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系统生物学旨在构建将分子机制与细胞行为联系起来的预测模型。全基因组尺度代谢模型是目前应用最广泛的框架之一，可用于整合化学计量学、热力学以及组学衍生信息，以预测可行的代谢表型。然而，细胞代谢的运行时间尺度受酶动力学以及代谢通量与代谢物库大小之间关系的共同制约。在稳态代谢模型中，这种关系可以用代谢物周转率来表示。代谢物周转率定义为通量与代谢物库大小之比，用于量化代谢物库更新的速率。因此，符合生理学的稳态解不仅应满足质量平衡约束和热力学约束，还应表现出与酶介导的细胞动力学一致的周转率。当前基于约束的方法可以纳入许多未考虑周转率的稳态通量—浓度状态，从而导致与真实代谢动力学不相容的表型，即使施加了多种类型的数据约束也是如此。在此，我们提出 METEOR-K，一种将稳态代谢通量通过周转率约束与代谢物浓度联系起来的优化框架，用于识别在动力学上合理的通量—浓度参考状态。由于这些约束会重塑可行解空间，我们还引入了考虑周转率的采样策略，以高效探索由此形成的可行区域。我们将 METEOR-K 应用于范围和规模逐步扩大的模型，包括简化的糖酵解途径、厌氧条件下的大肠杆菌模型，以及接近全基因组尺度的卵巢癌模型。METEOR-K 缩小了可接受的稳态解空间，降低了可行通量—浓度状态的不确定性，并改善了局部动态行为。在生物反应器培养和药物响应情景的非线性常微分方程（ODE）模拟中，基于 METEOR-K 得到的状态所产生的细胞内响应时间，与支持生长的代谢运行及扰动后的恢复过程相符。总体而言，这些结果表明，代谢物周转速率可作为可扩展的生物物理约束，提升稳态代谢建模的生理一致性。由于周转速率编码了通量与池大小之间的时间尺度约束，METEOR-K 将部分生理一致性评估前移至动力学参数化之前，从而为动力学建模和动态预测提供更合适的通量—浓度参考状态。
ljubisa.miskovic{at}epfl.ch
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摘要
系统生物学旨在构建将分子机制与细胞行为相联系的预测模型。基因组尺度代谢模型是整合化学计量、热力学及组学来源信息以预测可行代谢表型的最常用框架之一。然而，细胞代谢运行的时间尺度受酶动力学以及代谢通量与代谢物池大小之间关系的支配。在稳态代谢模型中，这一关系可用代谢物周转速率表示，其定义为通量与代谢物池大小的比值，用于量化代谢物池更新的快慢。因此，符合生理实际的稳态解不仅应满足质量平衡和热力学约束，还应具有与酶介导的细胞动态过程相一致的周转速率。现有的基于约束的方法可能允许许多未考虑周转速率的稳态通量–浓度状态存在，即使施加多种类型的数据约束，也会产生与真实代谢动态不相容的表型。在此，我们提出 METEOR-K，这是一种通过周转速率约束将稳态代谢通量与代谢物浓度联系起来的优化框架，用于识别在动力学上合理的通量–浓度参考状态。由于这些约束会重塑可行解空间，我们还引入了考虑周转速率的采样策略，以高效探索所形成的可行域。我们将 METEOR-K 应用于范围和规模逐步扩大的模型，包括简化的糖酵解途径、厌氧条件下的
大肠杆菌
以及近基因组尺度的卵巢癌
模型。METEOR-K 缩小了可接受的稳态解空间，降低了可行通量–浓度状态的不确定性，并改善了局部动态行为。在生物反应器培养和药物响应情景的非线性常微分方程（ODE）模拟中，由 METEOR-K 得到的状态所产生的细胞内响应时间，与支持生长的代谢运行及扰动后恢复相适应。总体而言，这些结果确立了代谢物周转速率作为可扩展生物物理约束的作用，能够提高稳态代谢建模的生理一致性。由于周转速率蕴含了通量与代谢物池大小之比所对应的时间尺度约束，METEOR-K 将部分生理一致性评估前移至动力学参数化之前，从而为动力学建模和动态预测提供更为合适的通量–浓度参考状态。
引言
细胞代谢具有复杂性，并呈现多种非线性动态现象，包括负反馈和前馈回路¹˒²、振荡³–⁵以及多稳态⁶–⁹。计算模型通过将代谢网络结构和生化调控与生理功能联系起来，有助于解释这些行为。
基于约束的建模一直是这一研究工作的核心，因为它能够在物理化学和生理约束下对稳态代谢通量进行大规模分析。这些方法可识别满足质量平衡¹⁰、热力学¹¹–¹⁴、资源分配¹⁵˒¹⁶和多组学数据整合¹⁷–²⁰要求的通量状态。然而，即使引入了这些扩展，可行解空间往往仍然很大，而且并非所有可接受的通量状态都对应于生理上合理的代谢行为。
一个关键局限在于，稳态表述通常并不
约束通量大小如何随代谢物池大小变化
21
,
22
。例如，基于热力学的公式
11
–
14
通过吉布斯能约束引入代谢物浓度，但这些公式主要限制反应方向性和可行的浓度范围。它们无法确定，对于相应的代谢物池大小而言，某一通量大小在动力学上是否合理。因此，即使通量分布满足质量平衡、热力学可行性以及其他施加的约束，仍可能暗示不现实的生化动力学。
这一局限之所以重要，是因为代谢物浓度受到生理条件的约束，而代谢通量则必须在更大的范围内进行调整，以支持生长和对环境变化的响应。当代谢需求增加时，细胞不能简单地使代谢物池按通量成比例增加。相反，在受约束的代谢物池中实现更高通量，需要更快的代谢物更新，从而使通量—浓度关系与代谢时间尺度相联系
23
。例如，在生长细胞中，如果某一稳态通量—浓度组合所暗示的代谢物更新时间尺度远慢于生长过程，那么即使该组合满足质量平衡和热力学可行性，它在动力学上仍与其试图表征的生理状态不一致。
代谢物周转速率为这种更新提供了直接的衡量指标。对于某一代谢物，其周转速率等于累积生成速率或消耗速率与其浓度之比，相应的周转时间则为该比值的倒数。该比值将稳态通量—浓度组合与其所隐含的代谢物池更新时间尺度联系起来。在最简单的一阶情形下，通量
v
是代谢物浓度
x
的线性函数（
v
=
k
·
x
），比值
v
/
x
就是动力学大小规律
常数 \(k\)。因此，通量-浓度对无需完整的动力学模型即可编码一个特征时间尺度（图1）。
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图1。
周转速率（TR）约束与 METEOR-K 工作流程。
通量-浓度比为每个代谢物池定义了一个隐含的周转速率，将池大小和消耗通量与局部动态响应时间尺度联系起来。METEOR-K 通过对代谢物 TR 施加边界约束来耦合通量变量和浓度变量，从而将可行空间限制在与周转一致的代谢状态范围内。该框架以给定生理条件下具有通量范围和浓度范围的稳态约束型代谢模型作为输入，并可选择性地加入热力学、交换、 生长组学和通路层面的时间尺度约束。METEOR-K 可以利用具有生理意义的参考时间尺度进行全局应用，例如细胞倍增时间、生物过程时间或生长阶段时间尺度；也可以采用靶向方式，通过识别与缓慢动态模态相关的代谢物，并对这些代谢物池施加 TR 约束来实现。由此得到的受约束解空间能够产生更紧的可行区域、信息量更高的稳态样本、更接近生理状态的特征时间尺度、经过协调的数据，以及改进的非线性常微分方程模拟结果。
一个具有生理学合理性的稳态还应当与现实的局部动态行为相容，而局部动态行为由该状态下的雅可比矩阵决定。由于雅可比矩阵的各项与通量-浓度比呈比例关系（补充说明1），周转速率会限制可实现的弛豫时间尺度范围。然而，周转速率并不能涵盖动态行为的所有决定因素，包括反应速率对代谢物变化的响应方式、调控……
