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卵形家族蛋白（OFPs）是一类植物特异性的核内负调控转录因子，其特征是含有保守的C端OVATE结构域。本研究对两个头对头排列的OFP——AtOFP2（具有完整OVATE结构域的Ovate-OFP）和AtOFP17（具有部分OVATE结构域的Ovate-Like OFP）进行了比较功能表征，为深入理解OVATE结构域的结构差异如何导致功能分化提供了重要见解。对功能缺失和功能获得突变体的28项形态及生理性状进行详细表型分析显示，这两个基因均作为植物生长发育的广泛多效性抑制因子发挥作用。在两个基因的敲低突变体中，抑制作用的解除表现为种子休眠期缩短、萌发和生长速率加快、植株增大以及种子产量显著提高。相比之下，组成型过表达表明，这两个基因总体上均具有抑制作用，但在特定性状的精细调控方面存在细微差异。例如，两个基因对根毛结构表现出拮抗作用。AtOFP2是根毛发育的强抑制因子，而AtOFP17则是下胚轴和根细胞结构的更强抑制因子。由于具有部分OVATE结构域，AtOFP17在整个生命周期内表现出较为温和的抑制作用，这一点可由AtOFP17敲低突变体植株较小、产量较低得到证实。相反，AtOFP2表现出强得多的抑制效应：超过90%的过表达突变体在幼年期死亡；剩余约10%个体能够存活，可能是由于激活了剂量依赖性反馈环机制，这一点可由成熟植株的正常生长得到体现，转录组数据也进一步支持了这一结论。对敲低植株和7日龄幼苗根部的转录组分析以及AtOFP2过表达突变体中OFP2的表达下调。然而，严重的生长矮化表型表明，存在稳定的OFP2蛋白并发挥作用。对OFP2突变体中差异表达基因（DEGs）的分析表明，OFP2是一种重要的调控因子，在激素信号通路的交汇处发挥作用，影响生长素、细胞分裂素、赤霉素（GA）、油菜素甾醇（BR）和脱落酸（ABA）发挥功能所需的关键基因。激素信号通路的扰动影响了细胞壁重塑相关因子，如扩展蛋白（EXPANSINS）、木葡聚糖水解酶（XTHs）和纤维素合酶（CSLs），从而导致整体生长矮化；同时还影响了WER、GL1、EGL3和TTG1等表皮模式形成基因，导致根长显著缩短、根毛显著减少。值得注意的是，对这一主调控因子的功能分析揭示了其显著的经济潜力。敲低这两个基因可解除其对生殖性状的天然抑制作用，使角果更长、种子更大且更重，并显著提高种子总产量，表明AtOFP2和AtOFP17是极具价值的农业作物改良靶标。
头对头排列的片段复制旁系同源基因 AtOFP2 和 AtOFP17 表现出功能的差异性时空分工，并负向调控包括种子产量和根系构型在内的多种发育性状 | bioRxiv
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AtOFP2
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AtOFP17
表现出功能的差异性时空分工，并负向调控包括种子产量和根系构型在内的多种发育性状
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Chahar
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Yadav
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Sandip
Das
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735610
Nishu Chahar
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德里大学植物学系
，德里 110 007，
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卡内基科学研究所植物生物学系
，美国加利福尼亚州斯坦福市 94305
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Ekta Pokhriyal
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Shobha Yadav
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Bijie Ren
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，美国加利福尼亚州斯坦福市 94305
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Meenakshi Dangwal
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sdas{at}botany.du.ac.in
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OVATE 家族蛋白（OFPs）是一类植物特有的负调控型核转录因子，其特征是具有保守的 C 端 OVATE 结构域。本研究对两个头对头排列的 OFP——AtOFP2（具有完整 OVATE 结构域的 OVATE-OFP）和 AtOFP17（具有部分 OVATE 结构域的 OVATE 样 OFP）进行了比较功能表征，为理解 OVATE 结构域的结构差异如何导致功能分化提供了重要见解。对功能缺失和功能获得突变体的 28 项形态及生理性状进行详细表型分析后发现，这两个基因均是植物生长发育的广谱、多效性抑制因子。在两个基因的敲低突变体中，抑制作用减弱，表现为种子休眠期缩短、萌发和生长速率加快、植株增大以及种子产量显著提高。相反，组成型过表达则显示这两个基因具有普遍的抑制作用，但在特定性状的精细调控方面存在细微差异。例如，这两个基因对根毛结构表现出拮抗作用。AtOFP2 是根毛发育的强效抑制因子，而 AtOFP17 对下胚轴和根细胞结构的抑制作用更强。由于 OVATE 结构域不完整，AtOFP17 在整个生命周期中发挥较温和的抑制作用，这一点可由敲低突变体植株较小、产量较低体现出来。
AtOFP17突变体则不然。相反，AtOFP2表现出强得多的抑制效应：超过90%的过表达突变体在幼年期死亡。其余10%的植株得以存活，可能是由于剂量依赖性反馈环机制被激活；成熟植株生长正常以及转录组数据均为此提供了证据。对AtOFP2敲低突变体和过表达突变体的7日龄幼苗根部进行转录组分析发现，过表达突变体中的OFP2表达下调。然而，植株严重矮化的表型表明，稳定存在的OFP2蛋白仍在发挥作用。对OFP2突变体中差异表达基因（DEGs）的分析揭示，OFP2是重要的调控因子，作用于多种激素信号通路的交汇处，并影响生长素、细胞分裂素、赤霉素（GA）、油菜素内酯（BR）和脱落酸（ABA）正常发挥功能所必需的关键基因。多种激素信号通路受到扰动，会影响扩张蛋白、木葡聚糖水解酶（XTHs）和纤维素合酶（CSLs）等细胞壁重塑因子，导致整体生长矮化；还会影响WER、GL1、EGL3和TTG1等表皮模式形成基因，造成根长和根毛显著减少。值得注意的是，对这一主调控因子的功能分析凸显了其巨大的经济潜力。敲低这两个基因可解除它们对生殖性状的天然抑制作用，从而形成更长的长角果、更大且更重的种子，并显著提高总种子产量，因此AtOFP2和AtOFP17是极具价值的作物改良靶标。
引言
拟南芥Ovate家族蛋白（OFPs）是一类新型植物特异性转录调控因子，其特征是具有保守的C端OVATE结构域，在植物发育、生长和株型建成中发挥重要但尚未充分揭示的作用（Wang et al., 2016）。这
ovate位点在一个多世纪前便已被发现，最初称为“pr”位点，后来称为“ovate”或“o”位点，该位点决定番茄果实呈梨形（Hedrick and Booth 1907；Prince and Drinkard 1908）。随后，OVATE位点被定位于番茄第2号染色体上，成为一个主效QTL（Ku et al., 1999），并通过图位克隆分离获得（Liu et al., 2002）。如今，已在地钱属（Marchantia）、小立碗藓属（Physcomitrella）、卷柏属（Selaginella）和泥炭藓属（Sphagnum）等有胚植物类群（Dangwal and Das, 2018；Chahar et al., 2021, 2023）、拟南芥（A. thaliana）（Liu et al., 2014）以及水稻（Oryza sativa）（Yu et al., 2015）等物种中鉴定出OFP多基因家族。该家族的创始成员被确定为果形决定因子（Tanksley, 2004），并被鉴定为定位于细胞核的转录抑制因子（Hackbusch et al., 2005；Wang et al., 2007）。现有研究表明，OVATE基因不仅在番茄中调控果形（Rodriguez et al., 2011），也在甜瓜（Ma et al., 2022）、柚（Citrus maxima；CitOFP19）（Wu et al., 2022）、辣椒（Tsaballa et al., 2011）和萝卜（Wang et al., 2020）等物种中参与果形调控。其他研究揭示了OFP家族成员在不同物种中的多种功能，包括参与维管组织发育（Schmitz et al., 2015）、胚珠发育（Pagnussat et al., 2007）、次生细胞壁形成（Li et al., 2011）、激素介导的细胞大小调控（Wang et al., 2007）以及果实成熟（Liu et al., 2015），凸显了它们作为关键生长调控因子的重要性。从机制上看，OFP1和OFP4可与BLH6（BEL样同源结构域6）和KNAT7形成复合物，从而调节次生细胞壁的形成（Li et al., 2011；Liu and Douglas, 2015）。它们还通过
通过与GA20ox1启动子相互作用抑制赤霉素合成，这一作用已在拟南芥、辣椒和水稻中得到证实（Wang et al., 2007；Wang et al., 2010；Tsaballa et al., 2012；Schmitz et al., 2015）。在拟南芥中，OFP过表达会抑制细胞分裂和细胞伸长，导致植株生长受阻、器官形态及模式建成发生改变（Hackbusch et al., 2005；Zhu et al., 2024）。例如，AtOFP2过表达会导致子叶呈肾形、叶片卷曲（Wang et al., 2011）；AtOFP2和AtOFP5可与微管排列的主要调控因子TONNEAU2（TON2）相互作用，后者可响应光照和油菜素内酯调节微管的排列方向（Zhang et al., 2020）。
在番茄中，SlOFP20与TRM家族相互作用，形成TTP复合物（TON1、TRM和PP2A）；该复合物对微管阵列的组织、细胞分裂模式调控以及由此形成的器官形态至关重要（Wang et al., 2020）。在水稻中，OsOFP8可通过与GSK3样激酶相互作用影响油菜素内酯信号通路，并通过调控叶片关节倾角影响植株株型（Yang et al., 2016）。由F-box蛋白FBX206、OsOFP8和OsOFP19构成的调控网络可调节油菜素内酯信号通路，从而控制水稻籽粒大小和产量（Sun et al., 2023）。OFP还参与胁迫响应，例如，桃中的OFP1与PpZFHD1相互作用，赋予植株耐盐性（Tan et al., 2021）；而毛果杨中的PpOFP1和小麦中的TaOFP29a则与耐旱性有关（Wang et al., 2020；Wang et al., 2021）。文献综述和比较功能分析表明，OVATE结构域的序列及功能具有保守性（Liu et al., 2014；Dangwal and Das, 2018；Chahar】【。
等，2023；Monforte 等，2014；Wu 等，2018；Colle 等，2017）。
对作用方式的剖析凸显了 OFPs 在协调激素信号间串扰中的多重作用，以及其精细调控植物发育结果的能力。总体而言，这些研究表明，OFPs 通过参与不同调控通路中的相互作用，在调控植物生长发育方面发挥着多样且动态的作用。因此，卵形家族蛋白（Ovate Family Proteins，OFPs）正逐渐被确认为复杂调控网络中的核心组分，这些网络整合多种激素与信号通路，进而影响植物发育和株型。尽管 OFPs 作为一个多基因家族几乎普遍存在于有胚植物中，但相关研究仍存在重大知识空白。例如：（i）仅对少数物种中的少量基因进行了部分功能鉴定，其作用方式与机制尚未完全阐明；（ii）OFPs 调控植物发育的完整范畴仍有待揭示；（iii）完整及部分 OVATE 结构域的结构变异所产生的功能效应尚未得到研究和阐明。
在拟南芥（A. thaliana）OFP 家族的 19 个成员中（Liu 等，2014），我们此前报道，AtOFP2–AtOFP17 和 AtOFP4–AtOFP20 分别以头对头排列方式位于第 2 号和第 1 号染色体上（Chahar 等，2023）。AtOFP2 含有完整的 OVATE 结构域（注释为 OVATE-OFP），其 C 端具有两个基序，N 端具有一个预测的 DNA 结合结构域（DNA Binding Domain，DBD）；而 AtOFP17 含有部分 OVATE 结构域（OVATE-like OFP），仅具有一个基序，且 N 端不含 DBD（Chahar 等，2023）。我们此前的研究揭示了 OVATE 结构域的序列与结构变异及其
