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黑色素瘤是转移性最强且具有多药耐药性的癌症之一，也是皮肤癌死亡的首要原因。这种复杂疾病需要鉴定参与其进展、侵袭和转移的其他协同事件，以进一步强化治疗策略。Rho GTPases在癌症发生发展和转移中发挥关键作用。Rho效应蛋白Rhophilin-2（RHPN2）在多种人类癌症中发生扩增，而其在黑色素瘤中的作用尚未得到研究。在本研究中，我们将人黑色素瘤细胞中的敲低实验与斑马鱼中的基因敲除和过表达实验相结合，以揭示RHPN2在黑色素瘤发生发展中的作用。我们发现，在人黑色素瘤细胞中，RHPN2促进细胞生长，并增强细胞的克隆形成、迁移和侵袭特性。利用NRAS^Q61L和BRAF^V600E斑马鱼模型，我们首次在体内证实了Rhpn2促进黑色素瘤起始和发展的作用。对Rhpn2缺失肿瘤进行组织学分析显示，侵袭性肿瘤与基质交界处的细胞密度降低，并且缺失初级纤毛结构。Rhpn2敲除黑色素瘤的转录组分析显示，IFN1应答基因的表达增加，同时脂质代谢和纤毛功能相关基因受到调控。综上，这些发现表明RHPN2是黑色素瘤的重要调节因子，并为将其作为抑制肿瘤发展的治疗靶点提供了新的视角。
Pirson.Isabelle{at}ulb.be
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摘要
黑色素瘤是转移性最强且多药耐药性最高的癌症之一，也是皮肤癌相关死亡的首要原因。这种复杂疾病需要鉴定促进其进展、侵袭和转移的其他协同事件，以进一步强化治疗手段。Rho GTPases 在癌症发生发展和转移中发挥关键作用。Rho 效应蛋白 Rhophilin-2（RHPN2）在多种人类癌症中发生扩增，但其在黑色素瘤中的作用尚未得到探究。在本研究中，我们将人黑色素瘤细胞中的基因敲低实验，与斑马鱼中的基因敲除和过表达实验相结合，以揭示 RHPN2 在黑色素瘤发生发展中的作用。我们发现，在人黑色素瘤细胞中，RHPN2 促进细胞生长，并增强细胞的克隆形成、迁移和侵袭特性。利用 NRAS^Q61L 和 BRAF^V600E 斑马鱼模型，我们首次提供了 Rhpn2 促进黑色素瘤起始和发展的体内证据。对 Rhpn2 缺失肿瘤进行组织学分析显示，肿瘤细胞密度降低，并且在侵袭性肿瘤/基质交界处缺乏初级纤毛结构。对 Rhpn2 敲除黑色素瘤进行转录组分析发现，IFN1 应答基因的表达增加，同时参与脂质代谢和纤毛功能的基因受到调控。综上，这些发现表明 RHPN2 是黑色素瘤的调节因子，并为将其作为抑制肿瘤发展的治疗靶点提供了新的视角。
引言
皮肤黑色素瘤具有很高的转移潜能和耐药性，是皮肤癌相关死亡的首要原因（Tasdogan 等，2025）。黑色素细胞中依赖于环境背景的遗传突变可激活促进生长的】【。
MAPK通路（BRAF、NRAS）的激活或肿瘤抑制机制（P53或PTEN）的减弱，是黑色素瘤发生的驱动因素（Centeno et al., 2023）。在过去十年中，随着靶向BRAF和MEK的治疗手段以及免疫检查点抑制剂的发展，黑色素瘤的治疗取得了显著进展。然而，由于细胞可塑性以及高度动态的肿瘤微环境（TME），大多数患者最终会对治疗产生耐药性。黑色素瘤的发生是一个复杂且具有异质性的过程，还需要其他协同事件共同促进疾病进展、侵袭和转移，而这些事件可能成为新的治疗靶点（Wouters et al., 2020）。
作为细胞骨架动态、囊泡运输以及细胞周期进程调控的主要调节因子（Etienne-Manneville and Hall, 2002），RHO GTP酶在癌症发生、上皮-间质转化（EMT）和细胞侵袭中发挥关键作用（Clayton and Ridley, 2020；Crosas-Molist et al., 2022；Lee et al., 2025）。RHOA/C信号促进基于膜泡的变形虫样迁移，使细胞能够挤入预先存在的空间，并在不需要显著进行细胞周围蛋白水解的情况下使细胞外基质（ECM）发生变形（Wyckoff et al., 2006）。RHOB特异性调控黑色素瘤细胞的膜泡形成，以及其在三维胶原中的变形虫样迁移（Gong et al., 2018）。目前对RHOA/B/C GTP酶研究最为深入的效应因子——ROCK、DIAPH1和PKN/PRK——也均被发现参与黑色素瘤细胞的迁移和侵袭（Arang et al., 2023；Carreira et al., 2006；Kümper et al., 2016）。我们及其他研究者鉴定出Rhophilin-2（RHPN2）是RHOB的效应因子，同时也是RHOA的相互作用蛋白（Mircescu et al., 2002；Peck et al., 2002）。
RHPN2是一种高度保守的支架蛋白，在小鼠和人类分泌性娱乐代理
上皮（Behrends et al., 2005；Mircescu et al., 2002）。该蛋白由不同的蛋白质相互作用结构域（HR-1、Bro1 和 PDZ）组成，最初被证实参与调控肌动蛋白细胞骨架和囊泡运输（Peck et al., 2002；Steuve et al., 2006）。此前已有研究构建了基因敲除小鼠，结果显示其未出现肉眼可见的异常或组织学异常，但研究者并未进一步分析其在病理状态下的表现（Behrends et al., 2005）。近年来，利用不同的人源细胞系，越来越多的证据表明，RHPN2 可能在癌细胞的生长和侵袭过程中发挥维持作用。RHPN2 通过激活 RhoA 维持胶质母细胞瘤上皮-间质转化（EMT）相关基因的表达（Danussi et al., 2013）。在肺癌和卵巢癌细胞系中分别稳定敲低或过表达 RHPN2，可使细胞系的生长能力以及小鼠异种移植实验中的肿瘤体积相应降低或增加（Xiao et al., 2020；Yu et al., 2020；Zhang et al., 2025）。近期有研究提出，rhpn2 基因中的一个内含子变异可能是与癌症相关的生殖系风险因素（Kellman et al., 2025）；此外，在一项计算机模拟研究中，RHPN2 被提出可能是维持黑色素瘤细胞存活所必需的候选基因，但尚未经过生物学验证（Pyatnitskiy et al., 2015）。然而，RHPN2 对体内肿瘤发生发展的影响，尤其是其在黑色素瘤中的作用，仍未得到研究。
