 mM，在室温下孵育15分钟，以终止烷基化反应。浓度为50 μg/μL的SP3微珠储备液
按照文献⁴⁰所述方法，在HPLC级水中以1:1（w/w）的比例混合疏水性和亲水性Sera-Mag SpeedBeads，制备磁珠悬液。向每份样品中加入10 μL浓度为50 μg/μL的SP3磁珠，随后加入250 μL乙醇。轻轻涡旋振荡使样品混匀，并于24 °C、1,000 rpm条件下孵育5 min。使用磁力架分离磁珠并去除上清液。用250 μL 80%乙醇洗涤结合蛋白质的磁珠，并去除上清液，共洗涤三次。随后进行磁珠上蛋白质酶解：加入50 μL酶解缓冲液（200 mM EPPS，pH 8.5，2%乙腈（v/v）），再按1:50的酶与底物比例加入LysC（2 mg/mL），于37 °C孵育3 h。另加入50 μL酶解缓冲液，并按1:100的酶与底物比例加入胰蛋白酶（2 mg/mL），于37 °C继续酶解7 h。使用磁力架去除磁珠，将澄清上清液转移至新的离心管中。
TMT标记
直接对酶解后的样品进行TMT标记。向每份样品中加入乙腈至30%（v/v），随后加入TMTpro 16plex试剂。反应在室温下进行1 h，每隔10 min涡旋振荡一次。为测定TMT标记效率并核查各通道比例，采用MS3分析混合后的12plex样品，确认标记效率>95%。加入50%羟胺水溶液至终浓度为0.5%（v/v），孵育15 min以终止标记反应。随后用甲酸将终止反应后的TMT样品酸化至pH低于3.0，并将各样品合并，形成12plex混合样品。减压蒸发溶剂至近干，以便随后采用台式碱性反相色谱进行分级分离。
（Pierce 高 pH 反相肽段分级试剂盒）。采用乙腈浓度分别为 10%、12.5%、15%、17.5%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、65% 和 80% 的 12 步梯度洗脱，将肽段分为 12 个组分。按以下方式合并乙腈洗脱组分：第 1 组分 + 第 7 组分、第 2 组分 + 第 8 组分、第 3 组分 + 第 9 组分、第 4 组分 + 第 10 组分、第 5 组分 + 第 11 组分、第 6 组分 + 第 12 组分，得到最终的分级样品。将最终样品完全干燥，随后使用 StageTip 进行样品净化。
质谱分析
在 Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪上进行分析之前，使用 EASY-nLC 1200 高效液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific），在填充有 2.6 μm Accucore 颗粒（Thermo Fisher Scientific）的毛细管色谱柱（长 30–40 cm，内径 100 μm）上分离肽段，柱温设为 60 °C。各组分中的肽段以 450 nL/min 的流速进行分离，在 240 min 内将缓冲液 B 的比例由 5% 梯度升至 100%；缓冲液 A 含 0.125% 甲酸（FA），缓冲液 B 含 95% 乙腈和 0.125% FA。所有数据均采用多窗口 MS3 TMT 方法采集⁴⁵。在 Orbitrap 中进行 MS 扫描，扫描范围为 m/z 400–1400，动态排除时间为 2 min。在离子阱中以 Turbo 速率进行 MS2 扫描，碰撞诱导解离（CID）能量设为 35%，最大离子注入时间不超过 400 ms。采用 55% 的高能碰撞诱导解离（HCD）能量进行碎裂后，在 Orbitrap 中通过同步前体离子选择（SPS-MS3）对 TMT 报告离子进行定量，扫描范围为 m/z 100–1000。Orbitrap 分辨率设为 50,000，离子注入时间可变，最长为 600 ms。所用液相色谱和质谱参数及设置的更多细节已于近期报道⁴⁶。
质谱数据分析
肽段被
使用基于 SEQUEST（v.28，rev. 12）的软件，在按大小排序的小鼠（Mus musculus）蛋白质组（UniProt 03/2021）正向和反向肽序列数据库中进行检索，数据库中添加了常见污染蛋白。检索时，前体离子的质量容差设为 20 ppm，碎片离子的质量容差设为 0.9 Da。每条肽段最多允许 2 个漏切位点。将甲硫氨酸残基氧化（+15.9949 Da）设为动态修饰，将碘乙酰胺烷基化的半胱氨酸（+57.0215 Da）以及肽段 N 端和赖氨酸上的 TMT 16plex 试剂标记（+229.1629 Da）设为静态修饰。
采用目标-诱饵数据库策略，在线性判别分析（LDA）过滤后，将肽段-谱图匹配（PSM）的假发现率（FDR）设为 1%。随后，最终归并后的蛋白质的 FDR 设为 1%。检索后对 MS1 数据进行校准，并再次检索。肽段定量信息来源于 MS3 谱图；TMT 信噪比定量要求 MS2 分离特异性 ≥70%，且任一给定肽段在所有 TMT 通道中的信噪比总和 ≥200。TMT 强度定量方法的详细信息及所用的其他检索参数已在既往文献中描述⁴⁶,⁴⁷。
统计分析
所有定量图表均使用 Prism 9.0.0（GraphPad）绘制，统计分析也使用该软件完成。图 3B、4D 和 5C 中的数据采用非配对 t 检验进行分析。
致谢
我们感谢 Maike De La Roche 惠赠抗体；Rohan Baker、David Komander 和 Greg Pazour 惠赠质粒；Yien-Ming Kuo 协助显微成像；Lei Wang 提供酶标仪使用支持；Ryan Leib 和斯坦福大学质谱平台进行数据采集；Jaclyn Goldstein
感谢为 Cilia-APEX EV 实验提供帮助的人员，以及 Nachury 实验室所有成员富有启发性的讨论。本研究由美国国立卫生研究院（NIH，GM089933，授予 MVN）和美国糖尿病协会（ADA，1-20-VSN-03，授予 MVN）资助。本研究还得到 EY002162 视觉研究核心资助及预防失明研究基金会非限定用途资助（MVN）的部分支持。
质谱蛋白质组学数据已通过 PRIDE 合作数据库提交至 ProteomeXchange 联盟，数据集标识符为 PXD057769。
已声明的资助方信息
美国国立普通医学科学研究所，
，GM089933
美国糖尿病协会，
，1-20-VSN-03
得克萨斯州癌症预防与研究所
，RR220032
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K63连接型泛素链标记非活性Smoothened，使其被包装入纤毛细胞外囊泡
Mingli
Zhu
,
Yash
Raj
,
Gary A.
Bradshaw
,
David U.
Mick
,
Marian
Kalocsay
,
Maxence V.
Nachury
bioRxiv
2026.07.01.735856;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735856
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K63连接型泛素链标记非活性Smoothened，使其被包装至纤毛细胞外囊泡中
Mingli
Zhu
,
Yash
Raj
,
Gary A.
Bradshaw
,
David U.
Mick
,
Marian
Kalocsay
,
Maxence V.
Nachury
bioRxiv
2026.07.01.735856;
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https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735856
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关键词：K63连接型泛素链 · Smoothened蛋白 · 纤毛胞外出芽 · 细胞外囊泡 · 载荷分选 · Hedgehog信号通路
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