在陆生植物中的演化轨迹，但尚未揭示其功能意义（Dangwal and Das 2018；Chahar et al., 2021, 2023）。AtOFP2和AtOFP17分别具有完整和部分结构域，这将有助于检验蛋白质结构与功能之间的直接联系。OFP家族中完整与部分OVATE结构域的共存不仅是演化上的新特征，还可能是功能分化的基础。
因此，本研究旨在对AtOFP2和AtOFP17进行比较功能表征，具体目标为：（i）了解完整和部分OVATE结构域对植物发育的影响；（ii）对尚未见功能研究报道的AtOFP17进行功能分析；（iii）利用功能获得型和功能缺失型突变体，比较分析AtOFP2和AtOFP17在植物生长发育中的作用；（iv）深入解析OFP2调控根系构型的分子机制。
材料与方法
植物材料与生长条件
所有实验均采用拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0生态型。植株在生长室中培养，温度为21 ± 2°C，相对湿度为65%，光周期为16 h光照/8 h黑暗，光照强度为120–150 μmol·m⁻²·s⁻¹（Weigel and Glazebrook, 2002）。
功能获得型和功能缺失型突变体的构建
采用Gateway™技术构建功能获得型转基因株系。通过PCR扩增AtOFP2和AtOFP17的编码序列（CDS）（补充表1），并将其克隆至pENTR/D-TOPO入门载体（Thermo Fisher Scientific）。为实现定向克隆，在正向引物的5′端添加5′-CACC-3′序列。在pENTR/D-TOPO-AtOFP2/AtOFP17构建体与目的载体之间进行BP和LR重组反应
载体 pGWB441 含有 CaMV 35S 启动子和 C 端 eYFP 标签（Nakagawa et al., 2007a），用于构建异位表达载体（补充图 1）。
为获得功能缺失突变体，从 TAIR 获取 AtOFP2 和 AtOFP17 的全长编码序列（CDS），并提交至 Web microRNA designer 服务器（http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi?page=Designer;project=st…），以设计基因座特异性的人工微小 RNA。以“纳入的最少靶标数 = 1”和“允许的脱靶数 = 0”为标准，将目标基因与“Araport11 genes 201606 cDNA”数据库进行比对。通过人工检查杂交能、错配位置及靶位点位置，筛选出最合适的人工微小 RNA（补充图 2、3A–C）。针对 pRS300 骨架中的人工微小 RNA 序列设计重叠延伸 PCR（SOEing-PCR）引物，按照所述方法将扩增产物构建至 pCHF3 载体中，并经测序验证（Schwab et al., 2006；Fankhauser et al., 1999；补充图 2、3）后，转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株。采用花序浸染法转化拟南芥（A. thaliana）Col-0 植株（Clough and Bent, 1998）。利用卡那霉素筛选转化植株，并对 T1 代植株进行 PCR 基因分型。通过自交繁育后代，并采用半定量 PCR 确认 T2 代植株中这两个基因的表达水平（补充图 3D–E）。
半定量 RT-PCR
使用 TRIzol™（Thermo Fisher Scientific）从生长 15 天的 T2 代幼苗中提取 RNA。使用 iScript™ 试剂盒（Bio-Rad；美国）合成 cDNA，并以肌动蛋白基因（At3G18780）作为检测转录本水平的内参（Anand et al., 2023）。第一链合成的反应条件为 25°C，持续
5 min；46°C处理20 min，96°C处理1 min。使用位点特异性引物进行半定量PCR，共28个循环，每个循环包括94°C变性、根据Tm值设定温度退火及72°C延伸，各20 s。
休眠测定
通过测定未经层积处理的种子在规定时间内的萌发百分率，评价野生型（WT）、amiR-AtOFP2/AtOFP17和oex-AtOFP2/AtOFP17种子的休眠性（Koornneef et al., 2002；Gubler et al., 2005）。将100粒种子均匀撒布于1/2浓度MS琼脂培养基平板上，不经层积处理，直接置于22°C生长箱中。第1天，先给予种子2 h光照以启动萌发，随后进行8 h暗处理。此后每天均采用16 h光照/8 h黑暗的光周期。使用Stemi-305体视变焦显微镜（Carl-Zeiss，瑞士）观察萌发种子数量并拍照。以胚根突破种皮并伸出作为种子萌发的判定标准。
种子形态与生理
为研究表型差异，通过电子显微镜观察，以及钌红、DMACA和四唑盐组织化学染色，评估种子大小、颜色、重量等一般性状，以及黏液产生、种皮通透性和原花青素生成等生理特性。
扫描电子显微镜观察
在分析种皮纹饰前，将种子于37°C烘干。在液态CO₂存在的条件下，对种子进行30 min临界点干燥，随后将其固定于样品台上，并使用溅射镀膜仪镀金。之后，使用扫描电子显微镜（JEOL，730 JSM-6610LV）在10 kV和20 kV加速电压下观察样品并拍照。
钌红染色
将种子置于1.5 ml微量离心管（MCT）中，并加入500 µl
加水使种子完全浸没。将样品置于开放式旋转摇床上，以400 rpm剧烈振荡1 h，使种子充分吸水并释放黏液。孵育1 h后，将水更换为0.01%钌红染液，染色2 h（McFarlane et al., 2014）。随后用水清洗种子，使用Stemi-305体视变倍显微镜（Carl-Zeiss，瑞士）进行观察和拍照。
DMACA（二甲氨基肉桂醛）染色
将种子直接置于DMACA溶液中（含0.2% DMACA的3 M HCl/50%甲醇溶液）。5 d后，用70%乙醇清洗种子，使用Stemi-305体视变倍显微镜（Carl-Zeiss，瑞士）进行观察和拍照（Li et al., 1996）。
四唑盐染色
将种子直接置于四唑盐染色液中［将0.1 g氯化三苯基四唑（2,3,5-三苯基-2H-氯化四唑）溶于10 mL无菌水中］，染色24～36 h。染色后，用水清洗种子，并使用Stemi-305体视变倍显微镜（Carl-Zeiss，瑞士）拍照。
统计分析
使用GraphPad Prism 9.3.1（https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/；GraphPad Software, Inc.，美国加利福尼亚州圣迭戈；Mavrevski et al., 2018）进行方差分析（ANOVA）、Tukey检验和回归分析。
AtOFP2幼苗根的RNA测序与数据分析
取7日龄幼苗的根进行RNA提取；分别为WT、oex-ofp2和amiR-ofp2构建RNA测序文库，每种样品设置3个重复，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。每个样品产生3,500万～4,000万条读段。使用Trimmomatic（v 0.39）对原始RNA-seq读段进行质量检查和修剪，以去除低质量碱基和接头序列（R代码见补充数据文件）。经修剪的高质量读段被
随后，使用 STAR 2.7.10（Spliced Transcripts Alignment to a Reference；Dobin et al. 2013）将其比对至拟南芥（A. thaliana）参考基因组 TAIR 10。使用 HTSeq-count（v 0.12.4）对 STAR 生成的已排序 BAM 文件进行基因水平定量。提供与参考基因组对应的 GTF 文件，以将测序读段分配至已注释基因。将 HTSeq-count 生成的原始基因计数及相应的样本元数据导入 R。为提高统计检验的可靠性，过滤掉在所有样本中计数均极低的基因。采用 DESeq2 核心方法进行差异表达分析，该方法使用负二项分布对计数数据建模，并估计每个基因的离散度。随后，DESeq2 应用广义线性模型（GLM）检验不同条件间的基因表达差异。筛选 log2 倍数变化大于 1（log2FC > 1）的基因，并使用 agriGO 2.0 平台进行 GO 富集分析（Tian et al. 2017；https://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/）。使用 Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index2.0.2.html；Oliveros 2007–2015）绘制韦恩图。
实时荧光定量逆转录 PCR（qRT-PCR）
使用 Trizol 试剂（Thermo Fisher Scientific）从 7 日龄拟南芥 Col-0（WT）、amiR-ofp2 和 oex-ofp2 株系幼苗的根中提取总 RNA；使用 Verso cDNA 合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成第一链 cDNA。采用实时荧光定量逆转录 PCR，使用 KAPA SYBR FAST（KAPA Biosystems；Analytik Jena 的 qTower）对选定候选基因进行相对定量。根据选定候选基因的 CDS 序列，靠近 3′ 端手动设计引物。每份 10 μL 反应混合液中含有 5 μL 的
2×SYBR 预混液、0.5 μL 第一链合成反应液、各 0.5 μL 引物（2 μM）以及 3.5 μL 无核酸酶双蒸水。
qPCR 循环条件如下：95°C 预变性 30 s；随后在 PCR 板中进行 40 个循环，每个循环包括 95°C 变性 20 s、55°C 退火 20 s 和 72°C 延伸 30 s。以肌动蛋白（Actin）作为内参，对样品间的差异进行归一化。使用 qPCR Soft 4.1 对数据进行可视化，并将数据导出至 Excel 工作表。采用 2^−ΔΔCt 法分析转录本水平及其倍数变化（Livak 和 Schmittgen，2001）。
结果
表型和生理分析揭示 AtOFP2 和 AtOFP17 的抑制作用及多效性效应
为研究 AtOFP2 和 AtOFP17 在拟南芥（A. thaliana）发育中的作用，利用组成型过表达（Oex）和基于人工微小 RNA（amiRNA）的敲低（amiR）构建体，分别获得了功能获得型和功能缺失型突变株系。在 T2 代确认了目标基因座的转录本水平。与野生型（WT）相比，相应过表达株系中 AtOFP2 和 AtOFP17 的转录本水平显著升高，而敲低株系中的转录本水平则降低（补充图 3D、E）。在 T3 代进行表型性状评估，选取至少三个独立转基因株系，每个株系取 10–15 株后代进行分析。由于此前尚无关于 AtOFP2 和 AtOFP17 异常表达所影响表型的报道，因此对从种子萌发到最终植株产量的整个生命周期进行了详细的表型评估。初步筛选显示，这两个基因对应株系的表型相似，但贯穿整个生命周期的详细分析表明，两个基因突变效应的外显程度存在差异。
幼苗性状
子叶面积
其面积
7日龄幼苗的子叶在不同基因型之间表现出显著差异。每种基因型均选取15株T3代植株进行评估（补充表S2a、S2d）。在AtOFP2相关基因型中，amiR-ofp2的子叶面积最大（平均值为5.132 ± 0.227 mm²），其次为野生型（WT；平均值为3.016 ± 0.219 mm²），oex-ofp2的子叶面积最小（平均值为1.386 ± 0.126 mm²；图1A、1F）。单因素方差分析显示，各组子叶面积存在显著差异，F值为1368，P值<0.001（F临界值为3.220；补充表S2b）。为确定各组间两两比较差异的显著性，进行了Tukey检验。amiR-ofp2与WT、amiR-ofp2与oex-ofp2以及WT与oex-ofp2比较的Q值分别为41.66、73.76和32.1（补充表S2c）。上述值均显著高于0.05水平的q临界值3.44和0.01水平的q临界值4.35，表明所有组间均存在显著差异（补充表S2c）。拟合优度为0.9849（R²值；补充表S2b），说明子叶大小的变异依赖于基因型。
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图1：
野生型（WT）、基因敲低（amiR-OFP2）和过表达（oex-OFP2）植株的幼苗性状及莲座叶面积比较。
A）7日龄amiR-OFP2、WT和oex-OFP2幼苗的子叶。
B）表现出根系形态变化的15日龄幼苗。
C、D）3周龄和5周龄植株。
E）根毛长度和根毛密度表型的代表性图像。
F、G、H、I、J和K）分别为子叶面积、下胚轴长度、根长、根毛密度、根毛长度和莲座叶投影面积的统计比较图。所有图中的柱形均表示平均值
± 标准差（SD），ns = 差异不显著，*p=0.033，p=0.02，*p<0.001。
