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异常的可变剪接可改变多种疾病相关剪接事件，包括与tau病理相关的MAPT外显子10包含，进而影响阿尔茨海默病（AD）的进展。异质性核核糖核蛋白AB（hnRNPAB）是一种剪接调控因子，但其在AD中的作用尚不明确。在本研究中，我们发现hnRNPAB的全长异构体AB332是MAPT外显子10包含的一种新型抑制因子。AB332结合保守的AAUAU基序，并通过其RNA识别基序（RRM）结构域和富含甘氨酸结构域招募RBMX和RBMXL1，组装形成复合物。除MAPT外，AB332还调控涉及多个AD相关基因的剪接事件网络，包括STAG2、ApoER2、MCL-1、PICALM和zDHHC7。值得注意的是，缺失外显子7的异构体AB285不具备上述活性。对AD患者死后脑组织的转录组分析显示，hnRNPAB表达降低；同时，在3xTg AD小鼠海马中证实了AB332的选择性下调。我们针对hnRNPAB外显子7及其侧翼内含子区域开展了系统性的反义寡核苷酸平铺筛选，鉴定出能够特异性上调AB332表达的ASO30。在3xTg AD小鼠中，ASO30恢复了海马AB332水平，降低了病理性tau磷酸化，并改善了认知缺陷。这些发现阐明了AB332调控AD相关剪接事件的分子机制，从而为AD提供了一种靶向hnRNPAB的治疗策略。图形摘要O_FIG O_LINKSMALLFIG WIDTH=200 HEIGHT=79 SRC="FIGDIR/small/736008v1_ufig1.gif" ALT="图1">查看大图（23K）：org.highwire.dtl.DTLVardef@1c7e8eaorg.highwire.dtl.DTLVardef@18c9501org.highwire.dtl.DTLVardef@8ab405org.highwire.dtl.DTLVardef@30da7e_HPS_FORMAT_FIGEXP M_FIG C_FIG
靶向 HnRNPAB 的反义寡核苷酸通过调节阿尔茨海默病相关的可变剪接，改善 tau 蛋白病理改变和认知缺陷 | bioRxiv
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HnRNPAB 靶向反义寡核苷酸通过调节阿尔茨海默病相关的可变剪接，改善 tau 蛋白病理改变和认知缺陷
Tao Jiang
Xingjun Xu
Yaqiong Yu
Caixin Zhu
Chao Ma
Yu Tang
Lingxia Min
Mingliang Tan
Jialin Bai
Zhou Feng
Jingming Hou
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736008
Tao Jiang
1
西南医院康复医学科，陆军军医大学（第三军医大学）；中国重庆，400038
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Xingjun Xu
1
西南医院康复医学科，陆军军医大学（第三军医大学）；中国重庆，400038
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Yaqiong Yu
2
重庆医科大学附属大学城医院康复医学科；中国重庆，401331
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Caixin Zhu
1
西南医院康复医学科，陆军军医大学（第三军医大学）；中国重庆，400038
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Chao Ma
1
西南医院康复医学科，陆军军医大学（第三军医大学）；中国重庆，400038
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摘要
异常性可变剪接会改变多个与疾病相关的剪接事件，包括与 tau 蛋白病理相关的 MAPT 外显子 10 包含，进而影响阿尔茨海默病（AD）的进展。异质性核糖核蛋白 AB（hnRNPAB）是一种剪接调控因子，但其在 AD 中的作用仍未得到充分阐明。在本研究中，我们鉴定出 hnRNPAB 的全长亚型 AB332，发现其是 MAPT 外显子 10 包含的新型抑制因子。AB332 可结合保守的 AAUAU 基序，并通过其 RRM 结构域和富含甘氨酸结构域招募 RBMX 和 RBMXL1，从而组装形成复合物。除 MAPT 外，AB332 还调控多个 AD 相关基因中的一系列剪接事件，包括 STAG2、ApoER2、MCL-1、PICALM 和 zDHHC7。重要的是，缺失外显子 7 的亚型 AB285 不具备这些活性。对 AD 患者死后脑组织进行转录组分析显示，hnRNPAB 的表达降低；同时，在 3xTg AD 小鼠海马体中也证实 AB332 发生选择性下调。我们针对 hnRNPAB 外显子 7 及其两侧侧翼内含子区域开展了系统性的反义寡核苷酸平铺筛选，鉴定出能够特异性上调 AB332 表达的 ASO30。在 3xTg AD 小鼠中，ASO30 恢复了海马体内 AB332 的水平，降低了病理性 tau 蛋白磷酸化，并改善了认知缺陷。这些发现揭示了 AB332 调控 AD 相关剪接事件的分子机制，并为靶向 hnRNPAB 治疗 AD 提供了策略。
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引言
可变剪接是一种关键的转录后过程，它通过外显子跳跃和内含子滞留等机制，使单个前体 mRNA 产生多个不同的蛋白质亚型（1）。由于这一过程发生在人类超过 90% 的……
基因，此外，选择性剪接也是高等真核生物功能复杂性的重要来源之一（2）。这一点在大脑中尤为明显，因为在人类组织中，大脑表现出最高发生率的选择性剪接事件之一（3，4）。剪接调控元件或剪接因子的失调可导致异常的选择性剪接模式，而这些异常模式在神经退行性疾病中发挥着关键作用（5，6）。
越来越多的研究已证实，选择性剪接失调是影响阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）病理进展的重要因素，其严重程度与临床疾病分期密切相关（7）。AD的典型病理特征包括由β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成的淀粉样斑块，以及由高度磷酸化的tau蛋白诱导形成的神经原纤维缠结（8）。其中，与Aβ沉积相比，tau病理与痴呆严重程度的相关性更强（9）。微管相关蛋白tau（MAPT）基因编码tau蛋白，是AD中发生异常选择性剪接的基因中最具代表性的核心靶点之一。
