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神经元分化需要在染色质组织、基因表达、蛋白质丰度及翻译后修饰等层面进行协同调控。利用LUHMES人多巴胺能神经元分化模型，我们整合了连续三个分化阶段的蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析数据、此前通过NET-CAGE和HiCap生成的增强子-启动子相互作用图谱，以及转录组分析数据。分化过程中，参与轴突导向、细胞骨架组织和突触信号传导的蛋白质丰度及磷酸化水平升高，同时细胞周期、DNA复制及染色质相关程序受到抑制。磷酸化蛋白质组分析进一步揭示，与神经元成熟相关的信号网络发生了广泛重塑。增强子-启动子相互作用分析表明，增强子的相互作用重构程度显著高于启动子，并鉴定出在多个分子层面受到调控的主调控转录因子和中继转录因子。siRNA介导的敲低实验表明，转录因子MYT1、ISL2和NHLH2对神经元的正常成熟至关重要，而LCOR则是分化的负调控因子。整合网络重建进一步将MEOX2确定为与增强子相关、调控多巴胺能神经元晚期成熟的候选因子。综上，这些发现从多个层面揭示了调控人类神经元分化的调控网络。
5
大阪大学大学院医学系研究科高级人工智能医学系
日本大阪府吹田市
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Peter Swoboda
2
卡罗琳斯卡医学院胡丁厄医学系（MedH）
瑞典斯德哥尔摩
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Pelin Sahlén
6
生命科学实验室，化学、 生物技术与健康工程科学学院
瑞典皇家理工学院
瑞典索尔纳
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Markku Varjosalo
1
赫尔辛基大学生物技术研究所，HiLIFE
芬兰赫尔辛基
9
iCAN 数字精准癌症医学旗舰项目
赫尔辛基大学
芬兰赫尔辛基
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通讯作者：
markku.varjosalo{at}helsinki.fi
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摘要
神经元分化需要对染色质组织、基因表达、蛋白质丰度以及翻译后修饰进行协调调控。我们采用 LUHMES 人多巴胺能神经元分化模型，将蛋白质组和磷酸化蛋白质组谱分析与先前通过 NET-CAGE 和 HiCap 获得的增强子–启动子相互作用图谱，以及涵盖连续三个分化阶段的转录组分析相结合。分化过程伴随着轴突导向、细胞骨架组织和突触信号传导相关蛋白的丰度及磷酸化水平升高，同时伴随着……
细胞周期、DNA复制以及染色质相关程序。磷酸化蛋白质组分析进一步揭示了与神经元成熟相关的信号网络发生了广泛重塑。增强子–启动子相互作用分析显示，增强子处的重构显著多于启动子处，并鉴定出在多个分子层面受到调控的主调控转录因子和中继转录因子。siRNA介导的敲低实验表明，转录因子MYT1、ISL2和NHLH2对于神经元的正常成熟至关重要，而LCOR则作为分化的负调控因子发挥作用。整合性网络重建进一步将MEOX2确定为一个候选的、与增强子相关的晚期多巴胺能神经元成熟调控因子。总体而言，这些发现从多层次角度揭示了调控人类神经元分化的调控网络。
引言
神经元分化是一个多步骤过程，在此过程中，祖细胞逐渐获得成熟神经元的分子和功能特征（Ming & Song, 2011）。这一过程始于多能干细胞或祖细胞向神经谱系的定向，随后经历一系列受到严格调控的分子和细胞变化。这些变化包括退出细胞周期、发生神经突起生长等形态转变，以及建立突触形成和神经递质表达等功能特征（Götz & Huttner, 2005；Wamsley & Fishell, 2017）。染色质修饰、转录因子和信号通路共同协调这些事件，以确保神经元身份和功能的正常建立（Yao & Jin, 2014；Nord & West, 2020）。在分化过程中，多种调控层面会发生动态变化，包括增强子和启动子的激活、转录状态的转变，以及
