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尽管已知视杯折叠涉及视网膜色素上皮（RPE）细胞特定的几何形态变化，但调控这些细胞形成高刚性几何形态的精确基因调控机制，以及这些机制如何促进折叠的顺利完成，仍不清楚。为弥补这一认知空白，我们研究了RPE细胞中机械张力的增加和细长几何形态的维持如何依赖于Wnt/β-catenin和YAP通路的激活。我们证明，干扰这些通路会降低RPE细胞张力，进而导致折叠失败。我们还鉴定了受这些通路控制的转录程序，这些程序调节肌动蛋白细胞骨架的力学性质、细胞间黏附、细胞与细胞外基质（ECM）之间的黏附以及内吞作用。最后，我们提出假说：在细胞膜与核膜之间传递张力的LINC复合体，以依赖细胞几何形态的方式介导β-catenin和YAP入核。我们结合定量成像、功能分析、力学扰动实验和转录组分析，全面揭示了机械敏感性基因表达与细胞几何形态变化之间的协调如何驱动眼的形成。
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视杯折叠由视网膜色素上皮（RPE）细胞的几何形态与张力驱动
Juan
Aperador-Redondo
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Estefanía
Sanabria-Reinoso
，
Javier
Macho-Rendón
，
Rocío
Polvillo
，
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JR
Martínez Morales
，
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María
Almuedo-Castillo
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.03.736268
Juan Aperador-Redondo
1
安达卢西亚发育生物学中心（CSIC-UPO-JA）
。西班牙塞维利亚，Rectora Rosario Valpuesta 大道 1 号，邮编 41089
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Estefanía Sanabria-Reinoso
1
安达卢西亚发育生物学中心（CSIC-UPO-JA）
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Javier Macho-Rendón
1
安达卢西亚发育生物学中心（CSIC-UPO-JA）
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Rocío Polvillo
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安达卢西亚发育生物学中心（CSIC-UPO-JA）
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JR Martínez Morales
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María Almuedo-Castillo
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尽管已知视杯折叠涉及视网膜色素上皮（RPE）细胞特定的几何形态变化，但调控这些细胞形成高度刚性几何形态的精确基因调控机制，以及这些机制如何促进折叠的成功完成，仍不甚清楚。为弥补这一认识空白，我们研究了 RPE 细胞机械张力的增加和细长几何形态的维持如何依赖于 Wnt/β-catenin 和 YAP 通路的激活。我们证明，干扰这些通路会降低 RPE 细胞张力，从而导致折叠失败。我们还鉴定出受这些通路控制的转录程序，这些程序调控肌动蛋白细胞骨架的力学性质、细胞间黏附、细胞与细胞外基质（ECM）之间的黏附以及内吞作用。最后，我们提出假设：在细胞膜与核膜之间传递张力的 LINC 复合体，以依赖于细胞几何形态的方式介导 β-catenin 和 YAP 入核。
我们结合定量成像、功能分析、力学扰动实验和转录组分析，全面阐明了机械敏感性基因表达与细胞几何形态变化之间的协调如何驱动眼的形成。
引言
单层上皮如何在缓冲组织水平作用力的同时，动态改变其力学性质和细胞几何形态，从而形成复杂器官，仍是发育领域的一个基本问题
力学生物学。在脊椎动物眼形成过程中，视网膜色素上皮（Retinal Pigmented Epithelium，RPE）很好地体现了这一问题。RPE位于神经视网膜（Neural retina，NR）外侧，必须迅速从圆形转变为高度扁平且伸展的形态，这一形态发生程序是视杯折叠所必需的（Moreno-Mármol 等，2021）。这一复杂的折叠过程由不同眼部细胞亚群共同驱动。NR通过基底侧收缩产生向内弯曲的力（Nicolás-Pérez 等，2016；Sidhaye & Norden，2017），而RPE细胞在形成其特有的伸展且刚性的上皮构型时，则承受强烈的侧向应变（Moreno-Mármol 等，2021）。尽管细胞经历了如此显著的形态转变，但决定这一特定几何形态并维持组织水平张力的确切力学信号转导通路仍不清楚。
为解答这些有关组织形态发生的未解问题，我们研究了发育中的RPE细胞如何主动感知、建立并维持其独特的力学特性。既往研究表明，作为主要力学信号转导效应因子的Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP），其活化在斑马鱼眼中具有高度区域特异性，且仅限于RPE细胞（Miesfeld 等，2015）。尽管yap1纯合突变体表现出相对较轻的眼部表型，但yap1及其旁系同源基因wwrt1（taz）的双突变会导致整体发育在视杯折叠发生前数小时停滞（Kimelman 等，2017；Miesfeld 等，2015）。
在本研究中，我们首先观察到，除YAP活化外，Wnt/β-catenin通路也发生了活化，该通路参与小鼠视杯中RPE细胞身份的特化（Westenskow 等
，2009），其也以时序性且短暂的方式局限于视网膜色素上皮（RPE）细胞中。此外，我们的研究结果表明，YAP和β-catenin信号通路的协同激活是维持RPE细胞力学与几何特征所必需的，因此对于视杯形态发生的顺利进行至关重要。通过结合体内定量成像、斑马鱼原代细胞培养、激光介导的力学消融和转录组分析，我们证实，这两种转录因子响应RPE组织内较高的内源性细胞内张力，在RPE细胞中被选择性激活。激活后，它们通过维持这一力学状态，建立自我维持的正反馈环路，以维持并促进RPE细胞的拉伸。抑制YAP和β-catenin信号传导的药理学及遗传学扰动实验表明，视杯折叠延迟的直接原因是RPE与神经视网膜（NR）界面处以及RPE细胞中由肌动球蛋白介导的组织张力显著降低，导致这些细胞维持在拉伸不完全的圆形几何状态。
通过比较转录组分析，我们鉴定出一套由YAP、β-catenin及肌动球蛋白细胞内收缩性的诱导共同驱动的下游汇聚性基因调控程序。这一共同的转录程序协同调控细胞的关键力学组分，包括肌动球蛋白细胞骨架、细胞间黏附和细胞与细胞外基质（ECM）间的黏附，并可能调控力敏感离子通道Piezo1。此外，我们的数据揭示，内吞机制可能参与缓冲膜张力，以适应RPE细胞拉伸过程中发生的快速膜扩张。
最后，利用嵌合
通过移植实验，我们鉴定出核骨架与细胞骨架连接复合体（LINC）可能是将肌动蛋白–肌球蛋白张力与转录因子YAP和β-catenin的核转位相耦联的物理转导器，从而激活机械响应性基因表达程序。
总体而言，我们的数据整合了张力转导器（LINC复合体）、细胞骨架锚定结构（肌动蛋白–肌球蛋白复合体和细胞黏附结构）以及核内效应因子（YAP和β-catenin），提出了一个全面且可自我维持的力学–化学模型，该模型是脊椎动物眼正常形成所必需的。
结果
YAP和β-catenin在RPE中的特异性活性对细胞伸长和视杯折叠至关重要
此前，研究者利用YAP/TEAD活化的转基因报告系统（4XGTIIC:Kaede或TEAD:Kaede），报道了YAP在发育中的斑马鱼视杯的视网膜色素上皮（RPE）中特异性活化的现象（Miesfeld & Link, 2014；Miesfeld et al, 2015；Voltes et al, 2019）（图1B）。在此，我们发现，另一种关键的机械敏感性转录因子β-catenin（Cha et al, 2016；Ray et al, 2013）也在这些RPE细胞中特异性活化。值得注意的是，β-catenin的活化模式与YAP不同，其活化具有瞬时性（图1A和1B；补充视频1、2和3）。之所以能够分辨出这种动态核转位，很可能得益于β-catenin报告品系（7xTCFsiam:mCherry或TCF:mCherry；Moro et al, 2013）的时间敏感性，使我们能够捕捉到RPE细胞群中信号的瞬时特征（补充视频1、2和3）。单细胞表达数据进一步证实了YAP和β-catenin通路的局部活化（Macho-Rendón et al, 2026）。UMAP分析显示，下游靶标和效应因子
与神经视网膜相比，Wnt（tcf12和wnt2）和YAP（ctgfa和yap1）两条通路的相关基因均在对应于视网膜色素上皮（RPE）细胞的细胞簇中显著富集，支持这些转录因子具有组织特异性作用（图1C）。
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图1.