MAPT外显子10受到广泛关注，因为其选择性剪接可产生两种tau蛋白亚型：3次重复tau（3R-tau，含有3个微管结合重复序列）和4次重复tau（4R-tau，含有4个微管结合重复序列）（10）。在AD患者中，失调的3R-tau∶4R-tau比例会导致tau磷酸化水平升高（11）。这种亚型失衡及其病理后果可通过促进MAPT外显子10跳跃的小分子剪接调节剂加以逆转，从而降低4R-tau的表达及高度磷酸化tau的水平（12）。此外，感染了1型单纯疱疹病毒（HSV-1）的前脑类器官
表现出MAPT外显子10包含水平升高，导致4R-tau比例增加，并重现类似AD的病理特征（13）。这些发现凸显了MAPT外显子10剪接在AD中的关键作用。除MAPT外，转录组学研究还一致发现其他AD相关基因存在异常剪接，例如APP、PICALM、CLU和PTGDS，支持从网络层面理解AD发病机制（7，14-17）。
这种多靶点特征表明，专注于单个基因的干预可能不足以逆转病理过程（18），从而推动了人们对剪接调控因子的治疗兴趣。靶向这些协调整个剪接网络的因子，为实现“一靶点、多效应”策略提供了有前景的途径。与此一致的是，对AD脑组织开展的蛋白质组学分析显示，与剪接相关的RNA结合蛋白发生了广泛改变（19-21）。例如，剪接因子SFA-1的过表达能够缓解与年龄相关的全局性剪接缺陷并延长寿命（22）。类似地，AD患者中NOVA1/2蛋白水平降低，并与疾病相关的、依赖于衰老的剪接变化相关（23）。异质性核糖核蛋白（hnRNP）家族成员进一步体现了这一治疗方向：hnRNPA1（一种调控APP、RAGE和MAPT剪接的因子）下调会加剧疾病发生发展（24-27）；具有神经保护作用的hnRNPL-DL亚型能够调控包括CAMKV在内的突触基因网络（28）。因此，这些发现强调了纠正AD中剪接调控因子功能障碍的广阔潜力。
HnRNPAB是hnRNP家族中的经典剪接调控因子。尽管其在癌症中的作用已得到充分确立（29-32），但初步证据表明，hnRNPAB参与神经生物学过程。这包括其与轴突导向至关重要的mRNA结合，以及
突触发生（33），以及通过NF-κB/Lcn2等通路促进神经损伤后的恢复（34）。然而，其在AD中的功能仍知之甚少。在本研究中，我们发现，全长hnRNPAB（AB332）可与RBMX/XL1形成复合物，并通过识别保守的AAUAU基序特异性抑制MAPT外显子10的剪接。除MAPT外，AB332还可调控多个AD相关基因的剪接，而缺失外显子7的异构体则不具备这种剪接调控活性。在3xTg AD小鼠的海马中，AB332的表达显著降低。利用促进hnRNPAB外显子7包含的反义寡核苷酸（ASOs）恢复其水平，可有效挽救该AD模型中的认知缺陷。综上，这些发现确立了hnRNPAB介导的剪接纠正作为AD的一种新型治疗策略，并凸显了靶向剪接网络以改变疾病发病机制的潜力。
材料与方法
质粒构建
本研究所使用的MAPT迷你基因构建体为pCI-MAPT，构建方法此前已有报道（35）。简而言之，该迷你基因包含265 nt的外显子9、截短的388 nt内含子9、93 nt的外显子10、429 nt的内含子10，以及外显子11的前82个核苷酸。迷你基因突变体采用部分重叠的引物对，通过定点诱变构建。为构建pCI-MAPT-boxB质粒，将MAPT迷你基因外显子10中位于+64至+68位点的AATAT序列替换为19 nt的boxB发夹序列（5’-GGGCCCTGAAGAAGGGCCC-3’）。所有蛋白表达质粒均构建于pCGT7或FLAG载体中，所表达的蛋白分别携带N端T7标签或FLAG标签。所有引物的详细序列见表S1。
细胞培养与转染
BV2、HeLa、
SK-N-SH和N2A细胞系购自普诺赛生命科技有限公司（中国武汉）。其中，BV2和HeLa细胞采用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；GIBCO，美国纽约州格兰德岛）培养，SK-N-SH和N2A细胞则采用添加非必需氨基酸（NEAA；GIBCO）的最低必需培养基（MEM；GIBCO，美国纽约州格兰德岛）培养。所有细胞系均在含10%（v/v）胎牛血清（FBS）和抗生素（100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素）的培养基中，于37°C、5% CO₂的湿润环境下培养。为分析蛋白质过表达对野生型（WT）和突变型MAPT微基因的影响，将细胞以每孔1.5×10⁵个的密度接种于12孔板中，培养基为含10% FBS的DMEM。次日，使用ExFect转染试剂（Vazyme，中国南京），将500 ng各微基因质粒分别与300 ng各蛋白表达质粒或空载体（Vctr）共同转染至细胞中。为敲低hnRNPAB，使用si-hnRNPAB（正义链：5′-UGGAAGCAAGUGUGAGAUCAATT-3′），并以siNC（正义链：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′）作为阴性对照。各siRNA单独转染或与微基因质粒共同转染，均使用相同的ExFect转染试剂以保持一致性。在37°C下孵育约6小时后，去除转染培养基并更换为完全培养基。本研究使用的所有反义寡核苷酸（ASO）均在全序列范围内统一采用2′-O-甲氧乙基、硫代磷酸酯骨架及5-甲基胞嘧啶修饰。这些ASO由Hippo Biotechnology Co., Ltd.合成并购得。所有ASO的详细序列见表S2。在ASO筛选实验中，使用CALNP™ RNAi体外转染试剂将各ASO分别转染至HeLa细胞中
按照制造商推荐的操作方案，使用转染试剂（Duona Pharmaceutical Co., Ltd.）进行转染。
半定量RT-PCR和qRT-PCR
转染后约36 h收集培养细胞，使用Trizol试剂（Vazyme，中国江苏南京）提取总RNA，随后以每份RNA样本中的500 ng为模板，使用oligo(dT)18和M-MLV逆转录酶（Vazyme），在10 μL反应体系中合成第一链cDNA。对于微型基因，使用正向引物MAPT-F（5′-CCACTCCCAGTTCAATTACAGC-3′）和反向引物MAPT-R（5′-Cy5-TAATGAGCCACACTTGGAGGTC-3′），经28个PCR循环扩增剪接产物（35）；对于内源性MAPT，则使用正向引物EMAPT-F（5′-CCATGCCAGACCTGAAGAAT-3′）和反向引物EMAPT-R（5′-TGCTCAGGTCAACTGGTTTG-3′），进行35个PCR循环。用于验证内源性hnRNPAB、ApoER2、TMPO、zDHHC7、MCL-1、STAG2和PICALM可变剪接的引物序列列于表S3。Cy5标记的PCR产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，使用Biorad ChemicDoc MP成像系统进行荧光成像，并使用Biorad Image Lab软件（Biorad，美国加利福尼亚州赫尔克里斯）对信号进行定量。外显子包含率表示为包含该外显子的mRNA占剪接后mRNA总量的百分比。使用SYBR qRT-PCR试剂盒（Vazyme，中国江苏南京）进行qRT-PCR，以GAPDH为内参基因。使用特异性引物对cDNA进行40个循环的扩增，并采用2^−ΔΔCt法计算倍数变化。用于RT-qPCR的所有引物序列均列于表S3。
