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关节软骨表层可实现低摩擦的关节运动，并保护组织免受机械磨损。表层的浅层软骨细胞（SZC）产生蛋白聚糖-4（PRG4），这是一种降低摩擦所必需的润滑物质。关节软骨的自我修复能力有限，因此临床采用自体软骨细胞植入术（ACI）等基于细胞的疗法来促进修复。然而，在ACI中，细胞需在组织培养用聚苯乙烯表面进行扩增，而SZC在该表面的黏附能力较差、增殖缓慢，并会发生去分化。因此，扩增后的SZC形成的纤维软骨组织中PRG4含量不足。我们此前已证实，在软骨细胞来源的脱细胞细胞外基质（CM）上培养SZC，可增强其黏附并维持其表型。由于纤连蛋白（FN）被鉴定为CM中含量最丰富的基质蛋白，本研究检验了以下假设：FN包被的培养表面能够部分重现CM的有益作用。我们发现，与CM类似，FN包被的聚苯乙烯表面可增强SZC的黏附和增殖。然而，与CM不同，在FN包被的聚苯乙烯表面扩增的SZC仍表现出较明显的去分化，其特征包括细胞铺展、成纤维细胞表型及收缩相关mRNA水平升高，以及平滑肌肌动蛋白（SMA）阳性应力纤维形成增加。与其去分化表型一致，在FN包被的聚苯乙烯表面培养的SZC呈现大量应力纤维，且细胞核内心肌素相关转录因子A（MRTF-A）水平较高。相比之下，CM减少了SZC中应力纤维的形成，并降低了细胞核内MRTF-A的水平。CM提供了FN以外的基质信号，可抑制去分化并维持SZC表型。鉴定改善SZC扩增所必需的基质信号可能促成在ACI修复组织中形成更优质的表面。
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纤连蛋白包被组织培养用聚苯乙烯以改善表层软骨细胞扩增
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Parreno
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https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736120
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该
关节软骨表层可实现低摩擦的关节运动，并保护组织免受机械磨损。表层的浅表区软骨细胞（SZCs）产生蛋白聚糖-4（PRG4），这是一种降低摩擦所必需的润滑剂。关节软骨的自我修复能力有限，因此，临床采用自体软骨细胞植入（ACI）等细胞疗法来促进修复。然而，在ACI中，细胞通常在组织培养用聚苯乙烯表面进行扩增，而SZCs在该表面黏附不良、增殖缓慢且发生去分化。因此，扩增后的SZCs形成的纤维软骨组织中PRG4含量不足。我们此前已证明，在软骨细胞来源的去细胞化细胞外基质（CM）上培养SZCs，可增强其黏附并维持其表型。由于纤维连接蛋白（FN）被鉴定为CM中含量最丰富的基质蛋白，本研究检验了以下假设：FN包被的培养表面可部分重现CM的有益作用。我们发现，与CM类似，FN包被的聚苯乙烯表面可增强SZCs的黏附和增殖。然而，与CM不同，在FN包被的聚苯乙烯表面扩增的SZCs仍表现出较高程度的去分化，具体表现为细胞铺展、成纤维细胞相关及收缩相关mRNA水平升高，以及α平滑肌肌动蛋白（αSMA）阳性应力纤维形成增多。与去分化表型一致，FN包被聚苯乙烯表面上的SZCs形成大量应力纤维，且核内心肌素相关转录因子A（MRTF-A）水平较高。相比之下，CM可减少SZCs中应力纤维的形成，并降低核内MRTF-A水平。除FN外，CM还提供了其他基质信号，可抑制去分化并维持SZCs表型。鉴定改善SZCs扩增所必需的基质信号，可能有助于生成
在ACI修复组织中形成更优质的表面。
引言
关节软骨可提供光滑且润滑的表面，促进关节活动过程中的载荷分布。关节软骨基质主要由Ⅱ型胶原（COL2）和聚集蛋白聚糖（ACAN）构成。软骨基质进一步分为三个不同的区域，各自具有独特的结构和功能[1,2]。最表面的层，即浅表区（SZ），在为关节运动提供润滑表面方面发挥着关键作用。浅表区软骨细胞（SZCs）通过产生蛋白聚糖-4（PRG4）等润滑蛋白，维持无摩擦运动，对维持浅表区功能至关重要[3,4]。软骨损伤后无法自行修复，因此软骨损伤的治疗面临重大挑战[2]。自体软骨细胞植入等细胞治疗方法旨在通过体外扩增软骨细胞以增加细胞数量，并将其植入缺损部位，从而修复受损组织[5–8]。尽管这些方法有助于组织修复，但软骨细胞扩增相关的挑战限制了其长期疗效。
一项主要挑战是，由于若干潜在问题，难以形成充分的浅表区。在单层扩增过程中，与深层区软骨细胞相比，浅表区软骨细胞的贴壁能力较弱，增殖速度较慢，导致其在扩增后的软骨细胞群体中逐渐减少[9,10]。浅表区是软骨退变过程中最早受累的区域之一，这进一步凸显了保留浅表区软骨细胞的重要性，也使其成为软骨再生策略中的一项关键挑战[2]。此外，扩增