YAP和β-catenin信号的特异性激活影响视杯折叠过程中RPE细胞的几何形态。
(A)
活体成像的延时图像，通过β-catenin报告系统7xTCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色）展示RPE细胞中Wnt/β-catenin激活的时空动态。Wnt/β-catenin仅在RPE细胞中以依次、短暂的方式激活。这些图像对应于补充视频1。时间点（t）以分钟表示。
(B)
活体成像的延时图像，通过YAP报告系统4XGTIIC:Kaede（TEAD:Kaede）（绿色）和β-catenin报告系统7xTCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色）的双报告品系，展示RPE细胞中YAP和β-catenin激活的时空动态。YAP与β-catenin的活性共定位，且局限于正在扁平化的RPE区域。这些图像对应于补充视频3。时间点（t）以分钟表示。请注意，t0对应于各视频延时成像的起始时刻，并不表示（A）和（B）中各次独立成像处于相同的发育阶段。
(C)
斑马鱼早期眼部细胞的UMAP聚类及单细胞RNA测序（scRNA-seq）表达谱（Macho-Rendón等，2026）。细胞簇分为RPE（紫色，以bhlhe40为标志）、神经视网膜（蓝色，以vsx2为标志）和增殖区域（橙色）。特征图展示了YAP通路效应因子（yap1、ctgfa）和Wnt/β-catenin通路组分局限且相互重叠的表达分布
RPE细胞簇内的（wnt2、tcf12）。
(D)
在表达Lyn-tdTomato（膜标记，红色）和h2B:GFP（细胞核标记，绿色）的胚胎中，经以下药物处理后，在视杯折叠时（受精后22小时，22 hpf）获取的代表性共聚焦图像：DMSO对照、达沙替尼（YAP抑制剂）、IWR-1（Wnt/β-catenin抑制剂）、Calyculin A（增加肌球蛋白II磷酸化和肌动蛋白-肌球蛋白收缩性）、Rockout（肌动蛋白-肌球蛋白收缩性抑制剂）和Yoda1（机械敏感性离子通道Piezo1的激动剂）。黄色标示代表性的RPE细胞几何形态。
(E)
对(D)所示不同药物处理条件下的RPE细胞圆度进行定量分析。箱线图表示细胞圆度值的分布；各数据点代表单个细胞。采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性。由于至少一组数据呈非正态分布，采用非参数Wilcoxon检验确定统计学显著性。DMSO组：n=24个细胞，来自3个胚胎；达沙替尼处理组：n=16个细胞，来自3个胚胎；IWR-1处理组：n=24个细胞，来自3个胚胎；Calyculin A处理组：n=19个细胞，来自3个胚胎；Rockout处理组：n=20个细胞，来自3个胚胎；Yoda1处理组：n=30个细胞，来自3个胚胎。比例尺：50 µm。
为探究YAP和β-catenin在RPE形态发生过程中的功能作用，我们采用了药理学扰动策略。该方法可实现精确的剂量依赖性调控和时间控制，这对于避开原肠胚形成和躯体后部延长等早期发育过程对这些通路的需求至关重要。通过优化药物浓度，我们在不影响胚胎整体存活的情况下，有效抑制了视杯折叠（补充图1）。在若干候选药物中，我们选择了达沙替尼（一种
YAP抑制剂；Sousa-Ortega等，2023）和IWR-1（Wnt/β-catenin抑制剂；Chen等，2009），因为它们在眼组织中具有较高的特异性。此外，为研究这些转录因子与机械力之间的相互作用，我们使用Rockout（肌动球蛋白收缩性抑制剂；Sidhaye & Norden，2017）、Calyculin A（可增加肌球蛋白II的磷酸化并增强肌动球蛋白收缩性；Ishihara等，1989）和Yoda1（机械敏感性离子通道Piezo1的激动剂；Syeda等，2015）调节细胞内张力。Piezo1是目前最广为人知的机械敏感性离子通道，可将物理力转化为化学信号。Yoda1是一种小分子激动剂，可导致这些机械敏感性通道过度激活，并引起异常的通道门控，使细胞无法准确感知环境信号，而非使组织的功能性张力整体升高（Botello-Smith等，2019）。值得注意的是，我们观察到，通过药理学手段抑制YAP（Dasatinib）、β-catenin（IWR-1）、Rho激酶介导的张力（Rockout）以及机械感知（Yoda1）后，视杯折叠均出现一致且显著的延迟，约为4–5小时（图1D和补充图1）。相比之下，施加相反作用，即通过Calyculin A增强细胞内张力，并未改变折叠动力学（图1D和补充图1）。同样，当张力转导能力受到药理学抑制时，这种延迟伴随着视网膜色素上皮（RPE）细胞未能伸展的现象；而增加细胞内张力时则未出现该现象（图1E）。这些结果支持以下观点：RPE细胞在较高的基础细胞内张力水平下发挥功能（Moreno-Mármol等，2021
），因此，进一步增加这一机械张力不会改变细胞几何形态或加快形态发生，而任何程度的张力降低都可能显著损害折叠过程。
为验证眼形态发生过程中YAP和β-catenin药理抑制剂的特异性，我们采用了其他遗传学策略来扰动这些信号通路。首先，我们注射了编码显性负性YAP（yapDN）的mRNA，并通过滴定确定其浓度，使其能够延缓视杯折叠进程，同时不影响胚胎的整体发育。其次，我们构建了wnt2的CRISPR敲除品系；近期对发育中斑马鱼眼进行的单细胞转录组分析表明，wnt2是视网膜色素上皮（RPE）特异性最高的Wnt配体。这些遗传学方法重现了药理抑制所引起的表型，即视杯折叠一致性延迟，同时RPE细胞保持圆形，而非扁平的几何形态（补充图2）。为评估这些变化对组织力学的功能性影响，我们通过监测YapDN和wnt2敲除胚胎RPE中Utrophin的积累，分析了肌动蛋白丝收缩性随时间的变化。Utrophin可特异性标记稳定且承受张力的F-actin，因此可用作收缩力的替代指标。在活体成像实验中，我们观察到Utrophin信号显著减弱，提示整体收缩性降低（补充视频4–7）。因此，这些胚胎的RPE细胞扁平化不完全，视杯折叠也显著延迟（补充图2）。
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图2.
体内和体外YAP与β-catenin信号转导的机械敏感性调控。
（A）
延时活体成像显示时空
通过YAP报告系统4X GTIIC:Kaede（TEAD:Kaede）（绿色），展示经DMSO处理（对照）和达沙替尼处理（YAP抑制剂）的胚胎中视网膜色素上皮（RPE）细胞内YAP激活的动态变化。即使使用低剂量达沙替尼仅轻度抑制YAP信号，YAP报告系统TEAD:Kaede在RPE中也未显示活性，验证了该药物处理的有效性。这些图像对应补充视频8和9。时间点（t）以分钟表示。比例尺：50 µm。
(B)
延时活体成像通过β-catenin报告系统7x TCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色），展示经DMSO处理（对照）和IWR1处理（β-catenin抑制剂）的胚胎中RPE细胞内Wnt/β-catenin激活的时空动态。即使使用低剂量IWR1仅轻度抑制β-catenin信号，Wnt/β-catenin报告系统TCF:mCherry在RPE中也未显示活性，验证了该药物处理的有效性。这些图像对应补充视频10和11。时间点（t）以分钟表示。请注意，t0对应各视频延时成像的起始时间，并不表示(A)和(B)中各次独立成像处于相同的发育阶段。比例尺：50 µm。
(C)
表达报告系统TEAD:Kaede（绿色）的斑马鱼囊胚细胞经解离后，在含DMSO（对照）或达沙替尼的条件下培养，其活体成像的静态图像。在细胞解离前，向部分胚胎中注射了黏着斑标记物Paxillin:mKate（红色）。在对照条件下，YAP活化的细胞集落周围分布着黏着斑；而在经达沙替尼处理的细胞中，黏着斑未能在集落周围组装，且这些细胞未激活YAP（TEAD:Kaede，绿色）。这些图像对应补充视频12–14。t=21小时20分钟为
如图所示。比例尺：30 µm。
(D)
对携带 TCF:mCherry 报告系统（红色）的斑马鱼囊胚解离细胞进行活细胞成像所得的静态图像，细胞分别在含 DMSO（对照）、Wnt/β-catenin 激活剂 Chiron 或 Wnt/β-catenin 抑制剂 IWR1 的条件下培养。正如预期，Chiron 增强了 TCF:mCherry 的激活强度，而 IWR1 则抑制其激活。这些图像对应补充视频 15–17。图中显示的时间点为 t=26小时40分钟。比例尺：30 µm。
(E)
斑马鱼囊胚解离细胞活细胞成像的静态图像。上排图像显示对照细胞与 IWR1 处理细胞中 TEAD:Kaede 的激活情况；下排图像显示单独使用 Chiron 或联合使用 Chiron 与 Dasatinib 激活后的 TCF:mCherry 活性。这表明这两条信号通路之间存在相互抑制作用。这些图像对应补充视频 18–21。上排图像显示的时间点为 t=19小时45分钟，下排图像显示的时间点为 t=16小时48分钟。比例尺：30 µm。
(F)
扰动肌动球蛋白收缩性对体内 YAP 和 β-catenin 激活的影响。表达 TEAD:Kaede（绿色，上排）或 TCF:mCherry（红色，下排）的受精后24小时（24 hpf）斑马鱼胚胎视杯的共聚焦图像，胚胎分别经 DMSO、ROCK 抑制剂 Rockout（用于降低张力）或 Calyculin A（用于过度激活肌动球蛋白收缩性）处理。降低肌动球蛋白收缩性会减弱这两条信号通路的激活，而过度激活肌动球蛋白收缩性则无影响。比例尺：50 µm。
(G)
斑马鱼囊胚解离细胞活细胞成像的静态图像：来自 TEAD:Kaede 胚胎的细胞（绿色，上排）分别经 DMSO 或 Rockout 处理，来自 TCF:mCherry 胚胎的细胞（红色，下排）分别经 Chiron 或 Chiron 与 Rockout 联合处理。在体外，降低肌动球蛋白张力同样会减弱 YAP 和 β-catenin 信号传导。这些图像对应补充视频
22–25。上排图像显示 t=19小时45分钟，下排图像显示 t=17小时20分钟。比例尺：30 µm。
(H)
对来自 TEAD:Kaede 胚胎（绿色）和 TCF:mCherry 胚胎（红色）的解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞成像所得的静态图像。这些细胞经 DMSO 或 Chiron 处理后，接种于柔软的 1% Matrigel 基质或硬度更高、浓度更大的 20% Matrigel 基质上。各图显示，对照组及 Chiron 刺激组的 TCF:mCherry 报告系统，以及对照组的 TEAD:Kaede 报告系统的激活均有所增强，提示较硬的细胞外基质（ECM）或较高的配体浓度可增强转录应答。这些图像对应补充视频 26–31。TEAD:Kaede 图像显示 t=19小时45分钟，TCF:mCherry 图像显示 t=26小时40分钟。比例尺：30 µm。
值得注意的是，尽管正常眼部形态和折叠动力学发生了显著改变，但我们从未观察到折叠过程完全停滞（补充图 1）。这与既往认识一致：除视网膜色素上皮（RPE）细胞扁平化外（Moreno-Mármol et al., 2021），还存在相互补充的机制共同驱动这一眼部折叠过程，例如神经视网膜细胞的基底侧收缩（Nicolás-Pérez et al., 2016；Shidaye et al., 2016；2017），以及边缘（RIM）内卷过程中细胞向未来视网膜区域的迁移（Heermann et al., 2015）。
体外及体内 RPE 细胞中组织张力对 β-catenin 和 YAP 活性的机械敏感性调控
为确定 β-catenin 和 YAP 的激活是否直接受组织张力控制，我们首先验证了所用药理抑制剂的有效性。对 YAP（使用 Dasatinib）和 β-catenin（使用 IWR-1）进行较温和的抑制，仅导致视杯折叠轻微延迟，但已足以阻止 YAP/TEAD 和 β-catenin/TCF 转基因报告系统的激活（图
2A和2B；补充视频8–11）。这一结果表明，即使在出现明显的视杯折叠缺陷之前，报告系统活性也对信号通路的扰动高度敏感。与此一致，我们发现，抑制这些通路本身并不影响视网膜色素上皮（RPE）细胞的命运特化。典型RPE标志物（如bhlhe40和tfec）的表达未受影响，表明分化正常进行（补充图3A和3B）。相反，这种扰动特异性地影响RPE的几何形态，提示YAP和β-catenin信号通路是形态发生在物理层面得以实现所必需的，而非组织身份建立所必需的。为进一步将信号响应与眼部形态发生过程分离，我们建立了由解离的斑马鱼囊胚细胞组成的原代培养体系。使用抑制剂达沙替尼（Dasatinib）或IWR-1处理这些解离细胞后，我们观察到报告系统活性显著降低，证实这些通路受到扰动并非整体眼部形态发生受损的结果（图2C和2D；补充视频12–17）。值得注意的是，通过paxillin:mKate表达对黏着斑（FA）进行可视化时，我们观察到YAP活化的细胞集落周围存在致密的黏着斑网络（图2C；补充视频13）；达沙替尼处理后，该网络完全消失，这与其通过扰乱黏着斑介导的信号传导来阻断YAP活化的已知作用一致（图2C；补充视频14）。对于β-catenin/TCF报告细胞，我们使用药理学激活剂Chiron，以获得更高且更可靠的活化强度（图2D；补充视频16）。
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图3.