蛋白质免疫印迹
使用添加了蛋白酶抑制剂混合物和/或磷酸酶抑制剂混合物（ABclonal，中国武汉）的RIPA缓冲液（Beyotime，中国上海）裂解培养细胞和经匀浆处理的小鼠组织。蛋白质样品经10–12%的
经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜（Immobilon-P，Millipore，美国马萨诸塞州）。将膜与一抗于4°C孵育过夜，随后与IRDye 680RD标记的山羊抗小鼠或抗兔二抗（LI-COR Biosciences，美国内布拉斯加州林肯市）孵育。抗体的详细信息见表S4。使用Bio-Rad成像系统，通过IRDye 680RD通道检测信号并进行可视化。对蛋白条带强度进行定量，以相应的上样内参进行归一化，随后进一步相对于对照组进行归一化。
RNA pull-down
RNA pull-down实验参照既往报道的方法进行（35）。生物素标记的野生型（WT）RNA（5′-UCCUUAAAUUAA-3′）和突变型RNA（5′-UCCGGAAAUUAA-3′）购自General Biol。分别将500 pmol RNA与60 μL预先洗涤的链霉亲和素琼脂糖珠（Sigma-Aldrich）于4°C旋转孵育2 h。随后，将RNA-微珠复合物与HeLa细胞核提取物在结合缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.8；100 mM KCl；0.1–0.2 mM EDTA；1 mM DTT；1 mM PMSF；0.05% Triton X；0.25 μg/μL酵母tRNA；以及蛋白酶抑制剂混合物）中于4°C孵育2 h。用含150 mM KCl的缓冲液洗涤微珠3次，以Laemmli缓冲液洗脱结合的蛋白，并于95°C加热10 min，用于后续分析。
免疫沉淀/免疫共沉淀（IP/Co-IP）
在HeLa细胞中分别过表达FLAG-AB332和FLAG-AB285表达载体。提取总蛋白，将细胞裂解液与共价偶联抗FLAG纳米抗体的磁性琼脂糖珠孵育3 h。洗脱结合的蛋白，并重悬抗FLAG微珠。样品经SDS-PAGE分离后，用考马斯亮蓝染色，选取差异蛋白条带进行质谱分析。
异构体测序及
可变剪接分析
对于 Iso-Seq，按照制造商说明，使用 Direct-zol RNA Miniprep Kit（R2050，ZYMO Research，美国）从 AB332 过表达组和 Vctr 对照组的 HeLa 细胞中提取总 RNA。参照 Pacific Biosciences 发布的 Isoform Sequencing 实验方案（文件编号 PN 100-092-800-03），使用 Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit（货号 634938，Clontech Laboratories，美国加利福尼亚州）构建测序文库。随后在 PacBio Sequel 第三代测序平台（Pacific Biosciences，美国）上对文库进行测序，该平台专为 Iso-Seq 设计，无需片段化即可进行全长转录组测序。将测序读段比对至人类参考基因组（Homo sapiens，GRCh38.p14 组装版本）。使用 SUPPA 软件进行可变剪接分析，计算剪接包含百分比（percent spliced in，PSI）。PSI 变化值（ΔPSI）定义为 AB332 过表达组的 PSI 值（PSI_AB332 OE）与对照组的 PSI 值（PSI_Vctr）之差：ΔPSI 为正（ΔPSI > 0）表示目标可变剪接事件的包含水平升高，而 ΔPSI 为负（ΔPSI < 0）则表示其包含水平降低。
增强型交联免疫沉淀测序
将 AB332 质粒转染至 T75 培养瓶中的 HeLa 细胞。转染后 48 h，使用 Stratalinker 交联仪（Stratagene），在冰上以 254 nm 紫外线（600 mJ/cm²）照射细胞进行交联，将蛋白质与 RNA 之间的离子键转化为共价键。使用 CLIP 裂解缓冲液裂解细胞，按照既往报道的方法富集 RNA 以进行免疫沉淀，并为每个样本分别构建 eCLIP 文库和输入对照文库。将 400 μl 核提取物与 5 μg
加入AB332特异性抗体，并于4°C孵育过夜，通过免疫沉淀富集AB332-RNA复合物。次日，加入Protein A/G微珠孵育4 h，随后用IP缓冲液洗涤两次，以去除非特异性结合物。将纯化产物经4%–12% Bis-Tris凝胶电泳分离后，转移至硝酸纤维素膜上，切取含AB332的区域，提取RNA-RNP复合物并进行去磷酸化处理。将单链RNA接头连接至RNA的3′端，并使用T4多核苷酸激酶（无3′磷酸酶活性）对RNA的5′端进行³²P标记。回收AB332-RNA复合物，经蛋白酶K和尿素处理去除蛋白质，纯化目标RNA并进行逆转录，生成第一链cDNA。去除残留RNA和dNTP后，将DNA接头连接至cDNA的3′端，随后通过PCR扩增和凝胶片段大小筛选，构建AB332 eCLIP文库。
动物实验与ASO给药
C57BL/6J和3xTg-AD小鼠购自金智合生物科技公司（中国广州）。所有动物实验方案均经第三军医大学（中国重庆）伦理委员会批准。所有实验小鼠均饲养于标准化环境中，采用12 h光照/黑暗循环，温度维持在23°C，相对湿度为50%–60%，可自由摄取标准啮齿类动物饲料和饮水。为初步检测AD中的AB332表达，使用4只12月龄雌性3×Tg AD小鼠和4只同龄雌性WT小鼠。为检测ASO30对hnRNPAB外显子7剪接的影响，使用6周龄雌性C57BL/6J小鼠。为评估ASO30对认知功能和AD病理的影响，选用9月龄雌性3×Tg AD小鼠。ASO30的给药途径为
以每只小鼠100 ng的剂量进行单次左侧脑室注射。小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，使用10 μL Hamilton微量注射器在预定坐标处注射ASO30。具体而言，6周龄小鼠的海马注射坐标为（相对于人字缝尖点）：前后（AP）-0.3 mm，内外侧（ML）1 mm，背腹（DV）-2.3 mm；7月龄小鼠的海马注射坐标则为（相对于人字缝尖点）：AP -0.5 mm，ML 1.3 mm，DV -2.6 mm。所有小鼠均在术中给予镇痛药物，并在整个手术过程中及术后3天内接受监测。
行为学测定
旷场实验
采用40×40×40 cm的不透明实验箱评估探索行为。小鼠先在测试环境中适应30 min，随后逐只置于实验箱中央，适应2 min后进行10 min测试。使用EthoVision XT（v11.5，Noldus）自动追踪并量化总移动距离（cm）及中央区域停留时间占比（%）。