蛋白质表达的变化（Feng et al., 2007；Ziller et al., 2015）。这些调控层协同作用，精确协调神经元的成熟与特化，最终促成功能性神经回路的形成。多组学技术的最新进展，使研究者能够综合表征神经元发育及神经退行性疾病中的转录调控、蛋白质组调控和磷酸化蛋白质组调控（Seddighi et al., 2024；Hao et al., 2026）。单细胞与空间多组学研究进一步揭示，在神经发育过程中，染色质可及性、基因表达和蛋白质丰度会发生协同变化（Guo et al., 2025；Uzquiano et al., 2022）。此外，利用基于 Hi-C 等技术对三维染色质构象进行分析发现，神经元分化过程中增强子–启动子相互作用会发生广泛重塑，并直接影响转录程序（Yoshihara et al., 2025；Heffel et al., 2024）。
阐明人类神经元发育的分子机制，有助于深入理解神经系统生物学及神经退行性疾病。由于发育中人类神经元难以获取，研究者广泛采用体外模型来探究神经元谱系定向与成熟过程。LUHMES（Lund Human Mesencephalic）细胞是一种人神经元前体细胞系，可快速、同步地分化为有丝分裂后多巴胺能样神经元（Scholz et al., 2011）。四环素诱导抑制 v-myc 转基因表达后，LUHMES 细胞退出细胞周期，呈现神经元形态，并表达包括 βIII-微管蛋白、MAP2 和酪氨酸羟化酶在内的神经元标志物（Scholz et al., 2011；
Lauter等，2020；Tüshaus等，2021）。重要的是，与其他神经元细胞系统相比，LUHMES细胞保留了细胞学上正常的人类核型（46条染色体，且不存在额外的染色体异常），并表现出高度同步且完整的分化过程；在分化启动后，不再有增殖性前体细胞残留（Lauter等，2020）。蛋白质组学和转录组学研究已证实，LUHMES细胞是一种稳健的人源多巴胺能神经元模型系统，表现出L1CAM、α-突触核蛋白、MAPT和SYN1等神经元标志物的显著诱导，同时重现了人类胎儿中脑发育的关键特征（Lauter等，2020；Tüshaus等，2021；Beliakov等，2023；Keighron等，2024）。与SH-SY5Y细胞系等其他神经元模型相比，LUHMES细胞还表现出较高的重复性以及对神经毒性化合物的敏感反应（Lotharius等，2005；Beliakov等，2023；Keighron等，2024），因此非常适合用于神经元分化的系统层面研究。
为探究神经元分化过程中的调控变化，我们对分化第1天、第3天和第6天采集的LUHMES细胞开展了整合性多组学分析。我们将利用NET-CAGE（Hirabayashi等，2019）和HiCap（Su等，2021）（启动子-cHi-C）进行的增强子—启动子相互作用图谱分析，与转录组学、全蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学相结合，以刻画染色质相互作用、基因表达、蛋白质丰度及磷酸化动态的协调变化。NET-CAGE能够灵敏地检测新生RNA，包括增强子来源的转录本；而HiCap则能够以高分辨率识别启动子与顺式调控元件之间的相互作用（Hirabayashi等，】【。
等，2019；Su等，2021）。这一整合性方法使我们能够将染色质相关的调控变化与下游转录和蛋白质组重塑联系起来。由于翻译后修饰是神经元信号传导和发育的核心调节因素（Ochoa等，2020；Dumrongprechachan等，2021；Gay等），磷酸化蛋白质组分析进一步实现了对神经元成熟过程中信号网络重塑的表征。
结果
LUHMES分化阶段的蛋白质组分析揭示了动态且具有阶段特异性的蛋白表达
为表征LUHMES神经元分化过程中蛋白质组和磷酸化蛋白质组的整体重塑，我们采用基于DIA的质谱分析，对细胞进行了检测。样本采集于三个关键阶段：第1天（起始期）、第3天（早期分化期）和第6天（成熟期）（图1A）。在生物学三重复样本中，每个阶段均鉴定出约7,600种蛋白质（图1B）。在三个时间点均检测到的蛋白质总数为7,237种，表明在整个分化过程中，核心蛋白质组总体上得以广泛 պահպան（图1B）。相比之下，部分蛋白质呈现阶段特异性表达，其中包括仅在第1天检测到的46种蛋白质和仅在第6天检测到的112种蛋白质。成对重叠分析进一步鉴定出196种仅在第1天和第3天之间共有的蛋白质，以及178种仅在第3天和第6天之间共有的蛋白质，这与神经元成熟过程中渐进性的蛋白质组重塑相一致（图1B）。
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图1.
