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背景 单细胞图谱揭示了结直肠癌（CRC）中多种不同的干细胞状态，然而，这些状态的总体演化轨迹及其潜在功能机制，包括其与药物敏感性的相关性，仍有待深入认识。方法 我们从微卫星稳定型结直肠癌中建立了64个患者来源的类器官，对其转录组和基因组进行了表征，并使用62至140种临床批准药物开展药物筛选。我们进一步分析了已发表的患者来源类器官转录组数据（来自三个独立数据集的72例患者）、TCGA-CRC数据（466例患者）以及肿瘤活检样本的单细胞转录组数据（来自六个独立队列的123,000个细胞），以构建结直肠癌干细胞的功能和分子图谱。随后，我们通过基于质谱的蛋白质组学、大规模激酶抑制实验和免疫荧光分析开展机制性后续研究。结果 我们发现，结直肠癌干细胞呈现出一个连续的状态图谱，其特征在于不同的发育程序，包括由成体干细胞向胎儿样再生状态的转变，以及不同分化程序之间的转换。通过大规模药物扰动和多组学建模，我们识别出一条依赖PI3K/mTOR的再生性/胎儿样干细胞轨迹。我们发现，所识别的发育轴在类器官、临床样本以及单细胞数据中均具有保守性，并且胎儿样、PI3K/mTOR依赖性状态与较差的临床预后相关。从机制上看，PI3K/mTOR脆弱性与适应能力缺失有关，这种缺失源于mRNA翻译受到抑制；同时，该状态还伴随着SRC信号网络的上调。结论 本研究通过结合功能性类器官中的扰动分析。这使得对干细胞状态调控进行机制建模成为可能，并在结直肠癌（CRC）中鉴定出一种依赖于 SRC/mTOR 的再生状态，未来或可据此改进治疗靶向。
多组学、基于类器官的建模揭示了结直肠癌中一条依赖 SRC/mTOR 的胎儿样干细胞轨迹 | bioRxiv
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多组学、基于类器官的建模揭示了结直肠癌中一条依赖 SRC/mTOR 的胎儿样干细胞轨迹
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Theresa Mulholland，
Bogac Aybey，
Zhenchong Li，
Luisa Schwarzmüller，
Niklas Rindtorff，
Lucrezia Tondo，
Ping Sui，
Ekin Karabati，
Philipp Albrecht，
Julian E. Riedesser，
Yvonne Petersen，
Thilo Miersch，
Erica Valentini，
Elke Burgermeister，
Tianzuo Zhan，
Lena Dreikhausen，
Nadine Schulte，
Sebastian Belle，
Stefan Wiemann，
Michael Boutros，
Matthias P. Ebert，
Johannes Betge
DOI：
https://doi.org/10.64898/2026.07.03.735750
Theresa Mulholland
1
德国癌症研究中心（DKFZ）转化胃肠道肿瘤学与临床前模型初级临床合作单元，海德堡，德国
2
海德堡大学曼海姆医学院曼海姆大学医学中心医学系 II
3
德国癌症研究中心（DKFZ）海德堡癌症研究所，曼海姆大学医学中心，海德堡，德国
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Bogac Aybey
1
德国癌症研究中心（DKFZ）转化胃肠道肿瘤学与临床前模型初级临床合作单元，海德堡，德国
2
医学系娱乐主管
曼海姆大学医学中心医学二科，曼海姆医学院，海德堡大学
3
曼海姆大学医学中心DKFZ赫克托癌症研究所
，德国海德堡
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Zhenchong Li
1
德国癌症研究中心（DKFZ）胃肠道肿瘤转化研究与临床前模型初级临床合作单元
，德国海德堡
2
曼海姆大学医学中心医学二科，曼海姆医学院，海德堡大学
3
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，德国海德堡
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Luisa Schwarzmüller
4
德国癌症研究中心分子基因组分析部
，德国海德堡
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Niklas Rindtorff
5
德国癌症研究中心信号传导与功能基因组学部
，德国海德堡
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Lucrezia Tondo
1
德国癌症研究中心（DKFZ）胃肠道肿瘤转化研究与临床前模型初级临床合作单元
，德国海德堡
2
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Ping Sui
1 德国癌症研究中心（DKFZ）胃肠道肿瘤转化研究与临床前模型初级临床合作组，德国海德堡
2 海德堡大学曼海姆医学院曼海姆大学医学中心医学 II 科
3 曼海姆大学医学中心 DKFZ 赫克托癌症研究所，德国海德堡
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Ekin Karabati
1 德国癌症研究中心（DKFZ）胃肠道肿瘤转化研究与临床前模型初级临床合作组，德国海德堡
2 海德堡大学曼海姆医学院曼海姆大学医学中心医学 II 科
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Philipp Albrecht
1 德国癌症研究中心（DKFZ）胃肠道肿瘤转化研究与临床前模型初级临床合作组，德国海德堡
2 海德堡大学曼海姆医学院曼海姆大学医学中心医学 II 科
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Julian E. Riedesser
1 德国癌症研究中心（DKFZ）胃肠道肿瘤转化研究与临床前模型初级临床合作组，德国海德堡
2 海德堡大学曼海姆医学院曼海姆大学医学中心医学 II 科，德国海德堡
大学
3
德国癌症研究中心海德堡·赫克托癌症研究所，曼海姆大学医学中心，海德堡，德国
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Yvonne Petersen
1
德国癌症研究中心（DKFZ）转化胃肠道肿瘤学与临床前模型初级临床合作单元，海德堡，德国
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曼海姆大学医学中心医学系II，曼海姆医学院，海德堡大学
3
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Thilo Miersch
1
德国癌症研究中心（DKFZ）转化胃肠道肿瘤学与临床前模型初级临床合作单元，海德堡，德国
5
德国癌症研究中心信号转导与功能基因组学部，海德堡，德国
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Erica Valentini
5
德国癌症研究中心信号转导与功能基因组学部，海德堡，德国
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Elke Burgermeister
2
曼海姆大学医学中心医学系II，曼海姆医学院，海德堡大学
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Tianzuo Zhan
2
曼海姆大学医学中心医学系II，曼海姆医学院，海德堡大学
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微生物群、药物代谢与癌症治疗研究组（MMPU），曼海姆，德国
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Lena Dreikhausen
2
曼海姆大学医学中心医学系，曼海姆医学院，海德堡大学
9
MMPU 微生物群药物代谢与癌症治疗中心
德国曼海姆
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Nadine Schulte
2
曼海姆大学医学中心医学系，曼海姆医学院，海德堡大学
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Sebastian Belle
2
曼海姆大学医学中心医学系，曼海姆医学院，海德堡大学
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Stefan Wiemann
4
德国癌症研究中心分子基因组分析部
德国海德堡
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Michael Boutros
5
德国癌症研究中心信号转导与功能基因组学部
德国海德堡
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海德堡大学海德堡医学院分子人类遗传学系
德国海德堡
7
德国癌症联盟（DKTK）
德国海德堡
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Matthias P. Ebert
2
曼海姆大学医学中心医学系，曼海姆医学院，海德堡大学
3
曼海姆大学医学中心 DKFZ 赫克托癌症研究所
德国海德堡
8
曼海姆癌症中心
德国曼海姆
9
MMPU 微生物群药物代谢与癌症治疗
，德国曼海姆
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Johannes Betge
1 德国癌症研究中心（DKFZ）转化胃肠道肿瘤学与临床前模型初级临床合作研究组，德国海德堡
2 海德堡大学曼海姆医学院曼海姆大学医学中心内科二科
3 曼海姆大学医学中心 DKFZ 赫克托癌症研究所，德国海德堡
7 德国癌症联盟（DKTK），德国海德堡
8 曼海姆癌症中心，德国曼海姆
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通讯作者：
j.betge{at}dkfz.de
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摘要
背景