新物体识别（NOR）实验
在40×40 cm的旷场实验箱中评估识别记忆。环境适应24 h后，将小鼠置于实验箱中央，箱内放置两个相同物体（距箱壁5 cm），允许其探索10 min（学习阶段）。间隔24 h后，将其中一个熟悉物体替换为新物体，允许小鼠探索10 min（测试阶段）。所有探索行为均通过视频记录，并使用EthoVision XT软件（v11.5，Noldus）进行自动追踪。
Morris水迷宫实验
采用注满不透明水（水温23°C，水深30 cm）的圆形水池（直径120 cm）评估空间学习与记忆能力。水池周围放置视觉线索（几何图形）。在……之前
训练前，允许小鼠在水池中自由游泳2 min，以适应环境。实验持续5天：前4天为训练阶段，小鼠每天接受4次试验（分别从各象限出发，试验间隔为60 min），以在60 s内找到水下环形平台（宽10 cm，位于水面下1 cm）。若小鼠未能在60 s内找到平台，则引导其到达平台并停留15 s。使用EthoVision XT软件（v11.5，Noldus）记录小鼠到达平台的潜伏期，并计算每日平均潜伏期。第5天进行空间探索试验，移除平台，让小鼠在水池中自由探索60 s。采集并分析象限停留时间百分比（%）、穿越平台原位置次数等参数。
统计分析
使用SPSS软件（v27.0），采用双侧Student’s t检验以及单因素方差分析（ANOVA）并结合事后检验进行数据分析。所有数据均以均值±标准差（SD）表示。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
hnRNPAB通过外显子10下游元件抑制MAPT外显子10的剪接
为阐明hnRNPAB的剪接调控功能及其潜在分子机制，我们采用此前已验证的MAPT微基因报告系统，并在HeLa细胞中将T7标签标记的hnRNPAB与该微基因共表达（35）。荧光半定量RT-PCR分析（36）显示，与空载体对照（Vctr）相比，hnRNPAB过表达使MAPT外显子10的包含率从35%显著降至3%（图1A–B）。使用抗T7抗体进行蛋白质印迹分析，证实了T7-hnRNPAB的表达（图1C）。siRNA介导的hnRNPAB敲低显著提高了MAPT外显子10的包含率（图1D–F）。综上，这些数据表明
hnRNPAB是MAPT外显子10剪接的强效抑制因子。
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图1.
hnRNPAB通过外显子元件抑制MAPT外显子10剪接。
（A–C）
T7标签hnRNPAB过表达对HeLa细胞中MAPT微基因剪接的影响及其定量分析。通过蛋白质印迹验证T7标签hnRNPAB的表达（n = 3）。
（D–F）
siRNA介导的hnRNPAB敲低对HeLa细胞中MAPT微基因剪接的影响及其定量分析（n = 4）。siRNA处理后，通过蛋白质印迹检测蛋白水平。
（G–I）
野生型（WT）MAPT外显子10序列及初始外显子缺失突变体中的缺失区域（虚线）。T7标签hnRNPAB过表达条件下，野生型和突变型MAPT微基因的剪接及定量分析（n = 3）。
（J–L）
在第62–73位范围内进一步缺失的外显子10突变体，以及T7标签hnRNPAB过表达条件下相应的剪接模式及定量分析（n = 3）。
（M–O）
针对外显子10第64–68位构建的替换突变体（突变碱基以下划线标示），以及T7标签hnRNPAB过表达条件下相应的剪接模式及定量分析（n = 3）。与载体对照（Vctr）相比，*P < 0.05，P < 0.01，*P < 0.001。与阴性对照（NC）相比，***P < 0.001。
为精确定位hnRNPAB结合元件，我们在MAPT微基因中构建了一系列覆盖外显子10及其侧翼内含子区域（−50/+50）的缺失突变体（图1G和图S1A），包括10个内含子缺失突变体和9个外显子缺失突变体，并保留外显子末端的二核苷酸，以避免破坏剪接位点。与T7-hnRNPAB或载体对照共转染后，4个内含子缺失突变体和2个外显子缺失突变体的外显子10包含几乎完全消失（<10%），因而无法进行后续分析；hnRNPAB过表达强烈抑制了其余大多数突变体的外显子10包含，但其抑制作用明显减弱于
突变体D63–72中的活性（图1H–I、S1B–C），表明外显子10的+63–72区域包含一个对hnRNPAB介导的剪接沉默至关重要的顺式作用元件。我们进一步通过靶向缺失对该区域进行了精细定位，发现去除5 nt的AAUAU基序（ΔD64–68）会显著削弱hnRNPAB依赖性的抑制作用（图1J–L）。对该基序进行系统性核苷酸替换发现，单点突变（U66C）即足以破坏hnRNPAB介导的剪接抑制作用（图1M–O）。综上，我们的系统性突变研究确定，位于+64–68的AAUAU基序是一个功能性外显子剪接沉默元件（ESS），是hnRNPAB介导的MAPT外显子10包含抑制所必需的。
hnRNPAB与MAPT外显子10 AAUAU元件的特异性结合介导剪接抑制
为验证hnRNPAB介导的剪接抑制与AAUAU基序结合之间的机制联系，我们使用覆盖外显子10第+59至+72位的生物素标记12 nt RNA探针进行了RNA下拉实验，并以T66C突变体作为非靶向对照。LC-MS分析鉴定出4种在野生型（WT）样本中富集的RNA结合蛋白，其肽段-谱图匹配数（PSM）≥15，且WT/突变体的PSM比值>2：hnRNPD、hnRNPDL、hnRNPAB和TIAL1（图2A）。为进一步确认hnRNPAB的特异性，我们检测了另外3种RNA结合蛋白对MAPT微基因剪接的影响。我们发现，hnRNPDL和TIAL1显著抑制MAPT外显子10的包含，而hnRNPD未表现出调控作用（图2B–C）。蛋白质印迹分析显示，与突变体对照相比，hnRNPAB在WT RNA–蛋白质复合物中显著富集，而hnRNPDL和TIAL1均未表现出这种优先结合（图2D）。
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图2。
HnRNPAB
与AAUAU基序结合。
(A)
通过RNA下拉实验鉴定hnRNPAB结合基序。
(B-C)
分析所示表达质粒对MAPT外显子10剪接的调控作用。
(D)
对洗脱蛋白进行Western blot分析，证实hnRNPAB在野生型（WT）RNA样品中特异性富集。
(E)
示意图展示N22融合蛋白靶向MAPT-boxB的过程。
(F)
Western blot分析验证了所有融合蛋白在HeLa细胞中的正常表达。
(G-H)
分析N22融合蛋白对MAPT-boxB微基因的影响（n = 3）。与空载体（Vctr）相比，P < 0.01，*P < 0.001。
