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Polo样激酶1（PLK1）是调控细胞进入及通过有丝分裂过程的关键蛋白，针对其激酶结构域（KD）的靶向治疗在临床上成效不一。通过靶向Polo盒结构域（PBD）来干预PLK1的亚细胞定位和激酶活性，是一种可行的替代策略。研究人员通过REPLACE策略发现了一类名为abbapolins的新型非肽类化合物，并通过基于结构的策略及在NCI-60肿瘤细胞系面板中筛选类似物，对先导化合物进行了优化。蛋白质组学分析显示，在NCI-60所包含的细胞系中，abbapolin的活性与PLK1蛋白水平相关。前列腺癌细胞系被确定为最敏感的细胞系之一，由此推动了在前列腺癌模型中对这些化合物活性的进一步深入研究。研究评估了这些化合物的药代动力学特性和体内疗效，结果显示，其在异种移植瘤模型中具有显著的抗肿瘤活性，且未观察到明显毒性。此前已证实abbapolin的结合可诱导PLK1丢失，因此研究进一步分析了经治疗肿瘤中PLK1的减少情况。结果显示，与未经治疗的肿瘤相比，abbapolin治疗组肿瘤中的PLK1发生了显著降解，从而证实了其在体内通过作用于预期靶点发挥效应，并提示PLK1水平可作为潜在的药效学标志物。研究还表明，先导化合物能够使对雄激素剥夺治疗耐药的前列腺癌（PC）肿瘤增敏，为未来开展体内联合治疗研究奠定了基础。这些数据为开发有效的PLK1靶向药物提供了一条替代路径，可避免已报道的靶向KD分子所存在的问题，同时为REPLACE策略提供了体内概念验证，并验证了靶向PBD作为抗肿瘤药物开发策略的可行性。
PLK1 PBD 抑制剂 Abbapolin 作为前列腺癌治疗药物：体内活性及其与雄激素疗法的协同作用 | bioRxiv
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PLK1 PBD 抑制剂 Abbapolin 作为前列腺癌治疗药物：体内活性及其与雄激素疗法的协同作用
George Merhej、Gurusanker Ramamoorthy、Danda Chapagai、Mohammad Esfini Farahani、Yifan Kong、Chintada Nageswara Rao、Jessy Stafford、Zachary T. Mack、Cassidy Socia、Shikha Kumari、Kristen Hogan、Niti Jani、Maria Marjorette Pena、Elmar Nurmemmedov、Ivan Babic、Mengqian Chen、Xiaoqi Liu、Michael D. Wyatt、Campbell McInnes
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736204
George Merhej¹
南卡罗来纳大学药学院药物发现与生物医学科学系，南卡罗来纳州哥伦比亚市，邮编 29208
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Gurusanker Ramamoorthy¹
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Danda Chapagai¹
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Mohammad Esfini Farahani³
肯塔基大学医学院毒理学与癌症生物学系，美国肯塔基州列克星敦市，邮编 40536-0298
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Yifan Kong³
肯塔基大学医学院毒理学与癌症生物学系，美国肯塔基州列克星敦市，邮编 40536-0298
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Chintada Nageswara Rao
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Jessy Stafford
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Zachary T. Mack
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Cassidy Socia
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Shikha Kumari
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Kristen Hogan
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Niti Jani
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Maria Marjorette Pena
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Elmar
Nurmemmedov
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，美国加利福尼亚州圣迭戈市斯克兰顿路9276号，邮编92121
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Ivan Babic
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Mengqian Chen
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Xiaoqi Liu
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肯塔基大学医学院毒理学与癌症生物学系
，美国肯塔基州列克星敦市
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Michael D. Wyatt
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通讯作者：
mcinnes{at}cop.sc.edu
Campbell McInnes
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摘要
Polo 样激酶1（PLK1）是一种控制细胞进入有丝分裂并完成有丝分裂过程的关键调节蛋白。以其激酶结构域（KD）为靶点的治疗策略临床疗效不一。通过靶向 PLK1 的亚细胞定位和激酶活性，抑制其 Polo-box 结构域（PBD）是一种可行的替代策略。新型非肽类化合物，被称为