抑制YAP和β-catenin降低了位于……处的相对组织张力
RPE-NR界面。
（A，B）
经DMSO（对照）、达沙替尼或IWR1处理的受精后23小时（23 hpf）斑马鱼myosin2:GFP报告胚胎视杯的共聚焦图像（A）及相应热图（B）。（A）中的黄色箭头和（B）中的白色箭头分别指示RPE-NR界面（A）和NR-晶状体界面（B）处的肌动蛋白-肌球蛋白索。比例尺：100 µm。
（C）
延时成像快照，显示对DMSO、达沙替尼和IWR1处理胚胎中的肌动蛋白-肌球蛋白索进行激光消融。黄色箭头指示切割位点。这些图像对应补充视频32–34。比例尺：30 µm。
（D）
距消融点的距离（µm）随时间（s）变化的定量分析，反映组织松弛。图中文字标示各处理组的初始回缩速度（µm/min，均值±标准差）。DMSO组胚胎n=4；达沙替尼处理组胚胎n=4；IWR1处理组胚胎n=7。
（E）
延时成像快照，显示对DMSO、达沙替尼和IWR1处理胚胎中的单个RPE细胞进行激光消融。黄色箭头指示切割位点。这些图像对应补充视频35–37。比例尺：30 µm。
（F）
距消融点的距离（µm）随时间（s）变化的定量分析，反映组织松弛。图中文字标示各处理组的初始回缩速度（µm/min，均值±标准差）。DMSO组胚胎n=5；达沙替尼处理组胚胎n=4；IWR1处理组胚胎n=6。
利用培养的离散囊胚细胞，我们观察到，无论使用达沙替尼（YAP抑制剂）还是IWR-1（β-连环蛋白抑制剂）处理，均会对另一条通路产生交叉抑制作用。这意味着，抑制YAP会降低β-连环蛋白报告系统的活性，而抑制β-连环蛋白同样会降低YAP的激活水平（图2E；补充视频18–21）。这种相互抑制强烈提示存在一种稳健的正向
眼发育过程中，RPE内这两条通路之间存在交叉调控环路。两条通路之间的这种相互激活与此前在其他系统中的研究报道一致，这些研究表明，YAP/TAZ是β-catenin降解复合物的组成部分（Azolin et al., 2014），而β-catenin可直接调控YAP的表达（Heallen et al., 2011；Rosenbluh et al., 2012）。
接下来，我们使用Rockout（一种收缩性抑制剂）和Calyculin A（一种收缩性增强剂），在体内调控肌动球蛋白介导的细胞内张力。与我们此前的观察结果一致，只有降低肌动球蛋白张力才能阻止YAP和β-catenin两条通路的激活（图2F）。相比之下，使用Calyculin A增强收缩性并未显著改变信号活性水平（图2F），这可能是因为在对照条件下，RPE细胞形态和视杯折叠已处于力学极限状态（图1D、1F和2F）。为将通路激活与整体形态发生过程解耦，我们开展了细胞培养实验，并用Rockout处理解离后的YAP和β-catenin信号报告细胞。我们观察到，信号激活本身对肌动球蛋白张力具有敏感性，即使独立于体内眼形态发生缺陷也是如此（图2G，补充视频22–25）。最后，为通过另一种独立策略调控细胞的力学性质，我们将Matrigel基质包被浓度提高至原来的20倍（20X）。这一较高浓度使表现出YAP和β-catenin激活的细胞集落数量和大小均显著增加（图2H；补充视频26–31）。需要注意的是，尽管这一结果提示存在机械敏感性诱导，但该效应可能源于
基底刚度、配体密度或两者共同增加（Anguiano 等，2020；Wu 等，2025）。
YAP 和 β-catenin 是维持 RPE–视网膜界面处肌动蛋白–肌球蛋白介导的组织张力所必需的
为探究 YAP 和 β-catenin 信号通路是否不仅响应组织张力的变化，还主动维持组织张力，我们评估了通路抑制后眼部依赖肌动蛋白–肌球蛋白的张力。在斑马鱼视杯中，两个不同的高张力肌动蛋白–肌球蛋白网络对折叠过程至关重要：一个位于神经视网膜（NR）的基底面，另一个位于 NR 与视网膜色素上皮（RPE）之间的顶端界面（Nicolás-Pérez 等，2016；Sidhaye & Norden，2017；Moreno-Mármol 等，2021）。
使用 Myl12.1:eGFP 报告品系（Behrndt 等，2012），我们观察到，经达沙替尼和 IWR-1 处理后，NR 基底面的肌动蛋白–肌球蛋白束基本保持完整，而 RPE–NR 界面处的顶端束则显著减弱（图 3A–B）。这凸显了 RPE 对这些通路的组织特异性需求，而这些通路仅在 RPE 中具有活性（图 1A、1B）。肌动蛋白–肌球蛋白信号强度的这种局部降低提示组织张力相应下降。
为对此进行量化，我们开展了激光消融实验，以测量 RPE 的瞬时回缩速度（Zulueta-Coarasa & Fernandez-Gonzalez，2017；Vogel & Venugopalan，2003）。我们选取了两个靶位点：RPE–NR 界面处的顶端肌动蛋白–肌球蛋白束，以及单个 RPE 细胞的胞体。在对照（DMSO 处理）动物中，我们观察到这两个位置均具有相当高的初始回缩速度（图 3D、3F；补充视频 32、35）。这证实了 RPE 在形态发生过程中维持着较高的内源性张力状态，且
肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架主动产生视杯扩张和弯曲所需的力。这种较高的基础力学水平与此前报道的视网膜色素上皮（RPE）发育过程中的拉伸和基底收缩现象一致（Moreno-Mármol 等，2021）。
抑制 YAP 和 β-catenin 后，回缩速度显著降低，提示组织的机械张力丧失（图 3D、3F；视频 33、34、36、37）。为确保观察到的 RPE 组织张力降低是机械转导受损的直接结果，而非组织生长或存活状态改变所致，我们评估了抑制 YAP 和 β-catenin 通路后 RPE 细胞的增殖和凋亡情况。我们使用磷酸化组蛋白 H3（有丝分裂标志物）和半胱天冬酶 3（凋亡标志物）抗体进行检测，证实与对照组 RPE 细胞（DMSO）相同，接受药理学干预的胚胎中 RPE 组织保持高度稳定，细胞增殖很少，细胞死亡几乎可以忽略不计（补充图 3C–3F）。此外，抑制实验中经典 RPE 标志物的维持（补充图 3A、3B），以及视杯折叠虽有延迟但仍相对完整地完成（补充图 1），表明 RPE 仍保持为具有活力的上皮细胞层，只是在产生或响应组织水平张力的力学能力方面受到特异性损害（图 2 和图 3）。我们的观察结果与既往研究一致，即这些阶段的 RPE 扩张依赖于协调的细胞拉伸，而非细胞密度的变化（Hernández-Bejarano 等，2015；Moreno-Mármol 等，2021），并支持以下观点：在 YAP 和 Wnt 受到干扰的胚胎中，RPE 回缩速度的降低与以下因素的降低有关：
肌动球蛋白产生的应力。因此，我们可以得出结论：YAP和β-连环蛋白在视网膜色素上皮（RPE）中构成一个自维持的力学环路：它们感知环境张力，随后向细胞传递信号，以维持力学稳态和视杯成功折叠所需的肌动球蛋白收缩性。
转录组分析揭示了YAP与β-连环蛋白通路共同调控RPE力学状态的基因调控程序
为鉴定YAP与β-连环蛋白力学环路下游的分子靶标，我们对经药理学抑制YAP和β-连环蛋白的胚胎进行了比较转录组分析。对经达沙替尼（YAP抑制剂）、IWR-1（β-连环蛋白抑制剂）、Rockout（肌动球蛋白收缩性抑制剂）和Yoda1（导致机械敏感性失调）处理的胚胎中的差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，结果显示，这些基因显著富集于细胞骨架动态、细胞间连接和细胞与细胞外基质（ECM）黏附相关通路（红色；图4A），以及MAPK和Wnt等共同的信号通路（黄色；图4A），还富集于钙信号通路和内吞作用等已知的机械敏感过程（蓝色；图4A）。值得注意的是，在所有抑制处理组中，内吞作用这一KEGG通路均呈现高度显著的富集（图4A）。内吞作用是一种平衡膜张力与膜表面积的机械敏感过程。抑制这些通路后，内吞相关分子机器下调，同时肌动球蛋白收缩性丧失（图3），这提示YAP和β-连环蛋白调控回路可能使RPE能够适应视杯折叠所需的表面积快速增加，同时不损害
上皮完整性。与KEGG富集分析结果一致，我们还进行了基因本体（GO）细胞组分（CC）富集分析，发现所有实验条件下，与锚定连接和黏着连接相关的条目均呈高度显著富集（补充图4A–D）。
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图4.