单细胞图谱揭示了结直肠癌（CRC）中多种不同的干细胞状态，但这些状态总体上的演变轨迹及其潜在功能机制（包括其与药物敏感性的关联）仍有待深入了解。
方法
我们建立了 64 个来源于患者的微卫星稳定型结直肠癌类器官，对其转录组和基因组进行了表征，并使用 62–140 种临床批准药物开展药物筛选。我们分析了其他已发表的患者来源类器官转录组数据（来自三个独立数据集的 72 名患者）、TCGA-CRC 数据（466 名患者）以及肿瘤活检样本的单细胞转录组数据（来自六个独立队列的 123,000 个细胞），以构建 CRC 干细胞的功能与分子图谱。我们通过以下方式开展了机制层面的后续分析。
基于质谱的蛋白质组学、大规模激酶抑制实验和免疫荧光分析。
结果
我们发现，结直肠癌（CRC）干细胞呈现出一个连续的状态谱，其特征在于不同的发育程序：从成体干细胞状态到胎儿样再生状态，以及不同分化程序之间的转换。通过大规模药物扰动实验和多组学建模，我们鉴定出一条具有PI3K/mTOR依赖性的再生性/胎儿样干细胞轨迹。我们发现，在类器官、临床样本以及单细胞数据中，所鉴定的发育轴均具有保守性；此外，胎儿样的PI3K/mTOR依赖状态与较差的临床预后相关。从机制上看，PI3K/mTOR易感性与适应能力缺失有关，这种适应能力缺失源于mRNA翻译受抑，并伴随着SRC信号网络的上调。
结论
通过在类器官中结合功能扰动分析，本研究超越了对CRC分子状态谱的描述。这使得我们能够对干细胞状态调控进行机制建模，并鉴定出CRC中一种依赖SRC/mTOR的再生状态，这可能有助于未来实现更精准的治疗靶向。
引言
结直肠癌（CRC）是全球第三常见的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因[
1
]。转移性CRC的预后尤其不佳，对于这类患者，化疗仍然是大多数病例的治疗基础。尽管分子分层已使针对特定患者亚群的靶向治疗成为可能，但大多数患者仍缺乏可靠的预测性生物标志物或新的靶向策略来指导治疗选择。这反映了CRC显著的肿瘤间和肿瘤内异质性。
转录状态在CRC的药物敏感性中发挥着重要作用。现有的
基于基因组和转录组的结直肠癌（CRC）肿瘤分类系统[2–4]，例如共识分子亚型（Consensus Molecular Subtypes，CMS）[2]，通过界定离散的肿瘤类别，为理解CRC生物学提供了重要 insight。然而，离散的CRC亚型无法充分捕捉动态过程，其在治疗分层中的转化价值也较为有限。近期发育生物学和单细胞生物学的进展表明，上皮细胞身份本质上具有动态性[5–8]。CRC细胞可以在不同分化谱系之间转换，包括吸收性和分泌性程序，并根据具体环境呈现不同的干样状态。值得注意的是，就后者而言，成年肠道干细胞程序以及胎儿样或再生状态均被认为参与了肿瘤进展[9,10]、转移[8]和治疗耐药[11–14]。这些程序在人类CRC中如何组织，以及它们反映的是彼此不同还是相互重叠的生物学轨迹，仍不清楚。此外，上皮干细胞状态及其与药物敏感性的相关性在CRC中仍未得到充分表征。
在本研究中，我们提出假设：CRC上皮程序是沿连续的转录轴组织的，而非构成离散的亚型；同时，这些轴在功能上与药物敏感性相关。为验证这一点，我们利用了患者来源类器官（patient-derived organoids，PDOs）。PDOs能够代表人类CRC的分子多样性并保留其内在的上皮程序，同时支持系统性的多组学分析和药物扰动筛选。通过整合多个数据集中的基因表达、突变状态和药物反应，我们定义了CRC中一个保守的上皮景观。我们显示，该景观由不同的发育程序所构成，将胎儿样
增殖性上皮程序中的再生状态，以及可塑性相关状态中的代谢程序。重要的是，这些轴与药物脆弱性直接相关，包括与一种可塑性相关的胎儿样干细胞状态相关的对 PI3K/mTOR 通路抑制的差异性敏感性。我们发现，这种 PI3K/mTOR 脆弱性与细胞因 PI3K/mTOR 抑制而无法适应有关，其原因在于 mRNA 翻译受到抑制，并由上调的 SRC 信号网络驱动，从而为将上皮可塑性与其潜在信号节点联系起来提供了一个框架。
结果
CRC PDO 定义了上皮可塑性的两个连续轴
为系统研究肿瘤内在的上皮可塑性如何与药物脆弱性相关，我们建立了一个来源于微卫星稳定型肿瘤（MSS）的 CRC PDO 生物样本库，共包括来自 64 名患者的 132 个样本；其中大多数患者均有多个生物学重复样本。随后，我们对该队列进行了转录组和基因组特征分析，并开展了功能性药物筛选（图 1a）。为涵盖广泛的异质性，我们纳入了具有不同临床特征的患者（补充表 1，补充图 1a）。我们的队列主要由未经治疗的患者组成（n=58），其肿瘤分别来源于直肠（n=43）或结肠（n=21）腺癌，且大多数为 III–IV 期（n=42）。最常见的突变为
APC
、
TP53
和
KRAS
，在队列中的比例分别为 81%、67% 和 65%。这一设计使我们能够捕获广泛肿瘤上皮亚型和状态中的基因组变异。
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图 1.
CRC PDO 中上皮可塑性的连续谱。
(a)
实验与分析设计概览。
(b)
基于前 50 个 PC1 或 PC2 探针的扩散图。对于扩散图，具有前 50 个……
使用PC1（左）或PC2（右）中载荷值最高和最低的各50个值。伪时间值由扩散图推断获得，显示从较低伪时间（深洋红色）到较高伪时间（黄色）的变化。样本沿连续轨迹排列。针对（c）PC1或（d）PC2轴进行基因集富集分析。基因按照载荷值进行排序。使用CRC特异性、肠道干细胞（ISC）、胎儿/再生性和YAP特征，并以不同颜色标记。图中显示标准化富集分数及其相应的FDR校正p值，并以气泡表示。气泡大小表示-log₁₀（FDR）值。
（e）联合扩散图，代表CRC干细胞可塑性景观。扩散图基于PC1和PC2中相互排斥的最高和最低各50个探针构建（n（PC1+、PC1−、PC2+、PC2−）分别为47、46、47和46）。样本沿两条连续轴排列：代谢型与EMT-可塑性，以及肠道干细胞样与胎儿/再生性。
（f）联合扩散图上的标志基因表达。沿联合扩散图展示所选吸收/代谢、EMT/间质/可塑性、分泌性和干细胞样程序的Z标准化标志基因表达值。标志基因沿不同的生物学梯度排列。
（g）联合扩散图上的胎儿和肠道干细胞特征评分。沿联合扩散图展示两个ISC特征和两个胎儿/再生性特征的平均特征评分。第一扩散成分将再生性/胎儿样程序与肠道干细胞样程序区分开来。
（h）PC1或PC2中排名前50的探针的连续表达。以热图形式展示每个PC1（左）和PC2（右）排名前50的探针的Z标准化表达值。表达值从低（蓝色）到高（红色）显示。PC探针两侧分别以不同颜色表示：正值（红色）和负值（蓝色）。
一侧。样本按照扩散图推断出的伪时间进行排序，基因表达模式呈现出连续梯度。
首先，我们基于对PDOs进行的基因表达分析，旨在界定CRC中上皮干细胞状态的景观。经性别校正的PCA未显示出离散的聚类，而是显示样本沿第一和第二主成分（PC1和PC2）呈连续排列（补充图1b）。随后，我们进一步考察PC1和PC2所捕获的主要变异是否反映连续梯度。对于PC1和PC2，我们分别使用主成分载荷最高和最低的探针各50个（分别记为PC+和PC−）构建扩散图（图1b；探针列表见补充表2）。选择50个探针是一种务实的特征选择方法，旨在捕获各主成分所代表的主要转录程序，同时减少低载荷探针带来的噪声。这一方法获得了具有针对性且在生物学上易于解释的探针集合。在基于PC1和PC2的扩散图中，样本均沿单一连续轨迹排列。热图展示了这些PC衍生探针在所得伪时间排序中的渐进性表达变化（图1h）。为评估这些轨迹是否反映了连贯的生物学结构，而非任意探针选择的结果，我们将所得嵌入与规模匹配的随机探针集合进行了比较。与随机探针集合相比，PC衍生探针集合与伪时间及第一扩散成分表现出更强的一致性，表明观察到的轨迹并非由随机探针选择驱动，而是反映了由PC探针中的高载荷探针所捕获的连贯排序关系（方法；补充图1c）。这些初步结果表明，CRC PDO样本沿连续轴分布，而非随机分布或中文字幕无码
形成离散的细胞簇。
随后，我们分别对PC1轴和PC2轴进行了表征，以考察其潜在的上皮生物学特征。PC1+轴富集于细胞发育、扩增过渡细胞以及肠道干细胞特征（图1c，补充图2a），并得到LGR5、HMGA2和IGF2等经典干细胞及发育标志物的支持。PC1−轴则富集于干扰素、TGFβ、分泌、炎症、杯状细胞样、YAP以及胎儿/再生相关特征，代表性基因包括MUC2、TFF1和REG4（图1c，补充图2b）。总体而言，PC1捕获了胎儿/再生程序与肠道干细胞样程序之间的连续谱。
PC2+轴富集于吸收功能和代谢相关通路，并得到ACE2、DPP4和FABP1等肠上皮细胞相关基因的支持（图1d，补充图2b，补充图2d）。相比之下，PC2−轴富集于与上皮重塑及EMT相关过程相联系的通路，同时伴随着细胞外基质组织和细胞迁移相关基因表达升高，包括FN1、CXCR4和PMEPA1。该轴并不反映一种完全的间质状态，而是与上皮可塑性及部分EMT样程序相一致。因此，PC2定义了上皮异质性的一个正交维度，将分化的代谢状态与重塑相关的EMT样细胞程序区分开来。
为评估我们的可塑性轴与既有结直肠癌分类体系之间的关系，我们量化了PC衍生的前50个探针组与已发表的CMS[2]、CRIS[3]和iCMS[4]特征之间的基因水平重叠。直接重叠程度有限（Jaccard指数通常<0.1），表明其与现有分类器之间总体冗余较低。
基因。然而，在我们的数据中，PC1评分与CMS2、iCMS2和CRISD评分呈正相关（r = 0.6），而与iCMS3、CMS1/CMS3以及CRISA/CRISB评分呈负相关（r = -0.7至-0.8）。PC2评分则与CMS2和CRISC特征呈选择性正相关（r = 0.6），与CMS1和CRISA特征呈负相关（r = -0.3）。总体而言，这些轴与已知的亚型程序存在部分交叉，同时捕捉到了超越既有CRC分类器的互补性转录变异。
接下来，我们将这两个轴整合起来，构建了一个统一的上皮可塑性景观框架（图1e）。为此，我们基于PC1+/-和PC2+/-前50个探针中彼此互斥的探针的表达值构建了扩散图（n（PC1+、PC1-、PC2+、PC2-）分别为47、46、47和46），从而捕捉转录变异的主要来源及其正交来源。该方法在共享的连续低维流形中，同时捕捉了不同样本之间主要转录程序和正交转录程序的相似性。在这一嵌入空间中，代表吸收/代谢、EMT相关可塑性、分泌以及干细胞样程序的标志基因，与相应的上皮轴相一致（图1e）。此外，胎儿/再生特征和肠道干性特征标记了该景观中DC1轴的不同端点（图1g）。这些分析证实了该投影具有生物学可解释性，并构建了连续性的CRC干细胞状态景观。
为评估临床或基因组特征是否定义了上皮景观的部分区域，我们将主要特征投影到扩散嵌入空间中（补充图3）。临床数据以及常见的驱动基因突变（
KRAS
/
NRAS
、
APC
、
TP53
和
FBXW7
）均未形成