SZC的单层培养会改变其表层区（SZ）表型，其中，扩增过程中SZC功能的丧失与软骨细胞去分化有关[10]。在聚苯乙烯（PS）表面，SZC发生形态变化，表现为细胞铺展增加和伸长。这些变化伴随着COL2、ACAN和PRG4等软骨生成相关分子表达的降低，以及Ⅰ型胶原（COL1）和腱生蛋白-C（TNC）等成纤维细胞样基质分子表达的升高[11–15]。成纤维细胞样基质分子生成增加，促使形成力学性能较差的纤维软骨，而非天然透明软骨[16,17]。此外，单层扩增还会导致α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）等收缩性标志物的表达增加；αSMA是一种肌动蛋白亚型，可促进去分化细胞形成高收缩性表型[11–15,18]。收缩性增强可能导致再生组织收缩，并在植入后妨碍其与周围天然组织的整合。
肌动蛋白细胞骨架的重组是调控软骨细胞表型的关键因素，并促进单层扩增过程中去分化的进展[11,12,19,20]。这种重组的特征是细胞内球状肌动蛋白（G-actin）与丝状肌动蛋白（F-actin）比例的变化。在单层培养中，G-actin向F-actin的聚合增加，促进应力纤维形成，使细胞呈现铺展的成纤维细胞样形态[12,21]。由于肌动蛋白是软骨细胞表型的重要调控因子，破坏F-actin应力纤维可抑制软骨细胞的去分化表型[19,22]。G/F-actin的变化调控下游
通过调控可与球状肌动蛋白（G-actin）结合的心肌素相关转录因子A（MRTF-A）来调节转录。当G-actin水平较低时，MRTF-A主要定位于细胞核内，促进成纤维细胞样基因的表达。相反，当G-actin水平较高时，MRTF-A与G-actin结合并滞留于细胞质中，从而限制转录[23,24]。尽管已有研究表明，MRTF-A可调控原代浅表层软骨细胞（SZC）的表型，但其在SZC扩增过程中的作用尚未明确[25]。
为克服现有软骨修复方法的局限性，需要开发靶向肌动蛋白–MRTF-A信号传导等关键通路的策略，以改善SZC扩增并抑制其去分化。在软骨细胞来源的去细胞化细胞外基质（CM）上对SZC进行单层培养，可提高细胞初始黏附率、促进增殖，并限制SZC扩增过程中成纤维细胞样及收缩相关基因表达的上调，从而改善SZC培养效果[26]。这些作用有助于解决SZC扩增中的关键问题，即SZC产量低以及培养过程中过度去分化。然而，CM中促进SZC黏附和改善其表型的具体基质分子及其作用机制仍不明确。我们对CM基质成分的分析发现，纤连蛋白（FN）是CM中含量最丰富的蛋白质[26]。FN通过与细胞表面整合素相互作用，调控SZC的黏附、增殖及分化状态；由于SZC高表达可结合纤连蛋白的整合素α5β1，因此优先与FN结合[27,28]。尽管在培养表面包被FN可增强细胞黏附，但研究表明，FN通过整合素介导的信号传导可调控肌动蛋白聚合和细胞骨架组织，而这些过程与MRTF-A相关
活化和软骨细胞去分化[29]。因此，尽管FN可能改善SZC的黏附和增殖，但也可能促进与去分化相关的关键信号通路。因此，单独使用FN能否在维持SZC表型的同时重现CM对SZC扩增的有益作用，目前仍不明确。
在本研究中，我们假设，在PS表面包被FN可改善二维培养条件下SZC的黏附和增殖。然而，鉴于FN参与肌动蛋白聚合和MRTF-A活化，我们推测，FN也会促进单层扩增过程中SZC的去分化。为验证这一假设，我们将在PS、FN包被的PS或CM包被的PS上培养并扩增SZC。我们将评估细胞黏附、扩增速率、F-肌动蛋白的组织结构、MRTF-A的核内活性，以及软骨生成和去分化相关分子的表达。总体而言，本研究旨在明确FN能否改善SZC的单层扩增，使扩增后的细胞可进一步用于组织再生。
结果
在CM和FN上培养P0代SZC可增强原代SZC的黏附
为确定FN是否增强原代SZC的黏附，我们将等量的P0代SZC分别接种于PS、CM和FN上。我们发现，24小时后，接种于CM和FN包被表面的SZC所覆盖的面积百分比增加（图1A）。在CM和FN上培养的SZC，其覆盖率分别为8.4% ± 2.7%和9.9% ± 3.1%，而PS上的覆盖率为3.5% ± 0.9%（图1B）。我们还通过DNA定量测定了培养24小时后黏附细胞的比例。在CM和FN上，SZC的黏附率分别为32.4% ± 4.7%和32.5% ± 7.6%（图1C）。CM和FN上的细胞黏附率均高于PS，后者为16.8% ± 3.8%。这些结果表明，CM和FN
与PS相比，增强原代SZC的黏附。
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图1.
