胞外注射系统联合肽类治疗细胞内金黄色葡萄球菌感染

摘要

细胞内细菌难以接触，长期以来使金黄色葡萄球菌感染的治疗面临挑战。研究表明，胞外注射系统 PVC 可将蛋白质精准递送至细胞内，无需借助小分子，并能够实现抗菌肽的有效胞内递送以用于治疗。基于此，我们选择了具有强效杀菌活性的抗菌肽，包括 Cecropin、LL37 和 Indolicidin，并利用 PVC 的胞内递送能力建立了定向抗菌攻击平台（Directed Antimicrobial Assault platform，DAAT）。DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 均以剂量依赖性方式抑制胞内细菌，其中 DAAT LL37 的抑制率达到 86.76%；治疗 72 h 后，活菌数量降至对照组的 1/66–1/82。通过重新靶向尾纤维，可直接杀灭胞外金黄色葡萄球菌；联合 DAAT 治疗则促进了小鼠伤口愈合。这些发现拓展了 PVC 衍生纳米注射器的应用范围，并确立了 DAAT 作为一种用于胞内抗菌肽治疗的模块化平台。

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细胞外注射系统联合肽类治疗细胞内金黄色葡萄球菌

Lei Feng

Yingying Qiao

Haishan Xu

Gaojie Wang

Shilong Ren

Xudong Ouyang

Ningning Song

Xiangxiang Zhao

Xianchao Feng

doi：

https://doi.org/10.64898/2026.07.06.736670

Lei Feng

1

西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西杨凌西农路22号，邮编712100

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Yingying Qiao

1

西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西杨凌西农路22号，邮编712100

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Haishan Xu

1

西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西杨凌西农路22号，邮编712100

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Gaojie Wang

2

呼吸道病原体与药物治疗潍坊市重点实验室，山东第二医科大学生命科学与技术学院，中国潍坊261053

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Shilong Ren

2

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Xudong Ouyang

2

呼吸道病原体与药物治疗潍坊市重点实验室，山东第二医科大学生命科学与技术学院

呼吸道病原体与药物治疗重点实验室，生命科学与技术学院，山东第二医科大学，中国潍坊 261053

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宋宁宁²

潍坊市呼吸道病原体与药物治疗重点实验室，生命科学与技术学院，山东第二医科大学，中国潍坊 261053

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通讯作者：

songningning{at}sdsmu.edu.cn

zhaoxx{at}sdsmu.edu.cn

fengxianchao1{at}hotmail.com

赵香香²

潍坊市呼吸道病原体与药物治疗重点实验室，生命科学与技术学院，山东第二医科大学，中国潍坊 261053

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通讯作者：

songningning{at}sdsmu.edu.cn

zhaoxx{at}sdsmu.edu.cn

fengxianchao1{at}hotmail.com

冯先超¹

西北农林科技大学食品科学与工程学院，中国陕西杨凌西农路22号，邮编 712100

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通讯作者：

songningning{at}sdsmu.edu.cn

zhaoxx{at}sdsmu.edu.cn

fengxianchao1{at}hotmail.com

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摘要

由于胞内细菌难以触及，金黄色葡萄球菌感染的治疗长期以来一直面临挑战。研究表明，胞外注射系统 PVC 能够将蛋白质精准递送至细胞内，无需借助小分子，并可实现抗菌肽的有效胞内递送以用于治疗。因此，我们选择了……

包括具有强效杀菌活性的杀菌肽（Cecropin）、LL37和Indolicidin，并利用PVC的细胞内递送能力建立了定向抗菌攻击平台（Directed Antimicrobial Assault platform，DAAT）。DAAT Cecropin、DAAT LL37和DAAT Indolicidin均以剂量依赖性方式抑制细胞内细菌，其中DAAT LL37的抑制率达到86.76%；处理72 h后，存活细胞数量降至对照组的1/66—1/82。通过尾纤维重新靶向，实现了对细胞外金黄色葡萄球菌的直接杀灭，而联合DAAT治疗则促进了小鼠伤口愈合。这些研究结果拓展了PVC衍生纳米注射器的应用范围，并建立了DAAT这一用于细胞内抗菌肽治疗的模块化平台。

1. 引言

临床细胞内细菌感染治疗面临的核心挑战在于难以将抗菌药物有效递送至细胞内，尤其是在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant *Staphylococcus aureus*，MRSA）侵入细胞的情况下（Peyrusson et al., 2020；Hommes et al., 2022）。金黄色葡萄球菌能够主动侵入宿主细胞，并利用细胞内环境作为保护屏障而持续存在，最终导致持续性感染（Peyrusson et al., 2020；Volk et al., 2024）。尽管新一代抗生素、抗菌纳米材料、噬菌体衍生酶以及抗毒力策略均对细胞外MRSA表现出杀菌活性，但其对细胞内细菌的活性仍然有限（de Oliveira et al., 2024）。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）凭借其快速且多靶点的作用机制，成为极具潜力的抗金黄色葡萄球菌候选药物；然而，其易受蛋白水解、跨膜 проник透效率低以及亚治疗性

感染部位的蓄积限制了抗菌肽（AMPs）在细胞内的应用（Brogden, 2005；Cesaro et al., 2023；de Oliveira et al., 2024）。因此，亟需一种安全、高效的递送系统，将 AMPs 直接送达细胞内感染部位。

胞外收缩注射系统，尤其是源自细菌的 Photorhabdus 毒力盒（PVC），可通过自主驱动的收缩机制将蛋白质货物递送至靶细胞；其封闭的管状腔室能够提供保护性空间，非常适合装载和递送抗菌肽（AMP）（Vlisidou et al., 2019；Desfosses et al., 2019；Jiang et al., 2022；Kreitz et al., 2023）。传统标签虽然便于 AMP 表达，却会以牺牲其活性为代价，因为标签可能遮蔽阳离子性和两亲性基序，并增加后续切割与再纯化步骤（Li, 2009；Li, 2011；Sadeeq et al., 2025）。在此背景下，Pdp1 引导的 PVC 装载策略提供了一体化解决方案：在胞质表达期间，Pdp1 暂时遮蔽 AMP 暴露的阳离子特征，减少其对生产宿主的过早毒性；随后，在颗粒组装过程中，Pdp1 将肽类货物引导至 PVC 内管（Jiang et al., 2022）。AMPs 被包裹在 PVC 内腔后，便受到物理屏蔽，直至经收缩注射进入靶细胞。因此，这一生物合成平台将宿主耐受性表达、保护性封装和细胞内递送结合起来，用于治疗金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染（Vlisidou et al., 2019；Jiang et al., 2022；Kreitz et al., 2023）。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染的治疗不能仅依赖于清除细胞内的细菌储库；大量胞外细菌及其诱发再侵袭和感染的潜力……

还必须考虑复发问题（Peyrusson et al., 2020；Hommes et al., 2022；Volk et al., 2024）。因此，同时清除细胞内和细胞外的金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）是最优策略。然而，天然PVC缺乏可直接靶向金黄色葡萄球菌的内在识别模块。既往研究表明，通过修饰尾纤维可以重新编程PVC的趋向性，这为克服这一局限提供了基础（Kreitz et al., 2023）。金黄色葡萄球菌噬菌体φ11的受体结合蛋白Gp45提供了一个具有理性设计依据的靶向元件：该蛋白通过识别经GlcNAc修饰的壁磷壁酸介导宿主识别，并作为关键的基板相关受体结合蛋白发挥作用（Xia et al., 2011；Li et al., 2016；Koç et al., 2016）。因此，将源自Gp45的识别结构域引入PVC尾纤维，可赋予其直接结合金黄色葡萄球菌、锚定于细菌表面并执行收缩注射的能力。这一改造不仅能够直接杀伤细胞外金黄色葡萄球菌，还克服了PVC此前无法靶向细菌细胞的限制，从而将DAAT拓展为一个协调作用于细胞内和细胞外的抗菌平台。

在本研究中，我们开发了定向抗菌攻击技术（Directed Antimicrobial Assault Technology，DAAT），这是一种源自PVC的收缩型纳米注射器平台，整合了细胞内抗菌肽递送与细胞外金黄色葡萄球菌靶向功能。针对细胞内治疗，我们将Cecropin、LL-37或Indolicidin与源自Pdp1的装载模块进行融合，并在颗粒组装过程中将其募集至PVC内管中，从而实现宿主耐受性抗菌肽的表达、保护性封装和收缩注射。通过纳米注射器形态、PVC结构蛋白谱分析，验证了抗菌肽的成功装载，