Abbapolin 是通过 REPLACE 策略发现的，并通过基于结构的策略及在 NCI-60 肿瘤细胞系面板中筛选类似物，完成了先导化合物优化。蛋白质组学分析发现，在 NCI-60 中，abbapolin 的活性与细胞系中的 PLK1 蛋白水平相关。前列腺细胞系被确定为敏感性较高的细胞系，因此进一步在前列腺癌模型中详细研究了其活性。研究评估了这些化合物的药代动力学特性和体内疗效，结果显示其具有显著的肿瘤异种移植模型抗肿瘤活性，且未观察到明显的整体毒性。研究人员分析了经治疗肿瘤中的 PLK1 是否减少；此前已有研究表明，abbapolin 结合可诱导 PLK1 降解。结果显示，与未治疗肿瘤相比，abbapolin 治疗组肿瘤中的 PLK1 显著降解，从而证实其在体内具有靶向作用，并提示 PLK1 水平可能是一种药效学标志物。研究还表明，先导化合物可使对雄激素剥夺疗法耐药的前列腺癌肿瘤细胞重新敏感，为后续体内联合治疗研究奠定了基础。这些数据提供了一条实现有效 PLK1 治疗的替代途径，可避免靶向激酶结构域（KD）的分子已报道的问题；同时也在体内验证了 REPLACE 策略的概念，并证实靶向极区盒结构域（PBD）可作为抗肿瘤药物开发策略。
引言
Polo 样激酶（PLK）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，可调控细胞周期进程[1, 2]。各成员（PLK1–5）在表达模式、作用与功能、底物及亚细胞定位方面各不相同[3–5]。PLK1–3 均具有保守的 N 端激酶结构域（KD）和 C 端极区盒结构域（PBD），但在连接两个结构域的结构域间连接环（IDL）方面存在显著差异，其长度和……
组成[3]。已知IDL会影响PLK1的活性，因此其很可能参与PLK其他成员的差异性调控。此外，PLK1中稳定闭合构象的残基在其他PLK成员中存在差异，从而导致不同的构象调控[3]。PLK1是研究最为深入的成员，因此人们鉴定出了其在调控有丝分裂进入及其进程中的关键作用，包括中心体成熟、双极纺锤体形成、姐妹染色质分离以及胞质分裂[6,7]；同时已知PLK1定位于包括中心体和动粒在内的多种关键有丝分裂结构[8]。PBD可结合靶蛋白上的磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸（STP）基序，这对于PLK1的亚细胞定位以及在磷酸化靶底物之前对底物进行识别至关重要[9-12]。
PLK1在多种肿瘤类型中均呈高表达，其表达水平预示着不良的临床结局[13-15]。研究人员已通过两种方式对PLK1作为药物靶点进行了广泛研究：一是通过对驱动肿瘤发生的基因进行特异性突变或缺失，从遗传学角度开展研究；二是开发ATP竞争性化合物，使依赖PLK1的肿瘤细胞发生敏化[16-18]。后一种方法已促成多种化合物进入临床试验，包括volasertib和onvansertib，尽管其临床开发进展尚未获得美国食品药品监督管理局（US FDA）的批准。PLK1相对于PLK2和PLK3的特异性十分重要，因为这些家族成员具有相反的功能，因而发挥肿瘤抑制作用[19]。KD中的单点突变（C67V）可使细胞在体外对多种KD抑制剂产生显著耐药性[20]。尽管目前临床上尚未观察到导致KD抑制剂耐药的PLK1突变，但点突变会导致显著的
其他被肿瘤学领域靶向的激酶中也存在耐药性问题。近期研究发现的另一种潜在有害的非预期后果是，KD抑制剂会诱导PLK1形成开放构象[4,21]。尽管这种构象在催化活性方面受到抑制，但其对关键底物来源肽段的亲和力却有所增加[21,22]。换言之，KD抑制剂可能无法阻断PLK1的非催化功能，甚至可能促进PLK1的非催化性PBD功能。
KD抑制剂的潜在缺陷促使研究者通过其他途径开发PLK1抑制剂[23,24]。PBD中的磷酸化识别基序是PLK家族所特有的，已有研究证明肽段和小分子均可选择性地结合PLK1的PBD[24]。过表达PLK1 PBD的HeLa细胞会发生有丝分裂阻滞，并出现染色体排列缺陷[8]，这表明PBD本身的化学计量关系及调控十分重要。尽管PBD的磷酸化识别位点在PLK家族成员之间具有保守性，但磷酸肽仍优先结合PLK1 PBD，因此，靶向该结构域为选择性阻断PLK1 PBD功能提供了机会。迄今发现的若干小分子PBD抑制剂[25-28]被证实是非特异性的蛋白质烷基化剂，几乎没有成为PLK1 PBD特异性抑制剂的潜力[28]。尽管已有其他PBD抑制剂被报道，但目前尚无证据证明其能够在细胞内直接结合PLK1[25,26,29]。
REPLACE（Replacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment，通过计算富集利用部分配体替代物进行替换）是一种经过验证的策略，可将肽类抑制剂转化为更具药物样性的先导化合物，并已被用于以迭代方式发现新型PBD抑制剂。这些被命名为abbapolins的化合物表现出良好的
对PLK1 PBD具有亲和力，能够结合并诱导内源性PLK1降解，并对肿瘤细胞表现出强效的抗增殖活性；此外，在表达C67V PLK1的细胞中也具有活性，而此类细胞对靶向KD的化合物具有显著耐药性[30,31]。在此基础上，通过生化、细胞结合以及抗增殖实验，进一步开展了abbapolin系列的开发。利用NCI-60细胞系面板对类似物进行评价，建立了其细胞结构-活性关系（SAR）。根据细胞系面板的结果，进一步在包括克隆形成实验在内的前列腺癌细胞系中开展详细研究，结果显示其具有极强的抗增殖活性。在雄激素耐药性前列腺癌中的实验表明，该化合物能够产生协同效应，并增强细胞对恩杂鲁胺治疗的敏感性。随后，基于其细胞效力，开展了体内模型评价，以确定其药代动力学（PK）和药效动力学（PD）活性。结果显示，化合物的血药浓度接近其细胞IC50，并且在异种移植模型中能够显著抑制肿瘤生长，且未观察到明显的整体毒性；这些结果证实了abbapolin作为激素难治性前列腺癌潜在治疗药物的潜力。总体而言，所获得的结果为REPLACE策略以及将PBD作为PLK1 KD抑制替代策略的靶点提供了体内概念验证。
方法
化学合成的一般方法
除非另有说明，所有反应均在烘干或火焰干燥的玻璃器皿中，于干燥氮气气氛下进行。所有反应混合物均采用磁力搅拌。对于在室温以上进行的反应，使用硅油浴作为热源。对空气和水分敏感的液体……
采用标准技术通过注射器转移。
除非另有说明，¹H 和 ¹³C 核磁共振（NMR）谱均在 CDCl₃、MeOH-d₄ 或 DMSO-d₆ 中测定。NMR 谱使用 Bruker 300 或 400 MHz 仪器记录。化学位移（δH）以百万分之一（ppm）表示，并以 CDCl₃ 的残余溶剂信号（0.00 ppm；TMS 信号）、CDCl₃（7.16 ppm）或 DMSO-d₆（2.50 ppm）为参照。¹H-NMR 偶合常数（J）以赫兹（Hz）表示，对应表观多重性。数据按以下顺序报告：化学位移、多重性（s = 单峰，br s = 宽单峰，d = 双峰，t = 三重峰，q = 四重峰，quin = 五重峰，sext = 六重峰，sept = 七重峰，m = 多重峰，dd = 双重双峰等）、偶合常数及积分值。
¹³C-NMR 谱在 75 或 101 MHz 下测定。化学位移（δC）以 ppm 表示，并以 CDCl₃（77.16 ppm）或 DMSO-d₆（39.57 ppm）为参照。分析型薄层色谱（TLC）采用 Silica Gel 60 F254 涂层铝背板 TLC 板（孔径 60 Å，含 F-254 指示剂）进行。除非另有说明，化合物均通过紫外照射显色。除非另有说明，所有商业溶剂均购自 Fisher 或 VWR，未经进一步蒸馏直接使用。水相反应使用去离子水。其他所有试剂均购自不同商业供应商，未经进一步纯化直接使用。详细合成方法及表征数据见补充信息。
细胞培养、克隆形成与免疫印迹
PC3 前列腺癌细胞（ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）培养于 Ham’s F-12K 培养基（Cellgro，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）中，并补加 10% Nu-serum 和 1% 青霉素-链霉素。将两千个 PC3 细胞……