在本研究中，我们表明，在人黑色素瘤细胞中敲低 RHPN2 可显著降低细胞的生长能力和存活率。随后，我们利用斑马鱼开展体内实验。斑马鱼现已成为研究癌症起始、进展及药物发现的成熟模型（Letrado et al., 2018），尤其广泛应用于黑色素瘤研究（Wojciechowska et al., 2016）。利用组成型活化的 NRAS 和 BRAF 黑色素瘤计划群
我们首次在体内揭示，RHPN2促进黑色素瘤的发生和进展；RHPN2缺失会降低肿瘤-基质界面的微管乙酰化水平，导致部分纤毛基因表达减少，并引起黑色素瘤细胞中干扰素（IFN）反应基因和脂质代谢相关基因表达及调控的变化。综上所述，我们的研究数据表明，RHPN2是一种能够调控这一高度侵袭性癌症的新型调节因子。
结果
RHPN2是人黑色素瘤细胞增殖和侵袭所必需的
为探究RHPN2是否能够影响黑色素瘤细胞的行为，我们首先通过蛋白质印迹法检测了不同黑色素瘤细胞系中的RHPN2表达水平，包括A375细胞（来源于原发性肿瘤）以及A2058、SKMEL2和SKMEL28细胞（来源于转移部位）。我们观察到，A2058和A375细胞中RHPN2的表达水平较高（图1A）。随后，我们以这些细胞系为对象，通过慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）靶向RHPN2表达水平进行敲低实验。在3个稳定表达RHPN2-shRNA的不同克隆中，通过免疫印迹法证实了RHPN2蛋白表达的降低（图1B）。随后，我们通过在不同时间点进行MTT检测，评估RHPN2沉默对细胞生长的影响。结果显示，与对照细胞相比，在所有检测克隆中，RHPN2敲低（KD）均导致72小时和96小时后的细胞活力显著下降（图1C）。此外，克隆形成实验也表明，在A375和A2058细胞中，下调RHPN2均会减少克隆的数量和大小（图1D）。值得注意的是，在上述两项实验中观察到的下降幅度均与相应克隆中RHPN2的敲低程度成正比。这种生长能力的下降与两种细胞中pERK水平的显著降低相关。
在RHPN2敲低（KD）的细胞系中（图1E），但未观察到pAkt的调节变化。此外，通过Transwell实验，我们发现，与对照细胞相比，RHPN2-KD细胞的运动性和侵袭性均受到抑制（图1F）。这些数据表明，与其他癌症中的情况类似，RHPN2在体外支持人黑色素瘤细胞的生长和侵袭。
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图1．
在人黑色素瘤细胞中敲低Rhpn2可降低其克隆形成能力、存活能力和侵袭能力。
A-
通过Western blot检测黑色素瘤细胞中的RHPN2表达（N=3；A375与A2058相比，**p < 0.0001；SKMEL28与A2058相比，*p = 0.0002；单因素方差分析）。
B-
通过Western blot检测稳定shRNA-RHPN2克隆（C）与shRNA对照组（Ctrl）相比的RHPN2表达下调情况。图中数据表示经GAPDH标准化后的RHPN2水平。（N=4；A375 C1与Ctrl相比，**p < 0.0001，非配对t检验；A2058 C1与Ctrl相比，p < 0.0001；C2与Ctrl相比，*p = 0.0006；单因素方差分析）。
C-
在WST-8存在条件下进行4天的细胞存活率检测（N=2；A375，C1与Ctrl相比，p = 0.0036（72 h，p = 0.0044；96 h，*p = 0.0004）；A2058，p = 0.0013（72 h，C1，*p = 0.039；96 h，****p < 0.0001；C2在72 h和96 h时均为p < 0.0001）；双因素方差分析交互作用）。
D-
克隆培养两周后检测其克隆形成倾向（N=3；A375 C1与Ctrl相比，*p = 0.0005，非配对t检验；A2058，C1与Ctrl相比，p < 0.0001；C2与Ctrl相比，*p = 0.0005；单因素方差分析）。
E-
通过Western blot检测Erk和pErk水平（N=3；Erk/GAPDH：A375 C1与Ctrl相比，****p < 0.0001；A2058 C1与Ctrl相比，*p < 0.01；pErk/Erk：A375 C1与Ctrl相比，*p = 0.0288；A2058 C1与Ctrl相比，**p = 0.0054；非配对t检验）。
F-
通过Transwell实验检测克隆细胞22 h内的迁移和侵袭特性（N=3；迁移：A375 C1与Ctrl相比，*p = 0.04；A2058 C1与Ctrl相比，**p = 0.0073；非配对t检验；侵袭：
A375 C1 与 Ctrl 比较，*p = 0.0237；A2058 C1 与 Ctrl 比较，*p = 0.0223，非配对 T 检验）。数据表示为均值 ± 标准差。
斑马鱼中 Rhpn2 的缺失损害 NRAS Q61L 驱动的黑色素瘤发展
为深入了解 Rhpn2 在体内肿瘤发展中的生物学作用，我们采用了斑马鱼模型系统。斑马鱼是研究肿瘤发展的成熟模型，借助强大的遗传学模型，以及人类与斑马鱼之间癌症相关通路的高度保守性，可以将从鱼类中获得的研究结果外推至人类（Hason and Bartůněk，2019）。在斑马鱼中，rhpn2 基因具有唯一性，并且在人类与斑马鱼之间无论在序列还是共线性方面均高度保守（图 S1A）。首先，我们利用 CRISPR/Cas9 介导的诱变技术构建了组成型 Rhpn2 敲除（KO）斑马鱼模型。针对第 1 外显子设计了两个单向导 RNA，并在 F1 代中获得了两个突变等位基因，分别通过 Sanger 测序进行了验证（图 S1B）。这两个突变分别导致 rhpn2 基因起始密码子缺失（rhpn2^SL4/SL4）和提前终止密码子的产生（rhpn2^Δ2/Δ2）（图 S1B；图 2A）。
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图 2.