耦合关系、守恒池或网络相互作用决定了单个动态模式在该范围内的具体实现方式。因此，周转率约束可提供一种动态筛选机制：较低的周转率可能表明相应稳态更有可能支持缓慢的局部响应，而较高的周转率则允许快速动力学的存在，但并不保证一定产生快速动力学。
因此，我们探讨了代谢物周转率约束是否能够在保留基因组尺度约束模型可扩展性和模块化特征的同时，帮助生成在动力学上合理的稳态通量—浓度状态。这促使我们开发了 METEOR-K（MEtabolite Turnover-rate Enabled Optimization for Relevant Kinetics，面向相关动力学的代谢物周转率启用优化）——一种通过周转率约束将稳态代谢通量与代谢物浓度联系起来的优化框架（图1）。这种耦合本质上是非线性的，因为周转率取决于通量与池大小之比。因此，若直接施加该约束，则需要采用非线性优化和混合整数非线性规划，从而限制其在大型代谢网络中的可扩展性。METEOR-K 通过采用常数分箱和分段线性近似，将周转率约束重新表述为混合整数线性规划（MILP），从而解决了这一问题。
这种重新表述使 METEOR-K 能够排除隐含周转率在生物学上不合理的稳态通量—浓度状态。我们开发了考虑周转率的采样策略，以高效探索由周转率约束所限定的可行域。对于大规模模型而言，在所有代谢物上统一施加周转率约束可能过于严格；针对这一问题，METEOR-K 利用动力学模型集合的模态分析，识别与慢模态相关的代谢物池。选择性地在这些
代谢物池使约束实施聚焦于网络中动力学信息丰富的部分，同时也使得在大规模网络中实施约束变得可行。我们在拓扑结构和规模各异的网络中评估了 METEOR-K，包括简化糖酵解模型、厌氧大肠杆菌模型，以及一个超大规模卵巢癌代谢模型。这些应用共同表明，METEOR-K 通过约束符合周转关系的通量–浓度状态，并优先考虑与局部代谢时间尺度最相关的约束，为在稳态代谢建模中纳入动态合理性提供了一种可扩展的途径。
结果
周转率限制可实现的局部时间尺度
在一个简化糖酵解模型中，我们检验了根据稳态通量–浓度对计算得到的周转率，能否识别出限制可实现局部动力学的代谢物池。我们通过定义代谢物 \(i\) 的周转率 \(TR_i\) 来量化通量与浓度之间的耦合，定义如下：
其中，\(x_i\) 为代谢物浓度，\(v_j\) 为反应 \(j\) 的通量，\(n_{ij}\) 为代谢物 \(i\) 在反应 \(j\) 中的化学计量系数，\(K_i\) 是在所考虑的稳态下消耗代谢物 \(i\) 的反应集合。因此，\(TR_i\) 的单位为时间的倒数，用于量化代谢物池相对于其大小的更新速率。等价地，\(1/TR_i\) 是在给定稳态通量下置换该代谢物池所需的特征时间。在稳态下，总生成量与总消耗量的大小相等，因此可以根据生成通量集合或消耗通量集合计算周转率。
周转与局部动力学之间的联系源于雅可比矩阵的结构：其元素随通量–浓度比值缩放，而反应速率敏感性和网络
耦合决定了各个模式的实现方式（补充说明1和2）。因此，周转速率可作为线性化系统所能达到的时间尺度范围的指标。特别是，当雅可比矩阵呈弱耦合或对角占优时，周转速率能够反映特征值的尺度，进而反映局部动态响应的可实现范围。然而，在强耦合网络中，周转速率所限定的是可实现的局部时间尺度范围，而非直接决定单个特征值，因为反应速率敏感性和非对角相互作用也会对雅可比矩阵产生影响。
我们利用一个简化的糖酵解模型说明周转速率的影响（图2A）。该网络描述了葡萄糖摄取、葡萄糖向葡萄糖-6-磷酸（g6p）的转化、随后经一个集总的糖酵解步骤转化为磷酸烯醇式丙酮酸（pep），以及进一步向丙酮酸（pyr）的转化；丙酮酸随后分流生成乳酸和乙酰辅酶A（accoa）。这种分支结构可能形成一个慢池，这是因为在保持于其可行浓度范围内的同时，accoa只能接收上游碳通量的一部分。为检验局部动态行为是否受潜在的通量-浓度状态塑造，我们对覆盖该网络解空间的5,000个可行稳态进行了采样，并利用ORACLE框架24针对每个样本构建了100个相容的动力学模型，仅保留具有动态稳定性的模型（方法）。我们将每个稳定动力学模型中实部最大的特征值转换为特征弛豫时间，并采用各模型特征时间的中位数来概括每个稳态。稳态解空间的不同区域对应着显著不同的特征时间，从而形成了一个梯度。
在采样状态的 PCA 投影中（图 2B）。当对每个稳态采用采样得到的最快特征时间时，也观察到了相同的趋势（图 S1），这表明该效应并不依赖于聚合指标。
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图 2.
周转速率限制了简化糖酵解模型中可实现的局部时间尺度。
(A) 简化糖酵解通路示意图，其中代谢物与通量（V1–V6）相互连接：glc（S）、g6p（X）、pep（2Y）、pyr（Z）和 accoa（T）。丙酮酸分支产生了一个潜在的低周转 accoa 库。(B) 5,000 个可行稳态样本的主成分分析（PCA）。各点根据围绕每个稳态参数化的 100 个动力学模型所计算的特征时间中位数（log10）着色。蓝色圆圈标记按特征时间中位数计最快的 20 个稳态，红色圆圈标记最慢的 20 个稳态。(C) B 面板中最快与最慢稳态组内 pep、g6p、pyr 和 accoa 的周转速率分布（1/s）。每个子图显示一种代谢物的归一化密度；蓝色表示最快状态，红色表示最慢状态。Accoa 在慢状态与快状态之间表现出最明显的分离。(D) 在施加不同 accoa 周转时间截止值的条件下生成的动力学模型群体的特征时间分布。纵轴表示以秒为单位的特征时间（log10），带颜色的水平虚线表示相应的 accoa 周转时间截止值。(E) 将主导时间尺度与代谢物库联系起来的模态分析。热图显示了代表性 accoa 周转时间（TR）截止值（500 s、10 s 和 1 s）下最快动力学模型的模态系数。报告值表示每种代谢物对该模态的贡献。
与所指示的时间尺度相关。
为确定哪些代谢物池与这些差异相关，我们比较了20个最快稳态（图2C，蓝色）和20个最慢稳态（图2C，红色）的周转速率分布。Pep和pyr的分布相互重叠，而g6p仅表现出部分分离。相比之下，accoa显示出明显的偏移：慢稳态始终与极低的accoa周转相关，而快稳态则表现出显著更高的数值。因此，在这一简单网络中，周转速率最低的代谢物决定了可实现的最慢局部时间尺度。根据网络结构，这种对应关系是可以预期的，因为accoa位于一个简单的线性分支中，并且直接与该代谢物池的周转相联系，补充说明2中给出了相应的解析证明。
接下来，我们检验了提高accoa周转对局部动力学的影响。我们将除accoa之外所有代谢物的周转速率限制在特征时间为2 s的水平，并将accoa的周转时间从500 s系统地调节至1 s。对于每种情况，我们生成一个代表性稳态，在其附近采样1,000个动力学模型，并量化由此产生的特征时间（图2D）。随着accoa周转加快，系统可实现的最快动力学也相应加速，直到accoa不再是周转最慢的代谢物池。当accoa的周转时间为2 s和1 s时，g6p成为新的瓶颈。模态分析证实了这一瓶颈的转移：当accoa的周转仍然缓慢时，最慢模态与accoa相关；而当accoa周转加快后，最慢模态则与g6p相关（图2E）。该分析表明，在这一简化网络中，特定代谢物池的缓慢周转可能限制可实现的最快局部时间尺度。
最后，当我们将所有