原代SZC在PS、CM和FN上的黏附。
（A）原代（P0）SZC在PS、CM和FN上黏附24小时后的光学显微镜图像及（B）细胞覆盖面积百分比的定量结果。（C）接种于PS、CM和FN上的SZC在24小时后的黏附率。p < 0.01，*p < 0.001。
在CM和FN上扩增SZC可缩短达到汇合所需的时间
接下来，我们测定了单层培养的SZC达到汇合（细胞覆盖率为80%–90%）所需的时间。在从P0扩增至P1的过程中，于CM和FN上培养SZC可缩短其达到汇合所需的时间。在CM和FN上培养的SZC于第8天达到汇合，而在PS上培养的SZC于第12天达到汇合。第8天，当CM和FN上的SZC达到汇合时，PS上培养的SZC汇合度仅为37.9% ± 5.6%（图2A和B）。
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图2.
在PS、CM和FN上培养的SZC从（A、B）P0至P1及（C、D）P1至P2的汇合度。
（A、C）在PS、CM或FN上培养的传代SZC从（A、B）P0扩增至P1及从（C、D）P1扩增至P2过程中每日的汇合度百分比。（B、D）分别为第8天和第7天的代表性光学显微镜图像。*p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001。组间比较以颜色标示（绿色：PS与FN；品红色：PS与CM；蓝色：CM与FN）。
同样，在从P1扩增至P2的过程中，于CM和FN上培养SZC可缩短其达到汇合所需的时间。在CM和FN上培养的SZC于第7天达到汇合，而在PS上培养的SZC则于第9天达到汇合。第7天，当CM和FN上的SZC达到汇合时，PS上的SZC汇合度仅为55.6% ± 11.9%（图2C和D）。综上，这些结果表明，与PS相比，CM和FN可缩短SZC达到汇合所需的时间。
在FN上传代培养SZC导致
成纤维细胞样形态与伸长
接下来，我们旨在确定在PS、CM和FN上进行扩增对细胞形态的影响程度，因为软骨细胞体积增大与去分化相关[11]。在P0代，培养于PS、CM和FN上的浅表区软骨细胞（SZC）在细胞面积或圆度方面均无显著差异（图3A）。从P0代扩增至P2代后，所有基底上培养的SZC的细胞面积均增大。至P2代时，FN和PS上的SZC较CM上培养的SZC更大（图3A、B）。
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图3.
PS、CM和FN上P0代与P2代SZC的形态学分析。
（A）在PS、CM和FN上培养的P0代和第2代（P2）SZC的代表性光学显微镜图像。P0代和P2代细胞（B）面积及（C）圆度的定量分析。***p < 0.001。
细胞圆度分析表明，在所有培养条件下，传代均会降低细胞圆度（图3C）。值得注意的是，在FN上培养的SZC表现出与PS上相似的形态变化。综上，这些结果表明，CM可限制传代相关的细胞体积增大，而FN则与PS类似，可促进细胞铺展和增大。
在FN上扩增SZC不能防止软骨形成相关基因及浅表区特异性基因表达的丧失
为评估在PS、CM或FN上进行单层扩增培养的各传代阶段对SZC去分化的影响，我们测定了扩增后SZC的mRNA水平。就软骨形成相关基因表达而言（图4A），在P0代，PS、CM和FN上的ACAN mRNA水平相近。在所有培养条件下，ACAN mRNA水平均从P0代至P2代显著下降。在P2代，不同培养表面之间无显著差异。在所有培养表面上，COL2 mRNA水平均从P0代至P2代下降。在P0代和P2代，COL2 mRNA
在PS、CM和FN上培养的SZC之间，其水平相近。SRY盒转录因子9（SOX9）是已知的ACAN和COL2转录激活因子[30, 31]。我们发现，在FN上培养的P0代SZC中，SOX9 mRNA水平高于在FN上培养的P2代SZC。在PS、CM和FN上培养的P0代SZC之间，SOX9 mRNA水平无差异。同样，在PS、CM和FN上培养的P2代SZC之间也无差异。
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图4.