转录组分析显示，细胞内张力及YAP/β-catenin信号传导降低后，机械转导相关基因的表达下调。
(A)
与DMSO对照组相比，经Dasatinib、IWR1、Rockout或Yoda处理的胚胎中下调基因（log₂倍数变化≤−1.5）的KEGG通路富集图。横轴表示基因比例，圆点大小表示各通路中的基因数量，圆点颜色表示校正后的p值。关键的细胞骨架结构及黏附相关通路（红色）、机械敏感性通路（蓝色）和信号通路（黄色）以相应颜色的方框突出显示。
(B–D)
热图展示了IWR1、Dasatinib和Rockout处理组相较于DMSO对照组共同下调的代表性基因的表达水平［log₁₀(TPM+1)标度］。基因按功能注释分组：细胞骨架（B）、细胞间黏附和黏着斑（细胞–细胞外基质黏附）（C），以及内吞作用（D）。
(E–G)
火山图展示了Dasatinib与DMSO（E）、IWR1与DMSO（F）以及Rockout与DMSO（G）比较中的差异表达基因（DEGs）。纵轴表示校正后p值的负log₁₀值，横轴表示log₂倍数变化。图中标示了下调基因（绿色）、上调基因（红色）、非差异表达基因（灰色）以及特定的机械转导相关基因（蓝色）。机械转导相关基因富集的统计显著性由
超几何检验（各图右上角）。标出了关键下调基因。
为确认不同药理学抑制剂的特异性，我们进行了超几何检验，以确定不同处理后下游靶标是否在统计学上显著下调（Falcon & Gentleman, 2007）（补充图4E–G）。我们观察到，Dasatinib、IWR1和Rockout处理均使相应通路的特异性靶标显著下调。然而，尽管Yoda 1被广泛用作通过Piezo 1调控机械感知的上游调节剂，我们未能在本研究的生物学背景下验证该处理的特异性。具体表现为，Yoda1处理后，下游离子通道相关基因未出现统计学显著的差异表达。因此，Yoda 1处理被排除在后续分析之外。
为专门解析调控视网膜色素上皮（RPE）力学稳态的机制，我们聚焦于肌动球蛋白收缩性与YAP/β-catenin通路的共同靶标。转录组筛选显示，抑制YAP和β-catenin后获得的KEGG通路与通过Rockout直接干扰肌动球蛋白后获得的通路高度相似。我们对Dasatinib、IWR-1和Rockout数据集中共有的、差异最显著的差异表达基因（DEGs）进行了靶向分析（图4B–4D）。在细胞骨架相关KEGG通路中，我们发现，对肌动球蛋白收缩性和稳定性至关重要的基因发生了下调，包括肌球蛋白结合蛋白（mybphb）、肌动蛋白结合调节因子（tmod、twf2a）和微管相关蛋白（mapta、mical3a、kif1ca）。此外，Rho家族GTP酶调节因子（如rnd1b）的下调
以及 fgd4，表明维持细胞骨架张力所必需的上游信号传导发生了崩溃（图4B）。与观察到的组织完整性丧失一致，我们发现，与细胞间黏附和黏着斑相关的转录本显著减少。其中包括多种 E-钙黏蛋白亚型（cdh2、cdh15、cdh27）和接触蛋白（cntn2），以及整合素β1（itgb1）、纽蛋白（vcla、vclb）和桩蛋白（pxnb）等核心黏着斑组分（图4C）。这些结构性锚定分子的协同下调，很可能解释了通路抑制后观察到的机械回缩显著减弱以及顶端肌动球蛋白缆索的弱化（图3）。最后，我们还发现了与内吞作用介导的膜运输相关的共同下调基因，例如 Ras 同源家族成员 rhoua、成蛋白结合蛋白 fnbp1a，以及 GTP酶激活蛋白调节因子 cytohesin-2 和 agap3（图4D）。值得注意的是，在与细胞骨架、细胞黏附和内吞作用相关的 KEGG 通路中鉴定出的这一基因子集（称为机械转导基因），在通路受到抑制后主要表现为下调，而上调基因仅占极少数或完全不存在（图4E–4G）。鉴于整个数据集中下调基因的总数较多（补充图4H），我们进行了超几何检验，以确定这种富集是否具有统计学显著性（Falcon & Gentleman，2007）。对于全部三种处理（达沙替尼、IWR-1 和 Rockout），高度显著的 p 值证实，这些机械转导基因的下调是抑制剂的靶向作用，而非总体基因分布所导致的结果（图4E–4G）。
有趣的是，与下调基因群不同，所有三种处理共有的上调基因子集中，未发现任何与机械转导相关的富集 KEGG 通路（补充图 4H–J）。
通过将组织张力的物理测量与统计学上严谨的转录组分析相结合，我们证明，YAP 和 β-catenin 不仅是机械环境的感受器，也是塑造 RPE 结构所必需的转录驱动因子。通过共同调控肌动蛋白–肌球蛋白动力系统、其膜锚定组分以及弹性相关组分（内吞机制）的表达，这一机械化学环路确保 RPE 维持驱动视杯折叠所需的稳态张力和黏附强度。
LINC 复合体可能是介导 RPE 拉伸与 YAP 和 β-catenin 激活之间联系的机械转导器
最后，我们试图鉴定可能将细胞拉伸转化为 YAP 和 β-catenin 核内激活的分子转导器，尤其关注 RPE 中的这一过程。我们将研究重点放在核骨架与细胞骨架连接（Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton，LINC）复合体上。这是一种保守的蛋白质桥梁，能够将机械力从细胞质中的肌动蛋白–肌球蛋白网络直接传递至核膜，从而调控基因表达。LINC 复合体由位于外核膜上的大型含 KASH 结构域蛋白 Nesprin 组成，它们在此直接结合细胞质中的肌动蛋白丝、微管和马达蛋白。Nesprin 的 KASH 结构域与内核膜上的 SUN 蛋白相连接，后者为核纤层和染色质结合蛋白提供锚定位点（Khilan 等，2021）。我们首先利用 CRISPR 技术，分别对斑马鱼的三个 Nesprin 旁系同源基因进行敲除（KO）（syne1a、syne1b 和
syne3）。F0代的初步筛查未显示这三个Nesprin旁系同源基因的突变与鱼类胚胎的明显表型之间存在任何相关性。我们还建立了syne1b和syne3的稳定敲除（KO）品系，但同样未产生表型，这可能是由于遗传补偿或功能冗余所致，正如先前在小鼠Nesprin1/2突变体中所报道的那样（Zhang et al, 2007）。为绕过这一问题，我们转而采用表达这三个Nesprin旁系同源蛋白的显性负性（dn）形式（nesDN）的策略（Zhang et al, 2001；Elosegui-Artola et al, 2017）。在整个胚胎中表达nesDN会导致胚胎在视杯形成之前出现严重的发育停滞（补充图5A、5B）。尽管尝试了剂量滴定，我们仍未能找到一种可避免整体发育停滞的浓度。因此，我们设计了定向移植实验，以更特异性地在眼祖细胞群中抑制Nesprin的表达。我们向供体胚胎中注入三种Nesprin的显性负性（DN）形式（nesDN），并将动物极最顶部的囊胚层细胞（高度富集眼祖细胞）移植至野生型（WT）宿主胚胎中（图5A、5F和5K）。我们首先观察到，当Nesprin受到抑制的细胞分布于视网膜色素上皮（RPE）区域时（图5B—5E中带有红色细胞核标记的绿色细胞），它们无法发生形态发生所需的特征性拉伸和扁平化（图5D、5E）。关键的是，这一效应具有组织特异性；当仅在神经视网膜（NR）中抑制Nesprin功能时，眼部折叠仍正常进行（图5B）。移植表达yap显性负性形式（yapDN）的祖细胞时，我们观察到了极为相似的表型（图5G—5J中带有红色细胞核标记的细胞
），其中，RPE特异性抑制YAP阻止了细胞扁平化，并随后改变了眼部折叠（图5J）。此外，RIM区域内大量YAP受抑制的细胞似乎干扰了正常的RIM内卷（图5I）。最后，我们使用YAP和β-catenin活性报告品系，确定LINC复合物是否为这些通路在细胞核内的激活所必需。通过将nesᴰᴺ细胞移植至报告品系宿主中（在YAP/TEAD:GFP报告品系中为红色细胞，在β-catenin/TCF:mCherry报告品系中为绿色细胞），我们证实，缺乏功能性Nesprin的RPE细胞无法激活YAP或β-catenin信号通路（图5L–5O）。这些结果表明，LINC复合物是不可或缺的物理桥梁，可将RPE的高机械应变转化为RPE形态发生和转录程序的激活。
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图5.
LINC结构域的嵌合性抑制揭示了其对RPE细胞中YAP/β-catenin激活的特异性影响及必要性。
（A–E）
将供体的Nesprin显性负性（nesᴰᴺ）细胞移植至野生型（WT）宿主。
（A）
实验示意图。在受精后0小时（0 hpf）阶段，向供体胚胎注射nesᴰᴺ:GFP和h2B:mCherry mRNA，随后在球形期将推定的眼祖细胞（来自最靠近动物极的区域）移植至WT宿主胚胎。对照WT视杯（B）以及整合至WT宿主视杯中的nesᴰᴺ:GFP/h2B:mCherry供体细胞（带有红色细胞核标记的绿色细胞）（C–E）的共聚焦图像。当Nesprin受抑制的细胞仅分布于神经视网膜（NR）区域时，未观察到其对视杯折叠和细胞几何形态的影响（C）。相比之下，当Nesprin受抑制的细胞分布于RPE时，扁平的细胞
几何形态（D）和视杯折叠均受到影响（E）。黄色箭头标示几何形态发生改变的 nesprin 受抑制的视网膜色素上皮（RPE）细胞。比例尺：50 µm。
（F-J）将供体中的 YAP 显性负性（yapDN）细胞移植至 bhlhe40:GFP 报告基因野生型（WT）宿主中（Moreno-Mármol 等，2021）。（F）实验示意图。在受精后 0 小时（0 hpf）向供体胚胎注射 yapDN 和 h2B:mCherry mRNA，随后在球形期将推定的眼祖细胞（取自最靠近动物极的区域）移植至 WT bhlhe40:GFP 报告基因宿主胚胎中。对照 bhlhe40:GFP 报告基因 WT 视杯（RPE 区域为绿色）（G），以及整合至 WT bhlhe40:GFP 报告基因宿主视杯中的 yapDN/h2B:mCherry 供体细胞（红色细胞）（H-J）的共聚焦图像。当 YAP 受抑制的细胞仅分布于神经视网膜（NR）区域时，未观察到其对视杯折叠和细胞几何形态产生影响（H）。相比之下，当 nesprin 受抑制的细胞分布于 RPE 中时，细胞会在视杯边缘（RIM）区域积聚（I），且视杯折叠受到影响（J）。黄色箭头标示几何形态发生改变的 YAP 受抑制的 RPE 细胞。比例尺：50 µm。
（K-O）nesDN 供体细胞克隆对 YAP 和 β-catenin 信号传导的影响。（K）实验示意图。在受精后 0 小时向供体胚胎注射 nesDN:mCherry 或 nesDN:GFP mRNA，随后在球形期将推定的眼祖细胞（取自最靠近动物极的区域）移植至 WT TEAD:Kaede（L、M）或 TCF:mCherry（N、O）报告基因宿主胚胎中。对照 WT TEAD:Kaede（绿色）（L）和 TCF:mCherry（红色）（N）报告基因视杯的共聚焦图像。（M）移植至 TEAD:Kaede 报告基因宿主（绿色）中的 nesDN:mCherry 供体细胞（红色）。nesprin 受抑制的细胞克隆未能激活 YAP 通路。（O）nesDN:GFP 供体细胞
（绿色）移植至TCF:mCherry报告宿主（红色）中。nesprin受抑制的细胞克隆未能激活β-catenin通路。黄色箭头指示nesprin受抑制的细胞克隆。比例尺：50 µm。
讨论