将代谢物周转速率提高至其可实现的最高值时，系统接近可达到的局部动力学理论上限；该上限由热力学约束、质量守恒和通量界共同决定（补充说明3）。总体而言，这些结果表明，稳态通量–浓度对已经编码了可实现动力学时间尺度的约束。因此，周转速率提供了一种可解释的方法，用于识别使原本可行的稳态在动力学上变慢的代谢物池。接下来，我们将这一原则形式化为一个混合整数优化问题，以识别受周转约束且在动力学上合理的稳态代谢状态。
受周转约束且在动力学上合理的代谢状态的形式化
METEOR-K 将质量守恒约束、热力学可行性约束和代谢物周转速率约束整合到一个混合整数线性规划（MILP）优化问题中，从而对稳态代谢状态施加约束。首先，通过质量守恒、通量界限，以及由实测交换速率或数据整合程序所提供的任何附加线性约束，定义可行的稳态通量空间：
其中，
\(N \in \mathbb{R}^{m \times n}\) 为化学计量矩阵，
\(v \in \mathbb{R}^{n}\) 为反应通量向量，并且
式4
源自附加的生理学约束或数据衍生约束。
热力学可行性通过标准热力学通量分析（Thermodynamics Flux Analysis，TFA）^11 公式加以施加。该公式通过混合整数约束，将反应方向性与转化后的吉布斯自由能以及代谢物浓度联系起来。对于每种代谢物 \(i\)，METEOR-K 使用对数转换后的浓度，其界限为
对于每个反应 \(j\)，反应吉布斯自由能通过下式与对数浓度相关联：
其中，\(R\) 为气体常数，\(T\) 为温度，
且 \(n_{ij}\) 表示代谢物 \(i\) 在反应 \(j\) 中的化学计量系数。随后，根据 \(\Delta_{r}G^{\prime}\) 的符号，采用方法部分所述的标准 TFA 二元变量公式对反应方向性进行约束。这些热力学约束排除了违反反应能学的通量状态，但并不限制代谢物池的补充速率。因此，两个稳态解可能满足相同的质量平衡约束和热力学约束，但其代谢物池大小相对于消耗通量却存在显著差异。相对于消耗通量而言较大的代谢物池意味着较慢的周转速率，并可能对应不合理的代谢时间尺度。
METEOR-K 通过要求选定的代谢物满足周转速率界限来解决这一局限。
对于代谢物 \(i\)，我们将总消耗通量定义为：
其中，\(K_i\) 表示在所考虑的稳态下消耗代谢物 \(i\) 的反应集合。通量变量可以拆分为表示正向和反向方向性的非负变量。
其中，包含消耗代谢物 \(i\) 的反应，即 \(n_{ij}<0\)；而包含反向通量消耗代谢物 \(i\) 的反应，即 \(n_{ij}>0\)。这种表示方式使其能够用拆分后的通量变量和表示为线性形式。我们施加如下形式的代谢物特异性周转区间：
其中，和分别定义了代谢物 \(i\) 的生理周转速率下界和上界。结合式 5 和式 9 可得：
这些约束是非线性的。为保留 MILP 形式，METEOR-K 采用浓度分箱变量，或在可行对数浓度范围内使用分段线性近似，来近似指数项。完整公式，包括热力学约束、周转约束线性化以及近似误差】【。
分析和计算权衡见方法部分。
周转速率约束限制稳态空间，并加快厌氧大肠杆菌的代谢响应时间
接下来，我们不再局限于简化网络，而是在一个更大的代谢模型中检验周转速率约束是否会限制可接受的稳态空间、降低通量—浓度不确定性，并选择具有更快局部和非线性代谢响应的状态。我们将这一建模方法应用于已发表的厌氧大肠杆菌代谢模型^25。该化学计量网络包含180个反应和141种代谢物，相应的动力学模型包括63个常微分方程和601个动力学参数（方法部分）。我们将模型约束在实验测得的厌氧生长速率下，并以细胞倍增时间作为参考时间尺度，对代谢物周转速率施加下限。由于这些下限定义的是最小周转速率，因而对于那些可行周转速率本已高于倍增时间倒数参考值的代谢物而言，实际上并未受到约束。例如，在该大肠杆菌模型中，ATP的周转速率值可以达到细胞倍增时间的200倍以上。
对于逐渐严格的周转速率下限，我们生成了100个替代稳态解，其对应的时间尺度分别为细胞倍增时间的5倍、10倍、50倍和100倍（图3A）。对于每个稳态解，我们抽样获得100组动力学参数，并计算相应的特征时间。所得稳态在主成分分析投影中占据了可行空间内彼此不同的区域（图3A），并且平均而言表现出不同的线性动力学特征（图3B）。随着周转速率下限逐渐收紧，可实现的最快特征时间和特征时间中位数均……
时间均有所缩短。然而，特征时间的中位数在约 10 倍截止值处趋于平台，而随着截止条件变得更加严格，可达到的最快特征时间仍持续缩短（图 3B）。这一模式表明，TR 约束会改变系统可达到的时间尺度；但超过某一阈值后，中位时间尺度受到动力学参数变异性、热力学约束和网络拓扑的影响更大，而不再主要取决于全局 TR 截止值。
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图 3.
METEOR-K 限制厌氧大肠杆菌模型中的稳态通量-浓度空间，并加速局部动力学。
(A) 对 100 个替代稳态解进行主成分分析。这些稳态解是在对所有代谢物施加全局 TR 下限的条件下生成的，TR 下限分别设定为细胞倍增时间的 1、5、10、50 和 100 倍。各点按照围绕每个稳态参数化的动力学模型所计算的特征时间中位数（log₁₀）着色。(B) 从各 TR 截止值组的稳态解生成的动力学模型群体的特征时间分布小提琴图。黑点表示中位数，虚线表示第 25 和第 75 百分位数。(C) 采用 TR 感知采样器生成的 20,000 个稳态样本的代表性边际分布（绿色），以及未施加 TR 约束的对照采样器生成的代表性边际分布（蓝色）。采用 Jensen-Shannon 散度值对每个变量的分布偏移进行量化。(D) 乙醇酸的通量-浓度平面，显示总消耗通量与采样浓度之间的关系。虚线曲线表示施加的 TR 截止边界；蓝色点表示对照样本，绿色点表示 TR 感知样本。(E) 基于 TR 感知样本和对照样本生成的动力学模型的特征时间分布。
稳态样本集；虚线表示中位数。
这些结果表明，TR 下界会同时改变可行稳态的位置以及可达线性时间尺度的分布。为量化 TR 约束在多大程度上重塑更广泛的可容许通量-浓度空间，我们采用考虑周转的采样方法，对 TR 约束和无约束的稳态集合进行了比较，并施加了一个全局 TR 下界，该下界对应于比细胞倍增时间短 10 倍的周转时间（方法）。TR 约束显著改变了采样分布：平均 Jensen-Shannon（JS）散度（使用自然对数计算）为 0.301，约为理论最大值的 43%；仅有 27% 的变量的 JS 散度 ≤ 0.1，表明采样分布发生了显著偏移。具有代表性的示例见图 3C。
为了解析网络中驱动这些分布偏移的部分，我们比较了无约束样本与 TR 约束样本中的细胞外交换通量、细胞内通量和代谢物浓度。细胞外交换通量总体上变化不大：在两种采样条件下，葡萄糖摄取以及更一般意义上的分泌和摄取速率呈现出相似的分布（补充表 1）。这种有限的变化可能部分源于模型已预先整合实验测得的摄取率和分泌率，尽管并非所有交换通量都受到这些数据的直接约束。相比之下，许多细胞内通路存在显著差异。例如，丙酮酸代谢中的通量平均 JS 散度为 0.258。PYK 是产生丙酮酸的糖酵解末端步骤，在样本中表现出明显偏移，其通量较低。