在PS、CM和FN上传代培养的P0代和P2代SZC的基因表达分析。
采用相对定量RT-PCR分析在PS、CD-ECM（CM）和FN上传代培养的P0代和P2代SZC中（A）软骨形成相关基因（ACAN、COL2和SOX9）、（B）浅表区（SZ）特异性基因（PRG4和CLU）、（C）去分化相关基因（COL1、αSMA和TNC）以及（D）增殖相关基因（KI67和CCND1）的mRNA水平。结果以PS上培养的P0代细胞相应水平的百分比表示。*P < 0.05，P < 0.01，*P < 0.001。
与接种于FN和PS上的SZC相比，接种于CM上的P0代SZC中，SZ特异性基因PRG4的mRNA水平更高（图4B）。尽管所有条件下PRG4 mRNA水平均随传代而降低，但在CM上培养至P2代的SZC仍维持比在PS和FN上培养的细胞更高的PRG4表达水平。所有条件下，SZ分子CLU的mRNA水平均无差异。为评估在不同包被基质上传代培养过程中细胞获得成纤维细胞样特征的情况，我们检测了COL1、αSMA和TNC的mRNA水平（图4C）。在传代过程中，于PS和FN上培养的SZC中，COL1、TNC和αSMA的mRNA水平从P0代至P2代升高，而在CM上培养的SZC中，这些基因在P0代和P2代的表达水平保持相近。在P2代，CM组的COL1、TNC和αSMA mRNA水平均显著低于PS组和FN组。
由于在CM和FN上传代培养的SZC比在PS上培养的SZC更快达到融合状态，我们还检测了增殖标志物Kiel-67（KI67）以及
细胞周期调控因子细胞周期蛋白D1（CCND1）（图4D）。KI67 mRNA水平表现出较大变异，且在两个传代阶段（P0和P2），各培养条件之间均无显著差异。在P0和P2阶段，CM上培养的SZC的CCND1 mRNA水平均高于PS上培养的SZC，而FN上培养的SZC与PS组相比无显著差异。综上，这些结果表明，在CM上扩增SZC可在传代过程中抑制去分化相关mRNA的表达水平，而FN则无此作用。
在FN上扩增SZC不能阻止与去分化相关的细胞骨架重塑
αSMA在去分化软骨细胞中高度表达，并促成P2软骨细胞的高收缩性表型[12, 21]。在此，我们通过观察PS、CM和FN上培养的P2 SZC中αSMA的组织结构，将αSMA作为去分化表型的指标（图5）。共聚焦成像显示，PS上22.0% ± 3.6%的SZC具有αSMA阳性应力纤维。FN上具有αSMA阳性应力纤维的SZC比例与PS组相近，为18.7% ± 2.9%。相比之下，CM上培养的SZC中该比例较低，仅有4.6% ± 2.6%的SZC具有αSMA阳性应力纤维。
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图5.
PS、CM和FN上P2 SZC的αSMA染色。
（A）
共聚焦显微图像显示PS、CM和FN上培养的P2 SZC中的αSMA（绿色）、F-actin（红色）和细胞核（蓝色）。虚线框标示了在（B）中以更高倍数展示的代表性细胞。
（B）
αSMA和F-actin组织结构的代表性高倍图像，包括独立的αSMA和F-actin通道。数值表示PS、CM和FN上具有αSMA阳性应力纤维的P2 SZC的百分比。
在FN上扩增与MRTF-A核内增加相关
定位与肌动蛋白聚合
由于软骨细胞中肌动蛋白聚合状态的改变可通过调控MRTF-A的定位来调节去分化[12,21]，我们评估了在PS、CM和FN上培养的P2 SZCs中F-actin的组织结构及MRTF-A的定位（图6）。与在CM上培养的SZCs相比，在PS和FN上培养的SZCs呈现出明显的应力纤维，而CM上的SZCs中F-actin应力纤维较少（图5B，中间面板；图6A，上方面板）。此外，CM减少了P2 SZCs中MRTF-A的核定位（图6A，下方面板；图6B）。这些结果表明，FN有利于形成明显的F-actin应力纤维，并促进MRTF-A的核定位，而这两者均与SZC去分化相关。另一方面，CM抑制F-actin应力纤维形成和MRTF-A核定位，从而维持SZC表型。
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图6.