离散的细胞簇，表明上皮细胞轨迹并非主要由基因型或样本来源所决定。尽管如此，RAS通路（KRAS/NRAS）中的激活性突变与沿主要扩散轴（DC1）的位移相关（线性模型，p < 0.001），而与正交轴（DC2）未显示出显著相关性（p = 0.22）。值得注意的是，KRAS/NRAS状态所解释的方差比例较小（DC1，R² = 0.15），表明这些突变会使细胞沿轨迹发生偏移，但并不决定该轨迹的整体结构。需要指出的是，KRAS/NRAS与炎症性/胎儿样再生程序之间的这种中等程度相关性此前已有报道[10, 11]。此外，PDO的解剖学位置（左侧结肠、右侧结肠或直肠）并未解释DC1（R² = -0.02，p = 0.87）或DC2（R² = 0.017，p = 0.17）中具有统计学意义的方差。总体而言，KRAS/RAS状态与肿瘤位置共同仅解释了DC1中15%的方差（p = 0.0013），而对DC2几乎没有解释作用（R² = -0.003，p = 0.43）。这些结果表明，上皮可塑性图谱主要由转录状态所支配，而非由离散的基因组改变所决定；致癌突变则发挥次要的调节作用。
综上，我们定义了一个连续的结直肠癌（CRC）上皮可塑性流形，其由两个相互独立且正交的生物学轴构成，分别代表不同的干性状态（成人样与胎儿样/再生性）以及代谢相关状态与可塑性相关状态。
多组学建模鉴定出上皮可塑性图谱中的PI3K/mTOR依赖性状态
接下来，我们旨在获得能够解释不同药物敏感性的基因表达模块，并评估其与上皮可塑性图谱之间的联系。为表征多种
诸如转录组学、基因组学和药物筛选数据等模态，我们构建了多组学因子分析（Multi-Omics Factor Analysis，MOFA）模型[15]。为提高分析的稳健性和可推广性，我们采用了发现队列和验证队列策略，将类器官药物库队列分为CRC1和CRC2两个队列，并将初始分析限定于包含药物-PDO组合的最大队列CRC1（52种药物-42个PDO），该队列覆盖了我们上皮细胞图谱的大部分区域（补充图4）。为验证MOFA分析结果，我们纳入了第二个队列CRC2（22个PDO和140种药物），其样本沿干细胞可塑性轴分布于相似区域。在MOFA模型中，我们采用了最常见的突变（至少在3位供体中发生突变，n=12）、变异程度最高的前10%基因的基因表达值（n=3812），以及52种药物的剂量-反应曲线下面积（AUC）值。该框架使我们能够以精细且稳健的方式考察药物-转录组-基因组轴。
MOFA分析最终收敛于6个具有不同关联模式的因子，这些因子累计解释了数据中67%的方差（图3a、b）。第一个潜在因子解释的方差最大，在数据集中累计达到20%，并参与了多种药物的反应（占药物方差的16%，补充图5）；该因子与基因表达（2%）以及突变（2%）的关联较弱。因子1与RAS突变状态和EGFR抑制剂耐药性呈现高度关联，后者是一种已得到广泛研究的药物-基因型关联[16]（补充图5）。
在药物-基因表达关联的背景下，信息量最大的潜在因子是第二个因子（F2）：其同时解释了基因表达方差（6%）和药物反应方差（11%）。因子2的最高药物载荷为
包括 PI3K/mTOR 通路抑制药物，如 Vistusertib、Gedatolisib、Taselisib 和 Everolimus。研究还纳入了 RAS/MAPK 信号通路抑制剂（MEK 抑制剂、BRAF 抑制剂），这类药物已知与 PI3K/mTOR 通路相互作用；此外，还包括多靶点酪氨酸激酶抑制剂和 CBP/β-catenin 抑制剂（图 2b–c）。同样，Factor 2 高表达与低表达类器官之间的 AUC 也存在显著差异（图 2d）。值得注意的是，靶向 PI3K/mTOR 的化合物也位列 Factor 1 药物载荷最高的化合物之中，但总体而言，其与 Factor 1 的靶标关联弱于与 Factor 2 的关联（图 2b）。
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图 2.
MOFA 鉴定出连接结直肠癌类器官药物反应、基因表达和突变状态的潜在轴。
(a)
对队列 1（探索队列）结直肠癌样本中的药物反应、基因表达和突变状态进行 MOFA 分析。作为 MOFA 的输入，采用变异性最高的 10% 探针（n=3812）、经 DMSO 归一化的 52 种药物 AUC 值，以及在至少 3 个样本中发生突变的基因（n=12）。共获得 6 个不同的潜在因子。潜在因子解释的方差以颜色表示，范围从低（白色/绿色）到高（深蓝色）。
(b)
因子 1 和因子 2 的药物载荷。图中突出显示靶向 PI3K/mTOR 的药物。
(c)
与 MOFA 因子 2 关联度最高的药物。图中显示排名靠前药物的因子权重。
(d)
因子 2 数值最高与最低的类器官对所选药物（因子 2 载荷最高）的反应。所有 p 值均采用 Wilcoxon 秩和检验（双侧）计算。
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图 3.
PI3K/mTOR 依赖性特征与上皮可塑性程序相关。
(a)
对因子 2 载荷进行基因集富集分析。基因按其因子 2 权重排序（补充表 5）。标准化富集分数为
计算了 Reactome 通路特征。
(b)
与 MOFA 因子 2 相关性最高的基因。展示排名最高基因的 Z 标准化因子载荷值。此前与胎儿或再生性干细胞特征相关的基因以不同颜色标示；纳入考虑的特征包括 Mustata 等（2013）[17]、Gregorieff 等（2015）[18]、Yui 等（2018）[19]、Ayyaz 等（2019）[20]、Wang 等（2019）[7]、Moorman 等（2025）[8]、Merlos-Suárez 等（2011）[21] 以及 Mzoughi 等（2025）[10] 发表的特征。
(c)
因子 2 载荷中胎儿/再生性干细胞特征和肠道干细胞特征的富集评分。根据基因的因子 2 权重对其进行排序，并针对每个特征基因计算富集评分。
(d)
两个 PDO 系（mTOR 耐药型 D172 和 mTOR 敏感型 D174）中 ANXA1、OLFM4 和 DAPI 染色的代表性图像。展示分离通道以说明标志物特异性的染色模式。比例尺为 100 µm。
(e)
胎儿-mTOR 依赖性基因集（FMD 基因集）与此前发表的胎儿/再生性特征之间的重叠。
(f)
FMD 特征在 CRC 干细胞可塑性轴上的映射。FMD 评分定义为前 50 个正载荷基因的平均 Z 标准化表达值减去前 50 个负载荷基因的平均 Z 标准化表达值。将 FMD 评分分别对 DC1 和 DC2 进行回归分析，R² 值表示可解释的方差比例。较高和较低的 FMD 评分分别以红色和蓝色表示。
(g)
在发现队列和验证队列中，与因子 2 高度相关的三种药物的 AUC 值与 FMD 评分之间的关系。采用 Pearson 相关分析展示 FMD 评分与 AUC 值之间的相关性。
随后，我们对 F2 进行了表征，并推导出与 PI3K/mTOR 敏感性相关的基因】【。
模块，整合其与基因表达、药物敏感性和上皮可塑性轴的关联。F2载荷较低的样本，即对mTOR敏感的PDO，富集于胎儿样/再生性程序，包括炎症、干扰素和免疫系统激活；而耐药样本则表现出吸收性和代谢程序的激活增强（图3a-c）。值得注意的是，与已发表的胎儿特征进行比较后发现，F2相关性最高的基因仅存在部分重叠（36个独特基因和14个共有基因，图3E），这提示F2所代表的胎儿-mTOR依赖性程序既包含已确立的胎儿样程序，也包含此前未被认为与干性程序相关的其他胎儿状态基因和mTOR依赖性基因（补充图6）。这些结果表明，F2所代表的胎儿-mTOR依赖性程序既涵盖已确立的胎儿样程序，也包含更多此前未与干性程序相关联的胎儿状态基因和/或mTOR依赖性基因。与这一解释一致的是，对两个具有代表性的PDO进行免疫荧光染色显示，与耐药PDO相比，mTOR敏感PDO中ANXA1（胎儿标志物，也是因子2中载荷最高的基因）表达升高，而OLFM4（LGR5+干细胞标志物）不表达（图3d）。为量化这一mTOR依赖性轴，我们将mTOR敏感性评分（胎儿-mTOR依赖性评分，FMD评分）定义为基于F2载荷排序后排名前50位和后50位基因的平均表达值之差。在两个类器官队列中，FMD评分均与mTOR抑制剂及CBP/β-catenin抑制剂的反应呈显著相关（AUC；Pearson r = 0.7-0.8；图3g左），并且这一关系在独立的药物库队列中得到了一致重复（Pearson r =
0.4-0.8；
图3g右侧），表明其在不同数据集中的稳健性。在所有因素中，FMD与上皮轴的关联最强，同时与PC1和PC2方向相关（Pearson r(F2+，PC1+| PC2+)和r(F2-，PC1-| PC2-) > 0.5），从而将mTOR敏感性与上皮可塑性程序的特定组合联系起来（补充图7）。进一步将这些评分映射至上皮可塑性图谱后发现，富集mTOR依赖性的区域表现出更高水平的EMT-可塑性程序和胎儿/再生程序，以及更低水平的代谢程序和成人样程序（图3f）。
值得注意的是，第三个MOFA因子与RAS突变状态及代谢相关基因表达相关（因子负载为负，补充图8）。其他因子（因子4-6）仅解释了基因表达数据中的变异，因此并非后续分析的主要关注对象。
总之，将我们的CRC干细胞图谱与多组学建模方法相结合，使我们能够获得PI3K/mTOR依赖性的基因表达特征，并将其与处于胎儿/再生干细胞轨迹上的一组样本关联起来。
PDO和患者肿瘤中均保留了可塑性轴和PI3K/mTOR依赖性特征
接下来，我们考察了FMD特征如何与不同CRC数据集中的CRC干细胞可塑性轴相对应。为此，我们纳入了来源不同的人类MSS肿瘤表达数据集：PDO生物样本库、TCGA CRC（COAD/READ）中患者的整体肿瘤样本，以及通过单细胞RNA测序获得的CRC活检样本。这一综合评估旨在为跨平台和跨模态迁移研究发现奠定坚实基础。对于每个数据集，我们计算了各个样本在本研究队列中的不同可塑性轴上的FMD评分，并对其进行了表征。
以及在验证队列中，我们展示了上皮轴的存在及其与不同数据集中的 FMD 评分之间的关系。
首先，我们能够在外部 PDO 数据集中重现这些轴。为充分捕捉异质性，我们整合了来自三个不同 PDO 队列的 RMA 标准化微阵列表达数据（n=78）[22–24]。在基于轴基因构建的扩散图中（图 4a），来自不同独立队列的样本沿轴分布的位置相互重叠，并未主要按队列聚类（补充图 9a）。重要的是，基于轴基因构建的扩散图揭示了与我们此前分析所得相同的上皮状态空间，该空间由标记基因定义，其中包括一条以对 mTOR 抑制剂敏感为特征的子集轨迹。类似地，轴基因的表达呈现连续梯度，各队列中的样本均沿这些轨迹排列（补充图 10a）。这表明，整合多个数据集对于覆盖单个数据集未能涵盖的更高程度异质性至关重要。这些结果说明，我们的上皮可塑性轴（包括 FMD 轨迹）可在其他独立 PDO 数据集中重现。
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图 4.