HiBiT发光检测和低分子量凝胶分析。DAAT以剂量依赖性方式抑制细胞内金黄色葡萄球菌，其中DAAT-LL37表现出最强活性；256 ng μL⁻¹时可维持HT-29细胞的相容性，而512 ng μL⁻¹则诱导宿主细胞应激。为清除细胞外细菌，我们进一步提出利用金黄色葡萄球菌噬菌体φ11的受体结合蛋白Gp45重新靶向PVC尾纤维，使其能够识别经GlcNAc修饰的壁磷壁酸，并实现细菌锚定和收缩性注射。最终，PVC技术介导的细胞内外协同抗菌活性促进了小鼠感染皮肤组织的愈合。因此，DAAT为对抗细胞内细菌储存库和细胞外金黄色葡萄球菌提供了一种双模式策略。

2. 材料与方法

2.1 合成抗菌肽抗菌活性的评价

Cecropin、LL-37和Indolicidin由青岛齐鲁生物技术有限公司（中国北京）合成。为进一步评价三种抗菌肽的体外抗菌活性，采用浓度梯度平板计数法进行检测。将每种肽配制为0、1、2、4、8、16、32、64、128、256和512 ng μL⁻¹的系列浓度，并与待测菌悬液孵育。孵育结束后，对处理后的菌悬液进行梯度稀释，并涂布于固体琼脂平板上。培养后观察菌落形成情况，以评估不同肽浓度对细菌存活和增殖的抑制作用。

2.2 试剂与质粒构建

含有pvc1–16的PVCpnf结构质粒、编码Pdp1/Pnf的负载质粒，以及携带PAU_RS16570–RS24015的调控质粒均购自Addgene（质粒编号：198291、198287和198317）。

抗菌肽编码序列及克隆所需的全部寡核苷酸均由通用生物技术有限公司（中国）合成。质粒构建过程中，采用 Phusion Flash 2× Master Mix（Thermo Fisher Scientific，F548S）进行 PCR 扩增，以扩增 pPayload 骨架和相应的插入片段，并将延伸步骤设定为 15 s。质粒构建采用 T5 外切核酸酶依赖性组装预混液（TEDA；实验室自制，参考既往报道的方法；30 ℃反应 40 min）或 2× Ezmax® Ultra Universal CloneMix（TOLOBIO，中国；50 ℃反应 30 min）。随后，将组装产物转化至化学感受态大肠杆菌（*E. coli*）DH5α 细胞中。

对于尾纤维的重新靶向，采用含有 *pvc1–16* 的 PVCpnf 结构质粒。将 Pvc13 中原有的 AD5RGDPK7 靶向序列替换为 Gp45 编码序列，从而赋予其识别金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）的能力。采用带有所需同源重叠序列的引物分别扩增含有 Pvc13 的质粒骨架和 Gp45 插入片段，并通过同源重组进行组装。质粒重构采用上述相同的组装体系。将组装产物通过电转化导入电感受态大肠杆菌（*E. coli*）EPI300 细胞中，并通过菌落 PCR 筛选阳性克隆，随后进行 DNA 测序确认。

2.3 DAAT 的表达与纯化

DAAT 的表达与纯化在 Kreitz 等（2023）所述方法的基础上进行了少量修改。简言之，将构建的抗菌肽编码 pPayload 质粒与一种相应变体的 PVC 结构质粒（pPVC）共同电转化至同一批电感受态大肠杆菌（*Escherichia coli*）EPI300 细胞中。将阳性克隆接种于 LB 培养基（Beyotime，ST163）中培养。

补加卡那霉素（Beyotime，ST101；50 μg/mL，3 μL）和氨苄青霉素（Beyotime，ST008；100 μg/mL，3 μL），于37°C、200 rpm条件下培养12 h。随后，将过夜培养物按1:100的比例接种至500 mL含有相同抗生素的新鲜LB培养基中，于30°C、160 rpm条件下继续培养24 h。细胞于4°C、4,000 × g条件下离心10 min收集。所得细胞沉淀立即处理，或于−80°C保存1–2个月后使用。对于DAAT的纯化，首先按照Kreitz等（2023）所述方法准确配制裂解缓冲液，并将收集的细胞沉淀重悬于其中。随后加入蛋白酶抑制剂混合物（Roche，11873580001；1×）、DNase I（Thermo Fisher Scientific，EN0521；25 μg/mL）和溶菌酶（Sigma-Aldrich，L6876；100 μg/mL），并于25°C下轻柔旋转孵育1.5 h。裂解液于4°C、4,000 × g条件下离心30 min以去除杂质，所得上清液随后于4°C、120,000 × g条件下超速离心2 h。将沉淀重悬于PBS（Life Technologies，10010049）中，并于4°C、16,000 × g条件下进一步离心15 min以澄清样品。为提高样品纯度，重复进行两次超速离心-重悬循环。最后，将澄清后的悬液再次于4°C、120,000 × g条件下超速离心2 h，以获得高度纯化的DAAT颗粒。

将最终获得的DAAT沉淀重悬于200 μL、pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，并使用Implen NanoPhotometer N80分光光度计（Implen，德国）根据A280值测定DAAT浓度。纯化的DAAT制剂可于4°C保存7 d，或于含10%甘油的磷酸盐缓冲液中−20°C保存3–4个月。

2.4 细菌菌株与培养

表达GFP的葡萄球菌

aureus 菌株 USA300/Eno-GFP 由陆军军医大学饶先才教授课题组惠赠。该菌株的基因组中整合了 GFP 编码序列，因此在荧光显微镜下可观察到绿色荧光信号。常规扩增时，将 USA300/Eno-GFP 接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，在 37 °C、200 rpm 条件下振荡培养过夜。用于感染相关实验前，将过夜培养物转接至无菌 TSB 培养基中复苏，并根据实验设计调整至所需菌密度。

2.5 细胞培养

HT-29 细胞购自 Procell Life Science & Technology Co., Ltd（中国）。细胞培养及常规传代均按照供应商说明进行。本研究所用细胞系均购自商业供应商，实验使用前未进行进一步鉴定或支原体污染检测。简而言之，将细胞接种于 T25 培养瓶（Corning，430639）中，在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润培养箱（Heracell™ 150i；Thermo Scientific，美国）内培养。常规维持培养使用 Procell 提供的完全培养基。对于感染模型建立及其他需要无抗生素条件的实验，将细胞培养于 DMEM/F-12（1:1）培养基（Purino，PM150312）中，并添加 10% 胎牛血清（Martínez-Maqueda 等，2015）。

2.6 细胞内金黄色葡萄球菌感染模型的建立

为建立细胞内金黄色葡萄球菌感染模型，将 HT-29 细胞以每孔 1 × 10⁵–1 × 10⁶ 个细胞的密度接种于 6 孔板中，每孔加入 2 mL 完全培养基，并在 37 °C、湿润环境下孵育 24 h。

含有5% CO₂，以促进细胞贴壁和恢复。随后，向各孔中分别加入1.6 × 10⁴、3.2 × 10⁴、6.4 × 10⁴和1.28 × 10⁵ CFU的金黄色葡萄球菌悬液，孵育1 h，以促进细菌黏附和内化（Hess et al., 2003）。采用血细胞计数板测定HT-29细胞数量；通过测量OD₆₀₀估算细菌浓度，并依据预先建立的OD₆₀₀–CFU标准曲线将其换算为CFU值（Stevenson et al., 2016）。通过测量OD₆₀₀估算细菌浓度，并使用预先建立的OD₆₀₀–CFU标准曲线将其换算为CFU值。细菌接种量按以下公式计算：每孔CFU = CFU mL⁻¹ × V，其中V表示每孔加入的细菌悬液体积（mL）。感染后，弃去培养基，并用无菌PBS轻柔洗涤细胞两次，以去除未黏附的细菌。随后，向每孔中加入2 mL含有庆大霉素（50 ng/μL）和青霉素（10 ng/μL）的新鲜完全培养基，以杀灭残留的细胞外金黄色葡萄球菌，并在标准培养条件下继续孵育2 h（Rollin et al., 2017；Kim et al., 2019）。随后弃去含抗生素的培养基，并再次用无菌PBS洗涤细胞两次。加入含庆大霉素（10 ng/μL）的新鲜完全培养基，以抑制后续培养期间细胞外细菌的再生长。继续培养6 h后，在显微镜下观察细胞形态、贴壁情况及总体生长状态。综合考虑细胞内感染的有效性与宿主细胞活力的维持，最终选择每孔6.4 × 10⁴ CFU作为 the