PS、CM和FN上培养的P2 SZC中MRTF-A的染色与定位。
（A）共聚焦显微镜图像，显示MRTF-A（绿色）、F-actin（红色）和细胞核（蓝色）；（B）PS、CM和FN上培养的P2 SZC中MRTF-A核内及胞质平均荧光强度的定量分析。***p < 0.001。
讨论
本研究结果支持我们的假设，即FN可在SZC扩增过程中部分重现CM的有益作用。FN增加了原代SZC的贴附，并缩短了达到汇合状态所需的时间，这与我们关于FN可提高细胞数量扩增效率的预测一致。然而，与在CM上扩增的SZCs不同，在FN上培养SZCs并未抑制其去分化表型。相反，在FN上扩增的SZCs在形态、转录特征及F-actin组织结构方面与在PS上培养的去分化SZCs相似。因此，尽管FN可改善SZC的贴附并促进其达到汇合状态，但仅靠FN并不能
足以在二维扩增过程中维持SZ表型。这些发现表明，FN支持细胞贴附和生长，但CM提供的其他因子可抑制单层扩增过程中发生的去分化。
在FN上观察到的贴附改善很可能由SZCs与FN结合型整合素之间的相互作用介导。软骨细胞表达多种介导其与基质配体黏附的整合素，包括可与FN、胶原、层粘连蛋白和骨桥蛋白结合的受体[27]。其中，α5β1整合素是一种已得到充分表征的FN受体，据报道其在SZCs中高表达[32, 33]。既往研究表明，SZCs优先与FN基底结合，提示α5β1介导的黏附可能有助于改善细胞在FN包被表面上的贴附[28, 34]。培养的SZCs在CM和FN上的贴附程度相近，提示FN可能有助于改善在CM上观察到的初始贴附。
在CM和FN上培养的SZCs比在PS上培养的细胞更快达到汇合。SZCs在CM和FN上达到汇合所需时间的缩短，可能源于贴附增加、增殖增强，或两者的共同作用。在CM和FN上观察到的贴附增加，使接种后即刻贴附于培养表面的细胞数量更多，从而缩短达到汇合所需的时间。此外，CM提高了SZCs中CCND1的mRNA水平。CCND1是细胞周期进程的关键调控因子，可促进细胞周期由G1期向S期转变，并与增殖活性相关[35]。因此，在CM上观察到的CCND1表达升高与细胞周期进程加快相一致，并提示CM可能促进细胞增殖。在
相比之下，尽管CCND1 mRNA水平未升高，FN仍缩短了SZC达到融合状态所需的时间，这表明CCND1不太可能是FN上细胞增殖增加的原因。相反，FN上细胞达到融合状态所需时间的缩短，可能反映了其他信号通路以不依赖CCND1的方式调控增殖。具体而言，已有研究表明，MRTF-A信号通路参与细胞增殖的调控[12, 21, 36]。因此，FN可能通过不同于CM上所起作用的信号通路促进细胞扩增。
尽管CM和FN均能促进细胞扩增，但二者对SZC分化状态的影响却截然不同。细胞形态分析凸显了SZC扩增后FN与CM之间的差异。至第2代（P2）时，在FN上培养的SZC细胞面积增大，并呈现出与PS上培养的细胞相似的铺展性成纤维细胞样形态。相比之下，在CM上培养的SZC在整个传代过程中均保持较小的细胞面积，这与其保留更接近天然SZC的形态相一致。这些发现表明，除FN所提供的基质信号外，CM还含有其他基质信号，可主动限制细胞铺展和SZC去分化。形态变化伴随着基因表达的差异，进一步支持了SZC在FN上去分化程度更高的结论。FN未能阻止传代过程中软骨分化标志物或浅表层特异性标志物的丢失，而与FN和PS相比，CM可维持其转录特征。CM抑制去分化的作用可能至少归因于三种不同因素。首先，与FN包被的组织培养塑料表面不同，CM保留了由多种软骨来源细胞外基质（ECM）蛋白组成的复杂混合物，包括VI型胶原（COLVI）、XII型胶原（COLXII）和I型胶原（COL1）[26]。其中，
其中，COLVI尤为值得关注，因为它是软骨细胞周围基质的组成成分，并被认为参与维持软骨细胞表型[37,38]。类似地，已有研究表明，在COL1包被的基底上培养可通过维持细胞的圆形形态并减少F-肌动蛋白应力纤维，抑制软骨细胞在单层扩增过程中的去分化[39]。综上，这些发现提示，CM能够防止SZC去分化，可能源于多种基质成分的协同作用，这些成分重现了天然细胞外环境。其次，CM中由细胞沉积的基质所形成的表面形貌也可能在限制去分化方面发挥作用，因为已有研究表明，软骨细胞的形态和去分化取决于培养表面的微观形貌[40]。最后，除表面形貌外，基质刚度也已被证实会影响软骨细胞表型[41,42]。CM基质的刚度约为350 kPa[43]，比PS低数个数量级，因此可能防止SZC去分化。CM的这些生物化学和生物物理特征可能改变SZC的行为，明确各项特征的贡献值得在未来进一步研究。