LUHMES细胞分化及蛋白质组分析策略概览。
（A）
LUHMES神经元分化时间线示意图。细胞样本采集于三个阶段：起始期（第1天）、分化期（第3天）和成熟期】【。
（第6天）。对各时间点的样本进行处理，以通过质谱分析总蛋白质组和磷酸化蛋白质组。图中展示了各阶段的代表性荧光图像，其中 Hoechst 染色的细胞核和鬼笔环肽染色的 F-actin 显示了细胞的整体形态。比例尺，10 μm。
（B）
柱状图显示了第1天、第3天和第6天各生物学重复（n = 3）中鉴定出的蛋白质数量。SuperVenn 图总结了三个时间点之间已鉴定蛋白质的重叠情况。
（C）
柱状图显示了各时间点各生物学重复（n = 3）中鉴定出的磷酸化蛋白质和磷酸化位点数量。SuperVenn 图总结了第1天、第3天和第6天之间磷酸化蛋白质及磷酸化位点的重叠情况。
磷酸化蛋白质组分析显示，每个阶段鉴定出的磷酸化蛋白质约为 5,000–5,800 个，磷酸化位点为 8,000–10,000 个；所有时间点共有的磷酸化位点超过 6,800 个（图 1C）。对蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据集进行主成分分析后发现，第1天、第3天和第6天的样本沿 PC1 明显分离，PC1 分别解释了总方差的 44.3% 和 45.2%（补充图 1A、B）。层次聚类分析也将样本按分化阶段归类，表明数据集具有良好的可重复性，并呈现阶段特异性的组织模式（补充图 1C、D）。
LUHMES 神经元分化过程中的蛋白质表达动态变化
为评估 LUHMES 分化过程中阶段特异性的蛋白质丰度变化，我们针对第3天与第1天、第6天与第3天以及第6天与第1天进行了两两差异表达分析（图 2A、C、E；补充表 1）。校正后 p 值 < 0.05 且 |log₂（倍数变化）| > 1 的蛋白质被视为
显著调控。
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图2。
LUHMES分化过程中蛋白质丰度差异及功能富集分析。
火山图显示了Day 3与Day 1
(A)
、Day 6与Day 3
(C)
以及Day 6与Day 1
(E)
之间蛋白质丰度的两两比较。蛋白质分别根据log
2
（倍数变化）（x轴）和–log
10
（校正后p值）（y轴）进行绘制。校正后p值<0.05且|log₂（倍数变化）|>1的蛋白质被视为具有显著差异表达。显著上调的蛋白质以橙色表示，下调的蛋白质以紫色表示，无显著差异的蛋白质以灰色表示。图中标注了上调和下调幅度最大的前30种蛋白质。条形图显示了Day 3与Day 1
(B)
、Day 6与Day 3
(D)
以及Day 6与Day 1
(F)
之间差异表达蛋白质的基因本体（Gene Ontology，GO）生物过程和Reactome通路富集分析结果。每个调控方向仅显示Benjamini校正后p值<0.001的前五个富集条目。条形长度表示统计学显著性（–log₁₀校正后p值），圆圈大小表示与各条目相关的蛋白质数量；上调和下调蛋白质集分别进行分析。完整的富集分析结果见补充表2。
从Day 1到Day 3的转变表现为蛋白质上调（379种）和下调（372种）较为均衡，反映了与早期分化相关的重塑过程（
图2A