上皮可塑性轴及 PI3K/mTOR 相关特征在独立 CRC 数据集中具有保守性。
在独立 CRC 数据集中展示胎儿样–mTOR 依赖性（FMD）轴（MOFA 因子 2 转录特征），包括：（a）三个 CRC PDO 生物样本库；（b）TCGA CRC 队列（COAD/READ）；以及（c）六个 CRC 单细胞数据集。对于 PDO 和 TCGA 数据集，使用上皮可塑性轴基因构建扩散图，并将代表性标记基因的 z 标准化表达值投影到嵌入图中。
从阴性（蓝色，mTOR抑制剂敏感/胎儿标志物水平高）到阳性/高水平（红色，mTOR抑制剂耐药、胎儿标志物水平低）。对于单细胞数据集，PC1和PC2上皮程序评分计算为阳性端基因与阴性端基因平均表达量之差，并将代表性标志基因的标准化表达值投影到弥散嵌入图上，颜色由低水平（深洋红色，mTOR抑制剂敏感）渐变至高水平（绿黄色，mTOR抑制剂耐药）。将胎儿/再生及肠道干细胞特征评分映射至嵌入图中，以评估上皮可塑性程序的保守性。在不同数据集中，FMD评分通常与上皮可塑性轴一致，支持上皮状态与PI3K/mTOR反应程序之间存在保守关联。
（d）
TCGA CRC中FMD特征与无进展生存期的关联。使用FMD评分的中位数，将样本分为FMD高组（mTOR抑制剂耐药/胎儿标志物水平低）和FMD低组（mTOR抑制剂敏感、胎儿标志物水平低），并通过Kaplan–Meier分析比较无进展生存期。
我们的第二个验证模型分析了来自TCGA患者大体积组织CRC数据集的表达值（经TPM标准化；COAD/READ，n=466）。在弥散图中，样本在两个轴以及两个队列（COAD和READ）上呈现相同的梯度，而未形成明显的离散簇（图4b，补充图10b）。在单基因层面，尽管大体积组织测序导致了一定异质性，PC基因模块仍保持连贯，并沿各条独立轨迹形成连续梯度（补充图11b）。如预期，在大体积组织背景下，部分样本中多个程序会同时被激活，而这些程序
可能受到间质细胞等非癌细胞的影响[25]。因此，即使在更具异质性的模型中，我们也可以将批量组织样本投影到我们的坐标轴上，并展示其沿同一上皮可塑性景观呈现的连续梯度表达模式。
在这一框架下，既定的CRC亚型并未形成离散的聚类，而是沿上皮可塑性景观呈连续分布（补充图11c）。CMS2和CMS4样本在代谢相关区域和EMT相关区域中富集，而CMS1和CMS3则趋向于更偏胎儿样或再生状态的区域，这与不同亚型定义之间存在重叠的转录程序相一致。值得注意的是，通常与微卫星不稳定性样本（MSI）及免疫浸润相关的状态，即使在微卫星稳定性（MSS）肿瘤中也能够检测到。此外，KRAS突变肿瘤更倾向于位于景观中胎儿样/再生状态的一端，这与我们的PDO分析结果一致，并且可能反映了与这些突变相关的炎症信号增强。这些结果进一步支持这样一种观点：这些程序反映的是共享的生物学状态，而非严格由基因型定义的类别。
临床和基因组变量并未沿该轨迹将样本划分为离散组别，而是表现出适度且具有轴特异性的影响（补充图10c）。线性模型分析显示，肿瘤部位、组织学亚型和KRAS状态共同解释了DC1中有限比例的方差（R² = 0.26），以及DC2中的有限比例方差（R² = 0.17）。效应量分析进一步表明，组织学对DC1和DC2的影响最强（Cliff’s δ分别为0.8和-0.6），而肿瘤部位和KRAS状态仅表现出较小或可忽略的影响（δ < 0.33）。这些结果证实了我们此前的 乐彩
我们在 PDO 生物样本库中的分析表明，上皮可塑性图谱主要由转录状态主导，而临床和基因组特征仅发挥次要的调节作用。
TCGA COAD/READ 数据使我们能够检验无进展生存期（PFS）与 FMD 评分之间的关联。按 FMD 评分中位数将样本分为高分组和低分组后，两组的 PFS 存在显著差异（log-rank p = 0.046，图 4d）；其中，mTOR 敏感性（低 FMD 评分，属于胎儿/再生干细胞轴的一个子集）与较差结局相关。相比之下，FMD 评分与总生存期的关联未达到统计学显著性（log-rank p = 0.58，补充图 10d）。此外，在单变量分析中，FMD 评分作为连续变量与 PFS 显著相关（HR = 0.79，95% CI = 0.63–0.98，p = 0.033，补充图 10e）；在校正年龄、性别和病理分期的多变量 Cox 比例风险分析中，该评分也与 PFS 显著相关（HR = 0.74，95% CI = 0.55–0.99，p = 0.042，补充图 10f）。这些结果表明，较低的 FMD 评分与进展风险增加之间存在独立关联。
最后，我们分析了来自四项独立研究的六个数据集中的单细胞 CRC 恶性上皮细胞样本（n = 123,000）[26–29]。鉴于单细胞表达数据固有的稀疏性和技术噪声，我们分别为 PC1 和 PC2 模块构建了程序评分，计算方法为以 PC+ 基因的平均表达值减去 PC− 基因的平均表达值。在 PC1 对 PC2 的程序评分图中，恶性细胞在几何空间和表达模式上均沿两个连续轴分布，而非形成离散簇（图 4c，补充图 11a）。根据我们所定义各轴的代表性标志物表达，上皮生物学
这些程序在连续谱的不同区域被激活。此外，样本并未按照数据集聚类，这意味着我们的坐标轴捕捉到的是上皮生物学特征，而非数据集特异性效应，并且能够捕捉总体性的上皮状态（补充图11b）。有趣的是，在单个肿瘤内部，多种上皮状态可以共存，但其具体组成因患者而异（补充图11c），这反映了恶性上皮细胞的肿瘤内异质性和可塑性。我们证明，在单细胞分辨率下，恶性肿瘤细胞占据了与患者来源类器官（PDOs）中定义的相同的连续二维可塑性空间。
可塑性坐标轴上的FMD梯度揭示了不同队列中mTOR敏感性的稳定空间模式。我们将FMD评分建模为潜在扩散成分或主成分（PC）评分的函数。在不同数据集中，FMD评分均可由这些坐标轴的线性组合较好地近似，从而在PC1–PC2空间内定义出一致的方向。mTOR抑制敏感区域的空间分布及其数学表征在不同系统之间均高度一致。这些结果表明，mTOR依赖性并不对应于单一的上皮细胞身份，而是与多种可塑性程序的组合相一致；相关区域在不同实验系统之间具有保守性。
因此，我们对类器官、临床及单细胞数据集进行的广泛分析表明，我们能够将此前鉴定的CRC干细胞发育坐标轴投射到不同粒度的肿瘤中，并验证具有胎儿样-mTOR依赖性特征的肿瘤细胞代表再生性/胎儿样干细胞状态的一个亚群，且与不良结局相关。
PI3K/mTOR依赖性与适应能力的缺失相关。
由于mRNA翻译受抑而导致的能力
为探究所观察到的mTOR依赖性的机制基础，我们利用基于MOFA获得的因子2载荷，选取了由8个PDO组成的代表性队列，其中包括敏感性轴上最高（n=4）和最低（n=4）的极端样本（图5a）。为进行全面分析，我们开展了mTOR抑制剂药物扰动实验（并以SN38作为对照），并在扰动前后分别获取RNA测序、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据。利用RNA测序和蛋白质组学对这些PDO进行基线表征，证实FMD特征在两种组学层面均得到了稳健保留（补充图12）。基于RNA测序数据的GSEA证实，mTOR敏感性（图5b）与上皮发育和炎症程序以及干扰素信号传导显著相关，这与此前基于微阵列数据获得的分析结果一致（图3a）。此外，RNA测序数据集还识别出其他与敏感性相关的通路，即YAP-Hippo通路上调，以及翻译机制组分下调（图5b）。在具体考察PI3K和mTOR信号传导时，敏感性与Hallmark PI3K/AKT/mTOR特征的转录组富集增加相关[30]，这一关联部分由衔接蛋白PIK3AP1驱动；PIK3AP1是因子载荷最高的基因之一，此前已被证实与PI3K/AKT通路激活相关[31]。然而，这种转录层面的关联并未转化为功能性通路活性的增加。相反，蛋白质组学GSEA和推断的激酶活性分析均显示，mTOR敏感PDO中的PI3K/mTOR信号轴受到显著抑制（图5c-d）。具体而言，敏感PDO表现出
MTOR、AKT1 以及 RPSKA1 的激酶活性降低，提示转录组状态未能转化为活跃的信号传导。通过整合敏感组之间的转录组和蛋白质组变化，我们识别出 EIF4E 和 RPS6KA1 等对翻译至关重要的信号组分；这些组分表现出明显的脱耦特征，即 mRNA 丰度较高，但蛋白质水平显著降低（图 5e）。相比之下，PI3K/mTOR 通路的其他组分，特别是 SLC2A1 和 SFN 等代谢适配蛋白，在 mTOR 敏感的 PDO 组中呈现协同上调。翻译机制受到抑制（图 5b），为观察到的蛋白质组瓶颈提供了一种可能的机制：在敏感模型中，PI3K/mTOR 信号传导受限于翻译产出不足。因此，通路抑制剂对 PI3K/mTOR 信号传导的进一步抑制，可能构成这些肿瘤细胞的一种特异性脆弱性。两个驱动这种胎儿样、依赖 mTOR 的状态的因子，在 RNA 水平显著上调后，在敏感 PDO 的蛋白质组水平上也仍保持上调。钙结合蛋白 ANXA1 和 B 细胞适配蛋白 PIK3AP1 可能成为 FMD 状态的生物标志物（图 5f）。
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图 5.