CM能够抑制SZC去分化，而FN则不能，这提示这些基底对肌动蛋白组织及肌动蛋白介导的信号传导具有不同的调控作用。在PS和FN上扩增会促进F-肌动蛋白应力纤维形成，并增加MRTF-A的核定位。相比之下，在CM上培养的细胞应力纤维较少，且MRTF-A保留在细胞质内。MRTF-A是一种机械敏感性转录因子，其活性受G-肌动蛋白与F-肌动蛋白之间平衡的调控。肌动蛋白增加
聚合促进MRTF-A转位至细胞核，并在其中驱动成纤维细胞相关基因和收缩相关基因的表达[12, 21, 44]。与这一机制一致，在PS和FN上，MRTF-A核定位增加，同时伴随COL1、αSMA和TNC表达升高；既往研究已证实，这些基因受MRTF调控[12, 21]。相反，在CM上，应力纤维形成减少，且MRTF-A主要定位于细胞质，这与上述去分化标志物的表达受到抑制相关。总体而言，这些发现支持如下模型：CM的生物化学和生物物理特性减少了SZC的铺展，从而阻止F-actin重组，抑制MRTF-A核转位，进而降低与软骨细胞去分化相关的成纤维细胞样基质及收缩相关基因的表达。
综上所述，通过使用牛SZC，我们证明了单独使用FN即可促进SZC黏附和增殖，但不能抑制SZC去分化。因此，在扩增过程中维持SZC表型可能需要更复杂的细胞外基质环境。进一步研究CM所固有的生物化学和生物物理特性，将有助于加深对调控SZC表型的关键细胞外因素的理解。此外，尽管本研究中的牛SZC取自总体健康的软骨，但要获得用于临床治疗的更优质细胞群体，仍需更深入地了解来源于人软骨以及不同疾病状态下软骨组织的SZC。明确调控SZC黏附、增殖和去分化的细胞外基质因素，将有助于制备
由具有天然组织样特征的浅表层构成的修复组织。
实验方法
牛原代浅表层软骨细胞（SZC）的分离
按照既往报道的方法[10, 25]，从牛掌指关节获取的软骨浅表层（SZ）中分离SZC。简言之，通过显微解剖从关节获取浅表层软骨，并采用序贯酶消化法从组织中提取SZC：先用0.5%蛋白酶（Sigma-Aldrich，9036-06-0；美国密苏里州圣路易斯）于37°C消化45分钟，再用0.1%胶原酶（Roche，德国曼海姆）于37°C消化14–17小时。将所得细胞悬液过滤，用不含钙、镁的磷酸盐缓冲液（PBS；Quality Biological，美国马里兰州盖瑟斯堡）洗涤，并进行细胞计数。
在PS、CM和FN上扩增
进行单层扩增时，将SZC接种于聚苯乙烯（PS；Corning，美国新泽西州爱迪生）、纤连蛋白（FN）包被的PS或细胞基质（CM）包被的PS上。CM包被的PS培养皿购自商业供应商（StemBioSys，美国得克萨斯州圣安东尼奥）。为用FN包被PS，将以PBS配制、浓度为10 μg/mL的FN溶液（牛血浆纤连蛋白，EMD Millipore Sigma，341631；德国达姆施塔特）加入PS培养皿中，于室温放置2小时。包被T75培养瓶时加入10 mL溶液，包被6孔板的单个孔时加入2 mL溶液，使最终包被量为2.5 μg/cm²。2小时后，用PBS洗涤表面3次，再接种软骨细胞。
将SZC以1500个细胞/cm²的密度接种于PS、CM和FN上。软骨细胞在扩增培养基中培养并传代。扩增培养基由Ham’s F-12培养基（Corning，MT10080CV）添加10%胎牛血清（FBS；GenClone，Genesee Scientific，美国加利福尼亚州圣迭戈）和1%抗生素-抗真菌剂（Corning）组成。将SZC培养至约80%融合度
培养至90%汇合度，随后使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（GenClone）消化脱离。脱离后的细胞被定义为第1代（P1）细胞。随后，将各条件（PS、CM、FN）下的P1代SZC重新接种于各自对应的表面，进行单层培养（2 × 10³个细胞/cm²）。将P1代细胞扩增至约80%–90%汇合度后，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化脱离，获得第2代（P2）细胞。
黏附与汇合度分析