）。下调蛋白质主要与DNA复制和细胞周期进程相关，包括MCM复合体组分（MCM2、MCM4–MCM7）以及DNA聚合酶亚基（POLA1/2、POLD1、POLE、POLE2），这反映出细胞退出细胞周期过程中增殖程序受到抑制（Aria & Yeeles，
2019；Nick McElhinny 等，2008）。相比之下，上调蛋白主要富集于细胞骨架组织以及早期神经元特征相关过程，包括 β-微管蛋白亚型（TUBB2A、TUBB3、TUBB4A）和微管相关蛋白，如 MAP1B、MAP2 和 MAP6（Conde & Cáceres，2009；Tantry & Santhakumar，2023）。
在第 3 天至第 6 天期间，差异调控蛋白的数量增加（上调 677 个，下调 513 个），表明细胞逐步获得神经元特征（图 2C）。MCM 复合体成员和细胞周期调控因子（包括 CDK1 和 CDK2）的持续抑制进一步支持细胞周期退出状态的维持。与此同时，参与突触囊泡动力学的蛋白（如 SYN1、SYT1、CADPS）、神经元黏附相关蛋白（如 NRXN1、NRXN2、NCAM1、NCAM2）、轴突和树突结构成熟相关蛋白（如 NEFM、MAP2、MAP1B），以及电压门控钙信号相关蛋白（如 CACNA1B）均显著上调，并伴随经典神经元分化标志物 ELAVL4、DCLK1 和 MAPT 的上调（Lauter 等，2020）。
第 6 天与第 1 天的比较显示出最广泛的蛋白质组重塑，共有 1,087 个蛋白上调、1,168 个蛋白下调（图 2E）。下调蛋白主要包括 DNA 复制核心机制相关蛋白（MCM2–7、GINS1–4、CDC45、POLA1–POLE2、PRIM1/2）、细胞周期调控因子（CDK1/2/4、CHEK1、MKI67、PCNA）（Martínez-Alonso & Malumbres，2020；Juríková 等，2016）、染色质组装与重塑因子（HELLS、CHAF1A/B、DNMT1）（Hoffmann & Schulz，2021），以及凝缩蛋白复合体亚基（SMC2、SMC4、NCAPD2、NCAPG、NCAPH）（Jackson & Bartek，2009）。与此同时，促进增殖的信号分子（NOTCH1/2、STAT1/3/5B、YAP1）（Lui 等，2011）以及支持核苷酸和氨基酸代谢的酶类俺去也
生物合成相关蛋白（DHFR、IMPDH1/2、SHMT1、GFPT1/2）（Saha 等，2023）也有所减少。
相反，与轴突导向和神经元黏附相关的蛋白（DCC、ROBO2/3、SLIT1、L1CAM、CNTN1/2、NCAM1/2）（Kolodkin 与 Tessier-Lavigne，2011）、突触小泡运输组分（STX1A/B、STXBP1/5、RIMS1/3/4、UNC13A/B、BSN、SYN1）以及电压门控离子通道（CACNA1B/H、KCNQ2、SCN3A/B、HCN4）均显著增加（Südhof，2013；Alexander 等，2015）。细胞骨架蛋白（TUBB2A/B、TUBB3、TUBB4A、MAP1A/B、MAP1A/B、MAP2、NEFL、NEFM）和轴突运输相关驱动蛋白（KIF5A/C、KIF21A/B）也发生积累。神经元身份调控因子（包括 MYT1、ISL2、ELAVL3/4、NOVA1/2 和 MECP2）的丰度增加，以及神经元信号转导激酶（如 CDK5、CAMK4、FYN 和 BRSK1/2）的增加，进一步支持了神经元逐步成熟的过程（Hirokawa 等，2010；Puri 等，2023；Chen 等，2020；Cheung 与 Ip，2012）。