用于后续实验的最佳细菌接种量。

2.7 电子显微镜观察

在 Scientific Compass（中国北京）的技术支持下，对纯化的 DAAT 颗粒进行了负染色透射电子显微镜（TEM）观察。Scientific Compass 是一家通过 ISO/IEC 17025 认可的独立检测实验室。简而言之，取每份样品 10 μL，吸附于经等离子清洗的 200 目碳膜铜网上。随后，使用 Electron Microscopy Sciences C1430 系统，以 2% 醋酸铀进行负染色。在低剂量条件下，采用配备 Gatan US1000 CCD 相机的 JEOL JEM-2100F 透射电子显微镜进行成像，加速电压为 120 kV。记录具有代表性的视野，用于后续形态学分析（Booth et al., 2011）。

2.8 SDS-PAGE 分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对纯化 DAAT 样品的蛋白质谱进行检测（Lim et al., 2023；Kilic et al., 2024）。简而言之，取每份 DAAT 制备物 20 μL，按照 4:1 的体积比与 5× SDS-PAGE 上样缓冲液混合。轻轻吹打混匀，以确保样品完全均一化，随后在干式加热模块中于 98℃ 加热 10 min，使蛋白质变性后再进行上样。电泳采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，包括 5% 浓缩胶和 12% 分离胶。将凝胶安装于电泳槽后，加入 1× SDS-PAGE 电泳缓冲液。预染蛋白质分子量标准品按每泳道 10 μL 上样，每份变性后的 DAAT 样品按每泳道 20 μL 上样。电泳开始时电压设为 80 V，直至样品迁移通过浓缩胶；随后将电压升高至 120 V，并保持该电压直至俺去也

溴酚蓝染料前沿接近凝胶底部。电泳结束后，将凝胶浸没于考马斯亮蓝染色液中染色30 min（Lim et al., 2023）。随后对染色后的凝胶进行脱色，直至背景变得清晰且可观察到明显的蛋白条带。使用凝胶成像系统采集凝胶图像。通过与分子量标记物进行比较，对DAAT制备物中的主要蛋白条带进行评估，以分析纯化颗粒的蛋白质组成及条带分布。

2.9 抗菌肽装载的验证

为进一步确认抗菌肽已成功装载至DAAT颗粒中，将HiBiT标签分别融合至每种抗菌肽的C末端。随后使用Nano-Glo® HiBiT胞外检测试剂盒（Promega，NG2421）测定信号强度（Promega, 2017）。HiBiT是一种基于生物发光的蛋白质检测策略，通过短HiBiT肽标签与LgBiT亚基之间的高亲和力互补，实现高灵敏度定量检测（Schwinn et al., 2018；Boursier et al., 2020）。所有实验步骤及数据计算均按照制造商说明进行。每个样品均进行3个独立的技术重复，以最大限度地减少实验变异并提高所得结论的可靠性。

2.10 光学显微镜成像

通过显微观察和基于菌落的细菌计数评估金黄色葡萄球菌感染模型的建立情况。采用光学显微镜观察正常HT-29细胞和感染后的HT-29细胞，以比较细胞形态，包括细胞铺展情况及感染相关的形态变化。

与此同时，利用 GFP 荧光通道对 USA300/Eno-GFP 细菌进行可视化，并评估 HT-29 细胞的感染状态。采用 4× 和 40× 物镜采集代表性的明场图像和荧光图像，对可比组别应用相同的成像设置。为进一步确定不同感染接种量下的细菌分布情况，以每孔 1.6、3.2、6.4、12.8 和 25.6 × 10⁴ CFU 的细菌接种量，用 USA300/Eno-GFP 感染 HT-29 细胞。感染后，采用系列稀释点滴平板法分别通过菌落计数对细胞外和细胞内细菌负荷进行定量（Thomas et al., 2015）。对于细胞外细菌的分析，感染后收集培养上清液或细胞外组分，并使用无菌 PBS 或 TSB 培养基进行稀释。为回收细胞内细菌，先用无菌 PBS 清洗感染细胞，以去除非黏附性细菌；随后使用含抗生素的培养基处理，以清除残留的细胞外细菌；最后裂解细胞，释放被内化的细菌（Sharma & Puhar, 2019）。将收集的细菌悬液进行系列稀释，点样于 TSB 琼脂平板上，并在 37 °C 下培养，直至形成可见菌落。记录可计数稀释点中的菌落数，并用于比较不同感染剂量下的细胞外和细胞内细菌负荷。采用配备 AJ-VERT 图像采集软件的 AJ-VERT 光学显微镜成像系统（AJ-VERT；中国深圳市 AOR Industrial Co., Ltd.）进行伪彩色光学显微成像。简而言之，将在 6 孔板中培养过夜的未处理对照细胞、建立细胞内金黄色葡萄球菌感染模型后的 HT-29 细胞，以及

经过一轮处理后收集的细胞直接在培养板中进行成像。图像采集前，小心吸去培养基，并使用无菌PBS轻柔冲洗细胞两次，以去除残留培养基和松散附着的物质。随后立即将培养板置于显微镜载物台上，并使用20×物镜进行观察。图像采集和伪彩色调节均在AJ-VERT软件中完成。成像参数设置如下：显示单位为μm；数字变焦为67%；RGB通道值分别为红色=125、绿色=164、蓝色=167；色调为+6；饱和度为255；亮度为35；对比度为100；伽马值为1.24；闪烁抑制模式为直流（DC）。首先通过目镜定位包含正常细胞和感染细胞的清晰视野，以便可靠地区分健康细胞与异常细胞的形态。所有实验组均采用相同的图像采集设置和伪彩色校准参数记录代表性视野，以保持一致性并实现样品间的直接比较。

2.11 药物浓度梯度筛选

通过比较不同DAAT处理对实验组和对照组的抑制作用，进行药物浓度梯度筛选。将HT-29细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔加入适量完全培养基，并使细胞均匀贴壁。细胞稳定贴壁后，弃去原培养基，换用含有系列浓度DAAT-Cecropin、DAAT-LL37或DAAT-Indolicidin的无抗生素培养基。每种DAAT制剂的终浓度分别设为512、256、128、64、32、16、8、4、2和1 ng μL⁻¹。处理24 h后，

充分混匀各孔中的内容物后，使用酶标仪测定 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀），并根据培养基浊度估算细菌生长情况（Balouiri et al., 2016；Kowalska-Krochmal & Dudek-Wicher, 2021）。对于基于浊度的定量分析，同时设置未处理细菌生长对照、空白对照和样品背景对照。空白对照仅含无菌培养基；样品背景孔则含有添加相应浓度 DAAT 制剂但不含细菌的无抗生素培养基，以便校正处理样品自身可能产生的浊度（Balouiri et al., 2016；Kowalska-Krochmal & Dudek-Wicher, 2021）。每种条件至少设置三个平行重复。根据背景校正后的 OD₆₀₀ 值，按照以下公式计算细菌生长抑制率：

在该公式中，OD treatment 表示细菌与指定 DAAT 制剂共同孵育后测得的 OD₆₀₀ 值；OD sample background 表示含有相应 DAAT 制剂但不含细菌的培养基的 OD₆₀₀ 值；OD growth control 表示在相同条件下培养的未处理细菌的 OD₆₀₀ 值；OD blank control 表示单独无菌培养基的 OD₆₀₀ 值。通过比较处理孔与未处理细菌生长对照的校正后浊度，确定各 DAAT 制剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用。