接种于六孔板中培养24小时，并使用图注中所述浓度的药物进行处理。10天后，使用甲醇固定细胞集落，并以10%的吉姆萨（Giemsa）染液进行染色。使用 ImageJ 对细胞集落进行计数。均值和标准差均根据三次独立实验计算得出。蛋白表达分析采用免疫印迹法进行，具体方法如前所述[21,31]。简言之，在蛋白质分析中，使用 BCA 蛋白定量试剂盒（#23225，Pierce，美国伊利诺伊州罗克福德）测定蛋白浓度。取等量蛋白质（25 µg）在4%–15%的 SDS-PAGE 凝胶上进行电泳分离。所使用的一抗如下：抗 PLK1 抗体（#05-844，Millipore Sigma，美国加利福尼亚州特梅库拉）、抗磷酸化 TCTP（Ser 46）抗体（#5251，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯）以及抗 GAPDH 抗体（#5174，Cell Signaling Technology）。按照生产商说明，使用 HRP 偶联的二抗（#NA931 和 #NA934，GE Healthcare，英国白金汉郡小查尔方特）和化学发光检测试剂盒（#32106，ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行检测。对于肿瘤蛋白分析，在冰上剥离肿瘤组织，并取每个肿瘤组织中的5 mg用于蛋白提取。将肿瘤组织浸入液氮中速冻，随后加入500 µL RIPA 裂解缓冲液（含1%的蛋白酶-磷酸酶抑制剂混合物）。然后在冰上使用电动匀浆器将肿瘤组织匀浆，并将样品置于裂解缓冲液中，于4°C振荡裂解2小时。样品在4°C下以16,000 × g离心20分钟。收集上清液并于−80°C保存。蛋白浓度的定量和免疫印迹分析按照与细胞蛋白提取物相似的方法进行。
雄激素耐药性与
联合用药实验
C4-2R 去势抵抗性前列腺癌细胞由 Allen Gao 博士（美国加利福尼亚州戴维斯市加利福尼亚大学）惠赠，并在补充有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI-1640 培养基中，于 37°C、5% CO₂ 湿润气氛下培养。对于克隆形成实验，将 2,000 个 C4-2R 细胞接种于 6 孔板中，过夜贴壁。随后，细胞分别接受单独使用恩扎鲁胺（0、10、20 或 40 µM）、单独使用 abbapolin6（0、10、20 或 40 µM）处理，或按照完整的 4×4 剂量矩阵联合使用两种药物。每 3 天更换一次含有新鲜药物的培养基。10 天后，使用 4% 甲醛固定细胞克隆，并以结晶紫（0.5% w/v）染色后进行计数。以未处理对照组为基准对克隆数进行归一化，以计算细胞存活率百分比。
对于协同作用分析，将 C4-2R 细胞接种于 96 孔板中，分别以恩扎鲁胺（0、10、20 或 40 µM）和 abbapolin6（0、10、20 或 40 µM）单独处理，或按照 4×4 剂量矩阵进行所有两两联合处理。按照制造商说明书，使用 MTS 检测法（CellTiter 96® AQueous One Solution，Promega）评估细胞活力。将经未处理对照孔归一化后的细胞活力值上传至 SynergyFinder（3.0 版；https://synergyfinder.fimm.fi）[32]，由该软件计算整个剂量矩阵的协同评分。采用 Loewe 模型对药物相互作用进行评分。在 SynergyFinder 中生成协同评分、热图和三维景观图，以可视化测试浓度范围内的药物相互作用。
肿瘤异种移植实验
PC3 和 22RV1 人前列腺癌细胞（CRL-2505，ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）按照上述方法培养至约 75%。
细胞达到融合度后，于注射当天收集，并重悬于50%的Matrigel中。将75微升含有一百万个细胞的悬液皮下注射（s.c.）至8周龄无胸腺裸鼠的侧腹部（JAX 002019，Jackson Laboratory，美国缅因州巴港）。待肿瘤生长至200 mm³后，将小鼠随机分配至对照组（给药载体）或治疗组（抑制剂）。给药载体或抑制剂通过腹腔注射（i.p.）或口服灌胃（o.g.）的方式给药，每周5天，持续3周。使用卡尺每日测量肿瘤体积，并按照以下公式计算体积：((宽度)² × 长度)/2。处死动物时收集肿瘤和器官，并记录其重量。在最初的22Rv1和PC3实验中（补充图1和2），abbapolin⁶以35 mg/kg的剂量进行腹腔注射（给药载体为PBS），并以100 mg/kg的剂量进行口服灌胃（给药载体为30%丙二醇和70% PEG400）。B16727以50 mg/kg的剂量每周口服灌胃给药2天。对照组小鼠给予磷酸盐缓冲盐水（PBS）。在重复进行的PC3实验中（图5），abbapolin⁶以55 mg/kg的剂量进行腹腔注射（100 μL，给药载体为PBS），并以150 mg/kg的剂量进行口服灌胃（给药载体为30%丙二醇和70% PEG400）。
结果
abbapolins的构效关系与先导化合物优化
通过REPLACE策略开发靶向Polo-box结构域的非ATP竞争性PLK1抑制剂，最终鉴定出abbapolins。这些非肽类分子已被证实能够在细胞内与靶点结合，促使内源性PLK1降解，并对肿瘤细胞表现出强效的抗增殖活性[30,31]。本文进一步研究了abbapolin系列，具体包括开发新型结构类似物，以期实现更有效的结合。
既包括PBD的磷酸基结合基序，也包括PLK1的疏水性隐蔽口袋。此前所述的abbapolin类化合物仅基于模拟底物磷酸苏氨酸与羧酸酯等排体之间的相互作用而设计。带有PBD结合基序预先磷酸化的底物通过离子配对与PBD中的H538和K540发生相互作用。为进一步探究该系列化合物的构效关系，研究人员构建了一个包含磷酸基等排体的化合物库（表1），并在PC3前列腺癌细胞中采用72小时MTT实验对这些化合物进行了测试。所得结果还与羧酸酯等排体进行了比较[31]。首先，生成了化合物1，即将羧酸酯的邻位（R2，表1）替换为磷酸酯等排体的化合物。与具有相同8原子烷基尾链的化合物相比，化合物2和3在MTT实验中的活性提高了2至3倍[31]。用膦酸基而非磷酸酯替换R2羧酸酯后，细胞活性进一步显著增强，化合物3的IC50达到9.2 μM。然而，与芳香环直接相连的膦酸酯等排体活性明显较低（化合物4），但仍高于母体羧酸酯化合物。含有间位膦酸基（R3，表1）的类似物表现出最低限度的活性，这表明额外的氧原子充当间隔基，可将二价阴离子适当地定位，从而与PBD中的H538和K540发生相互作用（化合物5）。对磷等排体进行进一步构效关系研究表明，将磷酸酯移至间位（R3）后，获得了该系列中活性最强的化合物，其IC50为2.3 μM（化合物6）。除磷酸酯等排体外，将酰胺键连接替换为磺酰胺键的类似物（化合物7）则】【。
生成的。该化合物在 R2 位还含有一个氟原子；与母体酰胺衍生物相比，其活性显著增强，在 PC3 细胞中的 IC₅₀ 提高了 3 倍[31]。
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表 1.
abbapolin 磷酸酯生物电子等排体在 PC3 细胞中的构效关系
abbapolin 的 NCI-60 筛选及其在集落形成实验中的进一步评价
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图 1.