为验证hnRNPAB通过结合AAUAU基序发挥剪接抑制作用，我们采用了既往文献所述的boxB-λN蛋白系留系统（36，37）。通过将外显子10中+64至+68位的核苷酸替换为一个19 nt的boxB基序，构建了突变型MAPT微基因（MAPT-boxB）（图2E）。将MAPT-boxB与带有T7标签的N22-hnRNPAB或N22-GFP共转染HeLa细胞，并分析外显子10的剪接情况。通过Western blot确认融合蛋白的表达（图2F）。该替换显著提高了外显子10的包含效率，重现了外显子剪接沉默子（ESS）缺失的效应。尽管N22本身对MAPT-boxB的剪接具有抑制作用，但N22-hnRNPAB表现出更强的抑制作用，使外显子10的包含率从42%（N22对照）降至8%，而T7-N22-GFP未表现出调控活性（图2G-H）。这一结果证实，N22介导的hnRNPAB向boxB基序的系留可特异性重现野生型MAPT微基因的剪接抑制效应，并验证了图1所揭示的机制。
AB332通过其RRM结构域和Gly结构域招募RBMX/RBMXL1，以抑制MAPT外显子10的剪接
hnRNPAB基因由8个外显子组成，编码三种异构体——AB332（该
在图1、图2和图S1中分析的经典异构体）、AB327和AB285——该蛋白包含多个结构域，包括CARG结合因子N端结构域（CBFNT）、两个位于中部的RNA识别基序（RRM）以及一个C端富甘氨酸结构域（Gly）（38）。与AB332相比，AB327的富甘氨酸结构域缺少5个氨基酸。相比之下，AB285的富甘氨酸结构域缺少47个氨基酸，这一缺失由hnRNPAB外显子7跳跃所致（图S2A）。为确定这些结构差异的功能意义，我们构建了各异构体的T7标签表达载体，并在HeLa细胞中评估其对内源性MAPT及MAPT微基因剪接的影响。所有异构体均抑制MAPT微基因中外显子10的包含，但只有AB332能强烈抑制内源性MAPT剪接（图S2B–C）。此外，即使在敲低hnRNPAB所有异构体的情况下，过表达AB332仍保留其抑制活性，且这一能力强于过表达AB285时观察到的抑制能力（图S2D）。
为鉴定AB332特异性结合蛋白，我们随后进行了免疫沉淀（IP）实验（图3A）。AB332样品中有7种蛋白富集，满足肽谱匹配数（PSM）≥50且AB332/AB285的PSM比值>5：RBMX、RBMXL1、RPL4、TUFM、HADHB、EIF2S3和EIF4A1（图3B）。免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，仅AB332与RBMX/RBMXL1之间存在特异性相互作用，而AB285未检测到结合活性（图3C和图S3A–B）。为明确AB332与RBMX之间的分子相互作用，我们使用PyMOL 2.5.3进行了蛋白质–蛋白质对接模拟。结果确定了关键氢键，分别连接AB332的Y303、T107和R248残基与RBMX的E3、R49和S73残基。此外，AB332的R109与RBMX的D42之间形成了一个起稳定作用的盐桥（
图3D）。AB332与RBMXL1的类似模拟呈现出高度相似的结合模式（图S3C）。AB332过表达后，RBMX的表达下调（图S3D–E）。过表达T7标签的RBMX或RBMXL1仅轻度抑制MAPT外显子10的包含，而与AB332共表达时，相较于单独表达AB332，剪接未发生进一步改变（图S3F–G）。这些数据表明，AB332是调控MAPT外显子10剪接的主导效应因子，其强烈的抑制作用掩盖了RBMX/RBMXL1的潜在贡献。
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图3.
hnRNPAB的RRM和Gly结构域通过结合RBMX/XL1抑制MAPT外显子10剪接。
（A–B）通过免疫沉淀（IP）实验鉴定与hnRNPAB相互作用的蛋白质。
（C）使用抗RBMX和抗RBMXL1抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）实验。
（D）采用分子对接模拟RBMX与AB332之间的结合模式。
（E）hnRNPAB及其缺失突变体的一级结构示意图。
（F）通过Co-IP实验鉴定AB332的关键结构域。
（G–H）在HeLa细胞中分析AB332结构域缺失突变体对MAPT微基因外显子10剪接的影响（n = 3）。与载体对照（Vctr）相比，*P < 0.05，***P < 0.001。
为定位AB332蛋白中与RBMX/XL1结合所必需的相互作用结构域，我们针对不同结构区域构建了一系列FLAG标签的缺失突变体（图3E）。Co-IP结果显示，删除AB332的CBFNT结构域并不影响其与RBMX或RBMXL1的结合。然而，删除RRM或Gly结构域几乎完全消除了这些相互作用（图3F）。与此一致，ΔCBFNT突变体对MAPT外显子10剪接的抑制作用与AB332相当，而ΔRRM和ΔGly突变体则丧失了这一抑制功能（图3G–H）。这些结果表明，RRM和
AB332的Gly结构域介导其与RBMX/RBMXL1的功能性相互作用，从而形成具有活性的剪接抑制复合物。
AB332协调AD相关基因的可变剪接事件网络
为全面表征AB332的调控作用，我们在稳定过表达T7标签AB332的HeLa细胞中进行了全长转录本测序（Iso-seq）。与载体对照（Vctr）相比，484个基因显著下调，另有1438个基因显著上调（图S4A）。我们使用RT-qPCR验证了两个参与AD发病机制的基因NT5E和NR1D1的mRNA水平（图S4B–C）。我们进行了差异转录本使用（DTU）分析，鉴定出涉及614个基因的722个具有统计学显著性的剪接改变事件，其中外显子跳跃（ES）占33.43%，内含子保留（IR）占12.75%，其他类别（包括互斥外显子（MXE）和可变5′/3′剪接位点（A5′SS、A3′SS））占53.82%（图4A）。在这些发生改变的事件中，35.29%表现为外显子包含增加（ΔPSI > 0，P < 0.05），而大多数（64.71%）表现为外显子跳跃增加（ΔPSI < 0，P < 0.05）（图4B–C）。KEGG富集分析显示，这些发生差异性可变剪接的基因参与线粒体自噬、细胞凋亡及其他通路（图S4D）。值得注意的是，AB332调控了多个参与AD发病机制的基因的剪接。这些基因包括：ApoER2，其外显子19包含增加与认知功能改善相关（39）；TMPO，与细胞衰老相关（40，41）；zDHHC7，突触可塑性的关键调控因子（42）；MCL-1，可促进线粒体自噬并减轻Aβ病理改变（43）；STAG2，参与脑发育（44）；以及AD风险基因PICALM，其缺失会损害小胶质细胞对Aβ的清除，并且
tau（45）。通过RT-PCR，我们验证了hnRNPAB的三种异构体对剪接变化的调控作用，证实AB332特异性地增加了ApoER2外显子19和MCL-1外显子2的包含，并促进了TMPO、zDHHC7、STAG2和PICALM中特定外显子的跳跃。相比之下，AB285异构体对这些事件没有影响（图4D–E）。这一一致的模式证实，AB332异构体特异性地协调调控与AD通路相关的剪接事件。
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图4.