在体内，Rhpn2 促进斑马鱼中依赖 NRAS 和 BRAF 的黑色素瘤发展。
A-
rhpn2 起始密码子（粗体）区域的基因组序列，其中 sgRNA 靶向的 PAM 序列以加下划线标示。rhpn2 突变等位基因分别含有 4 个碱基对缺失（起始密码子缺失，SL4）和 2 个碱基对缺失（移码，并在下游 25 个氨基酸处产生提前终止密码子，Δ2）。
B-
使用 ZF-Rhpn2 特异性抗体，对来自所示基因型斑马鱼幼体（6 dpf）的 35 µg 总蛋白提取物进行免疫印迹分析。未检测到 75 kDa 的 Rhpn2 蛋白。
C-
实验流程示意图。向单细胞胚胎中注射 MCR-NRAS 载体可促使肿瘤发展。鱼
携带肿瘤的鱼分别于第3、5和9周分离，并于受精后12周（wpf）进行基因分型。
D-
在受精后3周（3 wpf）已发生肿瘤的鱼与无肿瘤同窝鱼相比，各基因型所占比例与预期显著不同（N=3）。卡方分析：w2-3（n = 112，+/+ vs SL4/SL4，*p = 0.021），w4-5（n = 72，+/+ vs SL4/SL4，ns，p = 0,3），w6-9（n = 20，+/+ vs SL4/SL4，ns，p = 0,52）。
E-
SL4/SL4鱼的肿瘤发生率低于+/+鱼。
F-
SL4/SL4鱼（橙色）发生黑色素瘤的比例低于+/+鱼（黑色），且通过共注射MCR-Rhpn2可挽救这一表型（蓝色）。（N = 6；60 dpf时，WT（n=99），73.12%；Rhpn2-KO（n=145），43.1%；****p<0,0001，Log-rank（Mantel-Cox）检验）。
G-
比较SL4/SL4（n = 10）与+/+（n = 11）斑马鱼的肿瘤面积测量结果。统计分析：SL4/SL4 vs +/+，**p = 0,0062；T检验。
H-
实验流程。向单细胞胚胎注射MCR-eGFP或MCR-Rhpn2/eGFP载体，可在Tg（mitfa:BRAF V600E）；p53-/-鱼中挽救黑素细胞并促进肿瘤发生。持续观察肿瘤出现情况直至受精后6个月（mpf）。
I-
Rhpn2-OE鱼（蓝色）发生黑色素瘤的比例高于eGFP-OE鱼（黑色）。统计分析：****p<0,0001，Log-rank（Mantel-Cox）检验。（N=4）
J-
Rhpn2-OE鱼中黑色素性肿瘤所占比例更高。（N=3；*p = 0,01；T检验）。
成年杂合子后代符合预期的孟德尔遗传比例（图S1C）；纯合突变体具有存活能力和生育能力，且未见明显的生长或发育缺陷（图S1E-G）。对两个敲除品系受精后6天（dpf）幼鱼的总蛋白提取物进行免疫印迹分析，确认了蛋白缺失（图2B）。该实验使用针对斑马鱼Rhpn2设计的抗体进行，该抗体此前已通过蛋白质印迹检测验证。
重组蛋白免疫印迹（图 S1G）。以下实验均使用 rhpn2^SL4/SL4 突变体进行。
为确定 Rhpn2 是否可能影响黑色素瘤在体内的生长，我们首先采用了 MiniCoopR 系统（Iyengar et al., 2012），该系统可在数周内诱导鱼体产生黑色素瘤。MiniCoopR-NRAS^Q61L 载体（MCR-NRAS）通过在黑色素细胞缺失的 mitfa^-/-（nacre）背景下，在 mitfa 自身启动子的调控下重新表达 mitfa，从而实现黑色素细胞的嵌合性挽救。与此同时共表达癌基因 NRAS^Q61L，可在受精后最初几周内形成肿瘤。我们将 MCR-NRAS 载体显微注射至由 rhpn2^SL4/+ nacre 鱼相互交配获得的单细胞期胚胎中（图 2C）。
每周监测肿瘤生长情况，并在受精后 3、5 和 7 周（wpf）分离出出现结节性肿瘤的鱼。受精后 12 周，通过基因分型，我们观察到，在早期时间点（第 2～3 周）已形成肿瘤的群体中，WT 鱼的比例显著低于 rhpn2^SL4/SL4 鱼（图 2D）。在无肿瘤的同胞鱼中未观察到这种失衡。我们还注意到，与 rhpn2^+/+ 同胞鱼相比，rhpn2^SL4/SL4 鱼的肿瘤结节数量较少。然而，当将鱼的基因分型时间提前至受精后 6 周而非 12 周时，我们未观察到出现结节性肿瘤的存活 WT 鱼比例显著下降（图 S2A）。相反，我们观察到该比例有所升高，尽管这一差异未达到显著性。在受精后 9 周，存活且发生挽救但未形成肿瘤的鱼中，Rhpn2-KO 基因型富集，进一步证实与 rhpn2^+/+ 同胞鱼相比，rhpn2^SL4/SL4 鱼的肿瘤发生频率较低。这一点也得到了肿瘤数量的进一步证实。
每条鱼在受精后6周（图S2B）。这些结果提示，与Rhpn2-KO鱼相比，WT鱼形成了侵袭性更强的肿瘤，从而导致更高的死亡率。
为验证这一假设并进一步分析肿瘤的早期发生过程，我们随后将MCR-NRAS显微注射至分别由rhpn2^SL4/SL4^相互杂交以及rhpn2^+/+^同胞鱼相互杂交获得的胚胎中。首先，我们确认了两种基因型胚胎在受精后1天的存活率不存在差异（图S2C），并且在受精后7天表现出黑色素细胞恢复的鱼的数量在Rhpn2-KO鱼与WT鱼之间也无差异（图S2D）。注射后，我们每日监测肿瘤的出现情况，并利用Kaplan-Meier曲线对两种基因型进行定量分析（图2F）。我们观察到，Rhpn2缺失显著影响了发生肿瘤的鱼的数量（受精后60天，WT：73.12%；Rhpn2-KO：43.1%）。与rhpn2^+/+^同胞鱼相比，受精后6周的rhpn2^SL4/SL4^鱼中，经鱼体面积标准化后的肿瘤大小也显著减小（图2G）。在这些实验中，整个机体均缺失Rhpn2，因此难以明确Rhpn2影响的是黑色素细胞本身还是其微环境。为解决这一问题，我们通过将一个在mitfa启动子控制下表达Rhpn2的MCR载体（MCR-Rhpn2）与MCR-NRAS共同注射至rhpn2^SL4/SL4^胚胎中，实现了黑色素细胞特异性的Rhpn2表达恢复。在这种条件下，无肿瘤生存曲线显示该表型发生逆转（图2F，蓝色曲线；恢复组：65%），提示至少在一定程度上，肿瘤发生早期Rhpn2的表达具有黑色素细胞内在性作用。这些结果证实，Rhpn2^+/+^鱼中的肿瘤发展速度更快；在Rhpn2^+/-^鱼相互杂交的实验中也观察到了这一现象，即出现肿瘤的WT鱼发生死亡】【。
早于 KO（图 2D）。
黑色素细胞特异性过表达 Rhpn2 促进 BRAFV600E 依赖性黑色素瘤的发生