NCI-60 肿瘤细胞系面板的部分结果。
化合物 8（表 2）在初始单剂量筛选中表现出广泛活性，随后对其进行了剂量-反应测试。前列腺癌细胞对其最为敏感，乳腺肿瘤细胞的敏感性则相对较低。
为进一步探索 abbapolin 的开发潜力，研究人员在 NCI-60 面板中对先前报道的化合物以及新优化的类似物进行了评价。NCI-60 面板是美国国家癌症研究所（NCI）治疗开发计划的一部分。通常，化合物首先以单一剂量在来源于 9 种不同组织类型的 60 个细胞系中进行测试；对于在大多数肿瘤中表现出良好活性的化合物，则进一步在该面板中开展剂量-反应测试。对 abbapolin 单剂量和剂量-反应测试结果的分析显示，部分肿瘤存在选择性易感性，其中前列腺癌（PC3 和 DU145）、白血病、中枢神经系统肿瘤以及结直肠肿瘤对 abbapolin 治疗的反应最佳。与这些敏感细胞系相比，例如乳腺癌细胞对 abbapolin 的敏感性低 2–8 倍。利用剂量-反应测试后反应最佳的 abbapolin 的 NCI-60 结果，研究人员开展了 COMPARE 分析，以探讨其活性模式与公开可得的相关分子数据之间的关系，这些分子具有
已在该细胞系面板中完成筛选。COMPARE算法是由美国国家癌症研究所（NCI）开发的一种强大工具，通过将某一化合物在这60种细胞系中的抗增殖指纹与历史数据和当前数据进行比较，来探究并解释其活性模式。因此，COMPARE可以为潜在的共同作用机制、肿瘤选择性提供推测，并识别表型类似物。首先，将APPROVEDDRUGS数据集与数据库中经临床评估的PLK1激酶结构域（KD）抑制剂volasertib进行了比较；众所周知，volasertib可诱导有丝分裂阻滞。不出所料，与volasertib相比，排名最高的比较药物是抗有丝分裂药物紫杉醇（taxol），其Pearson相关系数为0.78。需要注意的是，Pearson相关系数高于0.8通常被认为具有强提示性，高于0.7被认为具有提示性，而0.6则被认为是推断两种化合物作用机制存在任何相关性的最低值。对4种进行了剂量-反应测试的abbapolin——8、9、11和14——与APPROVEDDRUGS数据集进行了比较。由于这些化合物是在DTP项目转为384孔板格式之前进行测试的，因此本研究中的化合物是依据“Classic Screen”进行分析的。COMPARE显示，对于任何一种abbapolin，数据集中均不存在Pearson相关系数高于0.6的药物；仅有一种abbapolin对应的单一化合物的相关系数高于0.5。这些分析表明，截至开展比较时，以PBD为靶点的abbapolin相对于COMPARE中的所有FDA批准药物，具有独特的作用机制。
此外，还使用COMPARE将abbapolin与ALLNSC数据集进行了分析，以比较其与NCI-60筛选中所测试的全部化合物的活性，从而探究其作用机制是否存在潜在共性。
在数据集中所有可用分子的范围内，对化合物 8、9 和 11 进行 COMPARE 分析后发现，它们彼此之间的 Pearson 相关值均为 0.85–0.91，强烈表明三者具有相似的作用机制。例如，以化合物 8 为查询对象时，其与化合物 11 和 9 的 Pearson 相关值分别为 0.88 和 0.91；以化合物 9 为查询对象时，其与化合物 11 的 Pearson 相关值为 0.91。除彼此之外，COMPARE 未发现其他 Pearson 相关值高于 0.7 的化合物，相关值高于 0.6 的化合物也仅有 2–4 个，这进一步表明这些带有氨基烷基尾链的 abbapolin 具有独特的作用机制。这些相关性较弱的化合物在结构上均与 abbapolin 不相似，也不太可能是激酶结构域（KD）或 Polo-box 结构域（PBD）PLK1 抑制剂，因而无法提供有用的机制见解。对化合物 14（其苯甲酰胺与烷基尾链之间通过硫杂原子连接）进行查询时，一个值得关注的结果是：化合物 8、9 和 11 与化合物 14 的 Pearson 相关值均低于 0.6。事实上，在 NSC 数据集中，没有任何化合物与化合物 14 的 Pearson 相关值高于 0.65，且相关值高于 0.6 的化合物仅有 5 个，这表明该类似物具有独特的活性谱，其相关特征目前尚未得到研究。
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图 2.
Abbapolin 在克隆形成实验中的活性。
PC3 细胞分别用化合物 6（A、B 左）和化合物 8（A、B 右）处理 10 天，随后评估克隆形成情况。数据以均值 ± LSD 表示（n = 3 次独立实验）。
通过进一步分析所获得的 NCI-60 数据集，确定了 abbapolin 中赋予其最佳抗增殖活性的结构特征与活性之间的关系，结果汇总于表 2。活性最强的化合物含有硫醚或胺】【。
连接烷基尾部与苯甲酰胺基团的基团，并与 PBD 底物识别位点中的隐蔽口袋发生相互作用。首先，由化合物 8–11 组成的氨基烷基系列在 10 μM 浓度下进行测试时，对 NCI-60 细胞系 panel 表现出最广泛的活性。其中，具有 C7NH 尾部且 R3 位为甲基的化合物 8，使该 panel 中 60 个细胞系中的 39 个细胞系的生长受到 50% 或更高程度的抑制；而具有 C8NH 烷基尾部且 R3 位为甲基的化合物 9，在该浓度下抑制了 60 个细胞系中的 37 个。令人意外的是，化合物 10（化合物 8 的 C8NH 版本）仅抑制了 9 个细胞系，而化合物 11（化合物 9 的 N-甲基化版本）则抑制了 25 个细胞系。在所有于 NCI-60 panel 中测试的化合物中，烷基胺衍生物 8、9 和 11 对前列腺肿瘤表现出最强活性；在剂量-反应测试中观察到其 IC₅₀ 值处于低微摩尔范围。对于硫醚系列，活性范围最广且效力最强的化合物为 14，其具有 C8S 尾部和 R2 甲基，使 60 个细胞系中的 42 个受到 50% 或更高程度的抑制。化合物 12 和 13 的效力较低，而化合物 17 在所测试的任何癌细胞系中均未显示活性。对于不含杂原子的化合物以及含有烷基链的化合物，观察到的活性较低，包括 C8（15）、C10（16）和 C12（17）化合物；其中仅化合物 16 抑制了数量较多的细胞系。
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表 2.