同样，在 AtOFP17 各株系中，amiR-ofp17 的子叶面积最大（平均值为 4.326 ± 0.375 mm²），其次为 WT（平均值为 3.236 ± 0.431 mm²），而 oex-ofp17 幼苗的子叶面积最小（平均值为 2.202 ± 0.31 mm²；图 2A、2F；补充表 S2d）。单因素方差分析表明，各组子叶面积存在显著差异，F 值为 119.2，P 值 <0.001，F 值高于临界值 Fcrit（3.220）（补充表 S2e）。amiR-ofp17 与 WT、amiR-ofp17 与 oex-ofp17，以及 WT 与 oex-ofp17 比较的 Q 值分别为 11.23、21.89 和 10.66。这些值均显著高于 q.05 临界值（3.44）和 q.01 临界值（4.35），表明各组之间均存在显著差异（补充表 S2f）。拟合优度为 0.8509，表明除基因型外，其他因素也影响表型（补充表 S2e）。
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图 2：
WT、表达下调（amiR-OFP17）和过表达（oex-OFP17）植株的幼苗性状及莲座叶面积比较。
A）7 日龄 amiR-OFP17、WT 和 oex-OFP17 幼苗的子叶。
B）根部形态发生改变的 15 日龄幼苗。
C、D）3 周龄和 5 周龄植株。
E）根毛长度和根毛密度表型的代表性图像。
F、G、H、I、J 和 K）分别为子叶面积、下胚轴长度、根长、根毛密度、根毛长度和莲座叶投影面积的统计比较图。所有图中的柱形均表示平均值 ± 标准差（SD），ns = 差异不显著，*p=0.033，p=0.02，*p<0.001。
下胚轴长度
该性状在每……的 15 株 T3 代幼苗中进行测量
萌发后10天的基因型。在AtOFP2和AtOFP17中，敲低株系的下胚轴均最长，其次为野生型（WT），过表达株系的下胚轴最短（图1B、1G；2B、2G）。对于AtOFP2，amiR-ofp2幼苗的平均下胚轴长度为5.34 ± 0.65 mm，而WT和oex-ofp2分别为2.66 ± 0.31 mm和3.67 ± 0.47 mm（补充表S3a）。对于AtOFP17，amiR-ofp17的平均下胚轴长度为5.43 ± 0.64 mm，而WT和oex-ofp17分别为2.64 ± 0.31 mm和1.99 ± 0.37 mm（补充表S3d）。单因素方差分析表明，两个基因的不同基因型之间均存在显著差异（AtOFP2：F = 109.8，F临界值 = 3.22；AtOFP17：F = 235.3，F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S3b、e）。Tukey检验证实，所有两两比较均达到显著水平（AtOFP2的q值 > 7.8，AtOFP17的q值 > 5.3，均超过q₀.₀₅临界值 = 3.44和q₀.₀₁临界值 = 4.35；补充表S3c、f）。AtOFP2和AtOFP17的拟合优度分别为0.84和0.92，表明AtOFP17的基因型与表型之间的关联更强，而AtOFP2的该性状可能还受到其他因素的影响。
主根长度
对15日龄幼苗的测量显示，AtOFP2和AtOFP17的不同基因型均呈现出明确的趋势：amiRNA株系的根最长，WT的根长居中，而过表达株系的根明显较短（图1B、1H；2B、2H）。对于AtOFP2，amiR-ofp2的平均根长为6.17 ± 0.95 cm，是WT根长（3.50 ± 0.64 cm）的两倍以上，且远长于oex-ofp2（0.41 ± 0.09 cm；补充表S4a）。AtOFP17也呈现出类似模式，amiR-ofp17的根长为7.30 ± 0.66 cm，而WT为3.54 ± 0.66 cm，oex-ofp17仅为0.93 ± 0.28 cm（补充
表 S4d）。统计分析证实，这些差异具有高度显著性。单因素方差分析得出的 AtOFP2 和 AtOFP17 的 F 值分别为 470.3 和 816.2，远高于临界值（Fcrit = 3.12；P < 0.001；补充表 S4b、S4e）。Tukey 事后检验表明，所有基因型之间均存在显著差异，且 q 值均较大（AtOFP2 均 > 20.1，AtOFP17 均 > 23.2），超过了 q₀.₀₅crit = 3.38 和 q₀.₀₁crit = 4.25 两个临界值（补充表 S4c、S4f）。较高的 R² 值（两个基因均为 0.93）表明，根长变异与基因型高度相关。
根毛密度
在 15 日龄幼苗的成熟区测量根毛密度。在 AtOFP2 株系中，amiR-ofp2 与 WT 的根毛密度相近（分别为 19.7 ± 2.11 根/mm² 和 19.2 ± 1.75 根/mm²），而 oex-ofp2 的根毛密度最低（11.4 ± 3.09 根/mm²；图 1E、1I；补充表 S5a）。相比之下，AtOFP17 呈现相反的趋势，oex-ofp17 的根毛密度最高（40.4 ± 5.56 根/mm²），其次为 WT（26.5 ± 2.95 根/mm²）和 amiR-ofp17（33.3 ± 3.23 根/mm²）（图 2E、2I；补充表 S5d）。
方差分析显示，两个基因均存在显著的基因型效应（AtOFP2：F = 37.96；AtOFP17：F = 28.92；Fcrit = 3.35；P < 0.001；表 S5b、S5e）。对于 AtOFP2，Tukey 检验表明，amiR-ofp2 与 WT 之间无显著差异（q = 0.66），但二者与 oex-ofp2 之间均存在显著差异（q 分别为 10.99 和 10.32；q₀.₀₅crit = 3.51，q₀.₀₁crit = 4.49；补充表 S5c）。对于 AtOFP17，所有基因型之间均存在显著差异，其中 WT 与 oex-ofp17 之间的差异最大（q = 10.75；补充表 S5f）。
有趣的是，amiR-ofp2 提高了根毛密度，而 oex-ofp2 则降低了根毛密度。相比之下，在 AtOFP17 中，amiR-ofp17 降低了根毛密度，而 oex-ofp2
根毛密度增加，呈现出相反的发育模式，提示这两个OFP基因可能在根毛发育中发挥相反的调控作用。
根毛长度
在15日龄幼苗中测定根毛长度，每种基因型选取10株T3代植株，每株测量30根根毛。在AtOFP2株系中，amiR-ofp2的根毛最长（335.5 ± 48.22 µm），WT居中（241.2 ± 68.77 µm），oex-ofp2最短（110.5 ± 21.99 µm；图1E、1J；补充表S6a）。在AtOFP17株系中，这一趋势相反：oex-ofp17的根毛最长（419.1 ± 34.35 µm），其次为amiR-ofp17（346.5 ± 28.09 µm），WT仍处于较低水平（241.2 ± 68.77 µm）（图2E、2J；补充表S6d）。方差分析（ANOVA）证实，基因型效应高度显著（AtOFP2：F = 50.82；AtOFP17：F = 35.83；Fcrit = 3.35；P < 0.001；补充表S6b、S6e）。在AtOFP2株系中，所有两两比较的差异均极显著（q = 5.95–14.2；q₀.₀₅crit = 3.38；q₀.₀₁crit = 4.25；补充表S6c）。在AtOFP17株系中，amiR-ofp17与WT及oex-ofp17之间的差异均高度显著（q分别为7.05和11.9），而WT与oex-ofp17之间比较的q值仅略高于q₀.₀₁crit阈值（q = 4.85；补充表S6f）。R²值处于中等水平（AtOFP2：0.79；AtOFP17：约0.8），表明除基因型外，其他因素也对根毛长度变异有所贡献。
有趣的是，amiR-ofp2促进根毛伸长，而oex-ofp2则抑制根毛伸长；相比之下，AtOFP17反向遗传学突变体呈现出不同的响应。oex-ofp17的根毛最长，其次为amiR-ofp17。这与根毛密度所呈现的模式一致，进一步支持了AtOFP2和AtOFP17基因可能在根毛发育中发挥相反调控作用的推测。
根细胞尺寸
成熟区的细胞尺寸
利用每种基因型10株T3代幼苗的图像，对15日龄根区的细胞进行定量分析。在AtOFP2株系中，amiR-ofp2的细胞长度（174.17 ± 10.52 µm）大于oex-ofp2（68.41 ± 4.65 µm），而WT的细胞长度居中（137 ± 7.8 µm）。细胞宽度呈现相似趋势，amiR-ofp2的细胞宽度（29.54 ± 4.86 µm）大于oex-ofp2（14.48 ± 1.31 µm）和WT（18.10 ± 3.09 µm；补充图4A；补充表S7a）。在AtOFP17株系中，amiR-ofp17的细胞长度（211.48 ± 8.74 µm）大于oex-ofp17（42.92 ± 3.84 µm）和WT（137 ± 7.8 µm）。amiR-ofp17的细胞也更宽（35.95 ± 6.87 µm），其次为WT（18.10 ± 3.09 µm），而oex-ofp17的细胞较窄（6.79 ± 1.07 µm；补充图5A；补充表S7f）。方差分析（ANOVA）证实，基因型对这两项性状均具有显著影响（AtOFP2：细胞长度的F值为446.9，细胞宽度的F值为53.04；AtOFP17：细胞长度的F值为1408，细胞宽度的F值为111.8；F临界值 = 3.35；P < 0.001；补充表S7b、d、g、i）。针对AtOFP2的Tukey检验表明，所有基因型之间的细胞长度均存在显著差异（q = 14.62–41.67；表S7c）；除WT与oex-ofp2之间的细胞宽度差异不显著外（q = 3.35；表S7e），其余基因型之间的细胞宽度差异均显著。对于AtOFP17，细胞长度和宽度的所有两两比较均达到高度显著水平（长度q = 33.05–74.88；宽度q = 8.13–20.97；补充表S7h、j）。
R²值表明，细胞长度的变异主要由基因型驱动（AtOFP2：0.97；AtOFP17：约0.97），而细胞宽度的拟合优度较低（AtOFP2：0.80），提示该性状还受到其他因素的影响。
盆栽植株性状
莲座叶投影面积
在5周龄阶段，OPF2和OFP17的amiRNA株系均表现出最大的莲座叶面积。amiR-ofp2的莲座叶平均面积为18.78 ± 1.22 cm²，而WT为10.22 ± 0.98 cm²
而 oex-ofp2 为 1.70 ± 0.42 cm²（图 1D、1K；补充表 S8a）。amiR-ofp17 的莲座叶面积为 19.07 ± 1.02 cm²，WT 为 10.74 ± 1.05 cm²，oex-ofp17 为 4.88 ± 0.55 cm²（图 2D、2K；补充表 S8d）。方差分析（ANOVA）检测到极显著的基因型效应（AtOFP2：F = 912.7；AtOFP17：F = 650.7；Fcrit = 3.35；P < 0.001；补充表 S8b、S8e）。Tukey 检验表明，所有组间均存在显著差异，且 q 值较大（AtOFP2：q = 30.3–60.4；AtOFP17：q = 21.9–50.9），远高于 q₀.₀₅crit = 3.44 和 q₀.₀₁crit = 4.35（补充表 S8c、S8f）。R² 值均很高（AtOFP2：0.99；AtOFP17：约 0.98），表明这两个基因的基因型与莲座叶面积表型均具有很强的关联。
莲座叶数量
抽薹期 amiR-ofp2 与 WT 植株的莲座叶数量相近（分别为 12.6 ± 1.45 和 12.2 ± 2.21），而 oex-ofp2 的莲座叶数量显著增加（23.2 ± 2.12；图 3A–D；补充表 S9a）。类似地，amiR-ofp17 与 WT 的叶片数量相近（分别为 12.8 ± 1.61 和 13.26 ± 1.28），而 oex-ofp17 的叶片数量较少（10 ± 1.13；图 4A–D；补充表 S9d）。方差分析检测到基因型间存在显著差异（AtOFP2：F = 154.2；AtOFP17：F = 25.43；Fcrit = 3.22；P < 0.001；补充表 S9b、S9e）。Tukey 检验表明，amiR-ofp2 与 WT 之间（q = 0.79）以及 amiR-ofp17 与 WT 之间（q = 1.33）均无显著差异，而对于每个基因，过表达株系与表达下调株系及 WT 之间均存在显著差异（AtOFP2：q = 21.1–21.9；AtOFP17：q = 7.99–9.32；q₀.₀₅crit = 3.51；q₀.₀₁crit = 4.49；补充表 S9c、S9f）。R² 值处于中等水平（AtOFP2：0.88；AtOFP17：0.54），表明尽管基因型对叶片数量有显著影响，但其他因素也可能影响叶片数量。
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图
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图3：
野生型（WT）、表达下调（amiR-OFP2）和过表达（oex-OFP2）植株的成熟期表型比较。
A、B、C）
分别为amiR-OFP2、WT和oex-OFP2植株的子叶、莲座叶和茎生叶。
D、E、F）
分别为莲座叶数量、莲座叶面积和茎生叶面积的统计比较图。
G）
oex-OFP2植株第一对真叶的退化。H）oex-ofp2植株抽薹后从茎基部长出的轮生叶，以及WT植株的一对叶。
I、J）
分别为10周龄的amiR-OFP2、WT和oex-OFP2植株，以及15周龄的AtOFP2-oex植株。