PI3K/mTOR 依赖性与适应能力缺失相关，而适应能力缺失是由 mRNA 翻译受抑所致。
(a) PDO 沿 FMD 轨迹的分布（MOFA 因子 2 载荷），并标示出敏感性轴上的极端样本；这些样本被选用于扰动实验。
(b) 基于 RNA-seq 数据的 GSEA，显示基线时与 mTOR 依赖性相关通路的标准化富集分数（NES）。通路活性分析采用 Reactome 通路［33］。
(c) 转录和蛋白质组层面的变化……
Hallmark特征[30]，以mTOR敏感型PDO相对于耐药型PDO的NES表示
(d)
敏感型与耐药型PDO中关键调控激酶的推断活性。
(e)
散点图显示PI3K-AKT-mTOR Hallmark特征在RNA与蛋白质水平之间发生的解耦，以敏感型与耐药型PDO之间的log₂倍数变化（LFC）表示。
(f)
两种FMD轴极端状态代表性PDO中ANXA1和PIK3AP1的基线表达（方差稳定化计数，VST计数，左；归一化蛋白强度，右）。
(g)
SN38和mTOR抑制剂处理后，PDO中基于RNA-seq的FMD、胎儿型和LGR5-ISC基因集富集分析（GSEA）的NES。
(h)
mTOR抑制下敏感型和耐药型PDO的转录组与蛋白质组响应，以Hallmark特征和GO生物过程GSEA后的NES表示（相对于DMSO对照）。
(i)
mTOR抑制后两组PDO中关键信号传导及细胞周期节点的推断激酶活性，相对于DMSO对照。所有p值均采用Wilcoxon秩和检验（双侧）计算。
此前对FMD特征的表征确立了一个相互对立的干性程序轴：胎儿样特征与因子2负向表达载荷（FMD评分为负）相关，而稳态ISC-Lgr5特征[21]则与之呈负相关，其峰值反而出现在不依赖PI3K/mTOR的因子2正向载荷（FMD评分为正）中（图3c）。与这种成体干性耗竭相一致，磷酸化蛋白质组学分析显示，PI3K/mTOR敏感型PDO中的GSK3B活性升高（图5d）。鉴于GSK3B是Wnt/β-catenin级联反应的负调控因子[32]，其高活性可能解释了这些PDO中由Lgr5+驱动的干性的丧失。这提示，
CRC中的mTOR依赖性是特定细胞转变为胎儿样状态后产生的一种新兴特征。在这一状态下，由Wnt驱动的稳态ISC信号受到抑制，并被一种依赖mTOR的发育程序所取代。
为确定mTOR依赖性PDO的胎儿样状态在接受化疗药物（SN38，即前药伊立替康的活性代谢物）和mTOR抑制剂（Vistusertib）药物扰动后如何发生变化，我们在代表性PDO队列中，从转录组和蛋白质组两个层面定量分析了FMD特征、胎儿特征以及ISC-Lgr5干性特征的富集情况（图5g）。与已有关于化疗诱导CRC中胎儿样可塑性选择的研究结论一致[10]，SN38处理后，mTOR敏感型和耐药型PDO均表现出FMD特征和胎儿特征的转录富集。与SN38所引发的更为广泛的反应不同，使用Vistusertib抑制mTOR后，干性程序的诱导呈现出显著差异。相较于各自的DMSO基线，Vistusertib在mTOR敏感型模型中强烈诱导了胎儿特征和FMD特征（NES > 1）；而在PI3K/mTOR通路受到抑制的条件下，耐药型模型则表现出胎儿特征受到抑制（NES < 0）。
通路分析（GSEA）显示，Vistusertib介导的mTOR抑制作用于预期靶点：在转录组和蛋白质组层面，分别表现为mTORC1信号以及核糖体相关机制（核糖体生物发生和rRNA加工）的下调（图5h）。在功能层面，这一结果同样得到印证：敏感型和耐药型PDO中的MTOR激酶活性均受到抑制（图5i）。然而，这两组模型表现出不同的适应性过程。
耐药性 PDO 在 RNA 水平诱导了代偿机制，其特征是翻译机器和 DNA 复制相关过程上调。这种转录活性的增强与 CDK2 活性升高相关，并提示细胞周期被诱导。相比之下，mTOR 敏感性 PDO 未能有效激活 CDK2，而是表现出较高的 CHEK1 活性；CHEK1 活性是复制压力或未解决的 DNA 损伤反应的标志，最终导致细胞死亡。
PI3K/mTOR 依赖性的胎儿型 CRC 干细胞状态由上调的 SRC 信号网络驱动
为进一步从功能层面解析驱动 FMD 表型的信号网络，我们在验证队列的 8 个 PDO 中对 277 种激酶抑制剂进行了全面分析（图 6a，补充表 6）。如果 mTOR 敏感性 PDO 组与另一组之间的 AUC 中位数差异超过 10%，并且基于 PDO 之间的总体方差达到显著效应量（Cohen’s d > 0.8），则认为该激酶抑制剂在 mTOR 敏感性 PDO 组中具有差异性活性。在所分析的抑制剂中，mTOR 敏感性 PDO 对 14 种化合物表现出选择性敏感性。除 mTOR 抑制剂外，这些化合物还包括靶向 Src 家族激酶（SFKs）的抑制剂，具体为 A419259（Cohen’s d = 1.52，p = 0.057）和 Saracatinib（Cohen’s d = 1.51，p = 0.057），以及选择性 BTK 抑制剂 Ibrutinib（Cohen’s d = 1.59，p = 0.057）（图 6b）。
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图 6.