在 TR 约束下生成的样本（图 3C）。由于周转取决于通量与库大小之间的比值，因此可以通过增加消耗通量或降低代谢物浓度来满足 TR 下限。在此情况下，该约束主要通过降低丙酮酸浓度来满足，因此，较小的代谢物库仅需相应较低的 PYK 通量即可满足周转下限。代谢物浓度分布也发生了偏移：TR 约束样本的平均细胞内浓度较低，这与排除了无法由足够消耗通量支持的高库量状态相一致（图 3C）。
TR 约束还通过排除在仅施加质量守恒和热力学约束时仍可行的高库量/低消耗通量区域，降低了细胞内代谢物浓度的不确定性。为明确展示这一排除效应，我们针对每种代谢物绘制了其总消耗通量与采样浓度之间的关系。施加的 TR 下限在通量—浓度平面上定义了一个清晰的排除区域，该区域对应于过大的代谢物库，这些代谢物库无法通过可用的消耗通量实现更新。乙醇酸体现了这一行为：TR 约束样本占据了与无约束样本不同的区域（图 3D），其他代谢物也观察到相同的定性模式。为量化整个网络中边际不确定性的相应降低，我们采用热力学变异性分析，在有无 TR 约束的情况下计算所有通量和浓度的可行范围，并将其影响表示为可行范围的分数减少量。对于 10 倍 TR 下限截断值，浓度范围表现出可测量的缩减，而通量范围的变化可以忽略不计。
（补充说明6）。这种不对称性具有重要信息：在该模型中，通量已经受到化学计量关系、热力学以及实测交换速率的强约束，而代谢物浓度仍保留着更宽的可行范围。因此，加入TR约束主要细化了可接受的浓度空间。例如，GTP浓度范围缩小了69%。
当我们分别从两个稳态集合中各采样100组动力学参数时，所得动力学模型在动态时间尺度方面表现出显著差异。由TR约束稳态生成的模型，其特征时间的中位数约缩短了一个数量级，即局部动力学更快（图3E）。
为确保这些分布变化源于TR约束，而非修改后的采样过程所产生的伪象，我们将TR感知采样器与一种基线方法进行了比较；该基线方法采用标准采样器，并基于相同的TR约束进行接受-拒绝筛选。两种方法对所有变量产生了几乎相同的分布，平均JS散度为0.0308，且超过95%的变量的JS散度≤0.1。这种一致性表明，除确保满足TR约束下的可行性之外，修改后的采样器并未引入额外的采样偏差。
随后，我们利用分批生物反应器模拟检验了约束代谢物周转速率是否也会在非线性环境下影响系统行为。我们将每个动力学模型与指数型生物量增长方程耦合，并利用实验数据^26对初始分批培养条件进行参数化，从而模拟生物量积累。为生成这些模拟中使用的动力学模型，我们在TR约束下对稳态进行了采样】【。
对应于周转时间分别等于倍增时间，以及比倍增时间参考值短5倍和10倍的情形。为确保反应器模拟具有有利的初始条件，我们在所有TR截断值下均一致地设定了较高的生物量前体稳态浓度范围，从而使不同截断值之间的差异反映周转约束，而非前体富集程度的差异（补充说明4）。
我们对每个批式生物反应器进行了15小时的模拟；在参考实验条件下，培养物约在10.5小时达到稳定期。作为主要读出指标，我们报告平均生长速率，该指标可与实验测得的速率直接比较，并将10.5小时的生物量浓度作为补充性检验。不同模拟之间的结果差异显著，这既归因于用于初始化接种物的稳态样本不同，也归因于所采样的动力学参数值不同，而后者决定了碳流和能量流经网络的方式。尽管存在这种变异，随着TR截断值增大，涌现的平均生长速率始终提高（图4A）。实验测得的厌氧生长速率作为生理学参考显示，但未用于拟合或选择TR截断值。相反，该结果表明，受更快代谢物周转约束的稳态能够产生生长动力学更快的动力学模型，并在非线性生物反应器模拟中表现出更快的生长。生物量滴度呈现相同的排序（图4B），但离散程度更大，因为滴度还取决于每个稳态样本所对应的初始生物量。在按照初始最大特征值对模拟进行分层后，这一趋势仍然存在，表明起作用的是TR下限，而不仅仅是初始特征时间。
解释了生物量滴度的增加（图 4C）。
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图 4．
周转率约束加速厌氧大肠杆菌生物反应器模拟中的非线性生长动力学。
(A–B) 生物反应器模拟中平均生长速率（A）以及 10.5 h 时生物量浓度（B）的经验累积分布。动力学模型均从稳态初始化，而这些稳态由全局周转率（TR）截断值生成；TR 截断值分别比倍增时间短 1 倍、5 倍和 10 倍。圆圈表示中位数，图例中给出了模拟模型的数量。(A) 中的竖直虚线表示实验观测到的厌氧生长速率，作为生理学参考。(C) 按 TR 截断值和初始特征值区间分组的平均最终生物量。误差线表示每组内的标准差。
总之，这些结果表明，加速局部弛豫时间尺度的周转约束也会改变涌现的非线性生长行为，从而在稳态通量–浓度结构与动态表型之间建立一种具有生物物理学可解释性的联系。
在大规模癌症模型中，有针对性地施加周转率约束可在加速局部动力学的同时保留多组学约束
接下来，我们考察了 METEOR-K 是否适用于可行空间已经受到热力学和多组学数据严格约束的情形。这一情形十分重要，因为对所有代谢物池统一施加单一的严格 TR 下界，可能会与现有的数据衍生约束和热力学约束发生冲突。因此，我们采用了先前工作中构建的一个大规模卵巢癌代谢模型
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来测试 METEOR-K 的有针对性模式。在该模式中，周转约束仅施加于与慢弛豫模态相关的代谢物池。该卵巢癌模型牲交
已经受到热力学可行性以及多组学数据整合的约束，包括代谢组学、交换通量测量和转录组学数据（方法）。这些约束界定了一个缩减后的可行通量和浓度空间，使其与现有的生化证据和实验依据相一致。该模型具有广泛的网络覆盖范围，包括跨越 8 个区室的 2137 个细胞内反应和 974 个代谢物；与之配套的动力学模型则包含 716 个常微分方程（ODE）和 9594 个动力学参数。
在这一已经受到限制的可行空间内，如果对所有代谢物池统一施加足够严格的 TR 下界，将使当前经过数据整合的模型构式过度受限。恢复可行性需要改变模型假设，例如降低具有缓慢消耗通量的代谢物的浓度上下界，或放宽限制可行浓度空间的热力学约束。鉴于这些边界和约束编码了整合后的数据及热力学先验信息，我们保持其不变，转而采用由模态分析指导的靶向周转约束策略。该策略将周转约束施加于在动力学上最具信息量的区域，而不是在整个网络中统一施加（图 1；方法）。
该靶向工作流程是迭代式的（图 1）。我们首先生成一组初始稳态样本，并围绕每个样本参数化动力学模型，从而计算特征时间和模态贡献。随后，我们对与慢模态最稳定相关的代谢物池施加 TR 下界。由于这一识别过程具有统计性质，并且取决于当前样本集，因此该流程会重复进行若干次迭代，直至慢模态的集合大小规律】【。
模态趋于稳定，或中位特征时间仅得到边际改善（方法）。
将这一迭代程序应用于癌症模型后，模态分析鉴定出705个反复参与慢模态的代谢物池。我们施加了TR下限，使其对应的周转时间比细胞倍增时间短15倍。该下限逐步将动力学模型集合的中位特征时间缩短至几乎比无约束基线低一个数量级（图5A）。TR下限是一个可调参数。对于大型网络，我们建议采用更严格的截断值，因为随着网络规模增大，采样到动力学性质有利的稳态的概率会降低。提高该下限会使可行域偏向局部周转更快的状态，并增加以下可能性：以这些状态为初始条件的随机参数化动力学模型能够表现出可接受的时间尺度。
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图5.