YAP和β-catenin信号在RPE细胞中特异性激活，可能与其扁平的几何形态及LINC复合体有关
我们的结果表明，YAP和β-catenin通路在RPE细胞层内特异性激活，但在神经视网膜（NR）等相邻眼部细胞群中并未激活。支持这一结论的证据包括：YAP和β-catenin报告系统的激活仅限于RPE（图1A、1B），以及与NR相比，RPE细胞簇中β-catenin和YAP信号的下游靶标及效应分子均呈富集（图1C）。除组织身份不同外，RPE和NR还表现出不同的力学和形态发生特征：RPE的刚度显著更高（Buono et al, 2021；Moreno-Mármol et al, 2021），并呈现明显拉长、扁平的几何形态，与NR细胞的立方形态形成对比（Sidhaye & Norden, 2017）。
值得注意的是，我们的研究结果将RPE细胞独特的刚度、细胞内张力及几何形态与YAP和β-catenin信号级联的特异性激活联系起来。我们获得了以下几项关键观察结果，支持这些信号通路与细胞张力之间的联系：（i）使用Rockout通过药理学手段降低肌动球蛋白收缩性时，两条通路的激活均受到阻断（图2F）；（ii）抑制这些通路会显著削弱RPE–NR顶端界面处特有的高张力肌动球蛋白缆索，而NR–晶状体基底侧缆索仍保持完整（图3A、3B）；以及（iii）当信号传导与眼部整体
在利用原代斑马鱼囊胚细胞培养开展的发育研究中，通路激活本身仍对细胞内张力敏感（图2G），并且可能也对基底刚度敏感（图2H）。
最后，为支持通路激活与细胞几何形态之间存在直接联系，我们探究了LINC复合体的参与作用。对表达显性负性形式Nesprins（nesDN）的细胞进行嵌合移植后发现，RPE细胞对LINC介导的机械信号转导具有特异性的敏感性。表达nesDN的RPE细胞未能发生特征性的伸展，而表达nesDN的NR细胞则维持其典型的立方形态，且未妨碍视杯形态发生（图5B–E）。关键的是，这些移植的LINC功能缺失RPE细胞也未能激活YAP或β-catenin信号报告系统。
这些观察结果强烈提示，RPE细胞伸展产生的物理应变通过LINC复合体传递，从而触发这些转录因子的核转位和激活。从机制上看，这种组织特异性与驱动眼形态发生的不同物理力相吻合：NR主要通过局部基底收缩驱动折叠（产生推力和弯曲力），而RPE则经历大幅度的侧向伸展（产生牵引力）。LINC复合体尤其适于感知这种侧向应变，因为细胞扁平化会使细胞核发生物理形变，改变核孔的力学特性，从而促使转录因子进入细胞核（Elosegui-Artola等，2017；Thorpe和Lee，2017；Koushki等，2023）。
总之，我们关于LINC复合体特异性参与伸长RPE细胞中YAP和β-catenin激活的结果，有助于完善这一闭环，其中，
LINC复合体感知基底侧组织的高张力，促进转录因子YAP和β-catenin在细胞核内的激活。二者在细胞核内驱动黏附相关基因和肌动球蛋白相关基因的表达，以维持细胞刚性及视网膜色素上皮（RPE）与神经视网膜（NR）界面处的肌动球蛋白束；这对于维持和促进RPE细胞伸展、进而推动眼部折叠至关重要。
YAP与β-catenin的相互串扰驱动视杯折叠所需的稳态张力
本研究的一项突出发现是，在RPE形态发生过程中，尽管YAP与β-catenin通路具有不同的激活相关上游和下游分子通路，但二者在功能上高度趋同，且在转录调控层面存在显著重叠。我们观察到二者的激活存在若干差异，例如，β-catenin呈现短暂的波状激活（图1A），这可能由局部的wnt2表达驱动（补充图2），而YAP则呈现持续激活模式（图1B），这可能与黏着斑的组装相耦联（图2C）。然而，通过遗传或药理学手段干扰任一通路，都会导致非常相似的形态发生缺陷，即RPE-NR界面处顶端肌动球蛋白束减少，以及RPE细胞扁平化受损（图1D）。同样，抑制任一通路都会导致共同调控相似机械转导基因程序的基因显著下调（图4）。这可能由二者之间的相互正反馈环路解释，我们的细胞培养实验也支持这一点：抑制其中一条通路似乎会使另一条通路的激活消失（图2E）。因此，尽管二者各具特异性，但它们并非作为冗余的信号级联发挥作用，
YAP与β-catenin似乎在一个自我维持的协同调控回路中发挥作用。
在这一回路中，LINC复合体介导的核孔物理牵拉可能启动这两种因子的核转位，随后二者协同维持彼此的活性状态。这种相互稳定作用确保了协调一致且得到放大的转录响应，从而调控黏附和细胞骨架组分，以在视杯折叠过程中维持视网膜色素上皮（RPE）较高的组织水平张力。与此一致，已有研究表明，在细胞皮质张力较低或缺乏Wnt激活配体的条件下，YAP/TAZ是β-catenin降解复合体的组成部分。相反，当张力增加时，β-catenin降解复合体解体，两种转录因子（YAP和β-catenin）均得以共同进入细胞核（Azzolin等，2014）。此外，研究表明，β-catenin可直接结合yap1的启动子，促进其表达（Rosenbluh等，2012）；具有活性的核内YAP/TEAD复合体则可结合wnt配体和frizzled受体基因的增强子及启动子，提高细胞对Wnt信号的敏感性（Park等，2015；Gregorieff等，2015）。最后，已有研究表明，LINC复合体将肌动球蛋白张力传递至细胞核，使YAP得以通过核孔进入细胞核（Elosegui-Artola等，2017）。
YAP与β-catenin的力学基因调控程序维持RPE形态发生和视杯折叠
我们在药理学抑制后进行的转录组分析支持这样一种持续性转录程序的存在：该程序由YAP和β-catenin通路激活，主动维持RPE细胞内较高的基础张力，而这些通路在其中……
特异性活跃。我们的差异基因表达分析、KEGG通路分析和GO富集分析显示，经Dasatinib（YAP抑制剂）、IWR-1（β-catenin抑制剂）和Rockout（肌动球蛋白收缩性抑制剂）处理的胚胎所产生的RNA-seq数据集之间具有高度一致性。抑制YAP和β-catenin后产生的下游转录谱与直接破坏细胞内张力所产生的效应高度相似，这一发现提示，这些通路可能作为整合回路的核心组成部分发挥作用，充当构建和维持RPE细胞力学装置所必需的转录驱动因子。对共有差异表达基因（DEGs）的详细分析表明，产生和维持组织水平张力所必需的结构网络受到干扰。在细胞骨架相关的KEGG通路中，我们发现，抑制YAP、β-catenin和细胞内张力均导致对肌动球蛋白收缩性、结构稳定性及其调控至关重要的因子显著下调。其中包括肌球蛋白结合蛋白（如mybphb）、肌动蛋白结合调节因子（如tmod和twf2a）、微管相关组分（如mapta、mical3a和kif1ca），以及作为上游信号调控因子、其下调可驱动肌动球蛋白网络功能失效的Rho家族GTP酶调节因子（如rnd1b和fgd4）。重要的是，这一受YAP和β-catenin信号调控的转录程序，可能解释了抑制这些信号通路后观察到的RPE细胞“软化”，以及RPE-NR界面处肌动球蛋白束机械回缩速度的显著降低（图3）。
这种转录调控不仅涉及细胞内肌动球蛋白网络，还延伸至在细胞间传递力的物理锚定结构
边界及细胞与细胞外基质（ECM）之间的连接。我们还观察到，编码细胞间黏附和黏着斑（细胞–ECM黏附）组分的转录本减少。这包括多种E-钙黏蛋白（如cdh2、cdh15和cdh27）、接触蛋白（cntn2），以及黏着斑的其他核心组分，如整合素（如itgb1）、纽蛋白（如vcla和vclb）和桩蛋白（如pxnb）。采用超几何检验的统计分析证实，机械转导相关基因的这种系统性下调具有特异性，而在共同上调的基因集中几乎不存在与力学或结构相关的基因。我们推测，缺乏这些分子锚定组分，视网膜色素上皮（RPE）将失去在整个上皮细胞层中分配和平衡物理力的能力。因此，YAP和β-catenin的自维持程序充当转录层面的主调控因子，确保细胞的肌动蛋白–肌球蛋白驱动系统及其黏附结构受到协同调控，从而稳健地引导RPE组织特性和视杯形态发生。还需注意的是，在抑制YAP和β-catenin通路后，绝大多数基因均发生下调（达沙替尼处理组为90%，IWR1处理组为80%），这可能表明，这些信号通路是RPE细胞结构性力学驱动系统的正向转录激活因子，而非RPE和/或眼发育的一般调节因子。与此一致，我们未在上调基因集中发现任何特定通路的富集（补充图4I），也未发现“眼发育”或“眼形态发生”等一般性KEGG条目的富集，这进一步支持了以下观点：YAP和β-catenin通路通过维持RPE细胞的力学驱动系统来特异性响应高张力状态，而非调控一般的细胞身份
程序。
最后，我们的转录组分析还揭示了这一协调性力学环路中一个有趣且尚未得到充分探索的方面，即在所有处理条件下（抑制YAP和β-catenin、干预Piezo相关机械敏感性以及降低肌动球蛋白收缩性），内吞机制相关组分的表达均极显著下调（图4D）。尽管内吞作用传统上被视为一种细胞内物质运输机制，但它也是平衡细胞膜张力与表面积所必需的机械敏感性过程。视网膜色素上皮（RPE）细胞由圆形转变为高度伸展且扁平的形态，同时承受强烈的侧向应变，表面积也显著增大。抑制YAP和β-catenin后内吞相关基因表达下调，提示这些通路可能通过提高内吞速率发挥力学缓冲系统的作用，使细胞膜能够适应RPE所经历的剧烈几何形态变化，同时不损害其结构完整性和上皮完整性。
YAP和β-catenin作为力学变阻器维持RPE细胞的收缩性
我们的研究结果表明，在发育中的RPE内，YAP和β-catenin作为转录共激活因子，参与构成一个高度动态的力学变阻器。在眼形态发生过程中，复杂的组织重塑和细胞运动使整个上皮层承受不断波动的力学应变。RPE内的YAP和β-catenin活性并非仅充当简单的开关式分子开关，而是持续监测并调节肌动球蛋白皮质张力和细胞黏附。这种敏感性使细胞既能适应来自周围组织的外源性作用力，也能适应RPE自身内部产生的内源性作用力。
通过维持这一持续的力学-生化反馈环路（Hannezo & Heisenberg, 2019；De Santis et al., 2025），组织确保视网膜色素上皮（RPE）细胞达到并维持精确的伸长、扁平化几何形态，从而以物理方式驱动视杯内陷。
多方面证据支持这一基于YAP/β-catenin持续力学反馈环路的力学变阻器模型，并界定了其基础运行条件和动态范围。首先，对照胚胎中顶端肌动球蛋白缆索及单个RPE细胞胞体的激光消融实验显示，其初始回缩速度相当高（图3C—3F）。这一间接反映力学状态的测量结果证实，该组织处于较强的内源性张力之下。这种较高的基础力学张力界定了该变阻器特定的“工作范围”，表明该系统已适应在高力水平下运行。通过Calyculin A处理增强肌动球蛋白收缩性，并未使细胞几何形态或折叠动力学发生进一步变化，这体现了该变阻器的上限或“最大容量”设定，提示该系统通常在其力学峰值状态下运行（图1D和图2F）。其次，我们的数据表明，该变阻器具有宽广的动态作用范围，这意味着YAP和β-catenin信号并非静态固定，而是能够响应广泛的物理输入。这些通路应能够感知RPE细胞的皮质张力，从而恰在细胞发生显著伸长时被激活。此外，YAP/β-catenin变阻器既能响应Rockout处理引起的皮质张力降低（图2F），也能响应细胞外基质表面浓度的变化（图2H）。第三，通过发挥一种