为评估观察到的 Rhpn2 作用是否延伸至黑色素瘤发生的另一种遗传背景，我们采用 Tg(mitfa:BRAFV600E); p53-/- 模型（下文简称 BRAF），利用 MCR-rhpn2-T2a-eGFP（MCR-Rhpn2）载体在黑色素细胞中过表达 Rhpn2（Rhpn2-OE），并以 MCR-eGFP 作为对照（图 2H）。我们每周监测 Rhpn2 表达鱼与 MCR-eGFP 注射对照鱼中肿瘤的发生情况（图 2I）。结果证实，Rhpn2 表达对肿瘤发生具有持续促进作用（22 wpf 时，WT（n=121）为 30.3%；Rhpn2-OE（n=50）为 72%；p<0.0001；N=4）。在 Rhpn2-OE 鱼中观察到的黑色素性肿瘤比例也高于 MCR-eGFP 个体（图 2J）。在该模型中敲除 Rhpn2 后，Tg(mitfa:BRAFV600E); p53-/-; rhpn2-/- 鱼的肿瘤发生同样受到抑制；与 rhpn2+/+ 鱼相比，rhpn2-/- 鱼中的肿瘤发生率为 15%（9/59），而 rhpn2+/+ 鱼为 23%（4/17）（数据未显示）。
rhpn2SL4/SL4 NRASQ61L 驱动的黑色素瘤中细胞密度降低且肿瘤边界处缺乏乙酰化微管蛋白结构
随后，我们对 6 wpf、携带 NRASQ61L 驱动肿瘤的 rhpn2SL4/SL4 和 rhpn2+/+ 鱼进行了组织学分析，分析材料为厚度 6 µm 的切片，并采用苏木精-伊红染色。在 rhpn2SL4/SL4 肿瘤中，与 WT 肿瘤相比，我们观察到细胞密度显著降低，这是肿瘤侵袭性增强的一个特征（图 3A-B）。这一趋势在 4 wpf 鱼的肿瘤中已经出现，尽管尚未达到统计学显著性（图 3B）。肿瘤侵袭性增强通常与肿瘤边界处更高的机械力相关（Linke 等，2024），并且细胞骨架】【。
由 RHO GTP 酶介导的重组。值得注意的是，在斑马鱼黑色素瘤中，斑马鱼黑色素瘤细胞与基质交界处纤毛的重新出现被鉴定为肿瘤边界的特征（Hunter et al., 2021）。此外，近期研究显示，Rhpn2 参与斑马鱼内耳立体纤毛的发生与功能（Dai et al., 2026），提示其可能参与环境感知。因此，我们以乙酰化微管蛋白作为纤毛标志物，通过免疫荧光分析检测肿瘤中纤毛结构的存在。结果显示，与 WT 相比，rhpn2^SL4/SL4 肿瘤在肿瘤–基质界面处完全缺失乙酰化微管蛋白信号。
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图 3。
A
6 wpf 时 WT 和 SL4/SL4 肿瘤的苏木精/伊红染色。比例尺：25 µm。
B
肿瘤细胞密度的定量分析（每个肿瘤取 15 个视野）（4 wpf 时，ns，p = 0.333；6 wpf 时，WT（n = 5）和 KO（n = 6）鱼，*p = 0.013）（Welch 检验）。
C
6 wpf 时 WT 和 rhpn2^SL4/SL4 鱼中表达 eGFP 的 NRAS 依赖性肿瘤切片的共聚焦图像，图像以肿瘤（绿色）/基质边界为中心，并使用抗乙酰化微管蛋白抗体（红色）和 DAPI（蓝色）进行染色。比例尺：20 µm。背景扣除后乙酰化微管蛋白信号的定量分析（n = 3）（**p = 0.002；Student’s t 检验）。纤毛化指数的定量分析（n = 3）（*p = 0.048；Student’s t 检验）。
Rhpn2 表达缺失在黑色素瘤细胞中诱导 IFN 反应，并降低部分纤毛相关基因的表达
为进一步了解其作用机制并评估 Rhpn2 如何影响肿瘤发生发展，我们随后对来源于 rhpn2^SL4/SL4 和 rhpn2^+/+ 鱼的 NRAS 黑色素瘤细胞进行了转录组分析。我们利用了共同注射】【。
在胚胎中将 mitfa:mCherry Tol2 载体与 MCR-NRAS 载体共同导入，以使黑色素瘤细胞表达荧光。这使得我们能够对来自
rhpn2
SL4/SL4
和
rhpn2
+/+
肿瘤的细胞进行分选和批量 RNA 测序。通过检测黑色素瘤标志性基因 mitfa、Sox10 或 tyr 的表达，证实了所分选细胞的黑色素瘤性质（
图 4A
）。尽管不同样本之间的转录状态具有高度异质性，我们仍鉴定出了特异性差异表达基因（DEGs）（
图 4B-C
）。我们观察到，在
rhpn2
SL4/SL4
黑色素瘤细胞中，显著上调的相关基因主要为干扰素刺激基因（ISGs）及免疫相关基因，例如含四肽重复序列的干扰素诱导蛋白 8（
ifit8
）、干扰素 α 诱导蛋白 27 2/3（
ifi27.2, ifi27.3
）、黏液病毒抗性蛋白 A（
mxa
）、DExH-box 解旋酶 58（
dhx58
）以及含自由基 S-腺苷甲硫氨酸结构域蛋白 2（
rsad2
），这与防御通路的激活相一致（
图 4D
）。
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图 4。
Rhpn2 缺失降低了肿瘤/基质界面处纤毛相关基因的表达和微管蛋白乙酰化水平。
A-
小提琴图显示 WT 和
rhpn2
SL4/SL4
肿瘤中代表性黑色素瘤标志基因的相对表达水平。
B-
差异表达基因（DEGs）的分布，以表达水平的 log2 倍数变化和 -log10 校正后 p 值表示。（校正后 p 值<0.05，FC>2）
C-
显著差异表达基因的热图（校正后 p 值<0.05）。
D-
所选差异表达基因的标准化表达水平图。上图：已报道的干扰素刺激基因。中图：与组织重塑和纤毛相关的通道编码基因。下图：与脂质代谢相关的基因。
在下调幅度最大的基因中，
rhpn2
SL4/SL4
在黑色素瘤中，我们发现了与组织重塑和纤毛相关的蛋白，例如轴丝动力蛋白重链11（dnah11）、黑色素瘤细胞黏附分子b（mcamb）、信号素4A（sema4aa）和黏附性G蛋白偶联受体L3（adgrl3），以及参与脂质代谢的蛋白，例如过氧化物酶体增殖物激活受体α（pparaa）、支链氨基酸转氨酶2（bcat2）（图4D）。
讨论
尽管Rho亲和蛋白-2（RHPN2）在25年前已被鉴定为一种与RHO GTP酶相关的蛋白，但其生物学功能仍未明确（Mircescu et al., 2002；Peck et al., 2002）。在本研究中，我们利用人源细胞和斑马鱼模型开展互补实验，首次提供了功能性证据，证明RHPN2在体内是黑色素瘤的促肿瘤因子。
RHPN2最初被鉴定为肌动蛋白细胞骨架和囊泡运输的调节因子（Steuve et al., 2006），随后有多项研究进一步提出，RHPN2可能是一种潜在的肿瘤相关基因。然而，迄今为止，RHPN2在黑色素瘤中的作用尚未得到表征，尽管一项计算机分析研究提示其对黑色素瘤细胞存活十分重要（Pyatnitskiy et al., 2015）。在本研究中，通过体外实验，我们利用A375和A2058人黑色素瘤细胞系证明，敲低RHPN2可降低细胞活力和pERK水平。我们还观察到，敲低RHPN2会降低细胞的迁移/侵袭能力以及克隆形成潜能。这些结果进一步支持了以下假设：RHPN2可能是黑色素瘤侵袭性的调节因子，同时限制转移性播散和肿瘤生长特性。既往针对RHPN2的敲低实验表明，RHPN2是卵巢癌和肺腺癌生长与侵袭所必需的（Xiao et al., 2020；Yan et al.