mTOR 依赖性的胎儿型 CRC 干细胞状态与上调的 SRC 信号网络相关
(a) 激酶抑制剂分析结果的瀑布图，鉴定出在 mTOR 敏感性 PDO 中具有选择性疗效的化合物（蓝色）。根据 FMD 轴两端各 4 个 PDO 之间 AUC 中位数的差异进行排序。
(b) 箱线图显示了 the
对在mTOR敏感PDO中具有选择性活性的SRC和BTK抑制剂的AUC。
(c) 基于RNA测序数据的GSEA显示了与SRC通路相关的Hallmark和Reactome通路的标准化富集评分（NES），并用于通路活性分析。
(d) SRC家族激酶、相关激酶及下游效应因子TEAD1的基线表达（VST计数）和蛋白丰度（标准化强度）。
(e) mTOR敏感型和耐药型PDO中PIK3AP1在S759位点的磷酸化标准化强度。
(f) SRC和胎儿状态相关转录因子活性的DoRothEA转录因子活性与FMD评分的相关性。
(g) 展示FMD状态下SRC-mTOR轴的信号网络模型。该模型强调，上游效应因子（生长因子受体、趋化因子受体和整合素）汇聚于SRC家族激酶（FYN、YES1），后者通过招募PIK3AP1作为放大器，维持PI3K-mTOR信号传导，从而维持蛋白质翻译，并与平行的增殖和存活通路（MAPK、STAT3、YAP）协同作用。d表示使用Cohen’s D计算的效应量。所有p值均采用Wilcoxon秩和检验（双侧）计算。
为探究两组PDO之间的基线差异如何与这种选择性敏感性相关，我们在RNA和蛋白质水平进行了GSEA。我们在两个组学层面均鉴定出多个与SRC激活相关的富集通路，例如整合素细胞表面相互作用、GPCR配体结合，以及B细胞受体和酪氨酸激酶介导的信号传导（图6c）；SFKs在其中充当信号转导因子[34]。此外，我们还发现SFK信号级联下游的其他通路也出现上调，例如IL6-JAK-STAT信号通路（图6c）。
分子验证及对……的研究
驱动SFK相关通路富集的前沿基因进一步证实，所观察到的敏感性是由特定的SFK成员驱动的，而非由c-Src本身驱动。对mTOR敏感的PDO显示出显著更高的YES1（p = 0.029）和TEAD1（p = 0.029）基础蛋白丰度，同时LYN、FYN和BTK的RNA表达水平也升高（图6d）。总体而言，SRC通路的激活与CRC组织重塑过程中所涉及的再生性胎儿样重编程相关[19]；但已有研究报道，YES1可特异性地促进YAP定位于细胞核[35]，而转录因子TEAD的存在是使YAP能够结合DNA的必要条件[36]。除对YAP的影响外，YES1等Src家族激酶的活性似乎也是MTORC1激活所必需的[37]。因此，TEAD1与YES1的共同表达可能为mTOR敏感PDO中富集的胎儿样转录程序提供一种机制性联系。
为进一步探究导致这种敏感性的信号网络，我们检测了FMD特征中富集的关键衔接蛋白PIK3AP1的磷酸化状态，该蛋白将SFK信号与PI3K激活联系起来（图3b）。mTOR敏感PDO中的PIK3AP1蛋白丰度不仅高出4倍以上（图5f），而且我们还检测到PIK3AP1在丝氨酸759位点发生磷酸化（图6e）；已有研究表明，这种PIK3AP1修饰可在B细胞和T细胞受体激活后出现，随后伴随PI3K/mTOR信号通路上调[38]。在B细胞受体信号传导过程中，该通路在mTOR敏感PDO中无论从蛋白质水平还是RNA水平来看均呈富集状态（图6c）；BTK或SYK介导的PIK3AP1磷酸化是为PI3K的p85亚基提供结合位点所必需的，
从而促进 PI3K 的激活［31，39］。有趣的是，在 mTOR 敏感型 PDO 中，BTK 和 SYK 的表达水平均升高（图 6d）；而 BTK 抑制则选择性地影响 mTOR 敏感型 PDO，这提示 BTK 介导的过程在 mTOR 依赖型 PDO 的存活中发挥着关键作用。
近期研究表明，PIK3AP1 的作用远不止将 B 细胞受体信号传递至 PI3K；在初级免疫应答中，PIK3AP1 还与 Toll 样受体（TLR）以及白细胞介素-1（IL-1）家族受体相关［40］。鉴于我们发现干扰素和白细胞介素信号在 mTOR 敏感型 PDO 中均呈上调状态（图 5b），我们的数据表明，PIK3AP1 可能是 SFK-mTOR 存活轴中的核心信号整合节点。
最后，我们评估了该枢纽下游转录因子的活性。在由 42 个 PDO 构成的初始发现队列中，我们发现 AP1、STAT3 和 YAP1 的活性与 FMD 评分呈显著相关（R² 分别为 0.43、0.37 和 0.39；图 6f）。其负向端代表胎儿样的 mTOR 依赖状态。值得注意的是，这些转录因子不仅与 SRC 信号传导相关，近期还被发现与 CRC 中处于可塑性状态的胎儿样干细胞相关［10，14］。这提示，YES1-YAP1 轴和 SFK-AP-1 轴是这些 PDO 中所观察到的胎儿样 mTOR 依赖状态下，再生性胎儿样干性程序的主要驱动因素。总体而言，这些发现支持这样一种模型：在胎儿样 mTOR 依赖型 PDO 中，Src-YAP 信号和类 BCR 信号（通过 BTK 和 SYK）在 PIK3AP1 处汇聚。尽管 mTOR 介导的翻译活性降低，该网络仍可能维持 PI3K/mTOR 信号传导以及胎儿样程序（图 6g）。
讨论
我们的研究
通过整合大规模PDO队列的转录组、基因组及大规模药物扰动谱分析，并在患者肿瘤和类器官数据集中对这些发现进行广泛验证，本研究对结直肠癌干细胞状态开展了全面的多组学与功能分析。由此，我们描绘了CRC成人型及胎儿型/再生型干细胞状态的图谱，并鉴定出潜在可干预的依赖关系，例如SRC/mTOR轴；随后，我们进一步通过蛋白质组学和功能性激酶抑制剂谱分析对该轴进行了研究。
近期的单细胞图谱显著推进了人们对CRC细胞异质性和发育可塑性的认识（参见综述［5］），并鉴定出CRC中的不同干细胞状态，例如增殖型和复苏型癌症干细胞［9］，或沿MAPK活性梯度组织的类器官发育轨迹［11，12］。然而，这些方法在很大程度上仍停留于描述性层面，对于具有治疗作用的依赖关系及其背后的机制所提供的见解有限。因此，将细胞状态与功能性扰动联系起来是一项重要任务［13］。通过将大规模患者来源类器官队列与系统性药物筛选相结合，我们系统地鉴定出一系列连续的发育轨迹，其范围从类似成人肠道干细胞的状态延伸至再生型/胎儿型状态，并且这些轨迹在类器官、肿瘤整体样本和单细胞数据集中均具有保守性（图4）。我们证明，胎儿型/再生型特征是细胞固有的状态，这与既往研究所显示的此类状态可在外部刺激下被激活相互补充［14］。这些发现支持这样一种观点：CRC干细胞状态并非彼此离散的实体，而是沿着由细胞可塑性塑造的动态发育连续谱存在。
以及与再生/胎儿可塑性相关的程序。
重要的是，我们的数据表明，功能表型分析能够发现仅凭转录组分析难以识别的、具有生物学和治疗学意义的脆弱性。尽管FMD轨迹显示出升高的mTOR相关转录程序，但蛋白质组学分析揭示了与翻译相关过程受到抑制（图5），提示转录水平的通路激活与蛋白质翻译之间存在脱节。这与一个已被广泛确立的观察结果一致，即mRNA丰度并不一定能够预测蛋白质丰度，后者还取决于翻译水平、蛋白质稳定性及其周转过程[41]。尤其是，既往研究报道，与RNA加工和翻译相关的通路通常表现出相对较低的RNA-蛋白质一致性[42]。
在此背景下，FMD高分PDOs对PI3K/mTOR抑制表现出显著敏感性，尤其是对mTORC1/2双重抑制剂Vistusertib和PI3K/mTOR抑制剂Gedatolisib的敏感性，这提示这些PDOs依赖于一种受限且具有治疗脆弱性的mTOR信号状态。一种可能的解释是，mTOR相关程序在转录水平上的上调，反映了蛋白质组层面翻译通路输出降低所引发的代偿性反应。因此，进一步药理学抑制该轴可能会超出胎儿样CRC细胞的适应能力，从而导致其对PI3K/mTOR通路抑制产生选择性敏感性。
除PI3K/mTOR依赖性外，我们还将FMD评分与一个处于激活状态的SRC相关信号网络联系起来，该网络作用于mTOR信号的上游。mTOR依赖性PDOs对SRC家族激酶抑制剂和BTK抑制剂表现出共同敏感性，这提示大小规律
上游 SRC/BTK 相关信号传导有助于维持 FMD 状态。与此一致，我们整合药物谱分析、转录组学、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析的结果支持这样一种模型：SRC/YAP 相关信号[
43
]与 BCR 样信号在 PIK3AP1 处汇聚，从而维持 PI3K/mTOR 通路活性[
31
,
39
]以及胎儿样转录程序，尽管与翻译相关的蛋白质产出有所减少。鉴于近年来人们重新关注 SRC 家族激酶，尤其是将 YES1 视为治疗耐药的介导因素[
43
,
44
]，这一点尤为值得注意。尽管 SRC 抑制剂作为实体瘤单药治疗时历来疗效有限，但我们的数据表明，胎儿样、mTOR 依赖性 CRC 模型可能代表一种更为明确的分子情境，在该情境中，SRC/BTK 相关信号传导促成了一种可靶向的适应性状态。
总体而言，这些发现表明，胎儿样、mTOR 依赖性 CRC PDO 并非普遍具有治疗耐药性，而是处于一种具有独特可靶向依赖性的特异性信号状态。因此，干扰上游 SRC/BTK 相关输入信号或下游 PI3K/mTOR 信号传导，均可能破坏支持该状态的适应性信号网络。更广泛地说，这些数据凸显了整合功能扰动方法如何通过解析肿瘤干细胞状态内部机制上不同且具有治疗可操作性的亚群，来进一步完善 CRC 的分子分类。
迄今为止，尽管 PI3K/mTOR 信号轴在 CRC 中经常被激活，但在结直肠癌中靶向 PI3K/mTOR 通路的临床治疗显示出的疗效仍然有限[
45
]。这可能部分反映了 CRC 的生物学异质性和可塑性，以及缺乏能够实现患者分层的生物标志物。我们的数据
提示，对 PI3K/mTOR 抑制的敏感性可能并非普遍与由突变驱动的经典通路激活相关，而是与一种独特的再生性/胎样肿瘤细胞状态相关。该状态的特征包括翻译适应能力受损以及 SRC 相关信号传导。上述发现可能为 PI3K/mTOR 靶向疗法在 CRC 中成效有限提供潜在解释，并支持这样一种观点：发育性肿瘤状态可为未来联合治疗的分层策略提供依据。
应当指出，本研究存在若干局限性。首先，尽管患者来源的类器官保留了关键的上皮肿瘤内在程序，但其无法完全再现与肿瘤微环境之间的相互作用，而后者可能进一步影响干细胞可塑性和治疗反应。在这一背景下，由于混杂了基质细胞和免疫细胞群体，整体肿瘤转录组的解读仍具有挑战性，这一点已在既往结直肠癌分类研究中得到指出。我们整合单细胞数据集，在一定程度上弥补了这一局限，证实所识别的发育梯度存在于恶性上皮细胞群体内部。此外，尽管我们的分析将大规模类器官扰动谱分析与多个整体转录组及单细胞 CRC 队列中的验证相结合，但所识别的 SRC/mTOR 依赖性尚未在体内得到验证，因此仍需在生理复杂性更高的模型系统中开展进一步研究。