AB332特异性调控多个AD相关基因的可变剪接事件。
（A）
饼图显示过表达AB332的HeLa细胞中可变剪接事件（外显子跳跃、内含子保留、可变5′/3′剪接位点、互斥外显子）的分布。
（B）
所有发生变化的剪接事件（n = 722）、外显子跳跃（n = 241）、内含子保留（n = 92）及其他剪接事件（n = 389）中正ΔPSI（PSI_AB332 OE − PSI_Vctr > 0）和负ΔPSI（PSI_AB332 OE − PSI_Vctr < 0）的分布（P值 < 0.05）。
（C）
所鉴定剪接事件的ΔPSI值（PSI_AB332 OE − PSI_Vctr）分布。数据以中位数和四分位距表示。
（D–E）
RT-PCR检测分析不同hnRNPAB异构体对HeLa细胞中ApoER2、TMPO、zDHHC7、MCL-1、STAG2和PICALM可变剪接事件的调控作用（n = 3或4）。与Vctr相比，*P < 0.05，P < 0.01，*P < 0.001；与AB332相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。
全基因组图谱分析揭示AB332通过结合富含AU的基序调控剪接
为鉴定生理条件下AB332异构体直接结合的RNA基序靶标，我们使用AB332特异性抗体，在HeLa细胞中进行了增强型交联免疫沉淀测序（eCLIP-seq）。我们鉴定出
3022个基因具有AB332结合位点，这些位点主要富集于终止密码子附近的3′非翻译区（3′ UTR）（图5A–B）。峰注释结果显示，约33.78%的AB332结合位点位于编码序列的外显子区域内，且与AB332结合的RNA绝大多数为蛋白质编码转录本（图5C–D）。基序分析表明，AB332对富含AU的序列具有强烈偏好，包括在MAPT中鉴定出的AAUAU基序（图5E和图S5A）。我们进一步将eCLIP-seq靶标与Iso-seq分析中呈现AB332依赖性可变剪接变化的基因取交集，鉴定出165个重叠基因，包括PICALM、TMPO、MCL-1和STAG2（图5F）。对这165个基因进行的GO和KEGG功能富集分析表明，AB332参与细胞凋亡的负调控（图S5B–C）。最后，我们对AB332在PICALM、TMPO、MCL-1和STAG2转录本上的结合富集情况进行了可视化展示（图5G和图S5D），为AB332通过结合这些基因的RNA来调控剪接提供了直接证据。
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图5.
HeLa细胞中AB332直接下游靶标的鉴定。
(A)
HeLa细胞中含有AB332结合位点的下游基因数量。
(B)
展示所有AB332结合峰富集模式的元基因图谱。
(C)
饼图展示通过eCLIP-seq鉴定的AB332结合位点在基因组中的分布比例。
(D)
eCLIP-seq数据集中AB332下游靶基因的分布。
(E)
通过从头基序分析鉴定的HeLa细胞中显著富集程度最高的AB332结合基序。
(F)
HeLa细胞中AB332的Iso-Seq与eCLIP-seq数据之间的重叠基因。
(G)
HeLa细胞中PICALM和STAG2基因的eCLIP-seq测序读段覆盖情况。
筛选鉴定出ASO30是一种高效的剪接调节剂
协同调控 hnRNPAB 和 MAPT
鉴于 AB332 在介导 hnRNPAB 依赖性剪接调控中的核心作用，我们探究了其在阿尔茨海默病（AD）中的治疗潜力。我们首先分析了 GEO 数据库中 AD 患者死后脑组织的转录组数据集（GSE5281），发现与无痴呆对照相比，AD 样本中的 hnRNPAB mRNA 水平显著下调（图 S6A）。我们进一步检测了 12 月龄雌性 3xTg-AD 小鼠海马中 AB332 异构体的表达，发现与同龄野生型同窝小鼠相比，AB332 水平选择性降低（图 S6B）。
靶向 hnRNPAB 基因的反义寡核苷酸（ASO）可通过促进外显子 7 包含并上调 AB332 表达，成为一种具有前景的 AD 治疗策略。为实施这一策略，我们在 HeLa 细胞中系统筛选了一组靶向 hnRNPAB 基因外显子 7 及其两侧内含子序列的 ASO。此次筛选采用了基于既往报道方案改进的三步 ASO 步移法（46，47）。我们设计了 42 条长度为 22 个核苷酸、相互重叠的 ASO，每条均采用 2′-O-甲氧乙基核糖修饰和硫代磷酸酯骨架。这些 ASO 覆盖了一个长 266 个核苷酸（nt）的区域，从内含子 6 的最后 62 nt 延伸至内含子 7 的第 63 nt。以一条无关寡核苷酸（ASO-00）作为阴性对照（图 6A 和图 S7A）。为评估 ASO 的效力，我们以 100 nM 的浓度将各条 ASO 转染至 HeLa 细胞，并通过半定量荧光 RT-PCR 分析 hnRNPAB 外显子 7 的剪接情况。靶向外显子 7 的 ASO 主要诱导外显子跳跃，而靶向内含子 6 和 7 的 ASO 则产生了更复杂的剪接模式（图 6B–C；图 S7B–C）。在这些候选 ASO 中，ASO 29–32、36 和 42 均不同程度地促进了 hnRNPAB 外显子 7 的包含。为确定
为筛选出最有效的候选物，我们在HeLa和SK-N-SH细胞中以50 nM的浓度评估了这6种ASO。在该浓度下，仅ASO30显著增加了hnRNPAB外显子7的包含，并促进了MAPT外显子10的跳跃（图6D）。ASO30还表现出跨物种活性，尽管存在单碱基错配，仍能有效调控小鼠BV2和N2A细胞中hnrnpab外显子7的剪接（图S8A–E）。
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图6. 靶向hnRNPAB内含子6和7并增强hnRNPAB外显子7包含的ASO的系统性筛选。
（A）纳入筛选的ASO示意图。每条水平线代表一种ASO。
（B）在HeLa细胞中检测20种ASO在50和100 nM浓度下的作用，以转染缓冲液和无关ASO（ASO-00）作为阴性对照。
（C）对应于（B）图的hnRNPAB外显子7剪接效率的定量分析。