K、L）
分别为成熟期株高以及一级和二级分枝数量的统计比较图。所有图中的柱形均表示均值±标准差，ns表示差异不显著，*p=0.033，p=0.02，*p<0.001。
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图4：
野生型（WT）、表达下调（amiR-OFP17）和过表达（oex-OFP17）植株的成熟期表型比较。
A、B、C）
分别为amiR-OFP2、WT和oex-OFP17植株的子叶、莲座叶和茎生叶。
D、E、F）
分别为茎生叶面积、莲座叶面积和莲座叶数量的统计比较图。
G）
10周龄的amiR-OFP17、WT和oex-OFP17植株。
H）
amiR-ofp17、WT和oex-OFP17植株盆栽幼苗的叶片形态。
I、J）
分别为一级和二级分枝数量以及株高的统计比较图。所有图中的柱形均表示均值±标准差，ns表示差异不显著，*p=0.033，p=0.02，*p<0.001。
莲座叶和茎生叶的面积
在莲座期，AtOFP2株系
oex-ofp2 的叶面积最大（6.09 ± 0.40 cm²），其次为 amiR-ofp2（5.47 ± 0.55 cm²）和 WT（3.70 ± 0.45 cm²；图3A–C、E；补充表S10a）。与此相反，amiR-ofp17 的叶面积最大（4.70 ± 0.38 cm²），其次为 WT（3.70 ± 0.46 cm²），而 oex-ofp17 的叶面积最小（2.69 ± 0.29 cm²）（图4A–C、E；补充表S10d）。方差分析证实，基因型效应显著（AtOFP2：F = 100.9；AtOFP17：F = 101.9；F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S10b、e）。Tukey 检验表明，所有 AtOFP2 基因型之间（q = 5.07–19.37）以及所有 AtOFP17 基因型之间（q = 10.02–20.19）均存在显著差异，q 值远高于 q₀.₀₅临界值 = 3.44 和 q₀.₀₁临界值 = 4.35（补充表S10c、S9f）。R² 值处于中等水平（AtOFP2：0.83；AtOFP17：0.83），表明其他因素也对莲座叶面积的变异有所贡献。
amiR-ofp2、WT 和 oex-ofp2 的茎生叶平均面积分别为 1.67 ± 0.22 cm²、0.90 ± 0.13 cm² 和 2.70 ± 0.38 cm²（图3A–C、F；补充表S11a）。amiR-ofp17 和 oex-ofp17 的相应值分别为 1.70 ± 0.25 cm² 和 0.75 ± 0.14 cm²（图4A–C、F；补充表S11d）。方差分析再次显示出显著的基因型效应（AtOFP2：F = 173.8；AtOFP17：F = 113.8；P < 0.001；补充表S11b、e）。Tukey 检验表明，所有 AtOFP2 基因型之间均存在显著差异（q = 5.07–26.27）；对于 AtOFP17，amiRNA 株系与 WT 及过表达株系（oex）之间均存在显著差异（q = 16.76–19.81）。然而，WT 与 oex-ofp17 之间的差异不显著（q = 3.05；图4D；补充表S11f）。AtOFP2 茎生叶的 R² 值较高（0.89），表明基因型是主要影响因素；而 AtOFP17 的拟合程度略低（0.84），提示还存在其他影响因素。
茎表皮毛密度
在主茎上选取长 2 mm 的区段进行表皮毛计数，所用材料为
约7周龄的植株。amiR-ofp2（13.6 ± 1.34）和oex-ofp2（13.3 ± 1.70）的表皮毛密度均明显高于WT（5.1 ± 1.19）。AtOFP17也呈现类似模式，amiR-ofp17（12.8 ± 1.22）和oex-ofp17（12.8 ± 1.62）均高于WT（5.1 ± 1.97）（补充图4C–D、5C–D；补充表S12a、d）。方差分析（ANOVA）检测到基因型间存在显著差异（AtOFP2：F = 113.4；AtOFP17：F = 106.5；F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S12b、d）。Tukey检验证实，表达下调株系和过表达株系均与WT存在高度显著差异（两个基因的q值均约为18），而amiRNA与Oex之间的差异不显著（q < 1；补充表S12c、f）。R²值（两者均约为0.89）表明，基因型是影响茎表皮毛密度的主要因素，但其他因素也可能影响这一性状。
成熟期株高
在结籽期测量成熟植株的高度（amiR-ofp2和WT约为10周龄；oex-ofp2约为15周龄）。amiR-ofp2植株的株高（31.5 ± 2.55 cm）显著高于WT（21.4 ± 2.72 cm）和oex-ofp2（21.7 ± 2.25 cm；图3H、I；补充表S13a）。与WT（22.13 ± 2.23 cm）和oex-ofp17（15.93 ± 1.48 cm）相比，amiR-ofp17植株的株高（25.93 ± 2.91 cm）也有所增加，但基因型效应较弱（图4G、J；补充表S13d）。方差分析显示存在显著差异（AtOFP2：F = 78.41；AtOFP17：F = 73.10；F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S13b、e）。针对AtOFP2的Tukey检验显示，amiRNA株系与WT和oex均存在高度显著差异（q值分别为15.59和15.07），而WT与Oex之间的差异不显著（q = 0.51；补充表S13f）。对于AtOFP17，所有两两比较的差异均显著（q = 6.44–16.94），超过q₀.₀₅临界值 = 3.44和q₀.₀₁临界值 =
4.35（补充表S13f）。R²值处于中等水平（AtOFP2：0.79；AtOFP2：0.78），表明除基因型外，其他因素也会影响株高。
一级和二级分枝数
在植株成熟时统计该性状的数值（n=15）。amiR-ofp2的一级分枝数（4.33 ± 0.81）高于WT（3.73 ± 0.79），而oex-ofp2的分枝数较少（2.73 ± 0.73；图3H、J；补充表S14a）。amiR-ofp17（4.33 ± 0.89）、WT（4 ± 1.07）和oex-ofp17（2.73 ± 0.88）也呈现类似模式（图4G、I；补充表S14f）。方差分析表明，差异幅度较小，但具有统计学显著性（AtOFP2：F = 16.33；AtOFP17：F = 11.73；F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S14b、g）。Tukey检验显示，oex株系与amiRNA株系及WT均存在显著差异（AtOFP2：q分别为8.00和5.00；AtOFP17：q分别为6.49和5.14；q₀.₀₅临界值 = 3.44；q₀.₀₁临界值 = 4.35）。两个基因的amiRNA株系与WT之间的差异均不显著（q < 3.1；补充表S14c、h）。R²值较低（AtOFP2：0.44；AtOFP17：0.35），表明仅凭基因型只能解释分枝数变异的一小部分。
amiR-ofp2、WT和oex-ofp2的二级分枝数分别为15.13 ± 2.23、11 ± 1.69和11.8 ± 2.336（图3H、J；补充表S14a）。amiR-ofp17、WT和oex-ofp17的相应数值分别为12.46 ± 2.29、12.13 ± 2.445和7.266 ± 1.83（图4G、I；补充表S14f）。方差分析检测到幅度较小但具有统计学显著性的差异（AtOFP2：F = 16.27；AtOFP17：F = 26.11；F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S14d、i）。针对AtOFP2的Tukey检验显示，amiRNA株系与WT及oex株系均存在显著差异（q分别为7.60和6.13），而WT与oex株系之间的差异不显著（q = 1.47）。对于AtOFP17，oex植株存在差异
与amiRNA和WT相比均存在显著差异（q = 8.54–9.13），而amiRNA与WT之间的差异不显著（q = 0.59；补充表S14e、j）。R²值较低（AtOFP2：0.44；AtOFP17：0.55），表明次级分枝数的基因型与表型之间相关性很弱。结合初级分枝数的结果，这些结果表明，与株高或莲座叶面积等其他地上部性状相比，基因型对分枝模式的影响较弱。
种子相关性状
角果长度和每角果种子数
在成熟期随机选取15个角果，测量从喙尖至果梗连接处基部的长度。同时测定这些角果的每角果种子数。在AtOFP2和AtOFP17中，amiRNA株系的角果均最长，每角果种子数也最多。amiR-ofp2的平均角果长度为14.02 ± 0.80 mm，每角果种子数为50.66 ± 3.06粒；相比之下，WT的角果长度为9.44 ± 0.72 mm，每角果种子数为39.13 ± 1.84粒，oex-ofp2的角果长度为9.66 ± 0.62 mm，每角果种子数为39.26 ± 1.83粒（图5E、J和K；补充表S15a）。amiR-ofp17的角果长度为13.42 ± 0.99 mm，每角果种子数为47.06 ± 2.57粒；WT的角果长度为9.83 ± 0.70 mm，每角果种子数为40.6 ± 2.66粒；oex-ofp17的角果长度为8.78 ± 0.90 mm，每角果种子数为26.13 ± 2.47粒（图6E、H和I；补充表S15f）。
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图5：
WT、基因敲低（amiR-OFP2）和过表达（oex-OFP2）植株的种子物理性状、生理性状及最终产量比较。
A）
播种48小时后萌发的种子。
B）
amiR-ofp2、WT和oex-OFP2种子的萌发率。
C）
WT、基因敲低（amiR-OFP2）和过表达（oex-OFP2）植株的种子特征比较：上图：
干燥种子。中图：完整种子的扫描电子显微图。下图：种皮表皮细胞的局部放大扫描电子显微图。
D)
种子染色——上图：吸水种子的黏液经钌红染色。中图：采用 DMACA 染色检测种皮中的原花青素。下图：采用四唑染色检测种皮通透性。
E)
amiR-ofp2、WT 和 oex-ofp2 成熟植株的长角果，展示长角果长度及每角果种子数。
F)
以单株收获的种子量表示总产量。
G、H、I、J、K、L)
以图表形式展示300粒干燥种子的重量、种子尺寸、单株长角果数、长角果长度、每角果种子数及单株产量的统计比较。所有图中的柱形均表示均值 ± 标准差，ns = 差异不显著，*p=0.033，p=0.02，*p<0.001。
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图6：
野生型（WT）、表达下调（amiR-OFP17）和过表达（oex-OFP17）植株的种子物理与生理性状及最终产量比较。
A)
播种于培养基上48小时后的萌发种子。
B)
amiR-ofp17、WT 和 oex-ofp17 种子的萌发率。
C)
野生型（WT）、表达下调（amiR-OFP17）和过表达（oex-OFP17）植株的种子特征比较：上图：干燥种子。中图：完整种子的扫描电子显微图。下图：种皮表皮细胞的局部放大扫描电子显微图。
D)
种子染色——上图：吸水种子的黏液经钌红染色。中图：采用 DMACA 染色检测种皮中的原花青素。下图：采用四唑染色检测种皮通透性。
E)
amiR-ofp17、WT 和 oex-ofp17 成熟植株的长角果，展示长角果长度及每角果种子数。
F)
以单株所获种子的形式展示总产量。
G、H、I、J、K、L）
种子尺寸、角果长度、每角果种子数、单株角果数、300粒干种子重量及单株产量统计比较的图示。所有图中的柱形均表示均值 ± 标准差，N = 10，ns = 差异不显著，*p = 0.033，p = 0.02，*p < 0.001。
方差分析（ANOVA）证实，基因型对这两个性状均具有显著影响（AtOFP2：角果长度的F = 193.2，种子数的F = 122.2；AtOFP17：角果长度的F = 115，种子数的F = 260.1；F临界值 = 3.22；P < 0.001；补充表S15b、S15d、S15g、S15i）。Tukey检验表明，在所有情况下，amiRNA株系与WT及oex株系之间均存在显著差异（AtOFP2：q = 19.03–24.65；AtOFP17：q = 9.73–31.5），而在AtOFP2中，WT与oex株系的角果长度和种子数均无显著差异（q ≈ 1；补充表S15c、S15e、S15h、S15j）。角果长度（AtOFP2：0.90；AtOFP17：0.85）和种子数（AtOFP2：0.85；AtOFP17：0.92）的R²值均较高，表明基因型是这些性状的主要决定因素。两个基因均呈现一致的amiRNA > WT > oex模式，表明OFP2/17表达下调与角果发育增强及繁殖产出提高相关。
单株角果数和种子产量