等，2021；Yu 等，2020；Zhang 等，2025），即使其所影响的分子机制似乎并不相同。在肺腺癌中，RHPN2 的表达对于转录因子 Kruppel 样因子 5（KLF5）促进肿瘤进展的作用至关重要（Zhang 等，2025），并赋予肿瘤抵抗谷氨酰胺耗竭的能力（Xiao 等，2020）。在卵巢肿瘤中，耗竭 RHPN2 会使细胞阻滞于 G1 期，并降低整合素 β1 信号传导及金属蛋白酶的分泌（Yan 等，2021）。在胶质母细胞瘤中，这是一种影响胶质细胞的癌症，而胶质细胞与黑色素细胞一样，均来源于神经嵴；此前研究也已表明，RHPN2 可促进上皮—间质转化（EMT）（Danussi 等，2013）。因此，我们在人黑色素瘤细胞系中的研究结果支持了这样一种观点：RHPN2 能够影响肿瘤细胞的生长和侵袭特性；然而，我们首次发现，敲低 RHPN2 会导致 Erk 信号传导减弱。鉴于 BRAF 和 NRAS 这两个 MAPK 激活因子是黑色素瘤中最常发生激活的基因，未来研究进一步探讨 RHPN2 在这一级联通路中的直接分子作用将具有重要意义。
既往针对肺癌和卵巢癌开展的人类肿瘤异种移植实验均表明，RHPN2 过表达会增加小鼠体内的肿瘤体积（Xiao 等，2020；Yu 等，2020）。然而，在本研究中，我们首次揭示了 Rhpn2 在诱导肿瘤发生的原发性肿瘤模型中的作用，并利用了斑马鱼这一研究癌症发生发展的成熟模型，尤其适用于黑色素瘤研究（Letrado 等，2018；Wojciechowska 等，2016）。首先采用 NRAS^Q61L^ 斑马鱼黑色素瘤模型（Iyengar 等，2012），使肿瘤能够以嵌合方式在数周内快速形成；我们证明，Rhpn2 的缺失能够显著抑制肿瘤的发生。
延缓肿瘤发生并减少肿瘤负荷。该效应至少部分源于黑色素细胞本身，这一点已通过在鱼胚黑色素细胞中早期重新表达 Rhpn2 的挽救实验得到证实。与 Rhpn2 缺失动物相比，野生型动物在早期阶段出现肿瘤的频率更高，这表明 Rhpn2 可能促进肿瘤许可状态的建立，而不仅仅是加速肿瘤生长。在该模型中，我们还观察到 Rhpn2-KO 鱼的细胞密度降低，这与黑色素瘤侵袭性降低相关。与此同时，我们在 mitfa:BRAF^V600E^; p53^-/- 稳定转基因鱼模型中也证实了 Rhpn2 对肿瘤发展的促进作用（Patton et al., 2005）；在该模型中，肿瘤发展较为缓慢（需数月时间）。与 Rhpn2^+/+ 鱼相比，mitfa:BRAF^V600E^;p53^-/-;Rhpn2^-/- 鱼中肿瘤出现率同样降低。
在 NRAS 和 BRAF/p53 黑色素瘤模型中，Rhpn2 缺失或过表达的效应均得到了重复验证，凸显了其在遗传背景多样的黑色素瘤亚型早期肿瘤起始与扩增过程中的潜在普遍意义。
细胞密度升高是恶性肿瘤和肿瘤侵袭性的标志之一，可进一步增强压缩应力、组织侵袭和转移（Linke et al., 2024）。我们观察到，Rhpn2 缺失会降低肿瘤细胞密度。这与细胞系中观察到的增殖和/或迁移信号受损相一致，后者可能与 MAPK 和 Rho 通路的改变有关。与此一致，斑马鱼黑色素瘤研究显示，MEK 抑制可抑制黑色素细胞增生，表明 MAPK 信号传导与肿瘤细胞密度之间存在直接联系（Fernandez Del Ama et al., 2016）。黑色素瘤中 RhoA 活性升高也与增强的】【。
增殖、代谢活性和侵袭性表型，尤其是在治疗压力下（Murali et al., 2024）。Rhpn2 被认为是 RhoA 的正调控因子（Danussi et al., 2013）或负调控因子（Xiao et al., 2020），具体作用取决于所研究的系统。因此，在黑色素瘤中，Rhpn2 缺失可能损害依赖 Rho 的肌动蛋白-肌球蛋白动力学，导致肿瘤团块内部的细胞黏聚性降低。随着邻近细胞增殖，或细胞之间沉积额外的基质，肿瘤中的纤维性基质和细胞会受到张力作用（Johnson et al., 2025）。这一效应在肿瘤周边最为显著（Mpekris et al., 2015）。有趣的是，在斑马鱼中，较高的肿瘤细胞密度可能与一种特殊“界面”细胞状态的出现相关，在该状态下，癌细胞会与周围微环境发生相互作用（Hunter et al., 2021）。位于致密且受到机械约束的肿瘤边界处的初级纤毛，可能充当机械感受中枢，将微环境信号与依赖 RHO 的细胞骨架重塑整合起来（Collinson and Tanos, 2025；Johnson et al., 2025；Wang and Dynlacht, 2018）。我们的数据表明，只有存在 Rhpn2，才能在界面处观察到这些纤毛结构。据报道，斑马鱼中 Rhpn2 的缺失会导致立体纤毛变短，并引发内耳前庭系统立体纤毛异常（Dai, Yubei et al., 2026），这一过程通过与 RhoA 的直接相互作用实现。尽管立体纤毛和初级纤毛在结构本质上截然不同——后者是以微管为基础的细胞器，而前者是富含肌动蛋白的细胞突起——二者均有助于细胞感知并响应其所处环境（Nekooki-Machida and Hagiwara, 2020）。
尽管在不同肿瘤之间观察到高度异质性，
对 Rhpn2 缺失的 NRAS 驱动型黑色素瘤进行的转录组学分析显示，DNAH11（一种纤毛轴丝蛋白）的表达略有下降，同时 mcamb 的表达也有所降低；mcamb 在形态发生过程中协调顶端-基底侧极性、平面细胞极性以及纤毛发生（Gao et al., 2017）。然而，该实验针对的是全部肿瘤黑色素细胞，其中仅有少数细胞位于表达纤毛的界面。因此，在未来的研究中，开展空间转录组学分析以阐明 Rhpn2 在肿瘤界面处的作用将十分有意义。
有趣的是，我们发现，在 Rhpn2 缺失的肿瘤中，dhx58（lgp2）显著上调，同时伴有多个干扰素刺激基因（stat1、ifit8、mxa/mx1、rsad2 和 ifi27）的表达上调，这提示 I 型干扰素反应被激活。I 型干扰素信号不仅可由病毒感染触发，也可由癌症中细胞应激、基因组不稳定性或细胞器功能障碍过程中释放的内源性核酸触发（Schoggins, 2019）。其中可能涉及多种危险信号感知机制，包括 cGAS/STING 通路和 RIG-I 样受体（RLRs）（Ishikawa and Barber, 2008；Liu et al., 2025），二者均已被证实在黑色素瘤中具有重要作用（Motwani et al., 2019；Oscherwitz et al., 2023）。Dhrx58 在核酸介导的细胞反应中作为 RLRs 的调节因子发挥关键作用（Bek et al., 2019）。