NCI-60 panel 中前列腺癌和乳腺癌细胞系的构效关系。
尽管 NCI-60 筛选数据令人鼓舞，并且总体上与本实验室已发表的研究结果［30，31］一致，但值得注意的是，根据先前的分析，其中几种化合物在 NCI-60 panel 中表现出的活性低于预期。这包括所有
尽管这些磷酸酯生物电子等排体在 72 小时 MTT 检测中对 PC3 细胞表现出显著活性，但在 NCI-60 细胞系面板中活性较低。尤其是化合物
6
，其在内部实验中对 PC3 细胞的 IC
50
值处于低微摩尔水平，但在 NCI-60 细胞系面板中对 PC3 和 DU145 细胞系的抑制作用较弱。因此，进一步采用集落形成实验研究化合物
6
和
8
，以评估较长期药物暴露的影响，并与采用较短药物暴露时间的 MTT 检测（72 小时）和 NCI-60 筛选（48 小时）进行比较。集落形成实验结果显示，化合物
6
对 PC3 细胞集落形成的抑制 IC
50
为 0.337 ± 0.045 μM，化合物
8
的生长抑制 IC
50
为 6.28 ± 1.05 μM。这表明，对于磷酸酯类似物，短期检测未能捕捉到其作用起效过程中的某些特征。
Abbapolin 类化合物的蛋白质组学分析及其与 PLK1 和底物水平的相关性
为确定 PLK1 总蛋白水平是否与两种对 PLK1 功能至关重要的磷酸化形式 pT210 和 pT214 相关[33]，按照文献报道[34]，利用 ATLANTiC 对基于质谱的蛋白质组学数据进行了相关性分析。PLK1 总蛋白水平与 pT214 PLK1 水平呈显著相关（Pearson 相关系数 r = 0.57，P = 0.0002，n = 38 个细胞系）（图 3A）。然而，PLK1 总蛋白水平与 pT210 PLK1 之间未观察到显著相关性，这可能是由于无法检测到该形式所致。pT210 仅存在于 G2/M 交界期，因此在非同步细胞群体中无法检测到。随后，我们研究了化合物
8
的抗增殖活性是否与 PLK1 的表达及其磷酸化状态相关。我们对化合物
8
的 IC
₅₀
值与 NCI-60 各细胞系中 PLK1 总量及磷酸化 PLK1 水平进行了相关性分析。
在该面板中，化合物8的IC₅₀值与PLK1总蛋白水平呈显著负相关（Pearson’s r = −0.32，P = 0.01，n = 60个细胞系）（图3B），提示表达较高水平PLK1的细胞对化合物8更为敏感。这些发现进一步支持该化合物的靶点内作用机制。然而，未观察到化合物8的IC₅₀值与PLK1在T210或T214位点的磷酸化形式之间存在显著相关性。这可能是因为T210和T214位点的磷酸化受到严格调控，以促使细胞进入有丝分裂期，而化合物8的活性作用发生在这些磷酸化形式含量最高的细胞周期阶段之外。此前已有研究发现，与KD抑制剂不同，abbapolin类化合物不会诱导有丝分裂阻滞，这表明它们可能在有丝分裂前干扰PLK1[31]。
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图3.
NCI-60面板细胞系的蛋白质组学分析
A）癌细胞系面板中PLK1磷酸化T214位点（pT214）的丰度与PLK1总蛋白丰度之间的相关性。B）PLK1总蛋白丰度与化合物8的IC₅₀之间的相关性。C）PLK1蛋白水平与其底物之间的相关性；D）PLK1磷酸化T214位点水平与其底物之间的相关性。
为进一步探讨PLK1丰度的生物学意义，研究人员分析了PLK1总蛋白水平与PhosphoSitePlus数据库中已知PLK1底物之间的相关性。基于质谱的蛋白质组学分析对全部60个细胞系中的PLK1总蛋白进行了定量，结果显示其与55个已注释PLK1底物中的32个存在显著相关性（P < 0.05）（图3C）。其中，观察到最强的正相关性的是AURKA（r = 0.81）、RACGAP1（r = 0.76）、CDC20（r = 0.73）、CCNB1（r = 0.72）、KIF11（r = 0.71）和UBE2S（r =】【。
0.71），这些蛋白均为有丝分裂进程的关键调控因子。类似地，PLK1 pT214 水平与 14 种底物呈现显著相关，这与 PLK1 总丰度和 pT214 水平之间的强相关性一致（图 3D）。相比之下，PLK1 pT210 水平仅与两种底物呈现显著相关，即 TP53（r = −0.56）和 ECT2（r = −0.43），且二者均为负相关。鉴于检测到 pT210 的细胞系数量显著较少，这些有限的相关性应谨慎解读，并且可能反映了统计效能的降低。
通过 abbapolin 类化合物确认 PLK1 的细胞内靶标结合
既往研究证实，abbapolin 类化合物能够在 PC3 细胞中以与其抗增殖 IC₅₀ 值相当的浓度（降解浓度，DC₅₀）诱导 PLK1 降解［31］。为探究化合物 6 和 8 在 PC3 细胞中诱导 PLK1 丢失的能力与使用这两种 abbapolin 类化合物时观察到的细胞死亡明显延迟发生之间的关系，通过评估其随时间变化的降解效应进行了测定。与既往已发表的 abbapolin 类似物数据一致，化合物 8 能够在 24 小时这一时间点诱导 PC3 细胞中的 PLK1 丢失，但所需浓度较高（数据未显示）。
有趣的是，化合物 6 诱导的 PLK1 降解在 48 小时和 72 小时的时间点均清晰可见（图 4A），这表明 PLK1 丢失和抗增殖活性的起始作用均有所延迟，同时进一步证实了其靶点特异性活性。因此，在 abbapolin 类化合物处理 72 小时后评估了剂量反应。两种 abbapolin 类化合物在该时间点均诱导了显著的 PLK1 水平下降，其 DC₅₀ 值分别为化合物 6 的 3.186 ± 1.057 μM 和化合物 8 的 5.005 ± 2.377 μM。
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图 4：
处理后 PC3 细胞中的 PLK1 降解ҩа
abbapolins。
(A) PC3 细胞经 30 mM（6）处理 24、48 或 72 h。(B) PC3 细胞经递增剂量的 6（左）和 8（右）处理 72 h。(C) PLK1 检测百分比，以 GAPDH 归一化。平均值和标准差由三次独立实验获得。(D) PLK1 丢失的剂量依赖性曲线及用于计算 DC₅₀ 的拟合曲线。
确定 abbapolin 6 可使细胞内 PLK1 显著减少后，我们进一步测定其与细胞内 PLK1 的直接结合。此前，我们利用细胞热转移分析（CETSA）证明，abbapolins 可在细胞内与 PLK1 靶向结合 [21, 30, 31]。本研究采用新型 Micro-Tag® 细胞靶标结合技术（CellarisBio，美国圣迭戈）测定细胞内 PLK1 的靶标结合情况。图 5 所示数据表明，亚微摩尔剂量的 6 可显著提高 PLK1 的热稳定性，显示其能有效结合细胞内 PLK1；而在相同剂量范围内及剂量高达 1 μM 时，PLK3 的稳定性均未受影响。这与此前关于其他 abbapolins 对 PLK1 相较于 PLK3 具有选择性的研究结果一致 [30]。
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图 5：abbapolins 对 PLK 的选择性：采用 Micro-Tag® 方法测定 6 与细胞靶标的结合情况，以 PLK 热稳定性为指标。在高于 300 nM 的剂量下，可观察到 PLK1（黑色方块）随剂量增加而稳定性增强；相比之下，相同剂量下 PLK3 的稳定性未见变化。
前列腺癌异种移植瘤中的体内药代动力学分析与疗效
在获得令人鼓舞的体外结果后，我们选用 abbapolins 6、7 和 8，利用 Swiss Webster 小鼠评估其体内药代动力学（PK）特征及抗肿瘤疗效。小鼠通过口服灌胃接受 50 mg/kg 剂量给药（表 3）。在这三种化合物中，7……
发现其具有良好的药代动力学（PK）性质，最大血药浓度（C_max）为40 μM，半衰期（t_1/2）超过3 h。然而，化合物8的C_max是化合物7的两倍，且半衰期也更长。化合物6在体外的活性最强，但根据C_max和曲线下面积（AUC，0–8 h）评估，其口服吸收水平约低1000倍。
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表3.