作为调节组织物理性质的变阻器，这些通路发挥着形态发生速度调节器的作用。当我们通过药理学或遗传学手段干扰这种精细调控时，发育速率便会发生改变，从而解释了视杯折叠动力学中持续观察到的延迟。关键在于，由于存在相互补充的形态发生程序，这种干扰只会延缓而不会完全阻断该过程（图 S1），这证明该变阻器特异性地决定了力学效率。最后，我们发现 YAP 与 β-catenin 通过相互反馈环路连接，充当分子缓冲器，防止信号传导中的随机波动在眼形成过程中引发结构缺陷，从而稳定整个变阻器系统（图 2E）。总之，力学变阻器这一概念（Weng 等，2016；Vining & Mooney，2017）从概念上阐明了 YAP 和 β-catenin 如何感知发育中视网膜色素上皮（RPE）细胞的高张力状态，将物理应变转化为持续的转录程序，主动维持并精细调节塑造视杯的形态发生力。
材料与方法
斑马鱼饲养与 mRNA 显微注射
使用转基因品系 Tg(b-actin:myo:GFP) 的胚胎对肌动蛋白–肌球蛋白网络进行可视化。为标记细胞膜并识别视网膜色素上皮（RPE）细胞，在单细胞期向胚胎显微注射 1 nL 浓度为 50 ng/µL 的 Lyn-dTomato mRNA。注射后，将胚胎置于添加了 0.0001% 亚甲蓝的 E3 培养液中，于 28.5°C 孵育，以防止真菌生长。
斑马鱼野生型品系及转基因品系 Tg(4XGTIIC:Kaede)（由 UPF 的 Pujades 实验室惠赠）、Tg(7xTCFsiam:mCherry)（由 UNIPD 的 Moro 实验室惠赠）、Tg(E1-
bhlhe40:GFP)（由 CBMSO 的 Bovolenta 实验室惠赠）和 Tg(b-actin:myl12.1:eGFP)（由 ISTA 的 Heisenberg 实验室惠赠）在标准饲养条件下饲养。所有动物实验均遵循机构伦理指南，并经巴勃罗·德奥拉维德大学动物实验伦理委员会批准，许可编号为 02/04/2018/041。
胚胎显微注射在单细胞期进行，使用 M400 Narishige 显微注射器，注射体积通过校准装置进行校准。将斑马鱼 nes1aDN:GFP、nes1bDN:GFP 和 nes3DN:GFP 的 mRNA 共同注射（nesDN:GFP）（补充图 5 中，每种 nesprin 旁系同源基因的 mRNA 注射量为 100–150 pg）。将斑马鱼 nes1aDN:mCherry、nes1bDN:mCherry 和 nes3DN:mCherry 的 mRNA 共同注射（nesDN:mCherry）（补充图 5 中，每种 nesprin 旁系同源基因的 mRNA 注射量为 100–150 pg）。补充图 2 中，yapDN mRNA 的注射量为每枚胚胎 100–150 pg。对于图 5 中的移植实验，将 nes1aDN:GFP、nes1bDN:GFP、nes3DN:GFP、nes1aDN:mCherry、nes1bDN:mCherry、nes3DN:mCherry 和 yapDN 的 mRNA 以每枚胚胎 300 pg 的剂量注射至供体胚胎中。H2b:mCherry、H2b:GFP、utrophin:GFP（Nicolás-Pérez 等，2016）、paxillin:mKate（Sidhaye & Norden，2017）和 Lyn-dTomato 的 mRNA 注射量为每枚胚胎 50 pg。注射后，将胚胎置于添加了 0.0001% 亚甲蓝以防止真菌生长的 E3 培养液中，于 28.5°C 孵育（需要减缓发育速度时，将胚胎置于 25°C 培养）。
为合成 mRNA，使用 NotI 将 DNA 质粒线性化，随后使用 mMESSAGE mMACHINE SP6 试剂盒（AM1340，Thermo Fisher Scientific）进行转录，合成加帽 mRNA。将注射后的胚胎包埋固定以进行活体成像，
将斑马鱼囊胚细胞解离用于细胞培养，或在适当的发育阶段将其与相应对照一同用4%甲醛（FA）固定。
斑马鱼nesprins和yap的显性负性（DN）构建体参照Zhang等（2007）的方法设计。
去卵膜与药理学处理
受精后8小时（hpf），将胚胎置于含30 ng/µL链霉蛋白酶的E3培养液中处理10分钟，以酶法去除卵膜。充分洗涤以去除链霉蛋白酶后，将胚胎分装至培养皿中（每皿50枚），并使用指定的药理学抑制剂进行处理：IWR-1（25 µM）、达沙替尼（100 µM）、Rockout（150 µM）、花萼海绵诱癌素A（Calyculin A，0.5 µM）和Yoda 1（10 µM）。在图2A和2B中，我们使用较低浓度的IWR-1（10 µM）和达沙替尼（50 µM），以获得较温和的抑制效果。
明场成像
将胚胎包埋于1%低熔点琼脂糖中以优化其位置，并覆盖添加DMSO或不同药理学处理药物的E3培养液。胚胎始终保持包埋状态，每小时采集一次延时图像。观察到的明显尾部伸长缺陷是成像过程中持续处于包埋介质中所造成的物理影响。通过计数体节数，确认对照组（DMSO）与处理组胚胎的发育阶段同步。使用尼康SMZ18体视显微镜采集图像。
斑马鱼囊胚细胞原代培养
收集胚胎并于28°C孵育，直至高囊胚期。去除胚胎卵膜后，将其置于经琼脂糖包被、含林格氏液（NaCl 5 M、KCl 1 M、HEPES 1 M、CaCl₂ 1 M）的培养皿中。为分离囊胚细胞，通过手工显微解剖机械破坏并去除每枚胚胎的卵黄细胞。化学去卵黄处理会损害细胞
质量，并需保持最佳细胞活力以用于培养。随后，将分离的胚盘收集于无菌1× PBS中，经40 µm滤网（Pluriselect）过滤，并轻柔解离为单细胞悬液。
48孔板预先用Matrigel基质胶处理，以促进细胞黏附（标准条件下使用以1× PBS配制的1% v/v溶液；仅图2H所示实验使用20% v/v溶液）。包被液于室温孵育1 h，并在细胞接种前移除。将解离的细胞以180 × g离心3 min收集，随后弃去上清液。将细胞沉淀重悬于1 mL原代细胞培养基中，该培养基由L-15培养基添加50 mM HEPES（pH 7.4）、5% KnockOut血清替代物（KSR）及0.5%青霉素/链霉素（P/S）组成。使用Neubauer血细胞计数板进行细胞计数，每孔接种约30,000个细胞。在细胞接种前，向培养基中加入相应的药物：Chiron（10 µM）、IWR-1（25 µM）、达沙替尼（75 µM）和Rockout（50/100 µM）。随后，将培养板转移至Zeiss Celldiscoverer 7自动成像系统进行活细胞监测，该系统配备环境控制舱，可将温度维持在28.5°C，CO₂浓度维持在5%。所有细胞培养操作及组织解离均在Ⅱ级生物安全柜内的无菌条件下进行。
整胚免疫染色及鬼笔环肽染色
在受精后22–23 h（hpf）收集胚胎，此时野生型（WT）或DMSO处理的对照胚胎的视杯已折叠至少2 h。使用链霉蛋白酶去除胚胎卵膜，并在4%甲醛（FA）中固定24 h。抗Caspase-3和抗磷酸化组蛋白H3免疫染色按照Sousa-Ortega等（2023）所述方法进行。简言之，将胚胎在含0.5% Tx/Tw的1× PBS中洗涤
于室温下处理2 h，随后用−20 °C预冷的丙酮处理20 min，并在新鲜配制的封闭液（含10%正常山羊血清〔NGS〕的1× PBS，含0.5% Tx/Tw）中孵育。将一抗抗活化型caspase-3抗体（BD Biosciences，559565）和抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体（Millipore，06-570）用封闭液按1:500稀释，胚胎于4 °C孵育过夜。胚胎用含0.5% Tx/Tw的1× PBS洗涤6 h，再次在新鲜配制的封闭液中孵育，最后与Alexa Fluor™ 555标记的山羊抗兔抗体于4 °C避光孵育过夜。胚胎用含0.5% Tx/Tw的1× PBS洗涤，并于4 °C用DAPI（Merck）复染过夜，其中DAPI（Sigma）用含0.5% Tx/Tw的1× PBS按1:1000稀释。
进行鬼笔环肽染色时，将同一发育阶段的固定胚胎置于含0.1% Tw的1× PBS中孵育，该溶液含1%（v/v）DMSO、按1:200稀释的鬼笔环肽488（Merck）及按1:1000稀释的DAPI（Merck）。
整体原位杂交
以受精后24 h（24 hpf）斑马鱼的cDNA为模板，扩增tfec和wnt2基因的编码序列片段。所用引物如下：
tfec正向引物，5’ TATAAAGACCGGACGGGGACAAC 3’
tfec反向引物，5’ TCCAGCTACGAATCCAGGAGCTG 3’
wnt2正向引物，5’ ATGAACTTTTTGCCAAATGGAA 3’
wnt2反向引物，5’ ACACCTGCAAAACCCAGTCCTGA 3’
将PCR产物克隆至pSCA Strataclone质粒（Agilent）中。根据插入片段的方向，使用地高辛-11-UTP核苷酸（ThermoFisher）以及T3或T7聚合酶（ThermoFisher）合成探针。所生成探针的使用终浓度为3 ng/μl。胚胎于受精后23–24 h阶段用4%甲醛（FA）固定，经甲醇脱水后保存于−20 °C。原位杂交（ISH）和荧光原位杂交（FISH）按照既往方案（Sousa-Ortega等，2023）进行。
共聚焦成像与处理
用于成像的固定或活体胚胎
将其包埋于1%低熔点琼脂糖中，并置于35 mm FluoroDish培养皿中。使用Zeiss LSM880显微镜进行共聚焦激光扫描显微成像。使用ImageJ2软件（版本2.14.0/1.54f）处理图像。进行活体成像时，将活胚固定，每隔8–12 min采集一次图像。为定量分析细胞圆度，我们从该区域的同一中央部位选取RPE细胞，避开RIM区域。使用“徒手选择”（Freehand selection）工具勾画细胞膜轮廓，并使用“测量”（Measure）工具获取细胞的几何参数。为定量分析增殖细胞，使用“多点”（Multi-point）和“测量”（Measure）工具选择细胞并进行计数。
激光消融与转盘共聚焦显微成像
将胚胎置于35 mm玻底FluoroDish培养皿中，使其面朝下，以便发育中的眼睛紧邻盖玻片。待琼脂糖凝固2 min后，向培养皿中加入含相应药物的E3培养液，使其浸没样品。使用Roper Scientific-Photometrics转盘共聚焦显微镜进行图像采集和激光消融。首先使用10×物镜定位胚胎，再使用40×水浸物镜进行高分辨率成像和靶向消融。分别使用491 nm和561 nm激光激发GFP和RFP荧光。
使用355 nm脉冲紫外光消融激光对RPE进行靶向消融。将消融靶区定义为一条宽度为1像素（对应0.33 µm）的水平线，该线垂直于肌动蛋白–肌球蛋白缆索，或沿RPE细胞边界绘制。在80%激光功率下施加5次激光脉冲进行消融，数字增益和曝光设置保持在
约为100（根据胚胎深度和荧光团亮度略作调整）。延时成像在单一焦平面进行。在消融前6秒及消融后150秒内连续采集图像，实际采集帧率为每0.729秒1帧。
回缩速度定量分析
使用PyJAMAS软件套件（Fernandez-Gonzalez等，2022）对初始回缩速度进行定量分析。根据Roper Scientific-Photometrics显微镜的具体设置，将分析参数校准如下：时间分辨率（t_res）= 0.729 s，消融时间 = 0.729 s，空间分辨率（xy_res）= 0.33 µm，零时刻索引 = 13。
CRISPR-KO突变体的构建