总之，本研究通过整合患者来源类器官药物扰动谱分析、转录组分析以及 CRC 单细胞数据，构建了连续性 CRC 干细胞状态的功能和分子图谱。除描述性细胞
图谱，该方法能够识别细胞状态轨迹的机制背景。具体而言，我们定义了一种再生性/胎儿样 CRC 状态，其特征为依赖 SRC 相关的 PI3K/mTOR 通路，并且翻译适应性受损。这些发现表明，功能谱分析能够补充分子分类方法，从而揭示 CRC 中具有生物学相关性且可能成为治疗靶点的肿瘤状态。
方法
患者
所有患者均招募自德国曼海姆海德堡大学医院。我们纳入了被诊断为微卫星稳定型（MSS）结肠癌和直肠癌的患者，并通过内镜从其原发肿瘤中获取活检样本，或通过超声引导下细针活检从转移性病灶中获取样本。排除标准为活动性 HIV、HBV 或 HCV 感染。患者的临床数据、肿瘤特征及肿瘤分子数据均经过假名化处理，并收集至数据库中。本文参与者的临床数据见补充表 1。本研究经海德堡大学曼海姆医学院医学伦理委员会 II 批准（批准编号：2014-633N-MA 和 2016-607N-MA）。所有患者均在进行肿瘤活检前签署了书面知情同意书。
类器官培养
按照既往报道的方法建立肿瘤活检样本来源的类器官 [
46
]。简而言之，活检样本经清洗后使用 Liberase TH（Roche）消化，随后包埋于 Matrigel（Corning）或 BME（Cultrex）中。Advanced DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific）培养基中加入 Pen/Strep（Gibco）、Glutamax（Gibco）和 HEPES（Gibco），并补充 100 ng/ml Noggin（PeproTech）、1× B27（Thermo Fisher Scientific）、1.25 mM N-乙酰半胱氨酸（Sigma）、10 mM 烟酰胺（Sigma）、50 ng/ml 人 EGF（Peprotech）、10 nM 胃泌素
（Peprotech）、500 nM A83-01（Biocat）、10 nM 前列腺素E2（Santa Cruz Biotechnology）和100 mg/ml Primocin（Invivogen）。解冻并传代后加入10 µM Y-27632（Selleck chemicals）。类器官每7–10天传代一次，每2–3天更换一次培养基。
药物谱分析
药物谱分析按照既往发表的方法进行，并作少量调整[46,47]。为进行细胞接种，将类器官置于TrypLE Express（Gibco）中，于37°C孵育，直至获得小型细胞团和单细胞。通过使用1000 µl移液器进行机械剪切辅助化学解离，并通过光学显微镜目视监测消化过程。将类器官碎片通过40 µm滤网（pluriSelect）过滤，以避免形成较大的类器官团块，随后进行定量。培养基中补充Y-27632，并加入生长因子降低型BME 2型，使其终浓度达到0.75 mg/ml（接种培养基）。接种时，将类器官重悬于50 µl接种培养基中，并使用多道分液器（Thermo Fisher Scientific）接种至384孔板中。接种后第3天进行药物处理。吸取并弃去培养基，加入45 µl新鲜培养基；药物预先用培养基稀释后，加入5 µl稀释药物。所有移液步骤均由Biomek FX^P^自动化设备（Beckman Coulter）完成。接种后第7天测定细胞存活率。吸取并弃去培养基后，向每孔加入30 µl未稀释的CellTiter-Glo®试剂（Promega）。室温孵育30分钟后，使用Mithras读板仪（Berthold Technologies）测定发光信号。
药物库
在两个亚队列中使用了两个临床药物库进行药物谱分析：一个包含140种药物的临床药物库，用于验证五分彩
由22种单独PDO组成的队列[47]涵盖了经FDA批准的、以癌症为靶点的小分子药物的全面选择（不包括抗体、抗体-药物偶联物，以及主要靶向免疫系统或肿瘤微环境的药物）。用于56种单独PDO药物发现研究的第二个队列包含该药物集合中一个经过筛选的子集，共有62种药物[46]。临床药物库中的药物及其最高浓度均根据对二维和三维细胞培养实验的文献综述以及我们此前开展的实验结果分别确定。此外，我们还采用包含277种化合物的激酶抑制剂库，对信号通路进行基于扰动的定位分析。该药物库见补充表6。在所有药物库中，每种化合物均以5种不同浓度进行筛选，各浓度之间按5倍梯度稀释。以5 µM硼替佐米作为阳性对照，以DMSO作为阴性对照。所有药物库均使用Biomek NX^P^自动化机器人系统（Beckman Coulter）以随机布局进行排列。药物购自Selleck Chemicals或MedChemExpress。
DNA测序
突变分析主要通过使用DKFZ-OTP流程[48]进行全外显子组测序，并结合此前发表的直肠癌类器官数据子集[47]完成。另一组此前发表的细胞系已按照前文所述方法[46]通过靶向扩增子测序完成表征。使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒（Qiagen）提取DNA。采用ANNOVAR[49]对变异进行注释；仅将同时满足以下条件的变异纳入进一步分析：位于外显子区或剪接区，被分类为“移码缺失”“移码插入”“非同义SNV”“终止获得”或“终止丢失”，等位基因频率>0.1，且存在于COSMIC数据库中。
蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析
结直肠癌患者来源类器官（PDOs）的蛋白质组学分析基本按照先前所述方法进行[47]。简言之，类器官沉淀在含盐酸胍的裂解缓冲液中裂解，经超声处理后进行过夜胰蛋白酶消化。采用SP3纯化流程对肽段进行纯化，并使用与Q Exactive HF Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific）联用的EASY-nLC 1200系统，通过纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC–MS/MS）在DIA模式下进行分析。使用Spectronaut软件（Biognosys）处理原始文件，并针对UniProt人类蛋白质组数据库应用directDIA工作流程。蛋白质定量和归一化采用Spectronaut集成分析流程完成。为考虑蛋白质组学数据固有的异方差性，使用R软件包vsn（v3.76.0）中提供的方差稳定化归一化（VSN）对所有强度值进行调整。
表达谱分析
按照生产商说明，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）提取类器官RNA。通过离心收集类器官沉淀，并在含1% β-巯基乙醇的RLT缓冲液中冷冻，随后进行RNA提取。
RNA测序由DKFZ测序核心设施采用TruSeq链特异性方案（Illumina）完成，数据使用DKFZ OTP流程进行处理[48]。对于微阵列分析，将样本杂交至Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片（Affymetrix）。
转录组学数据处理
对于内部PDO生物样本库，使用affy（v1.86.0）处理原始CEL文件，并采用稳健多芯片平均（RMA）归一化方法，包括背景校正、分位数归一化和探针汇总。基于对内部PDO微阵列数据进行的初步主成分分析（PCA），
样本按性别呈中度分离（补充图 1b）。类似地，X 或 Y 连锁基因与 PC1 轴呈中度相关（Pearson r(PC1, X) = -0.4 或 r(PC1, Y) = 0.3）。我们对性别因素进行了校正，以分离上皮生物学特征，并使用 limma（v3.64.3）中的 removeBatchEffect() 函数，将性别作为协变量对表达值进行建模。我们在后续分析中使用了批次校正后的表达值。
外部 PDO 队列的原始微阵列数据（Gene Expression Omnibus；GSE64392、GSE74843、GSE128213）通过 CEL 文件获取，并使用 oligo（v1.72.0）和 affy（v1.86.0）中实现的 RMA 标准化方法进行处理。样本限定为来源于原发性肿瘤的 CRC 类器官以及 MSS 病例。为实现跨数据集整合，我们合并了基因表达矩阵，并使用 sva（v3.56.0）中实现的 ComBat 算法校正由队列引起的批次效应。所得的标准化及批次校正后的表达矩阵用于后续分析。
TCGA-COAD 和 TCGA-READ 队列的基因表达数据来自癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（[
50
]，
）。分析限定为基于 MANTIS 评分分类为 MSS 的原发性肿瘤（按照 Kautto 等人 [
51
] 的建议，MSS 定义为 ≤ 0.4）。表达值转换为 log₂(TPM + 1)。共识分子亚型（Consensus Molecular Subtype，CMS）注释 [
2
] 来自已发表的分类结果，并与 TCGA 样本进行匹配。KRAS 突变状态源自 TCGA 体细胞突变数据，并整合用于后续的关联分析。
在单细胞分析中，我们使用了 Chu 等人 [
52
] 构建的 CRC 图谱，并将数据限定为具有足够恶性细胞代表性的研究数据集（来自四项不同研究的 n = 6，[
26
–
29
]）（>1,000 个恶性】【。
每个数据集的细胞数），并排除了息肉样本。由于原作者已完成预处理和质量控制，除去除在少于两个细胞中表达的基因外，未进行额外的质量控制筛选。对于涉及投影至上皮轴或标志物表达的分析，使用 Seurat（v5.3.1）对表达值进行 z 值标准化，并回归总 UMI 计数，以校正文库大小差异。
扩散图
我们使用 destiny（v3.22.0）中的 DiffusionMap() 函数，在默认参数下基于归一化基因表达值计算扩散图。对于内部 PDO 队列，我们使用经 RMA 归一化和批次校正的表达值。对于外部 PDO 数据集，我们使用整合后的 RMA 归一化表达值。对于 TCGA 数据，我们使用经 log₂(TPM+1) 转换的表达值。