2.12 通过宿主细胞裂解和点样平板法定量细胞内金黄色葡萄球菌负荷

为评估 DAAT 制剂对细胞内金黄色葡萄球菌的抗菌活性，将感染的 HT-29 细胞……

分别采用优化浓度为 256 和 512 ng μL⁻¹ 的 DAAT Cecropin、DAAT LL37 或 DAAT Indolicidin 处理。标准培养条件下处理 12 h 后，弃去培养基，并用无菌 PBS 轻柔洗涤细胞，以去除残留的胞外成分。随后在 37 °C 下用胰蛋白酶消化 4 min，使细胞脱落，并加入等体积完全培养基终止酶解。将细胞悬液转移至 1.5 mL 无菌离心管中，收集细胞以回收胞内细菌。为释放胞内细菌，将收集的细胞重悬于含 1% Triton X-100 的裂解缓冲液中，并在冰上孵育 30 min，以充分破坏宿主细胞膜，同时保持细菌活性（Häffner et al., 2020；Peyrusson et al., 2022）。将裂解液于 4 °C、12,000 × g 离心 10 min，收集所得上清液用于细菌负荷分析。使用无菌 PBS 或 TSB 培养基对各裂解液进行连续 10 倍稀释，最高稀释至 10⁻⁵。每个稀释度取 5 μL 稀释裂解液点接于 TSB 琼脂平板上。待液滴完全被琼脂表面吸收后，将平板倒置，于 37 °C 培养 10 h。随后对菌落生长情况进行拍照并记录（Häffner et al., 2020）。设置未处理的感染细胞和正常未感染细胞作为对照。以 DAAT 处理后菌落形成量的减少程度评估各制剂对胞内金黄色葡萄球菌（S. aureus）的清除效率。

2.13 DAAT 制剂对 HT-29 细胞的安全性评价

为评估 DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 对宿主细胞的安全性，将 HT-29 细胞……

接种于含完整培养基的96孔细胞培养板中，并在标准培养条件下使其均匀贴壁和生长。待细胞稳定贴壁后，弃去培养基，换入含不同梯度浓度DAAT-Cecropin、DAAT-LL37或DAAT-Indolicidin的新鲜完整培养基。对于每种制剂，最终浓度分别设为512、256、128、64、32、16、8、4、2和1 ng μL⁻¹。以在完整培养基中培养的未经处理HT-29细胞作为对照组，同时设置仅含培养基的孔作为空白对照，以校正背景信号。孵育24 h后，采用细胞活力检测试剂盒评估HT-29细胞活力。采用PrestoBlue™细胞活力检测试剂（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆；产品编号：A13261）测定HT-29细胞活力，具体操作按照生产商说明书进行（Thermo Fisher Scientific，2024）。简而言之，按照推荐体积将PrestoBlue试剂直接加入各孔中，并将培养板置于37 °C下孵育，直至信号达到线性检测范围。随后，使用酶标仪在560/590 nm的激发/发射波长下测定荧光信号。采用吸光度检测时，在570 nm处读取吸光度，并以600 nm作为参考波长。按照生产商提供的计算方法，在扣除空白值后，将处理孔信号归一化至未经处理对照组信号，据此计算HT-29细胞的相对生长率。每种处理条件均设置3个平行重复，所得结果用于确定DAAT制剂对HT-29细胞表现出可接受相容性的浓度范围。同时，选取经512、256、128、64、… ng μL⁻¹ DAAT-LL37处理的代表性HT-29细胞，···

以及 32 ng μL⁻¹的样品按照“伪彩色光学显微镜成像”部分所述的成像流程和参数设置，通过伪彩色光学显微镜进行成像。

2.14 HT-29细胞的活细胞荧光成像

采用活/死荧光染色评估HT-29细胞在反复DAAT处理后的存活率和生长情况。将感染后的HT-29细胞分为四组：未经处理的感染对照组、DAAT-Cecropin组、DAAT-LL37组和DAAT-Indolicidin组。处理组接受相应的DAAT制剂，浓度为256 ng μL⁻¹，每24 h给药一次。分别在处理1、2和3轮后检测细胞状态；在相同时间点，对照组加入等体积的新鲜培养基。每个时间点均移除培养基，并使用无菌PBS轻柔洗涤细胞，以去除残留培养基和未结合的DAAT颗粒。配制含有Calcein-AM和碘化丙啶的活/死染色液（MCE，HY-K1094），其终浓度分别为2 μM和4.5 μM，并加入细胞中（MedChemExpress，2024）。存活细胞通过Calcein-AM染色产生的绿色荧光进行鉴定，而死亡细胞则由碘化丙啶标记（Suzuki et al., 2017）。由于脱落的死亡细胞可能在洗涤过程中丢失，因此主要采用绿色荧光通道评估存活的贴壁细胞。染色后，用PBS轻柔冲洗细胞，并立即在荧光显微镜下成像。使用4×物镜采集代表性图像，曝光强度设置为60%。所有组别和时间点均采用相同的成像参数。使用AI辅助图像分析流程对每张图像中的绿色荧光阳性细胞进行计数，并且

细胞计数用于比较重复 DAAT 处理后活细胞的丰度（O’Brien et al., 2016）。

2.15 DAAT 处理后的炎症细胞因子分析

为评估 DAAT 处理后受感染 HT-29 细胞的炎症反应，在单次给药后测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和干扰素-γ（IFN-γ）的浓度（Deramaudt et al., 2020；Liu et al., 2021；Luqman et al., 2025）。将胞内金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染的 HT-29 细胞分为未处理感染对照组、DAAT-Cecropin 处理组、DAAT-LL37 处理组和 DAAT-Indolicidin 处理组。各处理组按指定工作浓度加入相应的 DAAT 制剂，对照组则加入等体积 PBS。在指定终点收集细胞培养上清液，并通过离心去除脱落细胞和颗粒碎屑。澄清后的上清液于 −80 °C 保存，直至进行分析。按照制造商说明，使用人源 ELISA 试剂盒定量 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-γ 的浓度（Solarbio，中国北京；货号分别为 SEKH-0047、SEKH-0002、SEKH-0013 和 SEKH-0046）（Liu et al., 2021）。通过与平行生成的标准曲线进行插值计算细胞因子浓度。所有实验组均进行三次独立重复分析。

2.16 尾纤维靶向改造 DAAT 的直接抗菌活性

将原始尾纤维蛋白和改造后尾纤维蛋白的氨基酸序列提交至 AlphaFold2 进行结构预测。每条蛋白质序列生成五个模型，并根据预测的局部……选择排名最高的模型。

距离差异检验得分。使用 PyMOL 对预测结构进行可视化，以比较原始尾纤维蛋白与工程化尾纤维蛋白的整体结构。

通过菌落形成实验评估尾纤维靶向改造 DAAT 对细胞外金黄色葡萄球菌的直接抗菌活性（Clinical and Laboratory Standards Institute, 2024）。制备 OD₆₀₀ 为 1.0、对应约 5 × 10⁷ 个细胞 mL⁻¹ 的细菌悬液，并按需稀释。每个反应中，将 1.28 μL 细菌悬液（相当于 6.4 × 10⁴ CFU）与 50、100 或 200 μL 浓度为 600 ng μL⁻¹ 的尾纤维靶向改造 DAAT 混合。对照组在相同条件下加入等体积 PBS。混合物在指定培养条件下孵育 4 h。孵育结束后，将各样品连续进行 10 倍梯度稀释至 10⁻²。随后，取 100 μL 各稀释液涂布于 TSB 琼脂平板上，并在标准细菌培养条件下孵育。孵育后对菌落进行成像和计数，并以 CFU mL⁻¹ 表示活菌负荷。通过比较菌落形成量相对于未处理对照的降低情况，评估尾纤维靶向改造 DAAT 对细胞外金黄色葡萄球菌的直接抗菌活性。

2.17 小鼠皮下金黄色葡萄球菌感染及 DAAT 治疗

野生型 C57BL/6 小鼠在标准实验室条件下于实验室内繁育和饲养。选择处于正常生长发育阶段且年龄适宜的小鼠进行实验。通过向小鼠背部皮下组织注射 100 μL 细菌悬液建立皮下金黄色葡萄球菌感染模型（Kim et al., 2014；Malachowa et al.