为定量分析细胞面积覆盖率（汇合度）和黏附情况，将P0代SZC以5.0 × 10⁴个细胞/cm²的密度接种于PS、CM或FN表面，在扩增培养基中进行单层培养。24小时后，吸去培养基，并用PBS洗涤培养物，以去除未黏附细胞。使用配备相机（Swiftcam Technologies；中国香港）的Zeiss Primovert组织培养显微镜（Zeiss，德国耶拿）采集光学显微图像。将图像导入FIJI（ImageJ；美国国立卫生研究院）进行分析。使用徒手选择工具手动描绘各视野内黏附细胞的轮廓。计算所描绘细胞的总面积，再除以图像总面积，以确定面积覆盖百分比。每孔对多个视野进行定量分析，每种实验条件至少分析3个孔。为评估传代过程中的汇合度，在P0至P1及P1至P2的整个传代培养过程中，每天对各SZC培养物进行上述操作，以比较不同条件下细胞扩增随时间的变化。
按照既往所述方法，通过DNA定量测定黏附于各培养表面的细胞比例[10, 26]。简言之，将P0代SZC以5.0 × 10⁴个细胞/cm²的密度接种于PS、CM或FN表面，在单层扩增培养基中培养。
24小时后，吸去培养基以去除未贴壁细胞，并用PBS轻柔洗涤细胞。使用木瓜蛋白酶消化液（含40 μg/ml木瓜蛋白酶、20 mM乙酸铵、1 mM EDTA和2 mM二硫苏糖醇，pH 6.2）收集贴壁细胞，随后于65°C消化4小时。将各培养表面贴壁细胞的DNA含量与接种时从初始细胞悬液中取出的等分样品的DNA含量进行比较，以确定细胞贴壁比例。采用Hoechst 33258染料结合测定法，定量检测经木瓜蛋白酶消化的细胞沉淀中的DNA含量。使用PBS稀释的小牛胸腺DNA绘制标准曲线。采用荧光分光光度法测量吸光度（Glomax Multi+检测系统；激发波长λ = 355 nm；发射波长λ = 460 nm）。
RNA提取与相对定量RT-PCR
按照制造商说明，使用TRIzol试剂（Sigma-Aldrich）从SZCs中提取总RNA。使用NanoDrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估RNA产量和纯度。按照制造商的操作规程，使用UltraScript 2.0 cDNA合成试剂盒（PCR Biosystems，美国宾夕法尼亚州韦恩）将RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。进行相对定量RT-PCR时，每个反应使用20 ng cDNA、工作浓度为10 μM的经预先验证的基因特异性引物（序列、GenBank登录号及温度见01）[11, 45]，以及qPCRBIO SyGreen Blue Master Mix（PCR Biosystems）。
使用Cielo 3实时PCR系统（Azure Biosystems，美国得克萨斯州休斯敦）进行反应，每个反应设置两个复孔（具体PCR条件见01）。设置了无模板对照和无逆转录酶对照
每次实验均纳入相应对照，以验证特异性并排除污染。以18S rRNA为内源性参照基因，采用Pfaffl法计算平均相对定量值[46]。
形态、面积和圆度
为评估细胞形态，将P0和P2代SZCs以5.0 × 10⁴个细胞/cm²的密度接种于PS、CM和FN表面，在扩增培养基中进行单层培养。24小时后，使用配备相机（Swiftcam）的Zeiss Primovert组织培养显微镜采集光学显微图像。在FIJI中手动勾勒贴壁细胞的边界。按照先前描述的方法计算细胞面积和圆度[22,26]。圆度值越接近1，表示细胞越圆；数值越低，则表明细胞形态越细长，越呈成纤维细胞样。每种条件至少评估3个图像视野，并分析至少45个细胞。
αSMA和MRTF-A的免疫荧光染色
为观察αSMA阳性应力纤维及MRTF-A的定位，将在PS、CM和FN表面扩增的P2代SZCs以1.0 × 10⁴个细胞/cm²的密度，分别接种于未包被、CM包被或FN包被的Thermanox塑料盖玻片（Thermofisher）上。24小时后，将细胞置于4%多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德）中，于室温孵育15分钟进行固定，随后用PBS洗涤3次。之后，使用含3%山羊血清、3% BSA和0.3% Triton的溶液对细胞进行透化和封闭，处理30分钟。透化后，将细胞与抗αSMA一抗（小鼠单克隆抗体，稀释比例1:200，ab7817，ABCAM，英国剑桥）或抗MRTF-A一抗（兔单克隆抗体，稀释比例1:100，77098，Cell Signaling Technologies，于4°C孵育过夜，