在卵巢癌模型中，有针对性地施加TR约束可改善局部动力学，并加快非线性ODE模拟中的响应。
(A) 小提琴图显示了从模态分析流程不同迭代阶段的稳态生成的动力学模型群体的特征时间分布。黑点表示中位数，虚线表示第25和第75百分位数。绿色和红色分布采用相同的靶向代谢物集合，但使用不同的TR下限，分别对应于比细胞倍增时间短15倍和30倍的周转时间。(B) 动态给药模拟中，下调了胸苷酸合成酶的活性，并跟踪了初始动力学模型群体和经TR修饰的动力学模型群体的生长速率轨迹。曲线表示相对于大小规律
初始值，阴影区域表示一个标准差。插图显示了相同轨迹在完整 600 h 模拟时间范围内的变化。(C) 在施加靶向 TR 约束后，受约束代谢物在通量–浓度平面中的面积分数降幅的经验累积分布。(D–E) 代表性代谢物的通量–浓度平面。虚线曲线标示 TR 边界，绿色阴影表示施加约束后保留的 TR 可行区域。
大部分改进在前两次迭代内实现：在第二次迭代之后，特征时间的中位数不再出现显著改善，尽管采样得到的最快特征时间仍持续降低。这一平台期表明，15 倍截止值而非迭代次数已成为限制因素。因此，在保持相同截止值的情况下增加迭代次数，只会使特征时间的中位数产生递减的改善。基于此，我们将所识别的 705 个代谢物的 TR 下限从 15 倍提高至 30 倍，从而使模型集合向可实现的更快动力学方向偏移（图 5A）。采用要求特征时间至少比细胞倍增时间快 3 倍的筛选标准时，在 15 倍 TR 截止值下，有 169 个动力学模型（来自 100 个稳态样本中的 14 个）符合条件；在 30 倍 TR 截止值下，则有 367 个模型（来自 100 个样本中的 23 个）符合条件。因此，当在相同截止值下继续迭代所带来的收益开始递减后，提高 TR 下限能够增加动力学上可接受的动力学模型数量。
靶向周转速率约束可富集癌症模型集合中的非线性药物反应恢复能力，并缩小可行的通量–浓度空间
TR 约束并不会创造
这种动态行为并非原始可行空间中所不存在的。相反，它们排除了通量集中状态，因为这类状态必然伴随缓慢的池更新，并将采样偏向于动力学参数化后更有可能产生生理相关动态的区域。最终实现的动力学仍取决于动力学参数、弹性系数和网络拓扑，而这些并不是 TR 所能确定的。原则上，无约束采样同样可以产生具有良好动态特性的稳态；但在实践中，随着网络规模增大，这种情况会变得越来越不可能，因为可行空间具有高维性，且大多数无约束样本都会落入与缓慢局部动力学相关的区域，如图 5A 中的初始分布所示。因此，我们考察了根据无约束采样分布参数化的动力学模型是否能够为非线性模拟提供合适的起始点。
为评估这一点，我们模拟了药物施用过程：胸苷酸合成酶（TMDS）的活性在 8 小时内呈指数下降至原来的十分之一，随后在模拟的剩余时间内维持在该降低后的水平（方法）。我们对每个动力学模型进行了 600 个模拟小时的积分，使生长速率反应和细胞内代谢均能够适应新的运行稳态。我们将第三次迭代后获得的 169 个受 TR 约束且同时满足特征时间筛选标准的模型，与从无约束模型集合中抽取的 150 个模型进行了比较；后者经筛选后覆盖了原始特征时间分布。由于没有任何无约束模型满足相同的筛选标准，因此，本比较考察的是整个可用时间尺度范围内的无约束模型，而不是将其作为匹配的快速时间尺度对照组。
我们监测了 久久精品
生长速率反应，并记录达到新的稳态值所需的时间。TR 约束模型通常在数小时内趋于稳定（图 5B）。相比之下，在 600 个模拟小时内，没有一个无约束模型达到稳定的生长速率，包括那些取自无约束分布中可获得的最快部分的模型（图 5B）。因此，靶向性 TR 强制约束使模型集合富集了通过无约束采样无法获得的、具备恢复能力的模型。
为评估整个细胞内网络的收敛情况，我们还应用了一种平衡状态检测算法，以确定所有细胞内浓度和通量何时达到新的稳态（方法）。按照这一判据，60% 的 TR 约束模型在 600 个（模拟）小时内达到了完整的细胞内稳态，而无约束模型中没有一个达到该状态，这与图 5B 所示的缓慢生长速率轨迹一致。因此，靶向性 TR 强制约束既改善了生长速率这一输出层面的恢复，也使部分模型实现了整个网络的平衡。
接下来，我们量化了 TR 约束在多大程度上缩小了人类癌症模型的可行解空间。以具有基线通量和浓度上下界的原始模型为起点，我们使用 15 倍下限截断值，对模态分析流程第三次迭代之前所识别出的所有代谢物施加 TR 约束。随后，我们进行了变异性分析，以估计所有浓度和通量的可行范围。作为对这一靶向性 15 倍强制约束的总体评估，我们还利用基于变异性分析所得通量和浓度范围的边界框近似，估计联合可行通量-浓度空间的收缩程度。
分析（补充说明6）。
为了评估每个TR约束的局部效应，我们计算了每种受约束代谢物在实施TR约束前后，其总消耗通量–浓度平面的面积。具体而言，该平面由代谢物的可行浓度范围，以及在每个浓度值下总消耗通量的可行范围共同定义。通过比较施加TR边界后保留的可行面积与由基线变异范围定义的原始面积，我们估算了该平面的相对缩减比例。该指标概括了TR约束对每种代谢物可获得的通量–浓度联合组合的限制强度。
在受约束的代谢物中，大多数代谢物的单独缩减幅度较小（图5C）。约70%的代谢物其通量–浓度平面的缩减幅度小于1%，25%的代谢物缩减幅度介于1%和10%之间，另有5%的代谢物缩减幅度超过10%。因此，对于大多数代谢物而言，施加的TR约束仅移除了其局部通量–浓度平面中的一小部分。然而，这些约束在整个解空间中的累积效应则体现为特征时间分布的偏移以及非线性恢复性能的改善。
图5D和图5E展示了TR约束如何缩减单个代谢物通量–浓度平面的代表性示例。4-羟基苯甲酸和dTTP的可行浓度范围相近，但二者的可行消耗通量范围相差约四个数量级。对于4-羟基苯甲酸而言，其消耗通量范围足够高，因此TR约束几乎是冗余的；只有消耗通量极低且浓度较高的组合违反了TR下界（图5D）。相比之下，dTTP
其可消耗通量范围要低得多，因此，TR约束显著缩小了其可行浓度范围（图5E）。这一行为表明，网络中低活性区域的代谢物无法同时维持较大的池大小并满足快速周转要求。
总体而言，这些结果表明，模态分析引导的TR约束通过选择性限制与周转不一致的通量—浓度状态、降低慢局部模态的发生率，并丰富能够更快恢复药物响应的动力学模型集合，使METEOR-K得以扩展至超大规模动力学模型。
讨论
METEOR-K弥补了稳态约束模型中的一个缺失环节：可行通量状态很少与代谢物池大小相耦合，因此，可接受的解可能暗示与酶介导动力学相冲突的代谢时间尺度。METEOR-K通过混合整数线性规划形式施加周转速率约束，将通量—浓度关系与生理上合理的池更新联系起来，并排除那些在数学上可行、但在动力学上不合理的状态。在本文研究的各个系统中，这些约束均缩小了可行稳态空间，改变了通量和浓度分布，并使下游动力学模型偏向于更快的局部动力学和更合理的非线性瞬态过程。因此，周转速率提供了一种具有生物学可解释性的约束层，可作为对质量守恒、热力学、浓度边界以及数据衍生约束的补充，并可直接整合至COBRA Toolbox等现有工作流程中^28。
周转约束是一种生理学筛选机制，而不是对整体动力学合理性的保证。它们作用于雅可比矩阵中通量与池大小之间的组成部分。低周转率表明
具有必然缓慢池更新特征的状态，而高周转率只能使快速弛豫成为可能。快速弛豫能否实现，仍取决于反应速率敏感性、守恒池、调控耦合、网络拓扑结构以及所采样的动力学参数。与此一致，在厌氧大肠杆菌模型中，逐步提高更严格的下界所带来的中位特征时间改善逐渐减小，这表明周转率限制了可达到的范围，而上述因素则决定动力学位于该范围内的具体位置。因此，周转率约束能够改进参考稳态集合，但不能取代动力学参数化或动态分析；同时，下界的设定需要生物学依据，而不应采用默认值。在高维模型中，当无约束采样很少能够访问动力学上有利的状态时，更严格的 TR 下界可能发挥作用，因为它们会将可行域偏向于池更新更快的状态。然而，所选下界应得到生理学先验、敏感性分析或预期建模目标的支持。
周转率约束在筛选动力学上不合理的通量-浓度状态方面所发挥的作用，也为实际应用这些约束提供了指导。当数据整合与热力学分析已经显著收紧可行空间时，统一的全局 TR 下界可能会使模型受到过度约束，从而不存在能够同时满足数据推导的边界、热力学约束以及所施加周转率要求的解。这反映的是约束之间的规格冲突，而不是周转率原则失效。与其放宽数据推导的先验或热力学先验，METEOR-K 还可以选择性地对那些模态
分析表明，其与慢模式相关。在癌症模型中，这种靶向模式在保留现有数据衍生先验和热力学先验的同时，允许加入周转约束，并且仍能产生与生长和扰动恢复相容的动力学。在这一尺度上，其价值在于可达性：在高维可行空间中，无约束采样无法获得具备恢复能力的动力学模型，而靶向施加约束则使这些模型变得可达。因此，METEOR-K 提供了两种互补模式：全局模式用于广泛筛除不合理的通量—浓度关系，靶向模式则将周转约束施加于在动力学上最具信息量的位置。