等，2019；Subramanian 等，2021）。将细菌悬液调整至 OD₆₀₀ = 1.0，相当于约 5 × 10⁷ 个细胞 mL⁻¹；因此，每只小鼠接受约 5 × 10⁶ 个细菌细胞。感染发展 2 天后，确认出现可见的皮下感染迹象，再进行治疗。随后，采用不同的 DAAT 制剂对小鼠进行局部治疗，以协同清除细胞内和细胞外细菌。每次给药剂量为 100 μL，其中含 50 μL、浓度为 256 ng μL⁻¹ 的细胞内 AMP 递送型 DAAT，以及 50 μL、浓度为 600 ng μL⁻¹、靶向细胞外金黄色葡萄球菌的尾纤维重定向型 DAAT；每次给药分别对应 12.8 μg 和 30 μg 的相应 DAAT 制剂。每 24 h 给药一次，连续 6 天。每组中选取代表性小鼠，每隔 72 h 对其伤口拍照（Malachowa 等，2019；Subramanian 等，2021）。

2.18 采用 H&E 和 Masson 三色染色对小鼠伤口组织进行组织学分析

进行组织学检查，以评估小鼠伤口组织的修复情况、炎性细胞浸润、组织再生及胶原沉积。治疗后第 12 天，仔细切取伤口区域及其邻近正常皮肤，并置于 4% 多聚甲醛中固定 24–48 h。固定后的样本经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，并切成 4–5 μm 厚的切片。进行苏木精-伊红（H&E）染色时，石蜡切片先脱蜡并复水，随后依次进行苏木精染色、分化、返蓝、伊红复染、脱水、透明，最后以中性树脂封片。在光学显微镜下观察 H&E 染色切片，以评估再上皮化、

肉芽组织形成、炎症细胞浸润及整体组织形态。进行 Masson 三色染色时，按照制造商说明书（Solarbio，中国北京；目录号：G1340），对脱蜡并复水后的切片进行染色。胶原纤维呈蓝色，肌纤维和细胞质呈红色。通过染色切片评估伤口愈合过程中的胶原沉积、纤维排列及细胞外基质重塑。使用光学显微镜采集图像，并根据炎症、表皮再生、肉芽组织形成和胶原沉积情况比较各组的组织学差异。

2.19 统计分析与可重复性

采用 IBM SPSS Statistics 23 进行统计分析。除非另有说明，定量数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准差表示。使用 Origin 2024 和 Adobe Illustrator 2020 绘制图表及示意图。多组比较采用单因素或双因素方差分析，并进行 Bonferroni 校正。统计学显著性定义为 *P* < 0.05，显著性水平标示为 *P* < 0.05（*）、*P* < 0.01（**）和 *P* < 0.001（***）。

• 结果

3.1 抗菌肽负载 DAAT 颗粒的构建与验证

为评估所选肽的抗菌活性，对 Cecropin、LL-37 和 Indolicidin 进行化学合成，并采用浓度梯度平板法检测其对金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）的抑菌作用（图 1B）。在 32–128 ng μL⁻¹ 浓度下，三种肽的细菌清除效果均有限，表现为菌落密集生长。当浓度升至 256 和 512 ng μL⁻¹ 时，菌落数量为

显著降低，表明在较高剂量下能够有效杀灭金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）。这种剂量依赖性活性与阳离子抗菌肽的膜靶向行为一致。这些肽在结合带负电荷的细菌表面后，可通过不同方式破坏膜完整性：Cecropin 主要形成膜孔，LL-37 诱导类似地毯式的膜通透化，而 Indolicidin 则使膜失稳，并可进一步与细胞内靶点发生相互作用。这些作用促进离子泄漏、细胞质内容物释放以及细菌活力丧失（图1A）（Silvestro et al., 2000；Lee et al., 2011；Hsu et al., 2005；Le et al., 2017）。结果证实，Cecropin、LL-37 和 Indolicidin 在足够浓度下均具有有效的抗金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）活性，支持将其用作 DAAT 介导的细胞内抗菌递送体系中的功能性载荷。

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图1.

抗菌肽负载 DAAT 颗粒的设计、构建与验证。

（A）Cecropin、LL-37 和 Indolicidin 抗金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）的抗菌机制示意图。Cecropin 主要诱导膜孔形成，LL-37 促进类似地毯式的膜通透化，而 Indolicidin 插入细菌膜并使其失稳，最终导致离子泄漏、细胞质内容物释放和细菌死亡。（B）浓度梯度平板实验显示合成 Cecropin、LL-37 和 Indolicidin 对金黄色葡萄球菌（*S. aureus*）的抗菌活性。所测试的肽浓度为 0、32、64、128、256 和 512 ng μL⁻¹，随着肽浓度升高，菌落形成数量逐渐减少。（C）DAAT 系统的遗传组织结构。*afp1–afp16* 结构基因簇编码了牲交

收缩性注射装置，而有效载荷盒则包含源自 Pdp1 的装载元件和抗菌肽载荷。（D）通过在 Pdp1-NTD 下游融合柔性 GGSGG 连接肽，并在其后连接各抗菌肽，构建 DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 载荷。（E）纯化的 DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 颗粒的负染 TEM 图像，显示出棒状的类 PVC 纳米注射器形态。比例尺，100 nm。（F）纯化 DAAT 颗粒的 SDS-PAGE 分析，显示不同 DAAT 变体之间具有相近的高分子量结构蛋白谱。（G）低分子量凝胶分析显示，在 Cecropin、LL37 和 Indolicidin 条带中均出现特异性的含抗菌肽融合蛋白条带，证实了肽载荷的表达。（H–J）基于 HiBiT 的发光检测分别证实，与空载 DAAT 相比，DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 颗粒中的载荷信号均有所增强。数据表示为均值 ± SD；**P < 0.01。

为实现 AMP 的安全表达与保护性递送，我们通过将 pdp1 与 AMP 融合，对 PVC pnf 纳米注射器的装载元件进行工程化改造，构建了一种能够携带多种可替换肽载荷的通用 DAAT 递送系统（Vlisidou et al., 2019；Jiang et al., 2022；Kreitz et al., 2023）。本研究拓展了 PVC 系统在针对胞内细菌进行治疗干预中的应用，为胞内细菌研究提供了一种新的策略。DAAT 的骨架由编码收缩性注射系统的 pvc1–pvc16 结构元件、源自 Pdp1 的用于载荷装载的引导序列，以及携带针对金黄色葡萄球菌的抗菌肽（AMPs）的载荷元件组成（图 1C）。

（Jiang 等，2019；Vlisidou 等，2019；Jiang 等，2022；Kreitz 等，2023）。该设计能够在大肠杆菌中实现结构颗粒与 AMP 负载模块的共表达，使颗粒组装和 AMP 负载物的封装能够在同一宿主菌株内完成（Jiang 等，2022；Kreitz 等，2023）。

为确认抗菌肽已成功装载至 PVC 颗粒的内腔中，选取三种具有代表性的 AMP，包括 Cecropin、LL-37 和 Indolicidin，作为模型货物。我们设计了一种复杂的 AMP 装载策略，即通过柔性 GGSGG 连接肽将 AMP 与 PD 融合（图 1D）。在该设计中，Pdp1 引导 AMP 装载至 PVC 内管中，而富含甘氨酸的柔性连接肽则有助于降低包装模块与抗菌肽序列之间的空间位阻干扰（Chen 等，2013；Jiang 等，2022）。基于该策略，我们构建了三种 DAAT 变体，分别命名为 DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin。为确定 AMP 的装载是否影响颗粒组装，我们采用负染色透射电子显微镜对纯化的 DAAT 颗粒进行了观察。三种制备物中均含有杆状、纳米注射器样颗粒，其形态类似 PVC，包括细长的鞘管主体以及末端与基板相关的区域，这与组装完成的细胞外收缩性注射颗粒相一致（图 1E）（Jiang 等，2019；Desfosses 等，2019）。这些结果进一步表明，PVC 结构模块能够与经改造的肽装载盒相兼容。SDS-PAGE 分析进一步显示，三种 DAAT 制备物中的主要高分子量条带均对应于 PVC 的主要结构蛋白。（

图1F）(

Jiang et al., 2019

；

Kreitz et al., 2023

）。电泳图谱未检测到明显差异，表明这三种重组系统均生成了结构蛋白组成相近的PVC来源颗粒。因此，引入不同的抗菌肽载荷并未显著改变DAAT颗粒的整体组装特征或结构蛋白组成。在确认颗粒能够完整组装后，我们进一步验证抗菌肽载荷是否能够有效整合至纯化的DAAT颗粒中。采用HiBiT发光检测法对肽载荷进行检测。将HiBiT标签融合至抗菌肽序列的C端，并通过HiBiT与LgBiT亚基之间的高亲和力互补作用分析抗菌肽的装载情况（

Schwinn et al., 2018

；

Schwinn et al., 2020

）。与空载DAAT对照组相比，三种负载抗菌肽的DAAT颗粒均表现出显著增强的发光信号（

图1G

）。DAAT-LL37和DAAT-indolicidin的发光强度略高于DAAT-cecropin，表明工程化肽载荷能够稳定保留于DAAT颗粒内部，并且在纯化过程中未发生明显损失。此外，采用蛋白凝胶电泳验证低分子量抗菌肽载荷的存在。在cecropin、LL-37和indolicidin对应泳道中，与目标载荷分子量相符的区域均检测到清晰的特异性条带。所有条带的分子量约为11 kDa，与由抗菌肽和HiBiT标签组成的融合蛋白的理论分子量一致（