在分化过程中，若干已确立的神经元蛋白在上调幅度最大的蛋白之列，包括 DCX、MAP2、L1CAM、DCC、CNTN2、NEFM 和 NRXN1（补充图 2A）。此外，还鉴定出多种此前尚无神经元注释、但诱导程度显著升高的蛋白，包括 TMSB10、RGMB、REEP1、TMEFF1 和 IGFBPL1（补充图 2B）。
综上，这些数据表明，在 LUHMES 分化过程中，蛋白质组发生了协调性的重组：细胞由增殖和生物合成程序逐渐转向具有有丝分裂后神经元特征的结构、突触和信号转导模块。与这些分子变化一致，免疫荧光成像显示出进行性的形态重塑：第 1 天细胞形态紧凑，第 3 天伸展出细长的神经突，并在第 6 天形成复杂的相互连接的神经元网络（图 1A）。
功能性
差异丰度蛋白的富集分析揭示了阶段特异性的生物学过程
为阐释差异丰度蛋白的功能意义，针对各比较中上调和下调蛋白分别进行了基因本体（GO）生物过程和 Reactome 通路富集分析（图 2B、D、F；补充表 2）。富集分析基于校正后 p 值 < 0.001 的蛋白进行，并采用 Benjamini–Hochberg 校正。
在第 3 天与第 1 天的比较中，上调蛋白主要富集于细胞骨架组织、轴突导向和早期神经元发育，而下调蛋白则与 DNA 复制、细胞周期进程和染色体组织相关（图 2B）。Reactome 通路分析同样显示，神经系统和膜运输通路在早期被激活，而有丝分裂和 DNA 复制程序受到抑制。
在第 6 天与第 3 天的比较中，富集模式进一步转向神经元成熟，上调蛋白与突触组装、囊泡介导的运输以及神经系统发育相关，而下调蛋白仍主要与 DNA 复制、细胞周期进程和 RNA 相关过程密切相关（图 2D）。
第 6 天与第 1 天的比较显示出最显著的功能分化。上调蛋白主要富集于神经元分化、轴突导向、细胞骨架重塑和突触信号通路，而下调蛋白则与增殖、RNA 代谢、核糖体生物发生以及染色质相关过程有关（图 2F）。
总体而言，这些富集分析表明，LUHMES 分化过程中发生了渐进性的功能转变，其特征是
神经元结构与突触程序的激活，同时伴随增殖及生物合成通路的协同抑制。
LUHMES 神经元分化过程中的蛋白质表达轨迹
为探究 LUHMES 分化过程中蛋白质丰度的时间动态变化，我们根据蛋白质在第 1、3 和 6 天的表达谱对其进行聚类。分析识别出九种不同的变化轨迹模式，包括持续上升、持续下降、早期上升、早期下降、晚期上升、晚期下降、第 3 天达到峰值、第 3 天降至谷值，以及一个在各时间点间变化极小的大型稳定簇（补充图 3；补充表 3）。值得注意的是，稳定簇包含了大多数定量蛋白质（5,460 种蛋白质，其中包括 233 个转录因子），而动态簇则由规模较小但功能特异性较强的蛋白质子集构成。后续分析聚焦于分化过程中呈渐进式上升或下降的六种主要单调变化轨迹（图 3A–F）。
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图 3.