与此一致的是，多个被诱导表达的基因提示 RHPN2 缺失、线粒体应激与脂质代谢重编程之间可能存在联系。线粒体功能障碍被认为是内源性危险信号的重要来源，这些信号可通过将线粒体核酸释放至细胞质中而激活干扰素通路。Cmpk2 在调控线粒体功能和炎性小体激活过程中发挥作用。
炎症应激（Zhao et al., 2022）；Rsad2可扰乱线粒体脂质代谢和抗病毒应激反应（Chen et al., 2025；Majhi et al., 2025）；PPARα则在癌症中调控线粒体脂肪酸氧化和能量代谢（Van den bossche et al., 2025）。结合ifi27的诱导表达（该基因与细胞应激、细胞凋亡和炎症反应相关），以及mx1和ifit家族基因表达水平的升高，这些发现支持以下假说：RHPN2缺失会引发广泛的细胞扰动，影响细胞骨架、纤毛、线粒体稳态及代谢通路，最终导致干扰素介导的应激反应持续激活，并可能促成Rhpn2-KO肿瘤中观察到的生长减缓。
总而言之，本研究首次确定Rhpn2是黑色素瘤进展的调控因子，可整合细胞骨架重塑、MAPK信号传导以及肿瘤-微环境相互作用。Rhpn2通过调控肿瘤起始、侵袭性、纤毛发生和免疫相关通路，成为一个具有前景的黑色素瘤治疗靶点。
材料与方法
细胞培养与转染
A375（ATCC-CRL-1619）、A2058（ATCC-CRL-3601）和SKML28（ATCC-HTB-72）细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。细胞均培养于补充有10%胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和5 μg/mL两性霉素B的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。所有组分均购自ThermoFisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。所有细胞系均在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。必要时，使用血细胞计数板对细胞进行计数。对于_久久爱
重组蛋白表达
根据制造商说明，使用 X-tremeGENE 9（Roche Life Science，瑞士巴塞尔）将 3 µg 的每种质粒转染至 2.5 × 10^6 个 HEK293T 细胞中。转染后 48 h 收集细胞并进行分析。
病毒颗粒的制备与转导
在转染前 20–24 h，将 Lenti-X HEK293T 细胞以每个 T225 培养瓶 18 × 10^6 个细胞的密度接种于完全培养基中。转染时，将 195 μL PEI（1 μg/μL）（公司，国家）以及以下质粒加入无血清 DMEM 中：pMD2.G（3.4 μg）、PsPAX2（6.8 μg）和目标质粒（13.6 μg）。转染 48 h 后，收集培养基，经 0.45 μm 滤膜过滤，并使用 PEGx800（NaCl 2.5 M 中的浓度为 25%）按 1:3 的比例浓缩 24 h。随后在 4 °C 下以 4000 g 离心 1 h。将病毒沉淀重悬于相当于初始上清液体积 1/100 的体积中。重悬后的病毒颗粒在冰上孵育 20 min，随后立即使用或储存于 −80 °C，待后续使用。通过系列稀释法测定病毒滴度。稳定转导的黑色素瘤细胞在添加 2 mg/ml G418（ant-gn-5，InvivoGen，美国加利福尼亚州圣迭戈）或 1 μg/μL PURO（#108321-42-2，InvivoGen，美国加利福尼亚州圣迭戈）的培养基中进行筛选。筛选 10–15 天后，将细胞用于后续实验。对于单个克隆，筛选 10–15 天后，将克隆转移至 24 孔板中，培养至汇合，进行胰蛋白酶消化后进一步扩增。
细胞活力检测
采用 MTT 法评估细胞活力。将细胞以每孔 1.5 × 10^3 个的密度接种于 96 孔板中，并在 37 °C 下培养 1 周。加入 10 μL WST-8/CCK-8 四唑盐（Abcam）（终浓度为 0.5 mg/mL），并】【。
每日向细胞中加入，随后孵育2小时。使用分光光度计（Bio-Rad Model 680 Microplate Reader）测定450 nm处的吸光度，以检测生成的甲臜含量。所有实验均设置三个复孔，并至少重复进行三次独立实验。
克隆形成实验
将对照细胞和表达目标shRNA的细胞以1 × 10³个细胞的密度接种于6孔板中的3 cm培养皿内，并于37°C下培养2周，以促进克隆形成。细胞用PBS洗涤后，使用4%多聚甲醛固定5分钟。随后，细胞用PBS洗涤3次，使用0.1%结晶紫染色2分钟，再用蒸馏水充分洗涤并晾干。使用ImageJ软件评估克隆的数量和大小。实验设置三个重复。
细胞迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭实验采用24孔Transwell小室进行（孔径为8 µm）（VWR 734-0038和VWR 734-1047，Corning，Corning，NY，Leuven，比利时），具体操作按照制造商说明进行。将4 × 10⁴个细胞接种于上室，其中含有500 µL无血清培养基；下室加入750 µL含FBS的完全培养基作为趋化剂。孵育20小时后，将细胞固定、染色（Differential Quik III Stain Kit，Polysciences, Inc.，Warrington，PA，美国）并计数。
Western blot
进行Western blot分析时，弃去培养基，细胞用预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后进行裂解。对于鱼类样本，在实验结束后取样30条幼鱼，置于0.25 mg/mL缓冲MS-222（Sigma）中浸泡实施安乐死，并通过充分吹打进行裂解。裂解缓冲液由50 mM Tris-HCl组成，pH值为】【。
6.8，其中含有12%蔗糖、2% SDS、0.004%溴酚蓝、20 mM二硫苏糖醇（DTT）和1× cOmplete™蛋白酶抑制剂混合物（Roche，瑞士巴塞尔）。通过在4°C、15,000 g条件下离心澄清裂解液，并使用PierceR 660 nm蛋白质检测试剂（22660，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）测定总蛋白浓度。取总细胞提取物样品（含30 µg蛋白质），在1× Laemmli缓冲液中于95°C变性，随后在8% SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离，并转移至硝酸纤维素膜（Amersham，GE Healthcare）。采用SuperSignal West Pico Atto或Pico（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）通过增强化学发光（ECL）检测蛋白质，并使用Fusion Solo S软件（Vilber Lourmat，法国马恩拉瓦莱）进行成像。