口服给予abbapolin类化合物后的药代动力学性质
采用PC3细胞构建前列腺癌异种移植瘤模型，以确定化合物6和8的体内活性。待肿瘤形成（200 mm³）后，分别通过腹腔注射（i.p.）和口服（p.o.）给予化合物6（55 mg/kg）和8（150 mg/kg），每日一次，连续给药20天。化合物6的给药剂量由其在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的溶解度上限决定。通过与腹腔注射PBS或口服聚乙二醇（PEG）溶媒的对照组比较，评价其体内疗效。统计分析显示，两个对照组之间无显著差异，因此将所有未接受药物治疗的小鼠合并为一个溶媒对照组。如图6所示，与对照组小鼠相比，接受化合物6（p = 0.0294）和8（p = 0.0022）治疗的小鼠肿瘤体积显著减小。重要的是，在20天的治疗期间，两种abbapolin类化合物均未引起可观察到的毒性。收集所有组小鼠的肾脏和肝脏并称重，以考察这些器官中潜在的不良反应。对于所分析的器官，治疗组与溶媒对照组之间未观察到重量差异，提示在上述治疗条件下，abbapolin类化合物6和8均未引起明显的肝脏或肾脏不良反应，且动物总体耐受良好。
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图6.
抗增殖活性的体内概念验证
abbapolins的：
在无胸腺裸鼠中建立PC-3前列腺癌异种移植瘤模型，并分别给予溶剂对照（蓝色）、化合物6（绿色）和化合物8（红色）处理。左图显示了20天内肿瘤体积的变化。其后的图显示了实验结束时对照小鼠以及接受化合物6和8处理的小鼠的肿瘤体积。右侧两图显示了实验结束时所有小鼠的肾脏和肝脏重量。
另采用22RV1前列腺癌细胞系开展了一项异种移植瘤实验，使用化合物7（灌胃给药）和化合物6（腹腔注射给药）。鉴于化合物7具有良好的药代动力学特征，选择以灌胃方式给药（100 mg/kg）；而由于药代动力学（PK）研究显示化合物6的口服生物利用度不足，因此仍采用腹腔注射给药（50 mg/kg）（表3）。化合物6处理后可观察到肿瘤生长受到抑制，但由于未处理对照组的变异性较大，差异未达到统计学显著性；而在该给药方案下，化合物7似乎未能抑制肿瘤生长（补充图1）。尽管化合物6的口服药代动力学特征逊于化合物7，但腹腔注射给药使其在该模型中表现出更好的体内活性。化合物6或7处理后，未观察到小鼠器官重量或体重受到影响，再次表明在所采用的剂量和处理时程下，小鼠对abbapolins具有耐受性（补充图1）。此外，还在该异种移植瘤模型中测试了已进入临床评价的KDI类药物volasertib（50 mg/kg，每周给药2天），该药物可显著减小肿瘤体积（补充图1）。然而，这种ATP竞争性抑制剂也导致小鼠总体重以及脾脏、肝脏和肾脏重量出现具有统计学显著性的下降，且研究期间有一只小鼠死亡。这些观察结果与其毒性作用一致
临床上使用 volasertib 时观察到的情况。相比之下，在两项异种移植实验中，abbapolin 治疗均未引起体重或器官重量的统计学显著变化。
Abbapolin 类化合物导致体内 PLK1 水平降低
此前对 abbapolin 类化合物的研究表明，这些新型 PBD 靶向抑制剂可诱导细胞内 PLK1 水平降低，呈现出类似 PROTAC 的降解表型，而蛋白酶体抑制可至少部分逆转该表型[31]。为确定能否在体内观察到这一细胞表型，以及其是否可作为药效学标志物，研究检测了 abbapolin 类化合物降低肿瘤中 PLK1 水平的能力（图 7）。每组分析 4 个肿瘤，共计 16 个肿瘤，分别来自接受化合物 6 治疗的小鼠、接受 PBS 载体处理的小鼠（化合物 6 治疗的对照）、接受化合物 8 治疗的小鼠，以及接受 PEG 载体处理的小鼠（化合物 8 治疗的对照）。从肿瘤中提取蛋白质，并采用 Western blotting 分析裂解液中的 PLK1。结果显示，与相应对照肿瘤相比，接受 abbapolin 治疗的小鼠肿瘤中的 PLK1 蛋白水平均较低（图 7A 和 7B），且差异具有统计学意义（图 7C）。随后，对 abbapolin 诱导的肿瘤体积减小（图 6）与这些肿瘤中 PLK1 蛋白水平降低之间的相关性进行了分析。将经 GAPDH 归一化的 PLK1 水平与肿瘤体积作图，分别绘制接受化合物 6 治疗的小鼠及其载体处理对照小鼠的肿瘤数据（图 7D），以及接受化合物 8 治疗的小鼠及其载体处理对照小鼠的肿瘤数据（图 7E）。随后进行 Spearman 相关分析，以确定各药物治疗组及其载体对照组中肿瘤体积与 PLK1 蛋白水平之间的相关性。两者均观察到较强的相关性
abbapolin 类化合物，其中，与接受化合物 8 治疗的小鼠及其对照组的肿瘤相比，接受化合物 6 治疗的小鼠及其对照组的肿瘤体积与 PLK1 蛋白水平之间的相关性更高。
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图 7：
PC3 前列腺癌异种移植瘤中 PLK1 蛋白的定量分析。
（A、B）Western blot 图像显示，接受化合物 6 或 8 治疗的小鼠肿瘤中相对于 GAPDH 的 PLK1 蛋白水平，并与接受腹腔注射 PBS（化合物 6 对照组）或口服 PEG（化合物 8 对照组）的小鼠肿瘤进行比较。（C）统计数据以均值 ± 标准差表示。进行了三次独立实验，并分析了每个动物组的四个肿瘤。* 表示 p<0.05。采用非配对双侧 Welch t 检验进行统计分析。（D）接受化合物 6 治疗的小鼠与对照组（蓝色）的肿瘤体积与 PLK1 蛋白平均水平的散点图；每个肿瘤的 PLK1 蛋白平均水平根据三次独立 Western blot 测定获得。线条表示简单线性回归，附有 95% 置信区间。采用 Spearman 秩相关检验评估相关性：r = 0.9048，p = 0.0046，n = 8 个肿瘤。（E）接受化合物 8 治疗的小鼠与对照组的散点图及分析，方法同（D）：r = 0.7619，p = 0.0368，n = 8 个肿瘤。