收获时的角果计数（n = 15株）显示，AtOFP2各基因型之间的角果数基本相似：amiR-ofp2为134.06 ± 14.76，WT为131.86 ± 23.05，oex-ofp2为132.2 ± 19.89（图5I；补充表S16a）。在AtOFP17各基因型中，amiR-ofp17（130.26 ± 11.65）与WT（129.4 ± 11.09）的角果数相近，而oex-ofp17的角果数减少（90.33 ± 8.06）（图6J；补充表S16f）。方差分析发现，AtOFP2中基因型效应不显著（F = 0.055；F临界值 = 3.22；P = 0.95；补充表S16b），且所有Tukey检验的q值均 < 0.5
（补充表S16c），且R²接近于零（0.0026），表明AtOFP2中长角果数量与基因型无关（补充表S16c）。相比之下，AtOFP17表现出显著差异（F = 70.31；P < 0.001），其中oex-ofp17与amiRNA及WT均存在显著差异（q ≈ 14.4–14.7），而amiRNA与WT之间的差异仍不显著（q = 0.32）（补充表S16g–h）。
单株种子产量呈现出明显的基因型依赖性趋势。amiR-ofp2的种子产量最高（327.26 ± 32.06 mg），而WT（121.2 ± 15.70 mg）和oex-ofp2（117.86 ± 11.03 mg）的产量则低得多，且二者几乎相同（图5F、L；补充表S16a）。同样，amiR-ofp17的种子产量最高（247.33 ± 32.06 mg），其次为WT（124.2 ± 20.14 mg）和oex-ofp17（62.8 ± 10.81 mg）（图6F、L；补充表S16f）。
方差分析（ANOVA）证实，两个基因均存在显著的基因型效应（AtOFP2：F = 452.1；AtOFP17：F = 256.3；Fcrit = 3.22；P < 0.001；补充表S16d、S16i）。Tukey检验表明，对于每个基因，amiRNA与WT及oex之间均存在显著差异（AtOFP2：q = 36.53–37.12；AtOFP17：q = 20.98–31.44）；而WT与oex之间的差异在AtOFP2中不显著（q = 0.59），但在AtOFP17中显著（q = 10.46；补充表S16e、S16j）。
种子形态与重量
在体视显微镜下观察WT和突变体的干燥成熟种子并拍摄图像。与WT相比，amiR-ofp2和amiR-ofp17的种子呈浅棕色，而oex-ofp2和oex-ofp17的种子颜色较深（图5C、6C上部图像）。与WT（6.62 ± 0.36 mg）和oex-ofp2（6.08 ± 0.24 mg）相比，amiR-ofp2的300粒种子重量最高（13.7 ± 1.8 mg；图5G；补充表S17a）。amiR-ofp17相应的种子重量为15.06 ± 0.45 mg，
其显著重于WT（6.36 ± 0.215 mg）和oex-ofp17（4.51 ± 0.15 mg；图6K；补充表S17d）。单因素方差分析证实不同基因型间存在极显著差异（AtOFP2：F = 102.8；AtOFP17：F = 1051；Fcrit = 3.22；P < 0.001；补充表S17b、S17e）。在AtOFP2中，Tukey检验发现amiRNA与对照组和过表达组之间均存在显著差异（q = 16.88–18.17），而WT与过表达组之间差异不显著（q = 1.29）。在AtOFP17中，所有两两比较均达到显著水平，其中amiRNA与过表达组（q = 60.71）以及WT与过表达组（q = 10.66）之间的q值尤其高（补充表S17c、S17f）。
较高的拟合优度（AtOFP2：R² = 0.97；AtOFP17：R² = 0.99）凸显了基因型是影响种子重量的主要因素。总体而言，这两个基因呈现出一致的趋势：敲低系种子质量较高，WT居中，过表达系最低。
种子尺寸
为评估种子形态，首先使用体视显微镜观察干燥成熟种子，随后通过扫描电子显微镜成像以进行精确测量（图5C、图6C下方图）。ImageJ分析显示，不同基因型间的种子长度存在显著差异。在AtOFP2基因型中，oex-ofp2种子最长（532.4 ± 11.5 μm），其次为amiR-ofp2（465.7 ± 20.8 μm）和WT（461.1 ± 14.2 μm）。然而，不同基因型间的种子宽度总体变化不大，amiR-ofp2、oex-ofp2和WT的平均宽度分别为286.4 ± 13.0 μm、283.5 ± 7.4 μm和282.6 ± 9.5 μm（图5H；补充表S18a）。单因素方差分析确认种子长度存在显著差异（F = 46.63，P < 0.001，F_crit = 3.354；补充表S18b），Tukey检验则判定所有两两差异均为
显著差异：amiR-ofp2与WT之间（q = 13.6）、amiR-ofp2与oex-ofp2之间（q = 7.86），以及WT与oex-ofp2之间（q = 5.73）的差异均高于q_0.01临界阈值4.25（补充表S18c）。对于宽度，方差分析同样发现差异显著（F = 28.37，P < 0.001），但Tukey检验表明，只有amiR-ofp2与oex-ofp2之间（q = 10.37）以及amiR-ofp2与WT之间（q = 7.3）的比较达到显著水平，而WT与oex-ofp2之间的比较（q = 3.069）低于q_0.01临界值（补充表S18d-e）。
相比之下，AtOFP17各株系的种子长度呈现相反的趋势。amiR-ofp17种子的长度最大（515.4 ± 13.8 μm），其次为oex-ofp17（484.0 ± 9.3 μm），WT最小（461.1 ± 14.2 μm）。种子宽度的测量值则存在差异：amiR-ofp17为300.2 ± 6.54 μm，WT为282.6 ± 9.5 μm，oex-ofp17为275.2 ± 6.54 μm（图6G；补充表S18f）。单因素方差分析显示，种子长度差异极显著（F = 62.35，P < 0.001）；Tukey检验的q值证实，amiR-ofp17与WT之间（q = 13.2）以及amiR-ofp17与oex-ofp17之间（q = 14.11）的差异显著，而WT与oex-ofp17之间（q = 0.91）的差异不显著（补充表S18g-h）。然而，对于宽度，方差分析结果不显著（F = 0.3766，P = 0.690），且所有成对Tukey检验的q值（1.174、0.896和0.278）均远低于临界阈值（补充表S18i-j）。
拟合优度值进一步印证了这些发现：在AtOFP2株系中，种子长度和宽度的R²值分别为0.822和0.0271，这表明基因型对种子长度有显著影响，但对种子宽度影响不大。在AtOFP17中，种子长度同样表现出较强的基因型依赖性（R² = 0.87），而种子宽度则不受基因型影响（R² = 0.016）。这些结果共同表明，AtOFP2和AtOFP17在
控制种子伸长，但对种子宽度的影响有限。
生命周期
在相似的生长条件下，我们比较了T3代WT和突变体植株完成生命周期所需的时间（n=5）。amiR-ofp2植株约在10 ± 0.70周内完成生命周期，而WT需要11.2 ± 0.836周，oex-ofp2所需时间最长，为14.8 ± 0.836周（图7K；补充表S19a）。在AtOPF17中，平均生命周期从10.4 ± 0.55周（amiR-ofp17）到11.1 ± 0.74周（WT）和11.4 ± 0.55周（oex-ofp17）不等（补充表S19d）。基因型对生命周期有显著影响，尤其是在AtOFP2株系中；在AtOFP17株系中，这种影响则不那么明显。单因素方差分析显示，基因型的影响显著（F = 49.26 > Fcrit = 3.885，P < 0.001）。Tukey检验表明，oex-ofp2与WT（q = 10.12）及amiR-ofp2（q = 13.49）之间存在显著差异，但amiR-ofp2与WT之间无显著差异（q = 3.372）（补充表S19b-c）。
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图7：
[A-J] AtOFP2过表达植株从第1周至第15周的生命周期阶段。
[K] amiR-ofp2、WT和oex-ofp2植株生命周期统计比较的图示。柱形表示均值 ± SD，N=5；ns = 差异不显著，*p=0.033，p=0.02，*p<0.001
在AtOFP17株系中，生命周期差异较小：amiR-ofp17为10.4 ± 0.55周，WT为11.1 ± 0.74周，oex-ofp17为11.4 ± 0.55周。方差分析显示组间差异达到边缘显著水平（F = 4.739 > Fcrit = 3.885）。Tukey检验发现，仅amiR-ofp17与oex-ofp17之间存在较弱的显著差异（q = 4.334），其他比较均无显著差异（WT与amiR-ofp17：q = 2.528；WT与oex-ofp17：q = 1.806）（补充表S19e-f）。因此，
基因型对 *AtOFP2* 株系寿命的影响显著，但对 *AtOFP17* 株系的影响较小。
休眠
通过追踪WT和突变体株系中未经低温层积处理种子的萌发百分率，评估种子休眠。将每种基因型的100粒种子置于½浓度MS琼脂平板上，并施加受控的明暗周期（第1天光照2 h、黑暗8 h；自第2天起光照16 h、黑暗8 h）。每隔12 h记录胚根萌发情况；种子均在96 h内完成萌发。每隔48 h为已萌发的种子拍照，以供比较。在 *amiR-ofp2* 中，种子在12 h内开始萌发（平均萌发率为24.67 ± 7.06%），并在48 h时达到100%。WT在12 h时的萌发率仅为0.67%，24 h时达到17.67 ± 7.09%，60 h时达到100%。在 *oex-ofp2* 中，种子直到36 h后才开始萌发，48 h时的平均萌发率仅为1.33 ± 1.53%，直至96 h才达到100%。与WT相比，*AtOFP2* 敲低突变体的种子休眠减弱，而过表达株系的种子休眠增强（图5A、B；补充表S20a–b）。
类似地，在 *amiR-ofp17* 中，种子在12 h内开始萌发（11.67 + 2.08%），并在48 h内达到100%。WT中的种子在12 h后开始萌发（14.33 ± 3.51%），60 h后萌发率达到100%。在 *oex-ofp17* 中，种子直到36 h后才开始萌发，48 h时萌发率达到3.33 ± 1.52%；至96 h时观察到种子萌发率达到100%（图6A、B；补充表S20c–d）。
种子形态与表皮细胞结构
扫描电子显微镜（SEM）观察显示，不同基因型的种子在形态上存在差异。与WT相比，*amiR-ofp2* 种子更圆、更大，而 *oex-ofp2* 种子则呈细长、皱缩状。
形态。种皮表皮细胞的结构也表现出差异：与WT相比，amiR-ofp2种子的细胞排列更加紧密、径向壁更厚；而oex-ofp2种子则表现出细胞壁破损、柱状突起增大以及纤维素微纤丝排列紊乱。野生型拟南芥（A. thaliana）种子的种皮黏液细胞（即种皮表皮细胞）呈六边形，中央具有“火山状”的柱状突起。由于次生细胞壁的合成，细胞壁在扫描电子显微镜图像中清晰可见。这些细胞的质膜与细胞壁之间含有黏液，并形成围绕柱状突起的黏液囊。从柱状突起向外辐射的纤维素微纤丝呈细线状。这些微纤丝决定了细胞形状。皮层微管确保纤维素微纤丝正确排列（Windsor et al., 2000）。与WT种子相比，amiR-ofp2种子的表皮细胞径向壁更为明显且增厚，细胞也更加紧密。相反，oex-ofp2种子的表皮细胞壁出现破损，柱状突起增大，且纤维素微纤丝排列紊乱（图5C下方各图）。
对amiR-ofp17、WT和oex-ofp17种子的扫描电子显微镜（SEM）图像观察显示出类似趋势。amiR-ofp17种子的表皮细胞排列紧密，径向壁明显；而oex-ofp17种子则表现出细胞壁破损、柱状突起增大，且细胞细长呈矩形。在oex-ofp17中，径向壁也出现破损，但其影响程度低于oex-ofp2（图6C下方各图）。
种皮黏液释放
为确定次生细胞壁修饰如何影响黏液，对AtOFP2和AtOFP17反向遗传学株系种子的黏液释放特性进行了考察
挤出。
已知，拟南芥（A. thaliana）种子一接触水分便会立即释放非黏附性黏液，而黏附性黏液则需要一定时间才能在种子周围形成晕圈（Western et al., 2000；Arsovski et al., 2010）。将 amiR-ofp2、oex-ofp2 和 WT 种子浸泡于水中 1 小时后，以可与酸性多糖结合并产生粉红色的钌红进行染色。所有构建体的种子均释放了大量黏液并形成晕圈，各品系之间未观察到差异（图 5D 上方各图）。
同样，将 amiR-ofp17、oex-ofp17 和 WT 种子浸泡 1 小时后进行染色。amiR-ofp17 和 WT 种子均显示黏液已完全释放，表现为种子周围形成晕圈；而 oex-ofp17 种子表面则可见向外放射的尖刺。这一观察结果表明，水合后种子壁仍在挤出黏液，说明与 amiR-ofp17 和 WT 种子相比，oex-ofp17 种子的黏液释放速度较慢（图 6D 上方图）。这些结果表明，oex-ofp17 中黏液释放的动态过程发生了改变，这可能是由种皮结构变化所致。
原花青素（PA）染色
原花青素（PA）是一种聚合型黄烷醇，其前体在种皮内层细胞中积累。种子收获后，PA 前体发生氧化，使种子呈深褐色。由于观察到敲低株系和过表达株系的种子颜色存在差异，我们使用 DMACA（对二甲氨基肉桂醛）试剂对干燥种子进行染色。该试剂可与黄烷醇结合并呈现紫色至蓝色。颜色深浅反映了种皮内层细胞中原花青素的含量。我们使用 DMACA 分析了原花青素含量。