METEOR-K 还改变了动力学建模工作流程利用稳态信息的方式。集成动力学建模工作流程
24
,
29
–
32
将采样得到的稳态通量和代谢物浓度作为速率定律参数化、稳定性分析和动力学模拟的参考状态。如果这些参考状态暗示了不现实的周转情况，所得动力学模型可能继承较差的局部行为和不可靠的瞬态响应。相反，在稳态层面约束周转，可以在拟合或采样动力学参数之前，使采样状态偏向具有生理学合理性的动力学。在其靶向模式下，METEOR-K 更进一步利用局部动力学信息来决定哪些稳态约束最为重要，从而在动力学分析与基于约束的状态选择之间建立反馈回路。以往针对这类模型不确定性管理的研究主要处理参数可辨识性、可观测性、预测不确定性以及参数化后的集成筛选问题
33
–
36
，而 METEOR-K 则在上游介入，即在参数化之前，
参考状态选择的层级。
同一框架还可以直接纳入实验获得的周转信息。对于单个代谢物、子系统或通路尺度，已知的周转时间，无论其来源于同位素标记时间序列实验^37–39、结合代谢物池大小的通量测量^40，还是经过整理的代谢物周转时间定量估计^23,41,42，都可以作为生理学先验，用以替代统一阈值，从而同时收紧稳态系综及其下游动力学。
总体而言，这些结果表明，代谢物周转是连接稳态可行性与动力学合理性的一个易于处理的桥梁。通过在标准稳态表述中加入通量与池大小之间的约束，METEOR-K 为稳态建模提供了一个可扩展的生理学层，并为更可靠地开展生长和扰动响应的非线性模拟提供了切实可行的途径。
方法
周转率（TR）约束的实现
如结果部分所述，式 10 中定义的周转率约束是在 TFA 变量空间中实现的。由于 TFA 使用对数浓度变量 \(C_i\)，并且为了使优化表述保持为混合整数线性规划（MILP），我们将 TR 约束表示为一种与 MILP 兼容的形式。在本研究所展示的应用中，我们仅施加了下界；但通过将下界不等式替换为相应的等式或上界不等式，同样的线性化策略也可以适用于等式约束或上界约束。为简便起见，下面使用下界约束介绍两种离散化策略
METEOR-K 为这一转换实现了两种与 MILP 兼容的替代方法：一种是基于浓度区间的近似方法，另一种是对该方法进行分段线性近似的方法。
指数浓度映射。
基于浓度分箱的分段离散化
对于浓度范围为 [lb, ub] 的代谢物 \(x_i\)，我们将该范围划分为 \(N\) 个分箱，索引为 \(m = 1, \ldots, N\)，每个分箱的边界为 \([lb_m, ub_m]\)。假设我们对该代谢物的周转率施加下界。我们还引入二元变量 \(B_m \in \{0,1\}\)，用于指示分箱 \(m\) 是否处于激活状态，并引入辅助浓度 \(AC_m\) 和对数浓度 \(LC_m\)。
随后，可将式 10 中的非线性 TR 约束转化为
在该表述中，同一时刻最多只能有一个二元变量处于激活状态，从而约束辅助对数浓度变量 \(LC_m\) 和近似变量 \(AC_m\) 的取值。需要注意的是，激活的辅助变量 \(AC_m\) 不一定等于由 \(C_i\) 所隐含的值，因为分箱约束仅限制各区间内允许的取值范围，并未强制规定 \(AC_m\) 与 \(C_i\) 之间的精确函数关系。因此，该线性化的近似误差取决于分箱宽度及其划分位置。
采用 SOS2 型约束的分段线性分箱
我们通过 SOS2 型约束构造分段线性近似，以表示对数浓度（\(C_i\)）与浓度（\(x_i\)）之间的指数映射。我们在对数空间中引入断点 \(b_1 < b_2 < \cdots < b_N\)，并定义相应的函数值。我们还引入权重 \(w_m \in [0,1]\)，使得 \(\{w_1, \ldots, w_N\}\) 构成一个 SOS2 集合，即至多只有两个相邻的 \(w_m\) 可以非零。利用这一表示，可施加 TR 下界约束：
SOS2 限制通过为相邻断点之间的 \(N-1\) 个区间引入二元变量 \(z_m \in \{0,1\}\) 来实现。每次恰好选择一个区间，并且每个
权重 \(w_m\) 仅当其相邻权重之一处于激活状态时才允许非零：
由于指数函数是凸函数，其分段线性插值会高估真实函数。因此，对于下界 TR 约束，近似浓度相对于所施加的约束是保守的。随着断点数量增加，近似误差会减小。
两种方法的近似误差
指数映射的近似误差取决于分箱和断点的数量及间距、可行浓度范围，以及相对于所施加 TR 约束所允许的误差。我们在补充说明 5 中量化了这种误差，并为两种方法如何选择分箱数 \(N\) 提供了指导。
周转率约束的单位换算
在实际应用中，通量通常以 mmol/gDCW/h 表示，浓度以 mol/L 表示，而 TR 约束以时间的倒数为单位。为统一单位，我们可能需要使用适当的换算因子对 TR 约束进行缩放，其中包括干细胞重量与湿细胞重量之比（gDCW/gWCW）以及近似细胞密度（gWCW/L）。
适用于 TR 约束的采样器
ACHR\(^{43}\) 和 optGpSampler\(^{44}\) 等采样算法旨在凸可行集上运行。因此，它们不能直接用于包含二元变量的混合整数形式，例如通过线性化将热力学约束与浓度耦合的模型，或通过分箱引入 TR 约束的模型。
一种常见的变通方法是在单一通量方向性模式（FDP）\(^{45}\) 内进行采样。将所有可逆反应固定为选定方向后，便无需使用相应的二元变量，从而可以进行凸集采样。这种方法也消除了……之间的耦合。
由热力学约束所形成的通量空间和浓度空间，因为只有在确定方向性之后，才能删除连接二元变量。
对于 TR 约束，仅分配一个 FDP 是不够的。即使在单个 FDP 内，TR 约束仍然依赖于分段线性化或分箱线性化，而这会引入二元变量。如果不消除将消耗通量项与浓度变量联系起来的近似关系，就无法移除这些变量。
为解决这一问题，我们修改了采样过程，使其仅从满足 TR 约束的区域生成稳态样本，同时尽可能保留凸采样步骤。我们首先通过一个一维示例说明这一思想，然后将其推广到 ACHR 和 optGpSampler 步骤。
在线段上的采样
给定两个点 \(x\)（前一个样本）和 \(w_p\)（预热点），我们在线段上绘制候选点 \(p\)。该线段由这两个点定义，并受到凸可行集边界的限制，其中 \(\alpha\) 受到凸空间中可行性的约束。假设某一代谢物满足周转率下界约束，且满足 \(\text{TR}_{x}\)、\(\text{TR}_{w_p}\) 和 \(\Delta\)，则有以下关系成立：
因此，点 \(p\) 处该代谢物的周转率为：
当 \(\alpha \in [0,1]\) 时，\(\text{TR}_{p}\) 始终满足下界约束。当 \(\alpha\) 小于 0 或大于 1 时，这一结论不再具有普适性，而是取决于 \(\text{TR}_{x}\)、\(\text{TR}_{w_p}\) 和 \(\Delta\) 的具体取值。允许的 \(\alpha\) 范围高度依赖于 \(|\Delta|\)；随着 \(\Delta\) 趋近于 0，该范围会扩大。
沿某一方向采样
在 ACHR 中，以及在 optGpSampler 的每条马尔可夫链中，采样步骤均通过向量 \((w_p-c_p)\) 定义一个方向，并从当前样本 \(x\) 出发提出一个新点 \(p\)，其中步长 \(\alpha\) 在一个可行区间内选取。
由凸约束确定。与前一个示例类似，候选点处的换手率可以表示为
这将产生一个复杂得多的函数
\[
\mathrm{TR}_p(a)
\]
其与换手率约束下界
\[
\varepsilon
\]
至多相交两次。我们采用以下步骤，在采样过程中确保换手率约束的可行性：
确定由凸约束对
\[
a
\]
施加的可行区间（采用标准的 ACHR 边界计算方法）。
在该区间内，定位
\[
\mathrm{TR}(a)-\varepsilon=0
\]
的至多两个根。我们通过划分区间并搜索符号变化来界定候选根，然后应用 Brent 方法确定这些根。
将
\[
a
\]
的采样限制在满足
\[
\mathrm{TR}_p\geq\varepsilon
\]
的子区间内。由于
\[
\mathrm{TR}(a)
\]
是凹函数，这些允许区域是连续且定义明确的。
采样初始预热点集合
我们直接通过求解 MILP 形式生成预热点，从而确保每个预热点均满足换手率约束。这些点对于相应的 LP 松弛同样是可行的。与传统的“变量数量的 2 倍”这一启发式方法相比，我们建议生成更多预热点，以提供更大的可行方向集合用于探索。在本研究中，我们生成了“变量数量的 3 倍”个预热点，并采用了 100 个点的稀疏化步长。
计算初始中心点
假设我们有
\[
k
\]
个预热点
\[
wp_i
\]
每个预热点的取值为
\[
(V_{wp_i},C_{wp_i}).