恩扎卢胺耐药肿瘤对 abbapolin 治疗敏感
在另一种体外模型，即雄激素抵抗性前列腺癌模型中，进一步考察了 abbapolin 类化合物作为前列腺癌化疗药物的潜力。使用雄激素受体拮抗剂恩扎卢胺、abbapolin 化合物 6 或两者联合处理 C4-2R 细胞。如图 8A 所示，单独使用 20 μM 恩扎卢胺处理仅引起集落数量的轻微变化，表明该剂量的抗雄激素治疗基本不影响 C4-2R 细胞。使用化合物 6 处理
在20 μM剂量下，单独处理即可使集落数量减少50%。然而，恩扎卢胺与化合物6联合处理时，两者各以20 μM的等摩尔剂量给药，产生了强烈的生长抑制作用，几乎消除了所有可见集落。为考察abbapolin与抗雄激素治疗的联合效应，生成了协同作用热图和三维协同作用景观图。15.2的协同评分表明，该联合处理具有显著的协同作用，并提示abbapolin类化合物能够逆转前列腺癌的雄激素耐药性。
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图8.
abbapolin类化合物与恩扎卢胺联合使用的协同作用。
采用恩扎卢胺（enza）单药或与化合物6联合处理雄激素耐药性C4-2R细胞。8A，有无enza处理条件下集落形成实验定量结果的绘图。8B，协同作用热图，y轴为化合物6，x轴为enza。8C，协同作用的三维能量景观图，x轴和y轴分别为化合物6和enza，z轴为协同评分。
讨论
本研究报道的abbapolin类化合物采用靶向蛋白质–蛋白质相互作用的REPLACE策略开发，代表了靶向PLK1的Polo盒结构域（PBD）研究的进展。第一代abbapolin类化合物为靶向PBD提供了原理验证[30, 31]。此前开发的abbapolin类化合物仅通过羧酸根等排体模拟底物中磷酸化苏氨酸与PBD之间的相互作用，而研究者认识到，含有磷酸化苏氨酸等排体的化合物可更有效地阻断磷酸化底物与PBD之间涉及H538和K540的离子配对相互作用，其目的是增强与PBD残基的静电互补性。对一系列磷酸基团等排体的测试发现，一种带有磷酸基团的间位取代abbapolin化合物
替代羧酸根的化合物在细胞测定中表现出最强的PLK1靶标结合能力，并且能够抑制PC3前列腺癌细胞的生长。集落形成实验中观察到的纳摩尔级活性及其在细胞内与PLK1的靶标结合，证实了这些类似物是优良生物电子等排体的假设。
NCI-60细胞系筛选数据揭示了肿瘤细胞系的敏感性，尤其是两种前列腺癌细胞系PC3和DU145；这些结果与既往研究共同支持进一步探索abbapolins作为潜在前列腺癌治疗药物的可行性。COMPARE分析表明，靶向PBD的abbapolins具有独特的作用机制，不同于volasertib等代表性靶向KD的PLK1抑制剂，也不同于所有FDA批准的抗肿瘤药物。即使在数据库收录的大量研究性药物中，也没有任何分子显示出显著的Pearson相关系数，这一发现提供了有力的间接证据，表明abbapolins具有独特的作用机制，且通过小分子靶向PBD是一种有效且独特的策略。本实验室此前报道了一项全基因组基因表达研究的结果：KD抑制剂BI2536如预期般引起了有丝分裂及细胞周期相关基因的表达变化，而所测试的abbapolins仅在少数靶基因组中表现出重叠的表达变化，其余基因表达变化则不同于KD抑制所诱导的变化，因此也为其独特的作用机制提供了证据[30]。在针对abbapolin 8的COMPARE分析中，一个有趣的发现是，在FDA批准的药物中，与其相关性最高的是COX-2抑制剂塞来昔布，尽管相关系数仅为0.42，未达到显著水平；这一点值得关注，因为据报道，塞来昔布
COX-2抑制剂可下调前列腺癌细胞系中包括PLK1在内的动粒/着丝粒蛋白的表达[35]。仍需进一步研究，以确定塞来昔布与PLK1之间相互作用的真实性。
重要的是，NCI-60筛选揭示了abbapolins发挥强效抗增殖活性所必需的关键结构特征，即通过硫醚基团或胺基连接烷基尾链与苯甲酰胺基团、并与PBD底物识别位点中的隐蔽口袋结合的化合物表现出最高活性。由于药物暴露时间的差异可能影响同一种abbapolin在不同细胞活力测定中的结果，我们采用集落形成实验，评估延长处理时间的影响以及潜在的延迟起效现象。与短期细胞活力测定的结果不同，化合物6表现出强效抑制作用，其IC₅₀为337.2 ± 45.0 nM。化合物6在延长暴露后效力增强的一种可能解释是，磷酸基团的存在可能导致其细胞内渗透延迟。尽管不同abbapolins在摄取和/或清除方面可能存在动力学差异，但Micro-Tag®测定所显示的PLK1靶标结合，以及在更接近细胞死亡起始时间的较晚时间点观察到的细胞内PLK1减少，均证实了这些最新abbapolins在细胞内的靶向活性。对NCI细胞系组所包含的60种肿瘤细胞系进行蛋白质组学分析发现，PLK1蛋白水平与细胞对abbapolins的敏感性呈负相关，进一步证实了其靶向作用机制。正如假设所述，PLK1的过表达对肿瘤存活至关重要，并赋予肿瘤一种可被利用的脆弱性，进而可被
可用于治疗。