染色结果显示，不同基因型的 PA 水平呈梯度变化。amiR-ofp2 种子的紫蓝色染色最深，表明 PA 积累量最高；其次为染色程度中等的 WT 种子。oex-ofp2 种子的染色最浅，且主要局限于合点端。amiR-ofp17 和 oex-ofp17 株系也呈现出类似趋势（图 5D、图 6D 中间面板）。
种皮通透性
种皮通透性是种子萌发的重要前提。种皮对水的通透性较低会妨碍种子萌发。为观察种子的吸水特性，我们将种子浸入氯化四唑盐溶液中 1 天。TZ（三苯基氯化四唑，2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride）能够渗透活细胞和死细胞，但只有具有呼吸作用的细胞才能将 TZ 转化为胭脂红色、水不溶性的甲臜。颜色深浅反映了 TZ 的吸收量及其转化为甲臜的程度。我们通过氯化四唑（TZ）吸收情况评估种皮通透性。胭脂红色甲臜的形成强度表明，amiR-ofp2 种子的通透性最高，其次为 WT 种子，而 oex-ofp2 种子的通透性最低。类似地，amiR-ofp17 种子的通透性高于 WT 种子，而 oex-ofp17 种子吸收的 TZ 最少，表明过表达株系的种皮通透性降低（图 5D、图 6D 下方面板）。这些结果共同表明，改变 AtOFP2 和 AtOFP17 的表达会影响种子休眠、形态、黏液质释放、PA 含量及种皮通透性。敲低突变体往往会降低种子休眠并提高种皮通透性，而过表达株系则表现出相反的效应（图 5D、图 6D 下方面板）。
AtOFP2 具有更强的抑制作用。
比AtOFP17
对过表达AtOFP2（oex-ofp2）和AtOFP17（oex-ofp17）的拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株进行的表型分析明确表明，这两个基因均对多种发育性状具有广泛的抑制作用（图10）。然而，该分析的一个关键发现是，两者在抑制作用的程度和具体性质上存在明确而细微的差异，表明各基因具有独特的功能特异性或潜在调控机制。这些差异对于理解这两个旁系同源基因在植物发育中的确切作用至关重要。在幼年发育阶段，过表达AtOFP2和AtOFP17均显著抑制了幼苗生长。然而，定量评估显示，oex-ofp2株系的生长受抑程度明显高于oex-ofp17株系。具体的定量数据清楚地体现了这一差异：oex-ofp17的平均根长为0.93±0.284 cm，而oex-ofp2的平均根长则明显更短，仅为0.41±0.091 cm。这一定量差异表明，尽管两者的根系生长相较于野生型植株均受到显著抑制，但oex-ofp17幼苗的根长仍约为oex-ofp2的2.2倍。这一有力的定量证据充分支持了两者抑制强度存在差异的观点。在所评估的所有幼苗性状中，除下胚轴长度外，AtOFP2过表达所引起的表型效应均比AtOFP17过表达更为严重。这表明，AtOFP2对幼苗的整体活力及早期发育的基本过程具有广泛而普遍的抑制作用
建成。除根系生长外，oex-ofp2株系的种子萌发延迟程度在定量上也大于oex-ofp17株系，进一步证实AtOFP2在植物发育的最初阶段具有更强且更全面的抑制作用。在基因敲低株系中，这两个基因的抑制作用得到逆转，使其种子产量高于野生型（WT）；在两种基因敲低突变体中，amir-ofp2突变体的种子产量显著高于amir-ofp17突变体。最重要的是，oex-ofp2突变体背景中约90%的幼苗在移栽至盆中后于幼年期死亡，仅约10%的幼苗能够发育为成熟植株。oex-ofp17突变体则未观察到幼苗死亡。平均根长等精确的定量数据，以及对幼苗性状受到广泛影响、基因敲低株系种子产量增加和过表达突变体幼苗死亡的明确描述，为AtOFP2在幼苗期具有显著更强的抑制作用提供了有力且可量化的证据。
幼年期的强烈抑制导致生命周期发生异时性变化
oex-ofp2突变体中一个尤为突出且关键的现象是，幼苗从琼脂平板移栽至土壤后的存活率显著降低（<10%），表明AtOFP2持续过表达诱发了严重的发育瓶颈或细胞胁迫反应，进而导致高死亡率。在琼脂平板上，其他所有基因型均生长良好，并可在萌发2周后移栽至土壤。即使到第3周后，oex-ofp2突变体仍因根系极小而难以移栽至土壤，且其根系在土壤中建成所需的时间也长于正常情况。这些幼苗表现出延长的休眠期，其特征是停留在四叶期
这一阶段持续了近一个月。在这段延长的时期内，新长出的成对叶片持续发生退化（图3G）。值得注意的是，成功克服这种休眠状态的幼苗最终恢复了正常的生长发育，表现出与野生型植株极为相似的模式。幼年阶段早期的生长抑制改变了生长发育的时间进程，导致发育异时性变化，并延长了寿命（例如，野生型Col-0为11.2 ± 0.8周，而oex-ofp2为14.8 ± 0.8周；图7）。野生型植株在7–8周达到成熟，而oex-ofp2植株在11–12周达到成熟。野生型植株在10–12周内完成生命周期，而oex-ofp2植株则需要15–16周（图7）。
转录组数据分析结果
对反向遗传学突变体的比较分析表明，ofp2的表型比ofp17更为显著。在所有表型类别中，幼苗根系构型是受影响最显著的性状之一。因此，我们通过转录组分析，研究了野生型、oex-ofp2和amiR-ofp2的7日龄幼苗根部基因表达模式的潜在变化。提取总RNA后，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行基于短读长的双端RNA测序。使用R中的DESeq2进行基因差异表达分析，并通过火山图展示表达显著失调的基因（图8A和8B）。
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图8：
野生型、oex-OFP2和amiR-OFP2株系7日龄幼苗根部的RNA-seq分析。
A）展示野生型与amiR-OFP2之间差异表达基因（DEGs）的火山图。
B）展示野生型与oex-OFP2之间差异表达基因（DEGs）的火山图。
C）展示共有基因的维恩图
以及 amiR-OFP2 和 oex-OFP2 基因型中共有和特有的显著表达失调基因。
D）韦恩图展示 amiR-OFP2 和 oex-OFP2 基因型中共有和特有的显著表达失调转录因子。
E、F、G、H）热图展示 oex-ofp2 和 amiR-ofp2 突变体中表达失调的重要基因簇，分别代表（i）细胞壁扩张相关基因、（ii）休眠和萌发相关基因、（iii）核心激素响应基因以及（iv）根系构型决定基因。
在 oex-ofp2 中，相较于野生型（WT），共有 8,691 个基因发生差异表达。筛选 log₂ 倍数变化（log₂FC）> 1 或 < −1 的基因用于下游分析（补充表 S21a）。其中，1,650 个基因显著上调，2,480 个基因显著下调（补充表 S21b、c）。在 amiR-ofp2 幼苗中，相较于 WT，8,519 个基因出现表达失调。其中，208 个基因显著上调，260 个基因显著下调（补充表 S22a–c），表明基因敲低背景下的转录响应较为有限。对这两种突变体背景进行比较分析发现，31 个基因在 oex-ofp2 中上调，而在 amiR-ofp2 中下调；另有 35 个基因呈现相反趋势，即在 oex-OFP2 中下调，而在 amiR-OFP2 中上调（图 8C）。此外，oex-OFP2 中特异性上调和下调的基因分别为 1,540 个和 2,255 个，而 amiR-OFP2 中特异性上调和下调的基因分别为 93 个和 39 个（补充表 22b–e）。
鉴于 OFP2 具有转录因子功能，我们专门分析了显著表达失调基因集中的转录因子（TF）基因。在 oex-OFP2 中，170 个转录因子显著上调
另有316个转录因子（TF）显著下调（补充表S21）。相比之下，amiR-OFP2植株中有48个TF上调，18个TF下调（补充表S22）。对两种基因型中共有和特有TF的分析发现，2个TF在oex-OFP2中上调，而在amiR-OFP2中下调；16个TF在oex-OFP2中下调，而在amiR-OFP2中上调（图8D；补充表S21–S22）。此外，oex-OFP2中有154个TF特异性上调、280个TF特异性下调，而amiR-OFP2中分别有18个和4个TF特异性上调和下调（补充表S21–S22）。
我们利用AGRIS AtTFDB对oex-ofp2和amiR-ofp2株系中表达失调的TF进行了分类。共有40个TF家族出现表达失调，其中27个TF家族在oex-ofp2和amiR-ofp2株系中均出现表达失调，包括ABI3VP1、AP2-EREBP、ARF、ARR-B、BBR/BPC、bHLH、bZIP、BZR、C2C2-CO-like、C2C2-Dof、C2C2-GATA、C2H2、CCAAT-HAP2、G2-like、GRAS、GRF、Homeobox、HSF、MADS、MYB、NAC、RAV、SBP、TCP、Trihelix、WRKY和ZF-HD。C2C2-YABBY家族仅出现在oex-ofp2的上调TF类别中。Orphan TF家族同时出现在amiR-ofp2的下调类别和oex-ofp2的上调类别中。VOZ-9和Whirly两个家族同时出现在amiR-ofp2和oex-ofp2的上调TF类别中。NLP家族同时出现在amiR-ofp2和oex-ofp2的下调类别中。5个TF家族（AtRKD、CAMTA、CCAAT-DR1、HRT、REM）同时出现在amiR-ofp2的上调类别和oex-ofp2的下调类别中。CPP、E2F-DP和EIL3家族同时出现在amiR-ofp2的上调类别以及amiR-ofp2和oex-ofp2的下调类别中（补充表S21
和S22）。利用显著失调表达的基因进行基因本体（GO）和KEGG通路分析，结果表明，变化主要涉及植物激素信号转导通路（补充图6）和昼夜节律通路（补充图7）。
在野生型Col-0中，OFP2的读段计数为110.33 ± 5.5；相比之下，野生型中基因的最高读段计数为220150.66，平均读段计数为881.83。这表明，OFP2在天然状态下的表达水平相对较低，而即使如此低的表达水平也足以发挥其作用。在表达下调株系中，其读段计数降至34.66 ± 6.6。有趣的是，过表达株系中OFP2的读段计数降至2.6 ± 2.03，表明存在一种强烈的反馈机制，限制了过表达株系中OFP2的表达。这一现象看似矛盾，因为尽管OFP2的表达量大幅降低，过表达株系仍表现出明显的生长矮化表型，与表达下调株系形成鲜明对比。
为确定OFP2可能影响哪些生物学通路，从而在表达下调和过表达株系中产生如此显著且截然相反的表型，我们对差异表达基因进行了研究。结果发现，参与激素信号传导、细胞壁合成与扩展、胁迫响应、器官发育的基因以及重要转录因子基因，在这两种基因型中均出现显著的表达失调。为将这些基因与观察到的表型系统地联系起来，我们归纳出最能直接解释这些表型的四类重要基因。这四类基因分别为：（i）细胞壁扩展及一般器官发育相关基因；（ii）决定根系构型的基因；（iii）激素响应基因；以及（iv）休眠与种子萌发相关基因（图8E–H）。在所有基因中，细胞壁扩展相关基因构成了变化最为显著的基因类别之一
富集的功能簇。膨胀蛋白在 oex-ofp2 中显著下调，而在 amiR-ofp2 中轻度上调，直接解释了二者相反的细胞大小表型，该表型影响了从幼苗到成熟植株整个阶段的生长。α-膨胀蛋白基因 EXPA7（log2FC：Oex 中为 −8.77x，amiR 中为 +1.27x）、EXPA4（−3.20x / +1.02x）、EXPA17（−1.75x / +1.30x）、EXLA3（−1.78x / +1.29x）、EXPA18（−3.67x / −1.44x）和 EXPB1（−5.46x / −0.72x）在两种条件下表现出明显的反向表达模式。膨胀蛋白通过破坏纤维素与木葡聚糖之间的非共价键使细胞壁松弛，从而在不发生酶促水解的情况下实现膨压驱动的细胞扩张（Cosgrove, 2005）。另一组重要基因包括木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶基因 XTH12（log2FC：Oex 中为 −9.68x，amiR 中为 −2.04x）、XTH26（−9.53x / −2.01x）和 XTH21（−8.79x / +0.01x），以及纤维素合酶样基因 CSLC12（−8.37x / −1.62x）、CSLB5（−8.04x / −1.68x）和 CSLB1（−8.22x / −0.44x）。
XTH 家族酶通过转糖基化和水解作用重塑纤维素–木葡聚糖网络，使细胞壁在生长过程中发生受控的延展（Rose et al., 2002；Nishitani and Vissenberg, 2007）。完整数据集中其他表达失调的细胞壁相关组分包括 CESA3、CESA6、COBRA、FLA3，以及多个 XTH 和 EXT 家族基因（补充表 S1 和 S2）。果胶甲酯酶基因 PME3（−1.05x / +2.59x）呈现出尤为重要的反向表达模式：其在 oex-ofp2 中受到抑制，使果胶基质硬化，而在 amiR-ofp2 中受到强烈诱导，使果胶基质软化，进而促成了相反的器官大小表型。
基于根发育相关基因本体条目对差异调控基因进行分析，发现富集的基因主要参与生长素极性运输、细胞分裂素信号转导，