\]
初始中心点定义为所有预热点的均值：
利用
\[
\]
我们得到：
如果每个预热点均满足换手率约束
\[
\mathrm{TR}_{wp_i}\geq\varepsilon,
\]
则可以证明中心点同样满足该约束，证明如下：
根据 Jensen 不等式，由于
\[
e^x
\]
是凸函数，
但根据定义，
因此，平均中心点
\[
(V_{cp},C_{cp})
\]
始终满足换手率约束
\[
\mathrm{TR}_{cp}\geq\varepsilon.
\]
当每个预热点分别满足
TR
wpi
≥
ε
时。
中心点的重新计算
在每次采样步骤之后，中心点按递归方式更新如下：
其中，cp（p）表示之前的中心点（即加入第
n
个样本之前的中心点），
p
表示新生成的样本，而
n
表示截至目前生成的样本数。该更新可视为前一中心点与新样本的凸组合。它与沿直线进行采样的表达式类似：
由于
n
≥ 0，因此可得
α
∈ [0,1]。在此范围内，插值点的周转率满足：
施加热力学约束
热力学通量分析（Thermodynamics Flux Analysis，TFA）
11
将每个可逆反应表示为分离的、非负的正向通量和反向通量，分别为
和
。二元变量
和
表示正向或反向方向在热力学上是否可行。为施加热力学上可行的方向性，TFA 使用方程（5）至（9）以及以下约束：
其中，
M
为足够大的常数。
本研究中使用的模型
简化糖酵解模型
简化糖酵解模型根据已知的
E. coli
糖酵解途径生物化学过程生成。完整示意图见
图 2A
，其中给出了反应和代谢物的名称及符号。我们不对与碳流无直接关系的代谢物进行建模，并假设各反应仅沿生成代谢物 pyr 和 accoa 的方向运行。我们将从 g6p 到 pep 的所有步骤合并为一个动力学可逆反应 LmpdG（
v
2
）。其余反应均表现出动力学不可逆速率定律（补充说明 2）。葡萄糖浓度作为参数处理，并设定为 10 g/L，摄取速率设定为 5 mmol gDCW
-1
h
-1
。
**厌氧条件下的
E. coli**
我们使用了一个
现有的、此前发表的厌氧条件下大肠杆菌中心碳代谢动力学模型^25，并在此简要概述其构建过程。该模型基于利用 redGEM^46 和 lumpGEM^47 生成的简化化学计量网络，涵盖核心代谢途径和一个集总生长反应。通过阻断氧摄取及依赖氧的呼吸反应，施加厌氧条件。所得稳态模型包含180个反应和141种代谢物。
为获得特定情境下的稳态参考系综，我们施加了生理和实验约束^26，包括固定的生长速率和葡萄糖摄取速率、与报道培养基组成及分泌产物一致的胞外交换边界，以及热力学可行性约束。随后，我们利用 pyTFA 对热力学可行的稳态特征进行采样，其中每个特征均包括通量、代谢物浓度和热力学变量。利用 SKiMpy^48 构建动力学模型结构，该结构包含63个质量平衡方程和138个反应速率方程，涵盖六类机制（Convenience、广义可逆 Hill、Bi-Uni 可逆 Hill、可逆 Michaelis–Menten、Uni-Bi 可逆 Hill，以及用于生长的多底物 Monod 形式），并由601个动力学参数进行参数化（463个 K_M 参数和138个 V_max 参数）。
人类癌症
我们采用了一个此前发表的、整合多组学约束的卵巢癌简化代谢模型^27。简而言之，该模型源自 Recon3D，并针对 BRCA1 WT 和 BRCA1 MUT 卵巢癌细胞进行了情境化处理。本研究使用的是代表 BRCA1 WT 生理状态的模型，该模型包含2,359个反应和974种代谢物。动力学骨架利用 SKiMpy 构建，包含716个质量平衡方程（以及25个池守恒方程）和2,131个速率方程。
规律，因此需要对 7,463 个 \(K_M\) 和 2,131 个 \(V_{\max}\) 进行参数化。
参数化与线性动力学
有多种方法可以利用参考稳态的信息来确定动力学参数值，包括 ORACLE、GRASP 以及闭式参数化等方法。在本研究中，我们采用了 ORACLE 框架。该框架围绕参考稳态代谢物浓度对酶饱和度进行采样，将这些饱和度映射为米氏常数（\(K_M\)），随后反向计算最大速率（\(v_{\max}\)），使其与参考通量相匹配。
对于每个参数化模型，我们计算了雅可比矩阵（补充说明 1）及其特征值，以评估局部稳定性和所隐含的线性时间尺度。我们仅保留稳定模型，即所有特征值的实部均为负的模型。随后，我们依据相关的线性时间尺度对模型进行进一步筛选，该时间尺度根据最大特征值绝对值进行估计。我们将模型的特征时间定义为
其中，\(\lambda_i\) 为雅可比矩阵的特征值。特征时间定义了系统最慢的时间尺度，并与稳态样本的 TR 值相关（补充说明 1）。在图 2–4 中比较特征时间时，均采用了该定义。
模态分析
为刻画稳态附近的局部动力学，我们对非线性动力学系统进行了模态分析。
对于稳态解 \(x^*\)（\(Nv(x^*, p)=0\)），我们将浓度扰动定义为 \(\delta x(t)=x(t)-x^*\)，并在 \(x^*\) 附近进行线性化。
如果雅可比矩阵可对角化，则有：
其中，\(\Lambda=\operatorname{diag}(\lambda_1,\ldots,\lambda_N)\) 包含特征值 \(\lambda_i\)，而矩阵 \(M\) 的各列为相应的右特征向量。将该分解代入线性化系统，并引入模态映射 \(y=M^{-1}\delta x\)。
给出：
该方程可解耦为相互独立的标量方程，其中每个模态的演化形式为：
因此，局部弛豫动力学可分解为相互独立的动态模态，每个模态由特定的特征值 λ 表征。λ 的实部定义了相应的时间尺度 τ。每个模态变量 yᵢ 表示代谢物扰动的加权组合，其中 wᵢⱼ 表示由 M⁻¹ 得到的模态权重。这些权重定量描述了代谢物 j 对模态 i 的贡献。因此，代谢物组会共同演化，其时间尺度由与该模态对应的特征值所决定。为评估动力学性能，我们识别出其对应时间尺度 τᵢ 慢于指定阈值的特征值。对于这些慢模态，模态权重 |wᵢⱼ| 较大的代谢物被解释为限制性动力学的主要贡献者。该过程使我们能够系统地识别出在动力学模型中主导慢弛豫行为的代谢物。
为确保所识别的是结构性限制代谢物池，而非单一稳态或单组参数所产生的伪象，我们在多个稳态以及独立采样的动力学参数集上重复执行了该过程。通过汇总整个参数与稳态集合中的模态贡献，我们识别出了全局上持续存在的慢模态，以及持续主导网络限制性动态行为的代谢物池。
迭代模态分析流程
为识别并削弱卵巢癌动力学模型中的动态慢模态，我们实施了一种结合针对性 TR 收紧的迭代模态分析流程。其目标是在最大限度保留其他部分灵活性的同时，有选择地约束导致不期望的慢线性时间尺度的代谢物。
初始动力学模型群体
我们首先围绕采样得到的稳态生成一个无偏的动力学模型群体。具体而言，我们选取了 100 个稳态剖面，并针对每个剖面使用 ORACLE 生成 100 组独立参数化，最终得到 10,000 个动力学模型。对于每个模型，我们计算其雅可比矩阵及其特征值和特征向量，以表征局部线性动力学。
慢模态的识别
我们将实部大于 −0.1 h⁻¹ 的特征值所对应的模态定义为慢模态。该截断值是相对于生理生长速率尺度选取的，用于识别其作用时间尺度与预期动力学状态不相符的模态。对于每个被标记的模态，我们检查相应的特征向量，并识别绝对模态权重大于 0.1 的代谢物。这些代谢物在整个模型群体中的并集构成了在动力学上具有影响力的物种集合。此外，我们还纳入了所有属于严格线性通路片段（即仅有一个消耗反应和一个生成反应）的代谢物，因为如补充说明 2 所示，此类代谢物与系统的一个特征值直接相关。