斑马鱼饲养
斑马鱼按照FELASA指南和相关法规（Aleström et al., 2020）在标准实验室条件下饲养。所有实验程序均经ULB动物福利伦理委员会（CEBEA）批准（实验方案866N和867N）。所使用的品系为：Tg(mitfa:BRAF^V600E^)；mitfa^-/-^；p53^M214K^（lf）（由美国波士顿儿童医院的Christian Lawrence提供）（本文称为BRAF/p53）。稳定的Tg(mitfa:BRAF^V600E^)、mitfa^-/-^、p53^-/-^和rhpn2^-/-^鱼系通过连续回交并结合数轮互交获得。术语“成鱼”是指年龄介于6个月至8个月的动物。
rhpn2^Δ2/+^或rhpn2^SL4/+^杂合鱼分别进行互交，并对其相应的成年子代进行形态测量分析。使用直尺测量体长。所有测量均在基因分型及孟德尔遗传比例确认之前完成。
的生成
rhpn2-/-突变斑马鱼
rhpn2（ENSDARG00000014577）敲除突变品系采用CRISPR/Cas9系统构建。利用Sequence Scan for CRISPR软件（http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/）和CRISPR scan（http://www.cirsprscan.org/）对rhpn2的第一外显子进行靶向分析，鉴定并筛选出两条单导向RNA（sgRNA）（sgRNA1：5’-GGTTGAGCATTCAGAAATGA-3’；sgRNA2：5’-CGGACACTCTCATTCCCAA-3’）。这两条sgRNA具有最高的靶向效率和最低的预测脱靶评分（Xu et al., 2015）。sgRNA合成的DNA模板采用此前报道的基于PCR的短寡核苷酸方法制备（Talbot and Amacher, 2014）。所得PCR产物经酚-氯仿抽提纯化后，使用SP6 RNA聚合酶（NEB，M0207）进行体外转录。随后，使用High Pure PCR Cleanup Microkit（Roche，498395500）纯化sgRNA。将60 pg sgRNA和100 pg Cas9蛋白（PNA Bio）共同注射至野生型胚胎的单细胞期。胚胎和成体的基因分型均使用以下引物进行：rhpn2正向引物（fw）：5’-ATCAACAGACATCCGAGAACC-3’，rhpn2反向引物（rv）：5’-TCTCAAAACTACAGTGACGGTAACA-3’。通过PCR和Sanger测序对突变进行验证（Eurofins，卢森堡市，卢森堡）。对于两条突变品系，实验均使用至少为F3代的个体。
黑色素瘤模型的构建与分析
mitfa:NRAS^Q61L^ MiniCoopR（以下简称MCR:NRAS）由Hurstone实验室提供（Badrock and Hurlstone, 2021）。将其与TOL2转座酶mRNA（20 pg）共同显微注射至单细胞期胚胎的卵黄中，每个胚胎的最终注射量为50 pg。随后，于受精后5天（5 dpf）筛选色素恢复情况，并密切监测明显的肿瘤发生时间及筛选情况。
进一步分析。
为通过 FACS 纯化肿瘤细胞，将 MCR:NRAS 与 mitfa:mCherry TOL2 载体共同注射，以同步表达荧光蛋白。
通过对 Tg(mitfa:BRAF V600E)、p53-/-、rhpn2+/- nacre 鱼进行杂交，评估 rhpn2 功能缺失对肿瘤发生时间的影响。在 Rhpn2 过表达实验中，将表达 eGFP 或 eGFP-T2a-Rhpn2（Genescript 定制）的 MCR 载体注入 Tg(BRAF)、p53-/- nacre 胚胎，表达受 mitfa 启动子调控。随后于受精后 5 天（dpf）筛选恢复色素的胚胎，并从受精后第 4 周监测至第 25 周，记录肿瘤出现时间。
肿瘤组织学分析
在肿瘤出现 3 周后（受精后第 6 周，wpf）收集荷瘤鱼，并使用 Leica EG1150 H 仪器进行石蜡包埋，或包埋于 OCT 中进行冷冻保存。简言之，将鱼处死并用 4% 多聚甲醛（PFA）固定。次日，将鱼置于 0.5 M、pH 8 的 EDTA 中，于 4°C 脱钙过夜。样本快速漂洗后，在中性缓冲福尔马林溶液（甲醛 10%、NaH₂PO₄·2H₂O 4.9 g/L、Na₂HPO₄ 6.5 g/L）中于 4°C 重新固定。随后，样本经梯度乙醇依次脱水（70% 1 小时、95% 1 小时、100% 1 小时、100% 2 小时），室温下用甲苯透明过夜，之后于 60°C 石蜡包埋（Paraffin Paraplast，Leica Biosystems）。按照制造商说明，使用 Leica RM2245 手动旋转式切片机切取 6 µm 厚的石蜡切片。切片前，将石蜡块置于冰水混合物中冷却。组织切片在 45°C 水浴上漂浮数秒以充分展平，随后贴附于涂层载玻片（VWR）上。载玻片水平置于 50°C 烘干，随后于 37°C 孵育过夜，再进行后续的】【。
处理。
荧光免疫染色
将荷瘤鱼置于4%多聚甲醛（PFA）中固定48小时。PBS洗涤后，于4°C下在0.5 M、pH 8.0的EDTA中处理过夜。随后，将样品置于10%中性缓冲福尔马林（NBF，pH 7.2；含4%甲醛、0.4%磷酸氢二钠、0.65%磷酸氢二钠和1.5%甲醇）中，于室温下再次固定过夜。解剖得到的肿瘤组织随后于4°C下在30%蔗糖中孵育过夜，之后包埋于OCT中，快速冷冻并进行冰冻切片（厚度为8 µm；CM3050 S，Leica，Wetzlar，德国），然后于65°C加热30分钟。染色前，将切片置于室温下风干1小时。使用疏水性隔离笔（DAKO pen）勾勒组织切片边界，并在1× PBS中洗涤两次，每次5分钟。随后，将切片置于PBS-0.5% Triton X-100溶液中透化15分钟，之后使用PBS-0.1% Tween-20洗涤。切片于室温下在封闭液（10 mg/mL BSA、1%山羊血清，溶于1× PBS）中封闭1小时，并于4°C下与一抗孵育过夜。洗涤后，将切片置于避光条件下与适当的二抗孵育1小时。使用DAPI（1:10,000）进行细胞核复染，并使用Fluo G封片剂封片。每种实验条件至少对3个个体进行成像。所使用的一抗和二抗如下：抗乙酰化微管蛋白抗体（小鼠）（T6793，Sigma-Aldrich；1/2000）、Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG（A-21239，Invitrogen；1/500）、Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG（A-21206，Invitrogen；1/500）。使用蔡司LSM 780倒置共聚焦显微镜对免疫染色的冰冻切片进行成像，所用物镜为Plan Apochromat 18 20×/0.8 M27和LD C Apochromat 40×/1.1 W korr M27。使用ImageJ软件对乙酰化微管蛋白阳性细胞进行定量。