表皮细胞命运特化和组织径向模式形成。在该类别的所有基因中，SHY2/IAA3（log2FC：Oex 中为 −3.49，amiR 中为 +1.02）表现出最明显的反向调控。已知该基因在整合生长素和细胞分裂素信号、调控根分生组织过渡区的细胞分化方面发挥核心作用（Dello Ioio et al., 2008）。在生长素外排载体中，PIN1（−0.51 / +0.34）、PIN7（−2.22 / −2.14）和 PIN3（+0.45 / +0.45）的表达失调，表明生长素极性运输受到扰乱。值得注意的是，PIN7 在两者中均受到抑制，而 PIN3 在两者中均略有上调，表明这些基因受到间接的网络效应影响。GH3.17（−1.45 / −0.45）编码一种调控局部生长素失活的 IAA-酰胺合成酶，其在 oex-OFP2 中受到更强的抑制；细胞分裂素受体 AHK3（−0.51 / +0.24）则表现出轻微的反向调控。这些结果共同表明，在分生区向伸长区过渡的过程中，生长素和细胞分裂素这两条信号通路均受到差异性调节。该子模块中其他表达失调的基因包括 ARR1、ARR12、AHP6、LAX3 和 AXR2，详见补充表 S1 和 S2。WER（−9.26 / −0.08）是 oex-ofp2 转录组中受抑制程度最强的基因之一，而在 amiR-ofp2 中基本无变化。它是决定非根毛细胞（N 位置）命运的 R2R3-MYB 类主调控因子，与 GL3（−3.29 / −0.60）、EGL3（−3.22 / −0.14）及 TTG1 共同组成 MBW 转录因子复合体，激活 GL2（−1.61 / +0.01），并抑制 N 位置细胞的根毛分化（Lee and Schiefelbein, 1999；Bernhardt et al., 2003）。该复合体的失调似乎扰乱了表皮细胞身份，从而解释了根毛密度和分布模式的改变。感知位置信息的受体激酶 SCM（−1.19 / +0.05）
侧向抑制因子 CPC（−0.95x / −0.07x）在 oex-OFP2 中也受到抑制，表明模式形成层级的多个水平发生了紊乱（Shibata and Sugimoto, 2019）。在径向模式形成子模块中，SHR、SCR 和 PHB 在两种条件下均未发生变化，表明基本组织的特化并非 AtOFP2 的主要靶标；然而，RBR1（−0.53x / +0.17x）表现出轻微的反向调控，提示静止中心的增殖与分化平衡受到细微调节（Cederholm et al, 2012）。
由于植物无法移动，植物激素是控制和协调其所有内部过程的主要化学信使。转录组数据显示，生长素、细胞分裂素、赤霉素（GA）、油菜素甾醇和脱落酸（ABA）通路中的激素响应基因出现表达失调，但在两种基因型中并未呈现反向变化，表明这些基因型中的激素信号传导较为复杂。在生长素方面，除 PIN 转运蛋白外，其他重要的表达失调基因还包括 YUCCA 生物合成基因，如 YUC3（−2.90x / −0.56x）和 YUC9（−1.91x / +0.04x），提示局部吲哚-3-乙酸（IAA）的合成减少。在两种基因型中表达失调的重要细胞分裂素通路基因包括编码含组氨酸磷酸转移蛋白的 AHP2（1.12x / −0.02x），其仅在 oex-ofp2 中受到抑制；而 A 型负反馈调控因子 ARR7（−2.73x / +0.64x）则表现出反向调控，提示细胞分裂素信号传导在过表达株系中减弱，而在敲低株系中增强（Tran and Ruszkowski, 2025）。在赤霉素信号传导方面，编码使 GA 失活的 2-氧化酶的 GA2OX2（+1.72x / +0.55x）在两种基因型中均被诱导表达，但在 oex-ofp2 中的诱导程度更高；而 DELLA 抑制因子 RGL1（+1.06x / −0.27x）则呈现出明显的反向变化模式。一个重要的 GRAS 中间调控因子 SCL3（+1.62x / +0.25x）被
在两者中均被诱导，但在 oex-ofp2 中的诱导更为强烈。油菜素甾醇信号传导相关基因的表达失调主要发生于过表达株系，而在 amir 株系中大多不受影响。BSE1-Int（−1.92倍 / +0.05倍）是重要的油菜素甾醇（BR）信号输出转录因子，在 oex-ofp2 中受到抑制，而其上游激活因子 BEE1（+4.88倍 / 未检测到）和 BEE3（+3.83倍 / 未检测到）在 oex-OFP2 中上调，在 amiR-OFP2 中则无变化。BR 信号促进型转录因子与其经典下游输出之间的这种脱耦表明，oex-OFP2 根中的 BR 信号传导处于功能失效状态（Friedrichsen et al., 2002）。
另一组重要的表达失调基因是 ABA 信号传导相关基因，它们揭示了种子休眠和萌发方面的相反表型。脱落酸是影响种子生物学过程的最重要植物激素。此类基因中表达失调最严重的是 MYB61（−8.61倍 / −0.36倍），它是种皮分化的关键调控因子（Penfield et al., 2001）。在 oex-ofp2 中受到显著抑制的三个重要 ABA 信号负调控因子包括：HAI2（−4.35倍 / +1.29倍），一种 A 类 PP2C 磷酸酶，可使 SnRK2 激酶失活并减弱 ABA 响应（Bhaskara et al., 2012）；PUB19（−2.21倍 / +2.76倍），一种 U-box 型 E3 泛素连接酶，其突变体表现出 ABA 超敏感性（Liu et al., 2011）；以及 MYB96（−2.02倍 / +1.28倍）和 MYB41（−1.52倍 / +1.31倍），二者分别调控 ABA 依赖性的种皮蜡质和木栓质沉积（Seo et al., 2011；Kosma et al., 2014）。在干种子中催化 ABA 分解代谢的主要 ABA 8′-羟化酶在两种基因型中也均受到抑制，但在 oex-ofp2 中受到的抑制尤为严重，这解释了干种子中 ABA 的积累及其对休眠的增强作用（Okamoto et al., 2006）。
转录组数据的验证
为从转录组数据中得出有意义的结论，对其可靠性和可重复性的检验已
必要的。通过随机选取若干候选基因，采用定量实时逆转录PCR（qRT-PCR）进行表达分析，以验证转录组数据的可靠性。转录组分析使用的RNA来源于7日龄幼苗的根。为确保对这些基因的验证具有可比性，从野生型（WT）、oex-ofp2和amiR-ofp2的7日龄幼苗根中提取RNA。所有基因在表达分析中均呈现出与转录组数据一致的变化趋势。与WT相比，amiR-ofp2株系中AT4G34580（CAN OF WORMS1 / COW1）的转录水平降低近94%（log2FC = -4.097），oex-ofp2株系中降低93.2%（log2FC = -3.88）。双尾t检验分析表明，amiR-ofp2株系（p值 = 0.048 < 0.05）和oex-ofp2株系（p值 = 0.036 < 0.05）中AT4G34580转录水平的下降均具有统计学显著性。同样，与WT相比，amiR-ofp2和oex-ofp2株系中AT2G33790（AGP30）均显著下调，表达变化倍数分别为-5.026和-4.81。与WT相比，oex-ofp2株系根中AT1G04240的表达下调近99%（log2FC = -6.64；p值 = 0.0035 < 0.01），amiR-ofp2中下调98.25%（log2FC = -5.8366；p值 = 0.0057 < 0.01）。与WT相比，amiR-ofp2株系中AT5G58010的转录水平降低49%（log2FC = -0.97；p值 = 0.39 > 0.05），oex-ofp2中降低76.7%（log2FC = -2.1；p值 = 0.13 > 0.05）（图9）。
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图9：
采用qRT-PCR检测（A）AT4G34580、（B）AT2G33790、（C）AT1G04240和（D）AT5G58010，以验证转录组数据。“*”和“**”分别表示在p < 0.05和p < 0.01水平上差异具有统计学显著性；ns = 差异不显著。
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图10：
amiR-AtOFP2、amiR-AtOFP17、WT、oex-AtOFP2和oex-AtOFP17突变体中所测性状的汇总。绿色表示性状增强，橙色表示性状减弱，黄色表示对照植株的性状以及无统计学显著性变化的性状。
讨论
卵形家族蛋白（Ovate Family Proteins，OFPs）是一类植物特异性转录调节因子，其共同特征是具有高度保守的C端OVATE结构域。OFPs最早在番茄（Solanum lycopersicum）中被发现，具有调控果实形状的作用；OVATE基因座编码一种定位于细胞核的转录抑制因子，已被证明能够调节关键的发育性状和形态结构性状。根据OVATE结构域的完整或部分结构，OFPs被分为Ovate-OFPs和Ovate-Like OFPs（Chahar et al. 2021）。OFP基因家族在苔藓植物中早期起源并扩张，包括具有完整和部分OVATE结构域的蛋白质变体（Chahar et al. 2023）。这种早期分化表明，功能特化可能具有适应性优势。据推测，某些拟南芥OFP（如AtOFP2和AtOFP17）的祖先形式已在胚胎植物（陆生植物）的最近共同祖先中演化形成，而在红藻和绿藻中明显缺失，这表明它们的出现是陆生植物演化中的一项关键创新。某些OFP基因对具有独特的头对头排列方式（例如，拟南芥中位于2号染色体上的AtOFP2-AtOFP17和位于1号染色体上的AtOFP4-AtOFP20），这种排列仅见于种子植物（裸子植物和被子植物），且核心十字花科类群中约在3200万至5400万年前发生过一次复制事件（Chahar et al. 2021，2023）。这种基因组排列方式提示，这些基因之间可能存在共同调控或特化的功能相互作用。
这些基因对之间的关系。理解结构域的完整性及其对分子功能和最终表型结果的影响，是本研究的核心主题，因为完整的结构域可能赋予完全的抑制活性或特定的相互作用能力，而不完整的结构域则可能导致结合能力改变、相互作用变化，甚至产生显性负效应。
迄今为止，所有功能鉴定报道均局限于具有完整 Ovate 结构域的 OFP（Ovate-OFP），而对 Ovate-Like OFP 的鉴定仍然缺乏，因此，结构域完整性对功能结果的影响尚未得到阐明。为此，我们通过构建人工微 RNA 介导的表达下调突变体、功能缺失突变体（Schwab et al. 2005, 2006）和功能获得突变体（Zhao et al., 2017），对呈头对头排列的 Ovate-OFP（AtOFP2）和 Ovate-Like OFP（AtOFP17）进行了比较功能鉴定。为比较二者对植物表型的影响，我们研究了突变体植株的 28 项表型性状。从种子萌发到植株最终产量，对各项性状的全面比较提供了重要信息，据此推测，这两个旁系同源基因主要以相似方式发挥抑制作用，但各自作用的细微差异表明二者发生了亚功能化。
在幼苗期，我们对六项性状——子叶面积、下胚轴面积、根长、根毛密度、根毛长度和根细胞尺寸——进行了定量测定。比较分析表明，AtOFP2 和 AtOFP17 以不同方式发挥抑制作用，其中 AtOFP2 对某些性状的影响更强，而 AtOFP17 则对另一些性状产生显著影响。总体而言，这两个基因均表现出抑制作用，过表达突变体小于野生型，而表达下调突变体大于野生型，其原因在于
从而解除转录抑制。对于子叶面积和主根长度，oex-ofp2株系中的抑制作用最为显著，表明AtOFP2对器官起始和根伸长具有更强的抑制作用。然而，oex-ofp17株系的下胚轴生长受到的抑制更为严重，表明AtOFP17对地上部伸长具有更强的调控作用。根毛性状也凸显了二者的差异：AtOFP2发挥抑制作用，降低根毛密度并缩短根毛长度，而AtOFP17则表现出相反的趋势，oex-ofp17株系的根毛密度增加、长度增大，提示其具有拮抗或调节作用。最后，在根细胞尺寸方面，与AtOFP2过表达相比，AtOFP17过表达导致细胞尺寸大幅减小，凸显了AtOFP17对细胞结构更强的影响。此外，amirRNA株系的细胞大小增至约1.5倍，而oex株系的细胞大小缩至约0.5倍，表明细胞大小而非细胞数量的变化是所观察到的植株整体生长模式差异的主要原因。总体而言，这些数据表明，除两个基因均具有普遍抑制细胞大小的作用外，AtOFP2还作为广谱抑制因子抑制子叶扩展和根伸长，而AtOFP17则对下胚轴生长和根细胞形态产生更强烈的抑制作用，同时增强根毛性状。在所有分析的性状中，主根受到这两个基因的影响最为显著，且受影响的方式相似。此外，我们利用7日龄幼苗根组织中OFP2敲低和过表达突变体的转录组数据补充表型数据，为从分子机制层面解释所观察到的表型提供了机制框架。转录组数据表明，细胞壁扩张相关基因集的表达失调提供了一个最为