（D）6种候选ASO（50 nM）对HeLa和SK-N-SH细胞中MAPT和hnRNPAB转录本的剪接调控作用。（n = 3）。与缓冲液组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。
ASO30改善3xTg-AD小鼠的认知缺陷和tau病理
为确定ASO30在体内研究中的有效剂量，我们开展了初步剂量–反应实验（0、20、50、100、200 ng），发现100 ng在增加hnrnpab外显子7包含和促进mapt外显子10跳跃方面效果最佳（图S8F–L）。随后，我们通过侧脑室（ICV）注射，向9月龄雌性3xTg小鼠单次给予100 ng ASO30、乱序对照寡核苷酸（ASO-NC）或生理盐水。8周后，采用一系列行为学测试评估这些小鼠的认知功能（图7A）。在旷场试验中，接受ASO30处理的小鼠在中央区域停留的时间更长，表明其焦虑样行为减少。
（图7B-C）。新物体识别测试显示，动物对新物体的偏好得以恢复，表明识别记忆有所改善（图7D-E）。通过莫里斯水迷宫评估的空间学习与记忆能力也得到挽救：ASO30处理组小鼠穿越原平台位置的次数更多，且在目标象限停留的时间更长（图7F-I）。这些行为学改善证实，ASO30介导的hnrnpab靶向可缓解AD模型中的认知缺陷。
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图7. 靶向hnrnpab的ASO可改善3×Tg-AD小鼠的tau病理和认知缺陷。
(A) 3×Tg-AD小鼠单侧脑室内（ICV）注射示意图。
(B-C) 对ICV注射ASO30后的3×Tg-AD小鼠进行旷场（OF）测试，以评估其运动活动和焦虑样行为（n = 7）。
(D-E) 对ICV注射ASO30后的3×Tg-AD小鼠进行新物体识别（NOR）测试，以评估其对新物体的偏好（每组n = 7只小鼠）。
(F-I) 对ICV给予ASO30后的3×Tg-AD小鼠进行莫里斯水迷宫（MWM）测试，以评估其学习与记忆能力（n = 7）。
(J-L) 对ICV注射ASO30后的3×Tg-AD小鼠海马组织进行RT-PCR分析，以检测ASO30对hnrnpab和mapt基因剪接调控的作用（n = 5）。
(M-P) 对接受ICV注射ASO30的3×Tg-AD小鼠海马组织中的ab332、4R tau和磷酸化tau蛋白进行蛋白质印迹分析（n = 5）。与生理盐水组相比，*P < 0.05，P < 0.01，*P < 0.001。
为将认知改善与分子机制联系起来，我们分析了剪接情况和蛋白表达。ASO30处理显著提高了hnrnpab外显子7的包含率及AB332蛋白水平，促进mapt外显子10跳跃，并降低了4R-tau和磷酸化tau水平（图7J-P）。综上，这些发现表明，ASO30通过特异性靶向hnrnpab，
有效改善了认知缺陷和AD的核心tau病理。
讨论
hnRNP家族由经典的剪接调控因子组成，其中多个成员已被证实与AD相关（48，49）。然而，特定hnRNP成员参与AD认知能力下降的确切分子机制仍有待进一步阐明。在本研究中，我们确定hnRNPAB是这一过程中的关键调控因子。我们证明，其AB332亚型可与RBMX/XL1形成具有功能的复合物，通过识别AAUAU基序，特异性抑制MAPT外显子10的包含，并调控一系列与AD相关的剪接事件。相应地，我们发现AD模型小鼠海马中AB332亚型的表达显著降低。针对这一缺陷，我们设计了可促进hnRNPAB外显子7包含并上调AB332表达的反义寡核苷酸（ASO30）。结果显示，ASO30能够有效降低磷酸化tau水平并挽救认知缺陷。这些发现凸显了通过hnRNPAB介导的剪接失调纠正策略治疗AD的潜力。
精准的可变剪接由剪接因子与剪接调控元件（SREs）的组合协同作用共同协调。尽管MAPT外显子10跳跃这一tau蛋白病变中的关键事件已得到广泛研究，且已有超过30种调控蛋白被报道参与其中，但我们的研究进一步揭示了其复杂性的新层面（50）。我们确定AB332是MAPT外显子10包含的强效抑制因子；然而，我们此前的质谱分析已确立其作为SMN2外显子7剪接的强效激活因子的特征性作用（36）。这种由激活因子向抑制因子的功能转换，最有可能归因于位置依赖性效应，即剪接结果取决于】【。
RNA结合蛋白的作用取决于其结合位点相对于受调控外显子的位置（51）。我们的研究结果与这一模型相符，也与TDP-43和NOVA等既往研究案例一致（52，53）。包括使用MAPP等工具开展的计算分析，已对这一机制进行了系统表征，揭示了RBFOX1等RNA结合蛋白如何根据结合位点的环境产生相反作用（54）。因此，AB332体现了剪接调控因子的一项关键功能特性：依赖上下文的双重功能。这一特性使数量有限的蛋白质能够调控种类繁多的剪接结果。
为确立AB332依赖上下文发挥功能这一特性，我们进一步阐明了其抑制疾病相关外显子剪接的分子机制。缺失定位分析确定，位于MAPT外显子10下游64–68个核苷酸处的关键AAUAU基序，是AB332响应性的核心元件。这一发现得到了既往研究的有力支持。Lisowiec等人报告称，该元件有助于形成H4.2，即一种具有外显子剪接沉默活性的抑制性发夹结构；其上游序列可招募包括SRSF6、RBMX和/或SRSF9在内的剪接因子（55）。Wang等人也通过MAPT N296N(T-C)突变，将该位置鉴定为外显子剪接沉默元件（56）。这与我们的发现一致：MAPT外显子10第66位的胸腺嘧啶在该调控元件中发挥关键作用（图1）。我们的数据拓展了对hnRNPAB结合特异性的认识：我们鉴定出的AAUAU核心序列嵌于Fukuda等人在与神经发育相关的mRNA 3′UTR中所鉴定的更广泛共识序列（SCCGMM）之内（33）。这一AAUAU基序也在我们的……中检出。
独立的eCLIP-seq分析进一步证实了其作为有效AB332结合位点的地位。尽管其完整的结合基序谱仍有待进一步研究，但我们的工作明确表明，该AAUAU元件是介导hnRNPAB依赖性MAPT外显子10剪接抑制的功能性基序。