针对性收紧 TR
我们对已识别的代谢物集合施加 TR 截断，使其对应的时间尺度比细胞倍增时间快 15 倍，并据此生成一组新的稳态样本。随后，我们生成新的动力学模型群体，并通过模态分析重新评估。
迭代过程
重复上述过程，直至采样得到的动力学模型群体达到目标线性动力学特性，或连续两次迭代中与慢模态相关的代谢物集合变化仅为轻微。在实际操作中，经过三次迭代，去除了
大多数慢模态，同时保留可行稳态的变异性。收敛后，我们进一步探索了对 TR 截止值进行全局收紧的可选方案，以使特征时间分布进一步向更快的时间尺度偏移。
非线性模拟
生物反应器模拟
我们使用先前工作中所述的生物反应器框架，对厌氧培养的大肠杆菌（*E. coli*）进行批式发酵模拟^25。每个细胞内动力学模型均扩展了标准的生物反应器质量平衡方程，包括描述生物量生长（生物量浓度）的常微分方程，以及基于摄取通量和分泌通量的胞外代谢物动力学方程。模拟初始条件采用用于参数化的稳态浓度和通量，并结合 Varma 和 Palsson 报道的接种量与培养基组成^26。
计算机模拟给药
我们按照先前工作中所述的流程进行模拟^27。简而言之，我们将药物作用建模为一个一阶过程，使靶酶活性 \(E_{\mathrm{tot}}\) 降低至预设的分数水平（TMDS 酶；在 8 小时内降低 10 倍）。在模拟中，我们使用了：（i）迭代工作流程第三次迭代后获得且满足特征时间筛选标准的全部动力学模型（169 个）；以及（ii）初始无约束模型集合中的一个代表性子集（150 个模型，其选取方式使其特征时间在原始分布中均匀间隔）。每个模型均从其参考稳态开始积分，直至达到新的稳态或模拟时间达到 600 小时，以先发生者为准。我们根据生长速率轨迹以及达到新的稳定值所需的时间，对扰动后的响应进行了定量分析。
平衡状态检测算法
至
为了量化受扰系统达到新运行点所需的时间，我们实现了一种平衡态（稳态）检测算法。扰动后的平衡态对应于满足以下条件的任意状态 \(x^*\)：
由于数值轨迹永远不会产生严格为零的导数，我们采用在长度为 \(\Delta\) 的时间窗口内评估的、经过缩放且具有持续性的判据来进行平衡态检测。在时间 \(t\)，我们定义残差向量 \(\mathbf{r}(t)=N\mathbf{v}(\mathbf{x}(t),p)\)，以及经缩放的残差范数：
其中，\(a_{\mathrm{tol},i}\) 和 \(r_{\mathrm{tol},i}\) 分别为针对具体代谢物设定的绝对缩放参数和相对缩放参数。该范数用于衡量各代谢物浓度的瞬时变化率相对于其自身尺度是否足够小。
为避免在轨迹仅短暂经过某个慢流形附近时错误地判定系统达到平衡，我们要求残差在整个时间窗口内持续保持较小：
其中，\(T\) 为当前时间，\(\varepsilon_R\) 为无量纲阈值。
仅凭残差较小可能会产生误判，因为 \(N\mathbf{v}(\mathbf{x},p)\) 中的相互抵消可能导致导数较小，即使状态仍在缓慢漂移。因此，我们在同一时间窗口内进一步强制施加漂移判据。我们定义经缩放的状态变化量：
以及相应的漂移速率
当且仅当以下两个条件同时满足时，我们认为系统在时间 \(T\) 已达到平衡：
(i) 残差持续性在区间 \([T-\Delta,T]\) 内成立。
(ii)
其中，\(\varepsilon_X\) 控制该时间窗口内允许的最大缩放状态变化速率。
无论系统最终达到何种具体平衡态，该算法都可判定系统是否已经停止演化。通过此过程确定的平衡时间由受扰系统中最慢的稳定动力学模态所决定。由于极其缓慢的模型可能表现出较小的
尽管瞬时导数仍在逐渐漂移，我们对漂移设置了严格的阈值，以避免在此类情况下错误地判定系统达到平衡。对于本研究，我们对所有代谢物均采用 \(a_{\mathrm{tol}} = r_{\mathrm{tol}} = 10^{-T}\)，时间窗口设为10小时，并设置 \(\varepsilon_R = \varepsilon_X = 1\)。
数据可用性
本研究生成的数据已存档于Zenodo存储库：https://doi.org/10.5281/zenodo.21133382。
代码可用性
本研究中用于开发模型、开展分析和生成结果的代码已公开，并以Apache-2.0许可证存档于：https://github.com/EPFL-LCSB/METEOR-K。动力学模型使用SKiMPy（Python符号动力学模型，Symbolic Kinetic Models in Python）构建，该工具可从以下地址获取：https://github.com/EPFL-LCSB/skimpy。
作者贡献
I.T.、D.W.、G.F.和L.M.构思了总体方法；V.H.和L.M.获得资金并负责研究监督；I.T.整理了数据、模型和计算资源；I.T.、D.W.、B.N.和G.F.设计了代码；I.T.、D.W.、G.F.和B.N.分析了数据；I.T.验证了结果；I.T.和L.M.对结果进行了可视化；I.T.准备了论文初稿；I.T.、B.N.和L.M.审阅并编辑了初稿。所有作者均阅读并评论了该手稿。
利益冲突
作者声明不存在任何利益冲突。
关于生成式人工智能和人工智能辅助技术在写作过程中的声明
在准备本研究期间，作者使用ChatGPT改进手稿的可读性和语言表达。在使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。
致谢
本研究得到了瑞士国家科学基金会项目200021_188623和...的资助。
CRSII5_198543、欧盟在第814408号拨款协议下开展的“地平线2020”研究与创新计划，以及洛桑联邦理工学院（EPFL）。
基金信息声明
瑞士国家科学基金会，
，200021_188623
，CRSII5_198543
欧盟委员会
，814408
洛桑联邦理工学院，
脚注
https://github.com/EPFL-LCSB/METEOR-K
https://doi.org/10.5281/zenodo.21133382
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发布于2026年7月3日
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用于构建生理学一致代谢状态的可扩展生物物理约束
Ilias Toumpe、Daniel R. Weilandt、Bharath Narayanan、Georgios Fengos、Vassily Hatzimanikatis、Ljubisa Miskovic
bioRxiv
2026.07.03.736321；
doi：https://doi.org/10.64898/2026.07.03.736321
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Ilias Toumpe、Daniel R. Weilandt、Bharath Narayanan、Georgios Fengos、Vassily Hatzimanikatis、Ljubisa Miskovic
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2026.07.03.736321；
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