使用CRISPRScan软件（Moreno-Mateos等，2015）设计sgRNA。选择位于约200 bp区域两侧、评分最高的4条sgRNA。随后通过PCR扩增该区域及其侧翼序列，以便后续评估sgRNA的效率。
使用M400 Narishige显微注射仪对单细胞期胚胎进行显微注射，并使用校准装置校准注射体积。Cas9 mRNA的终浓度为150 pg，每条sgRNA mRNA的终浓度为4 µM。注射后24 h，从10枚胚胎中提取基因组DNA，并对侧翼区域的PCR产物进行测序，以验证靶向缺失。我们确认第二外显子中存在16 bp的缺失，该缺失引入了一个提前终止密码子。为建立稳定的CRISPR/KO品系，将F0代创始鱼与野生型（WT）鱼进行外交，并对所得F1代后代进行测序，以鉴定缺失携带者。通过剪鳍取样及对F1代进行基因分型，鉴定出杂合突变体。我们从……中分离出纯合突变体
后续的 F2 代，以维持稳定的纯合品系。
RNA测序
RNA提取、文库制备与测序
解剖各处理组的胚胎头部，转移至 1.5 mL 无 RNase 的 Eppendorf 离心管中，每个处理的每个重复合并 10 个头部。样本立即置于液氮中速冻。
按照制造商说明，使用 QIAGEN 的 RNeasy Mini Kit（货号：74104）提取 RNA。提取的 RNA 用 15 μL 无核酸酶水洗脱后，送至 Novogene 进行文库制备和测序。通过 poly(A) 富集和逆转录构建 cDNA 文库，随后进行严格的质量控制评估。使用 Illumina NovaSeq X 平台进行 150 bp 双端测序，每个样本获得约 12 Gb 的原始数据。
生物信息学分析
对测序读段进行预处理，修剪序列起始端和末端的低质量（质量值低于 20）碱基。滤除平均质量值低于 20 的碱基（-r --cut_right_window_size 3 --cut_right_mean_quality 20 -M 30 -W 1 -q 30 -e 30 -l 20 -w 20）。随后，使用 Kallisto v0.50.1 将处理后的读段比对至最新版斑马鱼基因组（danRer11）。后续分析使用 Rstudio v.4.4.0 进行。剔除平均读段数少于 10 的基因（rowSums(counts(ddsTxi) >= 10)）。使用 R 包 DESeq2 进行差异基因表达分析（padj <0.05；logFC = ±1.5；
）。使用 clusterProfiler v.4.12.6 进行 GO 条目分析。使用 pheatmap v.1.0.13 绘制热图。主成分分析图、火山图、热图和箱线图使用 R 包 ggplot2 v.4.0.2 绘制。
数据可用性
RNA测序数据集可在 Annotare 中获取
EMBL-EBI 存储库中的以下登录地址：
https://urldefense.com/v3/__http://helpdesk.ebi.ac.uk/Ticket/Display.ht…$
补充图
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补充图1。
信号传导和细胞张力扰动后眼杯折叠的动力学延迟。
明场延时图像显示了受精后19至24小时（hpf）斑马鱼胚胎的整体发育情况（右列）及相应眼杯的放大图像（左列）。将胚胎包埋于1%低熔点琼脂糖中，每小时成像一次。胚胎分别接受达沙替尼（YAP抑制剂）、IWR1（Wnt/β-catenin抑制剂）、Yoda1（Piezo1激动剂）、Rockout（ROCK及肌动球蛋白抑制剂）或花萼海绵诱癌素A（肌动球蛋白过度激活剂）处理。对照组（DMSO）和花萼海绵诱癌素处理组胚胎的视泡在受精后19小时开始折叠，而达沙替尼、IWR1、Yoda1和Rockout处理均导致眼杯折叠的起始时间延迟约5小时。比例尺：200 μm。
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补充图2。
采用其他方法抑制YAP和Wnt/β-catenin，进一步证实了二者在调控视网膜色素上皮（RPE）细胞几何形态及确保眼杯适时折叠中的作用。
(A)
明场延时图像显示了受精后19至24小时（hpf）斑马鱼胚胎的整体发育情况（右列）及相应眼杯的放大图像（左列）。将胚胎包埋于1%低熔点琼脂糖中，每小时成像一次。与野生型（WT）同胞胚胎相比，注射显性负性形式YAP（yap DN）的胚胎均表现出约3小时的眼杯折叠延迟。比例尺：150 μm。
(B)
明场延时成像
展示受精后19至24小时（19–24 hpf）斑马鱼胚胎整体发育情况的图像（右列）及相应视杯的放大图像（左列）。将胚胎包埋于1%低熔点琼脂糖中，每小时成像一次。wnt2敲除（wnt2 KO）胚胎的视杯折叠均出现约5小时的延迟。比例尺：150 µm。
(C)
整体原位杂交显示，wnt2的表达局限于视网膜色素上皮（RPE）。比例尺：150 µm。
(C’)
眼部区域的共聚焦图像显示，wnt2荧光原位杂交信号（绿色）经DAPI（蓝色）复染，证实wnt2的表达局限于RPE区域。比例尺：50 µm。
(D)
受精后24小时阶段WNT和yap显性负性（yap DN）胚胎视杯的共聚焦图像，经鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）染色。红色标示具有代表性的RPE细胞几何形态。比例尺：50 µm。
(E)
野生型（WT）和yap DN胚胎中RPE细胞圆度的定量分析。箱线图表示细胞圆度值的分布；各数据点代表单个细胞。采用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性。由于所有组均呈正态分布，因此采用参数t检验确定统计学显著性。WT组：n=31个细胞，来自6枚胚胎；yap DN组：n=48个细胞，来自8枚胚胎。
(F)
受精后24小时阶段WNT和wnt2 KO胚胎视杯的共聚焦图像，经鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）染色。红色标示具有代表性的RPE细胞几何形态。比例尺：50 µm。
(G)
WT和wnt2 KO胚胎中RPE细胞圆度的定量分析。箱线图表示细胞圆度值的分布；各数据点代表单个细胞。采用Shapiro–Wilk检验评估数据的正态性。由于所有组均呈正态分布，因此统计学显著性
采用参数 t 检验进行判定。n=44 个 WT 细胞，来自 6 个胚胎；n=45 个 yapDN 细胞，来自 6 个胚胎。
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补充图 3.
抑制 YAP 和 Wnt/β-catenin 不影响视杯中早期 RPE 的身份特化、增殖和细胞存活。
(A)
活体延时成像快照显示，在经 DMSO（对照）、IWR1（β-catenin 抑制剂）和达沙替尼（YAP 抑制剂）处理的胚胎中，通过报告品系 bhlhe40:GFP（Moreno-Mármol 等，2021）（绿色）监测到早期视网膜色素上皮（RPE）特化标志物 Bhlhe40 的激活。时间点（t）以分钟表示。注意，t0 对应于各段影片开始延时成像的时刻，三种处理条件下均为受精后 20 小时（20 hpf）。
(B)
整体原位杂交显示，经 DMSO（对照）、IWR1 和达沙替尼处理的胚胎在受精后 23 小时（23 hpf）时另一种早期 RPE 特化标志物 tfec（蓝色）的表达。尽管抑制 YAP 和 Wnt/β-catenin 后视杯的形态发生性折叠出现改变，RPE 特化标志物仍处于活跃表达状态。
(C–E)
IWR1 和达沙替尼处理后视杯中有丝分裂细胞的分析。
(C)
不同处理条件下，受精后 24 小时（24 hpf）阶段代表性视杯的共聚焦光学切片，采用有丝分裂标志物磷酸化组蛋白 H3（pHistone3，绿色）染色，并以 DAPI（蓝色）复染。
(D)
RPE 区域内 pH3⁺ 细胞数量的定量分析。对照组与处理组之间未观察到统计学显著差异。箱线图表示每个胚胎 RPE 中 pH3⁺ 细胞数量的分布；各数据点代表单个胚胎。采用 Shapiro–Wilk 检验评估数据的正态性。由于至少有一组呈非正态分布，
采用非参数 Wilcoxon 检验确定统计学显著性。n=7，野生型（WT）胚胎；n=6，达沙替尼处理胚胎；n=11，IWR1 处理胚胎。
(E)
神经视网膜（NR）区域内 pH3+ 细胞数量的定量分析。对照组与处理组之间未观察到统计学显著差异。箱线图显示每个胚胎每个 NR 区域内 pH3+ 细胞数量的分布；各数据点代表单个胚胎。采用 Shapiro-Wilk 检验评估数据的正态性。由于至少一组数据呈非正态分布，因此采用非参数 Wilcoxon 检验确定统计学显著性。n=7，野生型（WT）胚胎；n=6，达沙替尼处理胚胎；n=11，IWR1 处理胚胎。
(F)
不同处理条件下受精后 24 小时（24 hpf）代表性视杯的共聚焦图像，采用凋亡标志物活化型 Caspase-3（Caspase3，绿色）染色，并以 DAPI（蓝色）复染。除非特异性背景信号外，对照组和处理组胚胎的视网膜色素上皮（RPE）或神经视网膜（NR）中均未检测到明显的细胞死亡。比例尺：50 µm。
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补充图 4.
细胞内张力及 YAP/β-catenin 信号传导降低后共同上调和下调基因的细胞组分富集、靶向通路谱分析及聚类分析。
(A-D)
与 DMSO 对照组相比，达沙替尼、IWR1、Rockout 或 Yoda 处理胚胎中下调基因（Log₂ FoldChange ≤ −1.5）的细胞组分（CC）GO 条目富集点图。横轴表示基因比例，点的大小表示各通路中的基因数量，点的颜色表示校正后的 p 值。“锚定连接”和“黏着连接”等结构相关条目在各处理条件下均显著富集，并以彩色方框突出显示。
（E–G）火山图展示达沙替尼（Dasatinib）与DMSO（E）、IWR1与DMSO（F）以及Rockout与DMSO（G）比较中的差异表达基因（DEGs）。纵轴表示校正后p值的负以10为底的对数，横轴表示以2为底的表达倍数变化对数（log₂ FoldChange）。图中显示了下调基因（绿色）、上调基因（红色）、非差异表达基因（灰色）以及特定通路相关基因（蓝色）。通路特异性基因富集的统计学显著性通过超几何检验确定（各图右上角）。图中标注了关键的通路特异性下调基因。
（H）DMSO、达沙替尼、IWR1和Rockout各重复样本中排名前2500的差异表达基因的表达热图［log₁₀(TPM+1)标度］。层次聚类将基因划分为不同的表达模式，主要包括第1簇（与DMSO相比，在达沙替尼、IWR1和Rockout处理组中上调的基因）和第3簇（与DMSO相比，在达沙替尼、IWR1和Rockout处理组中下调的基因）。
（I、J）第1簇基因（上调的差异表达基因，log₂ FoldChange ≤ +1.5）和第3簇基因（下调的差异表达基因，log₂ FoldChange ≤ −1.5）的KEGG通路富集图。仅在第3簇基因中可见与黏附、细胞骨架和收缩性相关的机械敏感性KEGG通路显著富集，这些通路以彩色方框突出显示（CAM＝细胞黏附分子）。
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补充图5.