图1H-J

）。这为抗菌肽成功装载提供了直接证据。

综上，TEM结果期特码

形态学观察、SDS-PAGE和HiBiT发光检测表明，cecropin、LL-37和indolicidin均已成功装载至DAAT内管中。在本研究中，我们成功构建了一组装载AMP的纳米注射器，为后续抗菌活性评价奠定了坚实基础。

3.2 DAAT介导的抗菌处理对细胞内

S. aureus 的作用

在确认抗菌肽货物能够装载至DAAT腔内后，我们进一步考察了装载AMP的DAAT是否能够有效抑制细胞内S. aureus感染。为建立一种易于操作的感染模型，我们采用表达GFP的USA300/Eno-GFP菌株感染HT-29细胞，从而能够通过荧光成像监测细菌定植情况（Luqman et al., 2019；Bravo-Santano et al., 2019）。未感染的HT-29细胞保持典型的贴壁上皮细胞形态，而感染细胞则表现出明显的绿色荧光，并伴随感染相关的细胞形态紊乱（图2A）（Rodrigues Lopes et al., 2022）。为确定适用于后续处理实验的细菌接种量，我们比较了不同递增接种量下的细胞外和细胞内细菌负荷。如预期，随着细菌接种量增加，细胞外细菌数量迅速增加，而细胞内细菌负荷则逐渐达到平台期。综合考虑可检测的细胞内定植水平和宿主细胞状态的 պահպան，我们选择每孔6.4 × 10⁴ CFU作为后续实验的最佳感染剂量（图2B）。

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图2.

DAAT介导的抗菌肽递送抑制HT-29细胞内的金黄色葡萄球菌感染。

（A）明场和GFP】【。

正常 HT-29 细胞和 USA300/Eno-GFP 感染的 HT-29 细胞的荧光图像，证实细胞内金黄色葡萄球菌感染模型构建成功。（B）不同细菌接种量感染的 HT-29 细胞中细胞内和细胞外细菌负荷。细胞内细菌负荷随感染剂量增加而升高；基于较高效的细胞内感染以及相对较低的细胞外细菌污染，最终选择每孔 6.4 × 10⁴ CFU 用于后续实验。（C–E）DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 对细胞内金黄色葡萄球菌的剂量依赖性抑制作用。（F）正常、感染及 DAAT 处理的 HT-29 细胞的伪彩色显微图像。感染导致明显的细胞收缩、聚集和结构紊乱，而 DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 处理可部分减轻感染相关的细胞损伤。比例尺分别为 5 μm 和 100 μm，如图所示。（G）DAAT 介导抗菌肽进入感染细胞的示意图，以及处理后可回收的细胞内细菌的菌落点样涂布实验。与感染细胞相比，DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 在 256 和 512 ng μL⁻¹ 浓度下均显著降低了细胞内细菌的存活率。数据以均值 ± 标准差表示。不同小写字母表示处理组之间存在显著差异（P < 0.05）。

在确定感染时间窗口后，我们进一步评估了三种载肽 DAAT 制剂重复给药后的抗菌活性。DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 的使用浓度范围为 1 至 512 ng μL⁻¹，并在进行三轮处理后评估细菌抑制效果。三种制剂均……

这些制剂均表现出对细菌生长的剂量依赖性抑制作用，但其活性曲线存在差异。DAAT Cecropin 在较高浓度范围内始终保持较强的抑制作用，在中等剂量下仍可观察到明显抑制（

图 2C

）。DAAT LL37 也表现出显著的抗菌活性，且随着剂量降低而逐渐减弱，这与其浓度依赖性的细胞内细菌控制作用一致（

图 2D

）。DAAT Indolicidin 的活性窗口相对较窄，在较高浓度下具有强效抑制作用，但在较低剂量下疗效下降更为明显（

图 2E

）。这些结果表明，抗菌效果取决于所负载抗菌肽的种类及其效力。

伪彩色光学成像区分了正常细胞与感染细胞，并直接显示了处理后细胞的状态。正常 HT-29 细胞形成连续的贴壁细胞层，细胞轮廓规则；而感染细胞则表现出明显的形态学损伤（

图 2F

）（

Rodrigues Lopes et al., 2022

）。DAAT 处理后，感染细胞的表型得到部分逆转，处理组中严重受损的细胞区域少于未处理感染对照组。因此，显微镜观察结果支持这样一种观点：DAAT 介导的递送降低了感染相关的细胞损伤，而不仅仅是改变了基于浊度的检测读数。

为直接评估处理后细胞内细菌的定植情况，我们随后进行了宿主细胞裂解，并结合系列稀释点样培养（

图 2G

）（

Bravo-Santano et al., 2019

）。感染细胞点样后可观察到菌落生长，而正常细胞未形成菌落。在对感染的 HT-29 细胞进行处理后，

与DAAT颗粒共同处理的细胞中，细胞内菌落数显著减少。以256 ng μL⁻¹和512 ng μL⁻¹的处理剂量为例，所有DAAT制剂均表现出抗菌活性，其中DAAT-LL37对细胞内细菌的治疗效果最强，其次为DAAT-Cecropin和DAAT-Indolicidin。此外，DAAT颗粒处理显著降低了感染HT-29细胞的菌落形成能力，表明DAAT治疗呈现出浓度依赖性的抗菌趋势。更为重要的是，仍需进一步确定一个既能维持宿主细胞正常生长、又能控制细胞内细菌感染的处理剂量。

3.3 DAAT处理的剂量优化

在证实DAAT颗粒能够递送抗菌肽载荷并抑制细胞内金黄色葡萄球菌后，我们进一步探讨了这种抗菌活性是否能够在与HT-29宿主细胞生长相容的浓度范围内实现。这一问题至关重要，因为有效的细胞内抗菌平台不应仅仅降低细菌负荷，还应保留受感染宿主细胞的恢复潜力（Greco et al., 2020；Bellavita et al., 2023）。为确定这一工作范围，将正常HT-29细胞暴露于浓度梯度为1至512 ng μL⁻¹的DAAT-Cecropin、DAAT-LL37和DAAT-Indolicidin中（图3A-C）。相比之下，512 ng μL⁻¹的处理剂量持续导致HT-29细胞生长出现明显下降，表明这一最高剂量已进入宿主细胞应激范围，而非最佳治疗窗口。因此，尽管512 ng μL⁻¹仍具有抗菌潜力，但未被选为优选处理剂量。

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图3.

DAAT 处理的细胞相容性和治疗效果。

（A–C）DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 对正常 HT-29 细胞的细胞相容性。所有制剂在大多数测试浓度下均具有良好的耐受性，而 512 ng μL⁻¹ 会降低细胞生长。数据以均值 ± 标准差表示；*P < 0.05，**P < 0.01；ns，差异无统计学意义。（D）不同浓度 DAAT-LL37 处理后 HT-29 细胞的伪彩色光学图像。在 256 ng μL⁻¹ 及更低浓度下，细胞形态保持良好。比例尺，200 μm。（E）三种 DAAT 制剂在 256 ng μL⁻¹ 下的抗菌抑制效果，其中 DAAT-LL37 的作用最强。数据以均值 ± 标准差表示；*P < 0.01。（F）感染的 HT-29 细胞经 256 ng μL⁻¹ DAAT 重复处理 24、48 和 72 h 后的活细胞荧光图像。绿色荧光表示存活且贴壁的细胞。比例尺，100 μm。（G）荧光阳性活细胞的定量结果，显示重复 DAAT 处理后细胞逐步恢复。

以 DAAT-LL37 作为代表性制剂进行伪彩色光学显微成像，进一步证实了这种浓度依赖性安全特征。在 256、128、64 和 32 ng μL⁻¹ 下，HT-29 细胞均保持致密、连续的贴壁形态，细胞铺展状态良好，生长模式有序。相比之下，暴露于 512 ng μL⁻¹ 的细胞形态相对较差，这与定量活力数据一致。这些成像结果直观证实，最高剂量下观察到的降低反映了真实的细胞应激，而非仅由检测波动造成（图 D）。综合细胞活力和形态学证据，选择 256 ng μL⁻¹ 作为后续细胞内……实验更合适的工作浓度。