RBMX通过与hnRNPA1竞争性结合调控PKM剪接，这一点已得到充分确立（57）。本研究进一步揭示，RBMX可与AB332组装成功能性复合物，从而抑制MAPT外显子10的包含。我们观察到，AB332过表达会抑制RBMX的表达（图S3），这与负反馈调控环路相一致。值得注意的是，据报道，RBMX在AD中表达升高（58）。我们推测，疾病状态下AB332的下调可能会减弱这种抑制作用，进而导致RBMX的代偿性上调。这种失调的表达模式最终会损害AB332–RBMX复合物的功能完整性，从而促成AD中的异常MAPT剪接。我们证实，AB332与RBMX之间的相互作用关键依赖于AB332的RRM结构域和Gly结构域。这一发现与Pan等人的近期研究结果一致，后者证实hnRNPAB的RRM1结构域对于其与TRIM25的相互作用至关重要（30）。该结果也与Wang等人的研究相符，后者确定hnRNPAB的Gly结构域是介导其抑制甲型流感病毒复制的关键区域（38）。
我们的Iso-seq分析鉴定出AB332的一种特异性调控作用，即调节AD相关基因的表达；而AB285亚型并不具有这一活性。我们重点研究了两个靶基因：NR1D1和NT5E。在HeLa细胞中过表达AB332可提高NR1D1的水平。该基因编码REV-ERBα，这是一种具有复杂……
AD中与自噬和tau清除等过程相关的情境依赖性作用（59–62）。AB332对NR1D1的影响提示其可能参与这些通路，但其在不同细胞类型和疾病阶段中的具体作用仍需进一步研究。同样，AB332上调了NT5E；已知该基因表达降低会加剧AD病理（63）。我们的数据与既有病理机制相一致，进一步增强了AB332与AD相关性的可信度。此外，AB332还调节了多个AD相关基因的可变剪接，包括ApoER2、zDHHC7、MCL-1和STAG2。在这些靶标中，MCL-1已知可调控两条有助于缓解AD相关认知障碍的通路——线粒体自噬和细胞凋亡。其可变剪接可生成抗凋亡的MCL-1L以及较短的促凋亡异构体，同时MCL-1还可作为线粒体自噬受体（64–68）。本研究表明，AB332可能直接结合MCL-1 mRNA，并促进其剪接偏向具有保护作用的MCL-1L异构体（图4和图5），由此可能抑制细胞凋亡并增强线粒体自噬。我们的Iso-seq结果也支持这一观点：受AB332影响而发生剪接变化的基因富集于自噬和线粒体自噬通路（图S4）。这些结果提示，AB332可作为一种关键的剪接调节因子，与已有的神经保护机制相联系；不过，这种调控串扰的确切分子基础仍有待阐明。
既往临床治疗的成功案例表明，ASO疗法在神经系统疾病治疗中具有广阔前景。Nusinersen是一种经2′-MOE/PS修饰的ASO，可纠正SMN2剪接，目前已获批用于治疗脊髓性肌萎缩症（47，69）。类似地，ASO MAPTRx可降低AD患者的总tau水平，】【。
患者（70）。然而，非选择性地降低tau蛋白水平可能会破坏其在神经元结构和功能中的重要生理作用（71，72）。一种更为安全的策略是选择性降低病理性tau蛋白，同时保留其正常功能。在本研究中，靶向hnRNPAB的ASO正是通过调控多个AD相关基因的可变剪接而实现了这一策略，其中包括促进MAPT外显子10跳跃、降低4R-tau和磷酸化tau蛋白水平，并最终改善认知功能。因此，该策略可能广泛适用于其他tau蛋白病，包括额颞叶痴呆。
总之，我们鉴定出一种靶向hnRNPAB可变剪接的候选ASO，将其作为AD及相关tau蛋白病的潜在治疗策略。本研究的主要局限在于，我们未在3xTg小鼠中评估ASO作用的持续时间，也未对候选ASO进行进一步优化，因为本研究的重点是将hnRNPAB确定为AD的新型治疗靶点。未来，可通过将ASO与靶向递送策略相结合，进一步优化这一方法，例如采用低强度聚焦超声。该联合策略有望通过提高ASO在脑内的生物利用度来增强药物疗效，同时提高患者的依从性和安全性。
作者贡献
Tao Jiang：研究设计、实验实施、数据分析、论文撰写。Xingjun Xu：实验实施、数据分析。Yaqiong Yu：实验实施。Caixin Zhu：数据分析。Chao Ma：数据分析。Yu Tang：数据分析。Lingxia Min：数据分析。Mingliang Tan：数据分析。Jialin Bai：论文撰写。Zhou Feng：研究设计、论文撰写。Jingming Hou：研究设计、论文撰写。
补充数据
补充数据可在线获取于NAR。
利益冲突
T. Jiang、X. Xu、Y. Tang、Z. Feng 和 J. Hou 是一项与利用 ASO 技术治疗 AD 相关的中国专利申请的发明人：“靶向 hnRNPAB 的 ASO 药物及其在阿尔茨海默病药物制备中的应用”（CN 120514722 B）。其他作者声明不存在利益冲突。
经费支持
本研究ได้รับ重庆市自然科学基金面上项目资助［项目编号：CSTB2025NSCQ-GPX0630，资助 T.J.］；重庆市中青年医学高端人才项目资助［项目编号：YXGD202460，资助 J.H.］；以及重庆市医学青年优秀人才项目资助［项目编号：YXQN202417，资助 Z.F.］。
数据可用性
与本研究相关的全部数据均已包含于本文或补充材料中。测序数据已存储于 SRA：Iso-seq 数据登录号为 PRJNA1423612；eCLIP-seq 数据登录号为 PRJNA1423657。
致谢
作者声明，本研究无其他致谢事项。
基金资助信息
重庆市自然科学基金面上项目
重庆市中青年医学高端人才项目
重庆市公共卫生医疗中心，
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靶向 HnRNPAB 的反义寡核苷酸通过调控阿尔茨海默病相关的可变剪接改善 tau 病理和认知缺陷
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关键词：阿尔茨海默病 · 选择性剪接 · 反义寡核苷酸 · hnRNPAB · Tau蛋白病理 · 认知缺陷
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.736008v1?rss=1