美国马萨诸塞州丹弗斯）。24小时后，洗涤细胞，并在室温下与二抗溶液孵育1小时。该溶液含有Hoechst 33342（细胞核；1/500；Biotium，40046；美国加利福尼亚州弗里蒙特）、罗丹明标记的鬼笔环肽（F-actin；1:50；Biotium，00027；美国加利福尼亚州弗里蒙特），以及CF488A标记的山羊抗兔IgG（MRTF；1:500；Biotium，20019）或CF488A标记的山羊抗小鼠IgG（αSMA；1:500；Biotium，20302）。各次孵育之间均用PBS洗涤细胞三次。随后使用Drop-n-Stain封片剂（Biotium）和玻璃盖玻片封片。使用配备40倍物镜的Zeiss LSM880激光扫描共聚焦荧光显微镜进行成像。以0.4 μm的层厚采集Z轴堆栈图像。
αSMA阳性应力纤维的定量
在FIJI中，通过逐一人工评估细胞是否存在有序排列的αSMA阳性应力纤维，定量计算应力纤维呈αSMA阳性的细胞比例；此类应力纤维被定义为横跨细胞体的清晰束状丝状结构。在单组实验中，每个条件分析4张图像，每张图像评估25个细胞，即每个条件共评估100个细胞。将阳性细胞数除以计数的细胞总数，计算每个条件下αSMA阳性细胞的百分比。在三组独立实验中重复此流程，每个条件累计评估300个细胞。
MRTF-A核定位分析
为进行定量分析，按照既往所述方法[47]，在FIJI中测量MRTF-A在细胞核和细胞质中的荧光强度。利用Hoechst信号确定细胞核区域，并利用鬼笔环肽标记的F-actin识别细胞边界。细胞核和细胞质内的MRTF-A积分荧光强度
利用这些区域计算每个细胞的 MRTF-A 核/细胞质比值。
统计分析
除非另有说明，所有实验均使用从多个牛关节中分离的 SZCs，并至少进行三次独立重复。每次独立重复均指在不同日期，使用来自不同供体牛的细胞进行的一次单独的 SZC 分离。分析时，将重复实验的数据合并。使用 GraphPad Prism（GraphPad Software Inc，美国马萨诸塞州波士顿）进行统计分析。采用 ROUT 方法筛查数据集中的离群值 [48]。采用单因素方差分析（ANOVA）比较 PS、CM 和 FN 各组，随后进行适当的多重比较检验。数据以均值 ± 标准差表示，统计学显著性由预先设定的 α 水平判定。
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表 1：
基因特异性引物序列
致谢
本研究获得骨科研究与教育基金会（Orthopaedic Research and Education Foundation，OREF）的部分资助（项目编号：26-010，授予 AWS 和 JP）。
已声明的资助方信息
骨科研究与教育基金会，
，26-010
脚注
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表示共同第一作者
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John E.
Caputo
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Manzoni
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Ewine
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Su
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Justin
Parreno
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2026.07.02.736120;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736120
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John E.
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Su
,
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2026.07.02.736120;
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关键词：浅层软骨细胞 · 纤连蛋白包被 · 细胞外基质 · 细胞扩增 · 软骨细胞去分化 · MRTF-A核转位
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.736120v1?rss=1