在体外获得强效抗增殖活性后，研究人员在前列腺癌异种移植模型中考察了最具前景的abbapolin类化合物。首先，采用22RV1去势抵抗性前列腺癌细胞，对化合物6和7开展了初步体内药效实验。尽管化合物7口服给药时具有良好的药代动力学（PK）参数，但其在该模型中的疗效未达到统计学显著性（补充图1）。由于初步PK研究表明化合物6的口服生物利用度不足（表3），因此决定采用腹腔注射方式给予化合物6。abbapolin类化合物6治疗后可观察到明显的肿瘤生长抑制，但未达到统计学显著性（补充图1）。在该模型系统中，还测试了已进入临床评价的激酶结构域抑制剂（KDI）伏拉塞替，其可显著减小肿瘤体积。然而，伏拉塞替治疗也导致小鼠总体重以及脾脏、肝脏和肾脏重量出现具有统计学显著性的下降，且研究期间有一只小鼠死亡。这些观察结果与临床观察到的伏拉塞替毒性作用一致。相比之下，abbapolin类化合物治疗未引起体重或器官重量的统计学显著变化。此外，研究人员在PC3异种移植模型中评价了NCI-60筛选中活性最高的abbapolin类化合物6和8，两者均使肿瘤体积出现具有统计学显著性的减小。在这两项研究中，均监测了小鼠体重和器官重量，结果显示，与未治疗对照动物相比均无变化，提示在所用剂量下，小鼠对abbapolin类化合物具有良好的耐受性。
鉴于观察到abbapolin类化合物可导致PC3细胞中PLK1减少，研究人员进一步在体内肿瘤中对此进行了研究，并探讨PLK1蛋白是否可作为一种
体内活性的潜在生物标志物。事实上，在接受化合物6或8治疗的小鼠的肿瘤样本中，观察到PLK1水平显著降低。此外，分析显示，PLK1水平的降低与肿瘤体积呈线性相关，因此有望成为反映肿瘤治疗反应的药效学指标，但仍需进一步研究，以验证肿瘤内PLK1作为药物疗效临床生物标志物的价值。
前列腺癌对雄激素受体拮抗剂恩扎卢胺的耐药性已成为一项重大临床挑战。令人鼓舞的是，研究表明，采用激酶结构域抑制剂（KDI）抑制PLK1可抑制前列腺癌中的雄激素信号通路[36, 37]。这些发现促使研究人员探究abbapolin类化合物是否也能克服雄激素受体表达异常的肿瘤对恩扎卢胺的耐药性。事实上，在C4-2R细胞系中观察到abbapolin化合物6与恩扎卢胺之间具有很强的协同作用，这提示通过Polo盒结构域（PBD）抑制PLK1可干扰雄激素依赖性信号传导。近期有报道称，PLK1可促进Hedgehog信号通路，进而驱动对恩扎卢胺的耐药性[38]。后续将开展进一步研究，探究其与Hedgehog信号传导的联系，从而进一步阐明abbapolin类化合物可能对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）有效的机制。
总体而言，这项关于abbapolin类化合物的研究提供了体内概念验证，证明可应用REPLACE策略，将效力强但不具备类药性的肽类配体转化为具有疗效的小分子；这一策略既普遍适用于蛋白质–蛋白质相互作用，也具体适用于PLK1的PBD。已鉴定出先导abbapolin化合物6和8，它们是进一步开发前列腺癌治疗药物的优良起点。这些化合物还提供了
为靶向PBD作为替代ATP结合位点的策略提供了验证，后者迄今尚未产生获FDA批准的药物。多种PLK1激酶结构域抑制剂（KDI）因疗效不足和毒性问题而在临床开发过程中被放弃。本研究结果表明，通过非ATP竞争性方式靶向PLK1治疗癌症具有优势。其中包括相较于已知的肿瘤抑制因子PLK3，能够高效且选择性地靶向PLK1（图4）。近期研究表明，与激酶结构域（KD）结合的分子可使PLK1呈开放构象，并可能通过提高其对底物的亲和力，改变PLK1的功能及其细胞内相互作用伙伴[21, 22]。本实验室及其他研究团队均观察到，经KD抑制剂处理的细胞中出现PLK1积累，这很容易被解释为有丝分裂期间PLK1的自然上调以及KD抑制剂引起的有丝分裂阻滞所致。然而，对于催化活性丧失但呈开放构象的PLK1，其形态与功能尚缺乏充分认识。因此，KD抑制剂可能无法阻断PLK1的非催化作用，实际上甚至可能促进其非酶促功能，这或许能部分解释KD抑制剂未能成功通过临床试验的原因。综上所述，本文报道的abbapolins代表了一种具有前景的新型PLK1靶向方式，在雄激素抵抗性前列腺癌的联合治疗中具有显著潜力。
作者贡献
GM、GR、CNR、MP、MF、DC、MDW和CM参与了稿件撰写。GM、DC和JS设计并开展了细胞实验，包括蛋白质印迹和抗增殖测定。MF、YK和XL设计并开展了去势抵抗性前列腺癌细胞的联合用药研究。GR、JS和CNR设计并
合成了本文所述的所有 abbapolin 衍生物。GM、KH、NJ 和 MP 参与了 abbapolin 分子的体内研究。EN 和 IB 开发并实施了 Micro-Tag® PLK1 和 PLK3 细胞靶标结合测定。MC、ZM、CS 和 SK 参与了药代动力学（PK）研究及数据分析。DC 参与了磷酸化蛋白质组及 PLK1 底物与 abbapolin 细胞活性之间的相关性分析。MDW 和 CM 负责项目的总体指导，包括假说提出、abbapolin 抑制剂设计、细胞研究的设计与实施、监督以及论文撰写。
资金来源
感谢美国国立卫生研究院提供资助（项目编号：NIH/NCI R21 CA263359、R41 CA213711、P30 GM154632、P20 GM109091 和 R41 CA298584）。
致谢
感谢 Bill Cotham 博士和 Perri Pellechia 博士分别提供质谱和核磁共振方面的专业技术与资源。
已声明的资助方信息
美国国立卫生研究院
，CA263359
，CA213711
，GM154632
，GM109091
，CA298584
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Liu
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Wyatt
,
Campbell
McInnes
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