基因选择基于内部队列先前降维分析所获得的主成分载荷。具体而言，我们针对 PC1 和 PC2 轴分别按照载荷进行排序，选取相互排斥的排名前 50 和后 50 个基因，从而捕获对各轴具有最强正向和负向贡献的基因。
使用 DPT() 函数推断扩散伪时间，并指定单个根端点（tips = 1）。提取第一个扩散伪时间成分，并将其作为样本水平的伪时间指标，用于后续分析。
基于置换的轨迹稳健性评估
为评估所观察到的轨迹是否可能由随机因素产生，我们从与基于 PC 的基因集规模相匹配的 100 个随机基因中生成扩散图，并重复 1000 次。对于每个随机基因集，我们计算伪时间与第一个扩散成分 DC1 之间的 Spearman 相关系数，从而生成伪时间–DC1 相关性的零分布。
相关性（补充图1d）。随后，将基于PC1和PC2获得的上皮基因集的观测相关性与该零分布进行比较。
基因表达模块的评估
为结合既往研究的背景对我们的上皮生物学轴和药物敏感性轴进行阐释，我们应用了多个来自不同生物学背景的已发表基因表达特征：i）胎儿/再生状态特征（补充表3）；ii）Hallmark基因集［30］；以及iii）CRC特异性基因特征（补充表4）。
为进一步表征与每条轴极端区域相关的生物学程序，我们对载荷值最强的基因进行了功能富集分析。我们分别从PC1或PC2的载荷中选取正载荷最高的前200个基因和负载荷绝对值最大的前200个基因。随后，使用gprofiler2（v0.2.3）中的gost()函数，分别对正基因集和负基因集进行富集分析，检验其在GO生物过程［53］、KEGG［54］和Reactome［33］通路中的过度表达情况。多重检验校正采用FDR方法，校正后p<0.05的条目被认为具有显著性。
为表示基因表达模块（例如FMD评分、PC1和PC2轴以及已发表的基因特征），我们针对每个样本，计算每个基因集内所有基因的z标准化表达值的均值，从而获得模块评分（对于每个基因，在所有样本中均值=0，标准差SD=1）。
多组学分析
为整合第一组CRC PDO队列（n=42）中的基因表达、药物反应和突变数据，我们采用了多组学因子分析（MOFA2 v1.13.0，［15］）。对于表达模块，我们根据变异系数选取变异性最高的前10%的探针，并
使用每个 PDO 和基因的平均 log2 转换表达值。对于药物反应模块，计算每个 PDO–药物配对的 DMSO 标准化 AUC 值的平均值。对于突变模块，合并经过严格过滤的外显子组突变数据（等位基因频率 > 10%）和扩增子突变检出结果，保留在至少 3 个样本中发生突变的基因，并将突变值编码为二元变量。
将这三种模态合并至同一个 MOFA 模型中，其中表达数据和药物反应数据采用高斯似然，突变数据采用伯努利似然。模型初始化为 7 个潜在因子，并使用默认设置进行训练，同时启用慢收敛模式、禁用随机推断，并固定随机种子为 42。训练过程中移除在每个视图中解释方差低于 1% 的因子。
生存分析
无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）数据取自 TCGA COAD/READ PanCancer Atlas 临床注释。生存时间以月为单位。分析中排除了生存状态缺失的样本。
使用 survminer（v0.5.1）中的 survfit() 函数绘制 Kaplan–Meier 生存曲线，并在适当情况下显示 95% 置信区间（CI）和风险表。
使用 survival（v3.8-3）中的 coxph() 函数，对 PFS 进行单变量 Cox 比例风险回归。分别独立检验各变量，包括 F2 评分、年龄、性别和病理分期。针对每个变量分别报告风险比（HR）、95% 置信区间（CI）和 Wald 检验 P 值。
采用多变量 Cox 比例风险回归，评估在校正临床协变量后，F2 评分是否与 PFS 独立相关。模型纳入 F2 评分、年龄、性别和病理 久久精品
将分期作为协变量。结果以校正后的风险比（HR）、95%置信区间（CI）和 p 值表示。HR 采用对数刻度显示。p 值低于 0.05 被认为具有统计学意义。
统计分析
采用线性回归模型评估分子特征与扩散成分（DC1 和 DC2）之间的关联。采用标准线性回归模型量化样本注释信息（例如肿瘤部位、组织学亚型和突变状态）与扩散成分（DC1 和 DC2）之间的关系。使用决定系数（R²）评估模型拟合度，并采用双侧检验评估各预测变量的统计学显著性。
基因集富集分析
在多个数据集中开展基因集富集分析。对于包括胎儿特征和 Lgr5+ 特征在内的专用自定义基因集，使用 fgsea R 软件包（v1.34.2）执行快速预排序 GSEA。采用 clusterProfiler 生态系统（v4.16.0）评估标准化功能注释；具体而言，使用 ReactomePA（v1.52.0）分析 Reactome 通路，并通过 gseGO 分析基因本体（GO）生物过程（BP）（使用 org.Hs.eg.db v3.21.0 进行映射）；此外，使用通用的 GSEA() 函数（MSigDBr，v25.1.1）获取 MSigDB Hallmark 通路集合 [
30
]。对于所有实现方式，输入数据均根据因子载荷或差异表达指标进行排序（DESeq2（v1.48.2）中的 Waldman 统计量，或 limma（v3.64.3）中的 t 统计量），并采用 p < 0.05 的显著性阈值。通过应用 Benjamini–Hochberg 程序控制错误发现率（FDR），评估统计学显著性。Hallmark 和 GO 富集分析仅限于包含 10 至 500 个基因的基因集。
基因。
激酶活性评分的推断
对原始磷酸化蛋白质组学强度进行筛选，保留在所有样本中缺失值低于20%的磷酸化位点，随后进行方差稳定化归一化（VSN）。在后续分析前，对重复的基因-磷酸化位点组合进行求和。采用R语言中的limma软件包（v）进行差异磷酸化分析。拟合包含处理条件和PDO作为协变量的线性模型，以校正类器官间的变异。对于每一组进行比较的条件，磷酸化位点在每个条件下均至少需要具有3个非缺失值。采用带趋势拟合和稳健拟合的经验贝叶斯调节，并将所得对比结果中的t统计量作为后续活性推断的输入。使用decoupleR软件包（v2.14.0）实现的加权平均富集方法（1000次置换），结合来源于OmniPath的激酶-底物网络，对激酶活性进行估计。仅保留磷酸化和去磷酸化相互作用，并移除调控模式相互冲突的任何歧义激酶-底物配对。测量位点少于5个的激酶被排除在活性评分之外。随后，使用PTMSigDB数据库（v2.0.0，登录日期：2024年7月12日）推断通路水平的活性。利用org.Hs.eg.db软件包（v3.21.0）将磷酸化位点标识符从基因符号映射至UniProt登录号，并采用相同的加权平均富集方法估计通路活性。通过基于置换的p值评估通路显著性，并使用整合活性幅度与统计显著性的综合评分（|score × -log10(p)|）对结果进行优先级排序。
免疫荧光染色与成像
包埋的PDOs经固定后，进行
用4%多聚甲醛固定，经1% BSA封闭后，分别与ANXA1（ab214486，Abcam）和OLFM4（#MAB9218，R&D Systems）的一抗孵育[55]，随后与适当的二抗孵育，并使用Hoechst 33324进行细胞核复染。采用Incell Analyzer 6000显微镜（GE Healthcare）在20倍放大倍数下采集图像，并使用FIJI（v 2.17.0/1.54p）对所有比较条件下的图像进行一致处理。
数据可用性
截至预印本发布时，本研究产生的数据集尚未公开。表达谱数据将存储于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中。蛋白质组学数据将存储于PRIDE数据库，并通过ProteomeXchange提供。来源于类器官模型的人类下一代测序数据将在适用情况下存储于或通过受控访问数据库提供，包括欧洲基因组-表型组档案（European Genome-phenome Archive，EGA）和/或德国人类基因组-表型组档案（German Human Genome-Phenome Archive，GHGA）。数据登录号将在论文最终发表版本中提供。对受控访问的人类序列数据的访问须经曼海姆大学医学中心和德国癌症研究中心（DKFZ）负责的数据访问委员会审查和批准，完成适当的数据传输协议或数据使用协议，并遵守欧盟《通用数据保护条例》。本研究纳入的已发表数据集可从论文中引用的原始来源获取。
作者贡献
ThM和BA参与了概念化、方法学、形式化分析、原始稿件撰写以及稿件审阅与编辑。ZL、LS、NR、LT、PS、EK、PA、JER、YP、TiM、EB、TZ、LD、NS和SB参与了调查研究。SB、ME以及
JB 负责资源提供。SW 参与监督工作。MB 和 MPE 参与监督工作和资金筹集。JB 参与概念化、监督、资金筹集、资源提供、原始稿件撰写以及稿件审阅与编辑。所有作者均审阅并批准了最终稿件。
致谢
我们感谢德国癌症研究中心（DKFZ）NGS 核心设施在外显子组测序方面提供的帮助，以及 DKFZ Omics-IT 设施在测序数据分析方面提供的帮助。我们感谢 DKFZ 微阵列核心设施开展表达谱分析实验，并感谢 DKFZ 蛋白质组学核心设施开展基于质谱的蛋白质组学分析。我们感谢 Shrihar Kanikar、Frank Herweck、Gabriela Atanasova 和 Kauthar Srour 在类器官建立和生物样本库建设方面提供的出色技术支持。我们感谢 Maryna Udovychenko、Ayse Civanna 和 Bianca Huber 在患者招募方面提供的出色支持，并感谢曼海姆中央内镜中心工作人员在肿瘤活检方面提供的协助。本项目获得了 Hector Foundation II、德国癌症联盟（DKTK）类器官平台联合资助项目、德国研究基金会（DFG）FOR5806 项目（项目编号：537604907）、DKFZ-MOST 计划以及海德堡—曼海姆健康与生命科学联盟的支持；该联盟获得了经巴登-符腾堡州议会批准的州财政资金。我们还感谢 DKFZ 国际博士项目（P.A.）、广州精英计划海外学习项目（Z.L.）以及德国国家学术基金会（J.E.R.）提供的支持。
已声明的资助者信息
Hector Foundation II
德国癌症联盟（DKTK）联合资助
德国研究基金会（DFG）
FOR5806（项目编号：
537604907)
DKFZ-MOST项目
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