广泛抑制LINC结构域会阻滞胚胎整体发育，而非特异性地延缓视杯折叠。
（A）受精后24小时（24 hpf）阶段具有代表性的野生型（WT）和nesᴰᴺ视杯的共聚焦图像，采用鬼笔环肽（绿色）和DAPI（蓝色）染色。全胚视图（右侧图）和眼部区域的高倍放大图（左侧图；
由红框标示）。红色轮廓勾勒出具有代表性的视网膜色素上皮（RPE）形态。比例尺：50 µm。
(B)
明场延时图像展示了斑马鱼胚胎从受精后19至24小时（hpf）的整体发育情况（右列）及相应视杯的放大图（左列）。将胚胎包埋于1%低熔点琼脂糖中，每隔2–3小时成像一次。nes DN胚胎中视杯折叠起始的延迟伴随着胚胎整体发育停滞。比例尺：150 µm。
补充视频
补充视频1。
通过β-catenin报告系统7xTCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色）对RPE细胞中Wnt/β-catenin信号的激活进行活体延时成像。本视频对应图1A。时间间隔为每帧10分钟。
补充视频2。
通过β-catenin报告系统7xTCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色）对Wnt/β-catenin信号的激活进行活体延时成像，并通过报告品系bhlhe40:GFP（绿色）对早期RPE命运特化标志物Bhlhe40的激活进行活体延时成像。β-catenin活性与Bhlhe40表达在逐渐扁平化的RPE细胞中特异性共定位。时间间隔为每帧10分钟。
补充视频3。
通过包含YAP报告系统4XGTIIC:Kaede（TEAD:Kaede）（绿色）和β-catenin报告系统7xTCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色）的双报告品系，对RPE细胞中YAP和β-catenin的激活进行活体延时成像。YAP与β-catenin活性共定位，且局限于逐渐扁平化的RPE区域。本视频对应图1B。时间间隔为每帧10分钟。
补充视频4。
对注射了Utrophin:GFP（肌动蛋白丝收缩性标志物；绿色）和Lyn-dTomato（细胞膜标志物；红色）mRNA的野生型（WT）胚胎的视杯进行活体延时成像。该WT胚胎是
作为后续视频5的同胞对照。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频5。
对注射了Utrophin:GFP（肌动蛋白丝收缩性标记物；绿色）和Lyn-dTomato（细胞膜标记物；红色）mRNA的YapDN胚胎的视杯进行活体延时成像。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频6。
对注射了Utrophin:GFP（肌动蛋白丝收缩性标记物；绿色）和Lyn-dTomato（细胞膜标记物；红色）mRNA的野生型（WT）胚胎的视杯进行活体延时成像。该WT胚胎为后续视频7的同胞对照。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频7。
对注射了Utrophin:GFP（肌动蛋白丝收缩性标记物；绿色）和Lyn-dTomato（细胞膜标记物；红色）mRNA的wnt2敲除（KO）胚胎的视杯进行活体延时成像。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频8。
通过YAP报告系统4X GTIIC:Kaede（TEAD:Kaede）（绿色），对经DMSO处理（对照）的胚胎中YAP的激活情况进行活体延时成像。本视频对应图2A。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频9。
通过YAP报告系统4X GTIIC:Kaede（TEAD:Kaede）（绿色），对经达沙替尼（YAP抑制剂）处理的胚胎中YAP的激活情况进行活体延时成像。即使使用低剂量达沙替尼仅轻度抑制YAP信号传导，YAP报告系统TEAD:Kaede在视网膜色素上皮（RPE）中也未显示活性，验证了该药物处理的有效性。本视频对应图2A。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频10。
通过β-catenin报告系统7x TCFsiam:mCherry（TCF:mCherry）（红色），对经DMSO处理（对照）的胚胎中Wnt/β-catenin的激活情况进行活体延时成像。本视频对应图
2B。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频11。
通过β-catenin报告系统7x TCFsiam:mCherry（TCF:mCherry，红色），对经IWR1（β-catenin抑制剂）处理的胚胎中Wnt/β-catenin信号的激活情况进行活体延时成像。即使使用低剂量IWR1仅轻度抑制β-catenin信号，Wnt/β-catenin报告系统TCF:mCherry在视网膜色素上皮（RPE）中也未显示活性，验证了该药物处理的有效性。本视频对应图2B。每帧时间间隔为10分钟。
补充视频12。
对来自TEAD:Kaede报告系统胚胎的离散斑马鱼囊胚细胞（绿色）进行活细胞延时成像，细胞在含DMSO的培养基中培养（对照）。本视频对应图2C。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频13。
对来自注射了黏着斑标记物Paxillin:mKate（红色）的TEAD:Kaede报告系统胚胎的离散斑马鱼囊胚细胞（绿色）进行活细胞延时成像，细胞在含DMSO的培养基中培养（对照）。Yap活跃的细胞集落周围分布着黏着斑。本视频对应图2C。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频14。
对来自注射了黏着斑标记物Paxillin:mKate（红色）的TEAD:Kaede报告系统胚胎的离散斑马鱼囊胚细胞（绿色）进行活细胞延时成像，细胞在含达沙替尼（YAP抑制剂）的培养基中培养。黏着斑未能在细胞集落周围组装，且这些细胞集落未激活YAP（TEAD:Kaede，绿色）。本视频对应图2C。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频15。
对来自TCF:mCherry报告系统胚胎的离散斑马鱼囊胚细胞（红色）进行活细胞延时成像，细胞在含DMSO的培养基中培养（对照）。本视频对应图2D。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频16。
活体
对来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎、在含Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）的培养基中培养的解离斑马鱼囊胚细胞进行延时成像。Chiron增强了TCF:mCherry的激活强度。本视频对应图2D。帧间时间间隔为8分钟。
补充视频17。
对来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎、在含IWR1（Wnt/β-catenin抑制剂）的培养基中培养的解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞延时成像。IWR1抑制TCF:mCherry的激活。本视频对应图2D。帧间时间间隔为8分钟。
补充视频18。
对来源于TEAD:Kaede（绿色）报告胚胎、在含DMSO（对照）的培养基中培养的解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞延时成像。本视频对应图2E。帧间时间间隔为8分钟。
补充视频19。
对来源于TEAD:Kaede（绿色）报告胚胎、在含IWR1（Wnt/β-catenin抑制剂）的培养基中培养的解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞延时成像。IWR1也抑制TEAD:Kaede的激活。本视频对应图2E。帧间时间间隔为8分钟。
补充视频20。
对来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎、在含Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）的培养基中培养的解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞延时成像。本视频对应图2E。帧间时间间隔为8分钟。
补充视频21。
对来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎、在含Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）和达沙替尼（YAP抑制剂）的培养基中培养的解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞延时成像。与Chiron联合使用时，达沙替尼同样抑制TEAD:Kaede的激活。本视频对应图2E。帧间时间间隔为8分钟。
补充视频22。
对解离斑马鱼囊胚细胞进行活细胞延时成像
来源于TEAD:Kaede（绿色）报告胚胎，在含DMSO（对照）的条件下培养。本视频对应于图2G。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频23。
来源于TEAD:Kaede（绿色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞在含Rockout（细胞内张力抑制剂）的条件下培养的活细胞延时成像。Rockout抑制TEAD:Kaede的激活。本视频对应于图2G。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频24。
来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞在含Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）的条件下培养的活细胞延时成像。本视频对应于图2G。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频25。
来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞在含Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）和Rockout（细胞内张力抑制剂）的条件下培养的活细胞延时成像。与Chiron联合使用时，Rockout同样抑制TCF:mCherry的激活。本视频对应于图2G。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频26。
来源于TEAD:Kaede（绿色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞在1% Matrigel基质中、含DMSO（对照）的条件下培养的活细胞延时成像。本视频对应于图2H。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频27。
来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞在1% Matrigel基质中、含DMSO（对照）的条件下培养的活细胞延时成像。本视频对应于图2H。每帧时间间隔为8分钟。
补充视频28。
来源于TCF:mCherry（红色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞在1% Matrigel中、含Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）的条件下培养的活细胞延时成像
基质。该视频对应于图2H。时间间隔为每帧8分钟。
补充视频29。
在含有DMSO（对照）的20% Matrigel基质中培养的、来自TEAD:Kaede（绿色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞的活细胞延时成像。基质中较高的Matrigel浓度（更硬的细胞外基质和更高的配体浓度）增强了TEAD:Kaede报告系统的激活。该视频对应于图2H。时间间隔为每帧8分钟。
补充视频30。
在含有DMSO（对照）的20% Matrigel基质中培养的、来自TCF:mCherry（红色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞的活细胞延时成像。该视频对应于图2H。时间间隔为每帧8分钟。
补充视频31。
在含有Chiron（Wnt/β-catenin激活剂）的20% Matrigel基质中培养的、来自TCF:mCherry（红色）报告胚胎的解离斑马鱼囊胚细胞的活细胞延时成像。基质中较高的Matrigel浓度（更硬的细胞外基质和更高的配体浓度）增强了TCF:mCherry报告系统的激活。该视频对应于图2H。时间间隔为每帧8分钟。
补充视频32。
对经DMSO（对照）处理的myosin2:GFP（绿色）报告胚胎的视网膜色素上皮（RPE）与神经视网膜（NR）界面处的肌动蛋白-肌球蛋白缆索进行激光消融的活体延时成像。该视频对应于图3C。时间间隔为每帧30秒。
补充视频33。
对经达沙替尼（YAP抑制剂）处理的myosin2:GFP（绿色）报告胚胎的视网膜色素上皮（RPE）与神经视网膜（NR）界面处的肌动蛋白-肌球蛋白缆索进行激光消融的活体延时成像。该视频对应于图3C。时间间隔为每帧30秒。
补充视频34。
激光的活体延时成像
经IWR1（Wnt/β-catenin抑制剂）处理的myosin2:GFP（绿色）报告胚胎中，RPE-NR界面处肌动球蛋白缆索的消融。本视频对应图3C。时间间隔为每帧30秒。
补充视频35。
对注射了Lyn-dTomato（细胞膜标记物；红色）并经DMSO（对照）处理的myosin2:GFP（绿色）报告胚胎中单个RPE细胞进行激光消融的活体延时成像。本视频对应图3E。时间间隔为每帧30秒。
补充视频36。
对注射了Lyn-dTomato（细胞膜标记物；红色）并经达沙替尼（YAP抑制剂）处理的myosin2:GFP（绿色）报告胚胎中单个RPE细胞进行激光消融的活体延时成像。本视频对应图3E。时间间隔为每帧30秒。
补充视频37。
对注射了Lyn-dTomato（细胞膜标记物；红色）并经IWR1（Wnt/β-catenin抑制剂）处理的myosin2:GFP（绿色）报告胚胎中单个RPE细胞进行激光消融的活体延时成像。本视频对应图3E。时间间隔为每帧30秒。
已声明的资助方信息
国际人类前沿科学计划组织，https://ror.org/02ebx7v45，RGEC31/2024
西班牙国家研究局，PID2020-113647GA-I00
西班牙国家研究局，PID2023-151084NB-I00
脚注
https://urldefense.com/v3/__http://helpdesk.ebi.ac.uk/Ticket/Display.ht…$
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关键词：视杯形态发生 · 视网膜色素上皮 · 细胞力学 · Wnt/β-catenin信号通路 · YAP信号通路 · 机械敏感性基因表达
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