苏木精和伊红染色
石蜡切片
石蜡包埋的组织切片首先进行脱蜡，并依次在甲苯、100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、流动自来水和蒸馏水中各漂洗5 min以实现再水化。切片置于含3% H₂O₂和1% KOH（Merck）的溶液中孵育15–45 min以脱色。随后，切片使用苏木精（Mayer苏木精）染色4 min，之后在流动自来水中冲洗至澄清。然后将载玻片浸入70%乙醇和盐酸溶液中进行蓝化处理。用流动水冲洗2 min后，切片使用醇溶性伊红进行复染。随后将载玻片置于流动水中冲洗5–10 min，直至获得所需的粉红色。切片经梯度乙醇溶液（70%和90%）脱水后，再用100%异丙醇漂洗两次（每次2 min），并用甲苯漂洗两次（每次5 min）。载玻片自然干燥后，使用邻苯二甲酸二丁酯聚苯乙烯二甲苯封片剂（DPX）（Merck）进行封片。使用Hamamatsu NanoZoomer数字切片扫描仪对完整载玻片进行成像，并通过NanoZoomer Slide软件观察，以评估肿瘤组织学特征。使用Qpath软件对细胞密度进行定量。
肿瘤细胞分选与RNA提取
将鱼置于500 mg/l的三卡因（MS-222）（Sigma-Aldrich，E10521）溶液中实施安乐死。解剖分离肿瘤（对照组和rhpn2-/-组），并在0.9× Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中使用0.075 mg/ml Liberase（Roche-05401119001）于33°C消化30 min。在此过程中，使用配备26 G针头的注射器（B.Braun，Omnifix 100 Duo）进行机械解离。细胞悬液在以1× DPBS稀释的2%胎牛血清中（FACS缓冲液）以300 g离心。随后，将细胞重悬于
FACS缓冲液，并使用无菌40 µm尼龙网（VWR，美国宾夕法尼亚州拉德诺）进行过滤。采用FACS ARIA流式细胞分选仪（Becton Dickinson，美国加利福尼亚州圣何塞）对mCherry阳性细胞进行分选，并使用DRQ7（3 µM，Thermo Fisher Scientific，D15105）排除非存活细胞。分选时间不超过15 min。按照制造商说明，使用ReliaPrep RNA组织Mini试剂盒（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）从约150,000个细胞中提取总RNA，并送交进行mRNA测序（Novogene-Europe，德国慕尼黑）。
Bulk RNA测序与数据分析
所有数据集的FastQ数据文件均采用相同方法进行处理。使用Hisat2将修剪和过滤后的测序读段比对至斑马鱼参考基因组GRCz11.95。使用iDEP（1.1版）进行差异基因表达分析及后续功能富集分析（Ge等，2018）。
统计分析
采用GraphPad Prism软件（8版，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣迭戈）进行统计分析。比较多个组时，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），随后进行多重比较检验。分析过程中未排除任何数据。当p < 0.05时，结果被认为具有统计学显著性，并以均值和标准差（SD）表示。统计分析所使用的数据展示方式和样本量均在图注中予以说明。
数据可用性
利益冲突声明
所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献
Mana Alavi和Alexia Gybels：概念化；数据整理；形式分析；调查；可视化；方法学；撰写初稿；审阅与编辑。
Sena Bekar、Katarzina Konobrocka、Laura Gulizia：数据整理；形式分析；调查。
可视化。
Garnik Hovhannisyan：资源；方法学；成像。
Camille Perazzolo：技术支持；方法学。
Sumeet Pal Singh：资源；软件；形式分析；方法学；撰写—审阅与编辑。
Isabelle Pirson：概念化；资源；数据整理；软件；形式分析；监督；经费获取；验证；调查；可视化；方法学；撰写—初稿；项目管理；撰写—审阅与编辑。
致谢
我们感谢 ULB Limif 平台的 Michiel Martens，以及 FACS 设施的 Christine Dubois。最后，我们感谢 Mustapha Chaouni 和 Kamel Gharbi 对鱼房设施进行日常维护。本项目由比利时国家科学研究基金会（Fonds National de la Recherche Scientifique，CDR：J0158.22F、J0170.24；Télévie 基金：7-4592-24F）资助。我们感谢 Adeline Augereau 和 Pierre Gillotay 提供的宝贵建议及富有成效的讨论。
基金资助信息声明
FNRS-CDR
，J0158.22F
，J0170.24
FNRS-Télévie
，7-4592-24F
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Rhpn2 促进斑马鱼黑色素瘤在体内的发生与侵袭性
Mana Alavi，
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Katarzyna Konobrocka，
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关键词：RHPN2 · 黑色素瘤 · 斑马鱼模型 · 肿瘤侵袭 · Rho GTPases · 初级纤毛
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.03.736252v1?rss=1