为细胞和器官大小的改变提供了直接解释。多个扩展蛋白家族基因，如 EXPA7、EXPA4、EXPA18、EXPB1、EXPA17 和 EXLA3；木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶基因 XTH12、XTH26 和 XTH21；以及纤维素合酶样基因 CSLC12、CSLB5 和 CSLB1，在 oex-ofp2 突变体中下调，而在 amiR-ofp2 突变体中上调（图 8E）。在拟南芥中，细胞大小由细胞壁扩张与结构加固之间受调控的平衡所决定（Czesnick and Lenhard, 2015）。扩展蛋白是一类非酶促的细胞壁松弛蛋白，通过破坏纤维素与半纤维素之间承载力学负荷的氢键，诱导膨压驱动的细胞扩张（Cosgrove, 2005）。纤维素合酶在质膜处合成刚性极高的纤维素微纤丝，而 XTH 酶则修饰初生细胞壁的半纤维素网络。它们暂时切断木葡聚糖连接链并将其重新连接，使纤维素骨架在物理上松弛，从而使细胞得以扩张（Rose et al., 2002；Nishitani and Vissenberg, 2007）。其中，XTH21 通过调控纤维素沉积，在主根生长中发挥必需作用（Liu et al., 2007）。果胶甲酯酶基因 PME3 和纤维素合酶样基因 CSLC12、CSLB5、CSLB1 也下调，表明细胞壁生物合成与重塑机制受到广泛抑制。所有这些基因在 amiR-ofp2 突变体中均上调，从而解释了这些株系呈现相反表型的原因。已有研究表明，AtOFP2 与 TONNEAU2 相互作用，通过调控皮层微管重排来调节细胞大小。该相互作用受油菜素甾醇信号调控（Zhang et al., 2020）。两个油菜素甾醇响应型 bHLH 因子 BEE1 和 BEE3，以及一个油菜素甾醇激活的转录因子 BES1 也下调，表明
表明，AtOFP2 抑制 BR 介导的细胞伸长途径。BEE1、BEE2 和 BEE3 三基因敲除植株表现出与 oex-ofp2 相似的生长矮化表型（Friedrichsen et al., 2002）。
与其他组织相比，oex-ofp2 的根系生长受抑制更为严重，这可归因于根表皮及径向模式建成紊乱，而这些紊乱可能由参与上述过程的基因表达下调所致。转录组数据分析显示，决定非根毛细胞命运的 MYB-bHLH-WD40 复合体相关组分 WER（FC 为 -9.26 倍）、GL3（-3.29 倍）、EGL3（-3.22 倍）、GL2（-1.61 倍）、CPC（-0.95 倍）和 SCM（-1.19 倍）的表达均下调。在非根毛细胞中，WER 与 GL3/EGL3 和 TTG1 形成三元复合体，激活 GL2 转录，从而抑制根毛细胞分化（Lee and Schiefelbein, 1999；Bernhardt et al., 2003, 2005）。小型 R3 MYB 抑制因子 CPC 从非根毛细胞移动至根毛细胞，并与 WER 竞争结合 GL3/EGL3，从而促进根毛细胞命运的确定；CPC 自身的转录则由非根毛细胞中的 MBW 复合体激活（Wada et al., 2002；Kurata et al., 2005）。该途径中两个重要的下游基因 RSL2 和 RSL4 也显著下调，其 log2 倍数变化值分别为 -10.1 和 -9.6，体现了该途径中自上而下的级联放大效应。SCRAMBLED（SCM）是一种非典型富含亮氨酸重复序列的类受体激酶，其在 oex-ofp2 中的表达同样下调；该激酶通过调节 WER 的积累启动位置依赖性模式建成（Kwak et al., 2005）。SCM 本身受 MBW 复合体的转录反馈调控（Kwak and Schiefelbein, 2007）。AtOFP2-oex 中整个模块受到抑制，似乎扰乱了非根毛细胞（N 细胞）与根毛细胞（H 细胞）的边界，并改变了表皮模式建成。其他表达下调的重要基因，在
oex-ofp2 中的是 RBR1（RETINOBLASTOMA-RELATED 1，视网膜母细胞瘤相关蛋白1），其协调根分生区中细胞周期退出与细胞分化，并与 SCR 直接相互作用（Wildwater et al., 2005；Cruz-Ramírez et al., 2012），进一步表明 AtOFP2 过表达广泛扰乱了细胞从增殖向分化的转变。
过表达突变体中多个激素响应基因的表达失调表明，OFP2 的广泛抑制作用可能通过协调的多激素信号级联实现。该网络的核心节点调控因子是 SHY2/IAA3（log2FC：Oex 中为 −3.49x；amiR 中为 +1.02x），其在两种基因型中呈相反的表达变化，这一结果也得到了 RT-PCR 验证。在多细胞生物中，器官大小由细胞分裂与分化之间的平衡决定。在拟南芥根中，生长素和细胞分裂素通过汇聚于 SHY2 基因的调控回路介导这一平衡。SHY2 是生长素与细胞分裂素拮抗作用的主要整合节点，调控根分生组织的大小。在野生型根中，细胞分裂素通过 ARR1 直接结合 SHY2 启动子来激活其表达，使 SHY2 抑制 PIN 生长素外排载体并驱动过渡区细胞分化；相反，生长素促进 SHY2 降解，以维持近端分生组织细胞的分裂（Ioio et al., 2007, 2008）。在细胞分裂素信号传递过程中，组氨酸磷酸转移蛋白 AHP2（Oex 中为 −1.12x；amiR 中为 −0.02x）和 A 型响应调节因子 ARR7（Oex 中为 −2.73x；amiR 中为 +0.64x）在 oex-ofp2 中均受到抑制，从而损害细胞分裂素信号转导（Hutchison et al., 2006）。AHP2 和 ARR7 同时受到抑制，形成了一种非相干前馈状态，使细胞分裂素信号既无法正常传递，也无法得到适当衰减。BES1（Oex 中为 −1.92x；+0.05x
在amiR中）直接结合PIN7和SHY2的启动子，促进分生组织扩展，而其功能丧失则限制根伸长（Li et al., 2020）。因此，同时抑制BES和SHY2会破坏根系最适生长所需的油菜素甾醇（BR）–生长素–细胞分裂素（CK）三激素平衡。
在成株中，与幼苗阶段相似，AtOFP2和AtOFP17的功能丧失均促进了植株的整体生长，表现为叶面积增大、植株更高、分枝数量增加、长角果数量增多且体积增大，以及单株总产量提高。这进一步证实，这两个基因均作为植物株型的负调控因子发挥作用。然而，将植株移栽至盆中后，过表达株系的表型揭示了二者功能上的显著差异。OFP17在植物的所有发育阶段均表现出典型的生长抑制作用：表达下调植株更大、产量更高，而过表达植株更小、产量更低。然而，oex-ofp2植株在移栽至盆中后，真叶持续退化（图3G），在较长时间内仅保留子叶。新生叶片的退化似乎源于叶原基活力丧失，进而导致发育停滞。这可归因于PIN1（−0.51倍）的表达受到抑制，从而削弱了生长素运输系统；同时，催化生长素生物合成中吲哚-3-丙酮酸（IPyA）向吲哚-3-乙酸（IAA）转化这一限速步骤的YUCCA类黄素单加氧酶YUC3（−2.90倍）和YUC9（−1.91倍）的表达受到抑制，从而削弱了维持分生组织所需的生长素浓度峰值（Yadav et al., 2023）。一旦克服了这种初期抑制，OFP2过表达植株便恢复正常生长，与野生型植株相似，此后直至最终收获均未再出现抑制迹象。这表明，初期由过表达驱动的
这种抑制并未在整个发育过程中持续存在。oex-ofp2 突变体的存活率仅为 10%，表明其存在早期致死现象；这种先出现严重生长抑制、随后恢复的模式，提示 OFP2 的转录调控具有剂量敏感性。存活植株可能代表这样一类个体：其中的抑制作用激活了转录因子中常见的反馈环路机制，或发生了翻译后基因沉默，后者在拟南芥中由 35S 启动子驱动的高拷贝转基因中也很常见（Fagard and Vaucheret, 2000；Matzke and Birchler, 2005）。许多转录因子通过反馈环路机制受到调控，例如 WUS-CLV3（Schoof et al, 2000）、miRNA156-SPL（Wu et al, 2009）和 TFL1-LFY（Huang et al, 2026），从而调节植物生长及特定发育阶段。
然而，这些植株中极端短根表型的持续存在表明，仍有足量稳定的 OFP2 蛋白残留，以发挥靶向抑制作用。幼年期的这种强烈抑制使 oex-ofp2 突变体发生了显著的发育异时性变化：它们最终能够达到与野生型植株相同的成熟程度，但需要额外 5 周的时间，使其寿命延长至 15–16 周，而野生型和 amiR 植株的寿命为 12–13 周。发育异时性受保守的 miR156/miR172-SPL 通路调控（Chuck et al, 2007；Wu et al, 2009）。OFP2 启动子中存在 SQUAMOSA 启动子结合位点，支持该调控通路可能被激活的推测。
两个基因的种子相关表型均呈现一致的相互对应模式。尽管在成熟植株中未观察到 ofp2 受到抑制的效应，但其在种子生理方面的表现与 ofp17 相似。这两个基因的表达下调均导致种子休眠程度降低（种子在 12 小时内萌发）、原花青素含量升高（深色
紫色种子），种皮表皮细胞排列紧密，具有较强的吸光特性。相反，过表达突变体表现出休眠（约48小时后开始萌发），原花青素积累水平较低（仅分布于合点端），表皮细胞形态扭曲且吸收能力较弱，而所有基因型的黏液释放均未受影响，表明黏液释放与萌发表型无关。高水平的原花青素（PA）通常与休眠相关，但矛盾的是，本研究中amiR突变体的PA水平较高，休眠程度却较低。这可能是由于其种皮具有较高的通透性。从休眠到种子萌发的转变是一个高度协调的过程，由激素信号传导、染色质重塑、转录重编程和表观遗传调控共同控制。这一过程的核心在于维持休眠的脱落酸（ABA）与促进萌发的赤霉酸（GA）之间的平衡（Holdsworth et al., 2008；Graeber et al., 2012）。转录组数据揭示了与休眠和萌发相关的关键候选分子，其在OFP2突变体中的表达发生了显著失调。CYP707A1（在oex-ofp2中的log2FC：−1.35倍）编码关键的ABA 8′-羟化酶，负责干种子中ABA的分解代谢。该基因受到抑制会提高ABA水平并加深休眠，正如cyp707a1突变体干种子中的ABA积累水平升高至约20倍（Okamoto et al., 2006）。HAI2（AT1G07430；在oex-ofp2中的log2FC：−4.35倍）编码一种A类PP2C磷酸酶，通过使SnRK2激酶失活而负向调控ABA信号传导，其表达显著下调。HAI2活性降低会增强ABA信号传导并强化休眠（Bhaskara et al., 2012）。PUB19（AT1G60190）编码一种负向调控ABA响应的U-box型E3泛素连接酶，其下调
导致ABA超敏感性和气孔关闭增强（Liu et al., 2011）的基因也下调了（log2FC：−2.21倍），进一步支持过表达株系中存在促进休眠的ABA状态。DAG2是一种DOF型锌指转录因子，部分通过激活促进胚根伸出的ECT1来正向调控萌发。与此一致，dag2突变体的萌发能力降低，需要额外的光照或低温处理，且对GA的敏感性降低（Gualberti et al., 2002；Li et al., 2024）。GA的另一个下游效应因子是ATMAN7，其编码一种内切-1,4-β-甘露聚糖酶，可水解珠孔端胚乳细胞壁中的甘露聚糖，促进组织松弛、种皮破裂和胚根伸出；atman7突变体的萌发速度较慢（Fernandez et al., 2013）。最后，BME3（BLUE MICROPYLAR END 3）是一种在胚轴中特异表达的GATA型锌指转录因子，作为萌发的正调控因子发挥作用。即使经过层积处理，功能缺失型bme3突变体的萌发率仍然较低，凸显了其在胚根伸出过程中的关键作用（Liu et al., 2005）。在oex-ofp2中，另一个严重下调的重要种皮结构相关基因是MYB61（AT1G09540；log2FC：−8.61倍）。MYB61是种皮分化和黏液沉积的关键调控因子，其功能缺失会损害种皮表皮的成熟以及胁迫条件下的萌发（Penfield et al., 2001）。MYB96（AT5G62470；log2FC：−2.02倍）是一种响应ABA的R2R3-MYB转录因子，可直接激活角质层蜡质生物合成基因，提示种皮表面通透性发生改变（Seo et al., 2011）。种皮表皮细胞的径向壁变形，种皮细胞壁的微纤丝结构松散，在
oex-ofp2 可能与 MYB41（AT4G28110；log2FC：−1.52 倍）的功能有关，该基因可响应干旱和 ABA，激活异位木栓质合成，提示种皮细胞壁的木栓化程度降低（Cominelli et al., 2008；Kosma et al., 2014）。相反，EXPA5（AT3G29030）显著上调（log2FC：+7.82 倍）；已知扩展蛋白介导的珠孔端胚乳细胞壁松弛有助于种皮破裂和胚根伸出（Cosgrove, 2005；Cho and Cosgrove, 2002），其表达诱导可能代表一种提高萌发能力的补偿机制。总体而言，ABA 分解代谢及其信号传导的负调控同时受到抑制，加之种皮结构异常，共同造成了强烈的休眠状态，而 GA 和 BR 的下调进一步强化了这一状态。这两种激素均通过拮抗 ABA 来促进萌发（Holdsworth et al., 2008；Graeber et al., 2012；Friedrichsen et al., 2002）。
结论
本研究证实，尽管 AtOFP2 和 AtOFP17 的结构域完整性存在差异，但二者均作为植物生长发育的广泛性抑制因子发挥作用。解除这两个基因的转录抑制可产生
关键词：拟南芥 · 卵形家族蛋白 · 旁系同源基因功能分化 · 植物激素信号 · 根系构型 · 种子产量调控
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735610v1?rss=1