感染治疗，因为在避免 512 ng μL⁻¹ 条件下细胞毒性的同时，其仍保持了较强的抗菌能力。

为验证最佳治疗浓度下重复给药的治疗效果，我们进一步考察了重复 DAAT 治疗是否能够随着时间推移逐步改善感染细胞的生长状态。活/死细胞荧光染色显示，未经处理的感染细胞仅维持稀疏的绿色荧光，反映出感染后细胞存活率较低，且贴壁细胞恢复受限。相比之下，经 DAAT Cecropin、DAAT LL37 或 DAAT Indolicidin 处理的细胞在 24 至 72 h 内绿色荧光逐渐增强（图 3F 和 G）。重复给药结果表明，感染的 HT-29 细胞在连续 DAAT 治疗过程中逐渐恢复了正常的增殖能力。因此，所有 DAAT 处理组的活细胞数量均随着治疗周期的持续而增加，而感染对照组始终维持在显著较低水平。在三种制剂中，DAAT LL37 表现出最明显的恢复趋势，这与其在 256 ng μL⁻¹ 条件下较高的细菌抑制率一致。

综上，这些结果确定了 DAAT 介导的细胞内抗菌治疗的有效治疗窗口。因此，选择 256 ng μL⁻¹ 作为抗菌治疗的最佳浓度。在此条件下，重复 DAAT 肽治疗降低了细胞内细菌负荷，并使感染的 HT-29 细胞逐步恢复其贴壁生长状态。因此，DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 不仅能够作为抗菌颗粒对抗细胞内的金黄色葡萄球菌（*S. aureus*），还能够在适当的剂量范围内维持宿主细胞的存活。

3.4 DAAT 降低

感染细胞中的炎性细胞因子水平

在证明 DAAT 颗粒能够抑制细胞内金黄色葡萄球菌后，我们进一步考察了这种抗菌作用是否伴随着感染 HT-29 细胞中炎性细胞因子反应的降低。经 DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 处理后，对包括 TNF-α、IL-1β、IFN-γ 和 IL-6 在内的四种代表性炎性细胞因子进行了定量分析（图 4A-D）。与感染对照组相比，所有 DAAT 处理组的细胞因子水平均明显降低，表明 DAAT 介导的细胞内细菌抑制作用与感染诱导的炎症反应减弱相关。

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图 4.

DAAT 介导的抗菌肽递送可降低炎症反应、杀灭重新靶向的金黄色葡萄球菌，并促进小鼠皮肤伤口愈合。

(A-D) DAAT 处理后炎性细胞因子的定量分析，包括 TNF-α、IL-1β、IFN-γ 和 IL-6。与感染对照组相比，DAAT-Cecropin、DAAT-LL37 和 DAAT-Indolicidin 均降低了细胞因子水平，表明在抑制细胞内金黄色葡萄球菌后，感染诱导的炎症反应受到减弱。(E) 菌落形成实验显示，尾纤维重新靶向的 DAAT 对细胞外金黄色葡萄球菌具有直接抗菌活性。将细菌分别与 DAAT-Cecropin-金黄色葡萄球菌、DAAT-LL37-金黄色葡萄球菌或 DAAT-Indolicidin-金黄色葡萄球菌孵育，随后进行系列稀释并涂布于 TSB 琼脂平板上。与 CK 组相比，所有重新靶向的 DAAT 制剂均显著减少了菌落形成，证实尾纤维修饰后能够有效杀灭细胞外细菌。(F) 感染小鼠皮下金黄色葡萄球菌的皮肤伤口代表性图像。

治疗期间金黄色葡萄球菌感染模型中的伤口情况。DAAT-Cecropin-S. aureus、DAAT-LL37-S. aureus、DAAT-Indolicidin-S. aureus 或 PBS 处理后第 0、3、6、9 和 12 天记录伤口情况。与 PBS 处理的小鼠相比，DAAT 处理组的伤口渗出减少、结痂形成更快，且伤口闭合情况有所改善。(G) 采用苏木精-伊红（H&E）染色和 Masson 三色染色对感染皮肤组织进行组织学分析。与 PBS 组相比，DAAT 处理组的炎症细胞浸润减少，表皮结构改善，胶原沉积增加，表明组织修复和重塑加快。比例尺，100 μm。数据以均值 ± 标准差表示。*P < 0.05，**P < 0.01。

TNF-α 水平在对照组中约为 48.3，而 DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 处理后分别降至约 41.2、40.6 和 40.0。IL-1β 也呈现类似趋势：对照组中约为 2.7，经过 DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 处理后，分别降至约 2.1、2.1 和 2.0。在所检测的细胞因子中，IFN-γ 的降幅最为显著：其水平从对照组的约 126.5 降至三个 DAAT 处理组的约 93.0、91.5 和 98.0。此外，IL-6 水平从对照组的约 55.0 降至 DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 处理后的约 35.5、35.0 和 40.5。

统计分析进一步证实，与感染对照组相比，DAAT 处理显著降低了这些炎性细胞因子的水平。总体而言，这些结果表明，DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 不仅能够抑制

胞内金黄色葡萄球菌，同时还可减轻由胞内感染诱导的炎性细胞因子反应。

3.5 尾纤维修饰赋予 DAAT 介导的针对金黄色葡萄球菌的靶向杀伤能力

为考察尾纤维重新靶向是否与 DAAT 的组装及细菌靶向能力相兼容，随后通过菌落形成实验（图 4E）评估尾纤维重新靶向 DAAT 对胞外金黄色葡萄球菌的直接抗菌活性。将初始菌量为 6.4 × 10⁴ CFU 的细菌分别与浓度为 128、256 或 512 ng μL⁻¹ 的 DAAT Cecropin S. aureus、DAAT LL37 S. aureus 或 DAAT Indolicidin S. aureus 孵育 4 h，随后进行系列稀释并涂布于 TSB 琼脂平板上。PBS 处理对照组显示出密集的菌落生长，表明在未接受 DAAT 处理的情况下，金黄色葡萄球菌仍具有较高的存活率。相比之下，与对照组相比，三种尾纤维重新靶向的 DAAT 制剂均显著减少了菌落形成。

代表性平板显示，DAAT Cecropin、DAAT LL37 和 DAAT Indolicidin 处理后仅出现零星细菌菌落，而对照平板几乎被菌落覆盖。这一差异表明，尾纤维重新靶向使 DAAT 获得了针对胞外金黄色葡萄球菌的直接杀伤活性。在这三种制剂中，代表性平板上 DAAT Cecropin 和 DAAT LL37 处理组的可见菌落数略少于 DAAT Indolicidin 组，但所有 DAAT 处理组均表现出明确的抗菌作用。这些结果表明，尾纤维重新靶向使 DAAT 颗粒能够识别并杀伤胞外金黄色葡萄球菌，为其进一步应用于胞内感染及体内抗菌治疗实验提供了支持。

3.6 DAAT 促进小鼠皮下伤口愈合和组织修复

金黄色葡萄球菌感染模型

为评估DAAT介导的抗菌肽递送在体内的治疗效果，建立了小鼠皮下金黄色葡萄球菌感染模型。如图4F所示，PBS处理的创面持续渗出，并出现溃疡和延迟愈合，表明感染持续存在。相比之下，DAAT-Cecropin-金黄色葡萄球菌、DAAT-LL37-金黄色葡萄球菌和DAAT-Indolicidin-金黄色葡萄球菌处理均显著改善了创面恢复，表现为渗出减少、逐渐形成痂皮以及创面更快闭合。至第12天，与PBS处理的创面相比，DAAT处理创面的表面修复更加完整。

组织学分析进一步支持了DAAT处理的创面愈合效果（图4G）。H&E染色显示，与PBS处理的感染创面相比，DAAT处理组织的炎性细胞浸润减少，表皮结构得到改善。Masson三色染色显示，DAAT处理组胶原沉积增加，且真皮重塑更加有序。结合细胞因子水平降低和细菌菌落数减少的结果，表明DAAT介导的抗菌肽递送通过结合细菌清除、炎症缓解和组织修复，促进了感染创面的愈合。

4. 讨论

细胞内细菌感染仍然难以治疗，因为病原体进入宿主细胞后能够逃避免疫清除，减少与抗菌药物的接触，并以受保护的细胞内储存库形式持续存在（Peyrusson等，2020；Hommes等，2022；Volk等，2024）。为解决这一递送障碍，我们开发了定向抗菌攻击技术（Directed Antimicrobial Assault Technology，DAAT），这是一种基于PVC纳米注射器的抗菌肽（AMP）递送平台。通过将抗菌肽与一种 geschniegelt

在Pdp1衍生的装载模块作用下，肽类货物在颗粒组装过程中被募集至PVC内管中，从而在同一系统内整合了宿主耐受性表达、保护性包封和细胞内注射递送功能（Jiang et al., 2022；Kreitz et al., 2023）。该设计将通常难以表达和递送的AMP转化为可编程的纳米注射器载荷，用于细胞内细菌治疗。DAAT-Cecropin、DAAT-LL37和DAAT-Indolicidin的成功构建证明了该平台的模块化特性。TEM显示，三种颗粒均保留了类似PVC的纳米注射器形态；SDS-PAGE则表明，AMP的装载并未显著改变PVC颗粒的结构蛋白组成。HiBiT荧光素酶信号以及低分子量货物条带进一步证实了AMP的成功装载，而非非特异性共纯化。

在表达GFP的USA300/Eno-GFP感染模型中，三种DAAT制剂均以剂量依赖性方式抑制了细胞内细菌的生长。其中，DAAT-LL37表现出最强的活性，抑制率达到86.76%；DAAT-Cecropin则保持了更宽的有效范围，而DAAT-Indolicidin表现出较窄的治疗窗口。显微镜观察和菌落点涂布实验进一步支持了以下结果：DAAT处理后，细胞内存活细菌数量减少，且感染相关的宿主细胞损伤得到缓解。本研究还确定了DAAT治疗的实用工作浓度范围。尽管512 ng μL⁻¹表现出较强的抗菌活性，但其会在HT-29细胞中引起可检测的应激反应（Xu et al., 2026）。相比之下，256 ng μL⁻¹在维持抗菌功效的同时，能够更好地保持宿主细胞的形态和活力，因此被选定为优选工作浓度。在该浓度下进行重复处理时，

剂量增加了活细胞数量，并促进了感染细胞的恢复，表明 DAAT 在降低细胞内细菌负荷的同时，能够维持宿主细胞存活。总体而言，本研究确立了 DAAT 作为一种可编程的 PVC 衍生 AMP 纳米注射器平台，用于细胞内细菌治疗。

尾纤维修饰为 DAAT 增添了细胞外抗菌功能。通过将尾纤维靶向识别结构域改造为针对金黄色葡萄球菌（*S. aureus*），DAAT 能够识别革兰氏阳性菌、锚定于细菌表面，并通过收缩注射介导的机制杀菌（Xia et al., 2011；Li et al., 2016；Koç et al., 2016；Kreitz et al., 2023）。抗菌点样实验支持了这一设计，结果显示，重新靶向后的 DAAT 能够直接抑制细胞外细菌生长。这一结果拓展了 DAAT 的功能，使其不再局限于细胞内 AMP 递送载体，并表明 PVC 衍生颗粒也可作为主动抗菌纳米机器，对抗细胞外细菌。由此，DAAT 将 Pdp1 引导的 AMP 装载用于细胞内治疗，与尾纤维介导的细菌靶向用于细胞外清除相结合，为应对金黄色葡萄球菌的细胞内—细胞外逃逸循环提供了协同策略（Peyrusson et al., 2020；Hommes et al., 2022；Volk et al., 2024）。

在小鼠皮下感染模型中，研究者联合给予递送细胞内 AMP 的 DAAT 和靶向细胞外金黄色葡萄球菌的 DAAT，进一步支持了这种双模式设计的治疗相关性。DAAT 治疗促进创面愈合趋于正常，并显著降低了从皮肤组织中回收的细菌负荷，表明其在复杂组织环境中具有有效的抗菌活性。这些体内结果进一步拓展了……

DAAT 的应用不止于细胞培养实验。本研究还表明，清除细胞内储库与靶向细胞外细菌能够协同发挥作用，构成一种协同治疗策略。总体而言，尾纤维重塑与小鼠感染实验共同确立了 DAAT 作为一种可编程的 PVC 衍生平台，可整合受保护的 AMP 递送、对细胞外细菌的直接攻击以及组织层面的感染控制。

5. 结论与展望

本研究确立了 DAAT 是一种可编程的 PVC 衍生抗菌肽纳米注射器，可用于协同开展细胞内与细胞外抗菌治疗。Pdp1 引导的装载可实现宿主耐受性 AMP 的表达、肽的腔内保护性封装以及靶向细胞内递送，从而应对 AMP 表达、稳定性以及进入宿主保护性细菌所面临的关键障碍。与此同时，通过重塑尾纤维识别结构域，可使 DAAT 重新靶向细胞外金黄色葡萄球菌（*S. aureus*），实现细菌结合、表面锚定以及通过收缩注射介导的杀菌作用。因此，DAAT 将细胞内储库清除与细胞外细菌靶向相结合，使 PVC 衍生系统从蛋白质递送工具拓展为适应性精准抗菌平台。

DAAT 的未来价值在于超越天然抗菌肽，转向可编程的从头设计抗菌载荷。DAAT 不必仅依赖现有 AMP 序列，还可装载经工程化设计、能够通过互补机制攻击细胞内细菌的合成蛋白载荷，例如直接损伤细菌、抑制毒力以及破坏免疫逃逸。这将使 DAAT 从肽载体转变为模块化抗菌机器，能够在受保护的感染灶内实施多层次干预。

储库。同时，革兰氏阳性菌厚实的细胞壁仍构成收缩注射的物理屏障，因此，提高穿透效率是亟待突破的工程难题。未来若能优化 DAAT 的识别、锚定和注射模块，最终有望构建一类新型精准抗菌纳米机器：它们不仅递送药物，还能主动搜寻、突破并瓦解顽固性细菌感染。

资源可用性

通讯联系人

有关资源和试剂的更多信息及申请，请联系通讯联系人 Xianchao Feng（fengxianchao1{at}hotmail.com）；相关资源和试剂将由其提供。

数据和代码可用性

支持本研究结论的所有数据均可在本文及其补充信息文件中获取。

本文未报告原创代码。

重新分析本文所报告数据所需的任何其他信息，可向通讯联系人申请获取。

作者贡献

L. Feng 和 Y. Qiao 负责研究实施、方法学、数据整理及论文初稿撰写。H. Xu、G. Wang、S. Ren 和 X. Ouyang 负责软件、形式分析及概念构思。N. Song、X. Zhao 和 X. Feng 负责监督、资源提供、经费获取及论文审阅与编辑。

利益声明

作者声明不存在竞争性经济利益。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（项目编号：32401252、32172143 和 318732014）以及陕西省重点研发计划（项目编号：2024SF-ZDCYL-03-23）的资助。我们衷心感谢所有同事和合作者在本研究期间所作的宝贵贡献、提出的深刻见解以及提供的技术支持。

研究。我们还衷心感谢广大社会群体所给予的支持，正是这些支持促成了本研究的完成。最后，我们谨向为本研究进展作出牺牲的实验动物致以崇高敬意，并重申我们致力于遵循最高标准的动物福利和科研伦理规范。

已声明的资助信息

中国国家自然科学基金委员会

，32401252

，32172143

，318732014

陕西省重点研发计划

，2024SF-ZDCYL-03-23

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Lei Feng、Yingying Qiao、Haishan

Xu

，

Gaojie

Wang

，

Shilong

Ren

，

Xudong

Ouyang

，

Ningning

Song

，

Xiangxiang

Zhao

，

Xianchao

Feng

bioRxiv

2026.07.06.736670；

doi：

https://doi.org/10.64898/2026.07.06.736670

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结合肽类的胞外注射系统用于治疗胞内

金黄色葡萄球菌

Lei

Feng

，

Yingying

Qiao

，

Haishan

Xu

，

Gaojie

Wang

，

Shilong

Ren

，

Xudong

Ouyang

，

Ningning

Song

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Xiangxiang

Zhao

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Xianchao

Feng

bioRxiv

2026.07.06.736670；

doi：

https://doi.org/10.64898/2026.07.06.736670

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（24800）

遗传学

（15820）

基因组学

（22923）

免疫学

（18155）

微生物学

（41229）

分子生物学

（17493）

神经科学

（90575）

古生物学

（679）

病理学

（2899）

药理学与毒理学

（4934）

生理学

（7856）

植物生物学

（15456）

科学传播与教育

（2064）

合成生物学

（4413）

系统生物学

（9987）

动物学

（2311）

关键词：金黄色葡萄球菌 · 胞内细菌感染 · 抗菌肽递送 · 胞外注射系统 · 伤口感染治疗

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.06.736670v1?rss=1