LUHMES 分化过程中蛋白质表达轨迹的聚类。折线图展示了第 1、3 和 6 天的蛋白质丰度谱，并根据时间表达模式分为六个簇：持续上升（A）、早期上升（B）、晚期上升（C）、持续下降（D）、早期下降（E）和晚期下降（F）。每条细线代表一种蛋白质。粗彩色线表示转录因子（TF），粗黑线表示该簇的平均表达谱。每个面板中均标示了分配至相应簇的转录因子数量和蛋白质总数。各簇下方的柱状图展示了富集程度最高的前五个 Gene
对应簇中蛋白质的本体生物过程（Biological Process）和 Reactome 通路术语。条形长度表示与各术语相关联的蛋白质数量，颜色表示统计显著性（Benjamini 校正 p 值的 –log₁₀ 值）。
持续上升簇中的蛋白质（9 个转录因子 / 304 个蛋白质）从第 1 天到第 6 天逐渐积累，富集于神经系统发育、轴突导向、神经元系统通路和突触组装，这与神经元连接的逐步建立相一致（图 3A）。早期上升簇中的蛋白质（26 个转录因子 / 497 个蛋白质）主要在第 1 天至第 3 天期间增加，富集于微管组织、胞吐作用、膜运输和 RHO GTP 酶信号通路，表明细胞骨架重塑和囊泡运输程序在早期被激活（图 3B）。相比之下，晚期上升簇中的蛋白质（18 个转录因子 / 585 个蛋白质）在分化早期相对稳定，但在第 6 天显著增加。这些蛋白质富集于神经系统发育、细胞黏附、轴突导向和 L1CAM 相互作用通路，提示与成熟相关的神经元黏附和连接程序逐步激活（图 3C）。
下降轨迹簇主要与增殖和染色质相关功能有关。持续下降簇中的蛋白质（34 个转录因子 / 327 个蛋白质）在整个分化过程中逐步减少，富集于转录调控、DNA 复制和有丝分裂细胞周期通路，这与增殖程序持续受抑相一致（图 3D）。早期下降簇中的蛋白质（27 个转录因子 / 359 个蛋白质）到第 3 天时迅速减少，并富集于
DNA复制、染色体分离、DNA修复以及细胞周期检查点通路，反映出有丝分裂机制的早期关闭（图3E）。晚期下降簇中的蛋白质（45个转录因子/572种蛋白质）主要在第3天至第6天期间下降，并富集于染色质组织、染色质修饰酶以及NOTCH相关信号通路，表明在神经元成熟过程中，与染色质相关的调控程序逐步减弱（图3F）。
LUHMES神经元分化过程中的磷酸化蛋白质组重塑
为补充总蛋白质组分析，我们定量分析了LUHMES分化各阶段的位点特异性磷酸化变化（图4A–F；补充表4）。在未针对总蛋白质丰度进行归一化的情况下，对磷酸化位点强度进行了分析，以保留与分化过程中蛋白质丰度大幅变化相关的磷酸化动态。鉴于分化过程中蛋白质丰度变化具有较大的动态范围，按总蛋白质水平进行归一化可能会降低强烈上调的神经元蛋白质上磷酸化变化的表观幅度。因此，这些数据被解释为反映分化相关的磷酸化蛋白质组重塑，而非磷酸化占有率。该解释与近期对iPSC来源神经元分化开展的时间序列蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析一致；在该研究中，磷酸化蛋白质组动态被视为总蛋白质组变化的补充性调控层（Hao等，2026）。
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图4.
LUHMES细胞分化过程中的差异性磷酸化蛋白质组动态。
火山图显示了第3天与第1天（A）、第6天与第3天（C）以及 马会
第6天与第1天的比较
（E）磷酸化位点以 log₂（倍数变化）（x轴）和–log₁₀（校正后的p值）（y轴）表示。校正后的p值 < 0.05 且 |log₂（倍数变化）| > 1 的磷酸化位点被认为发生了显著调控。显著增加的磷酸化位点以橙色表示，显著降低的磷酸化位点以紫色表示，无显著变化的位点以灰色表示。图中标注了增加和降低幅度最大的前20个磷酸化位点。柱状图展示了Day 3与Day 1（B）、Day 6与Day 3（D）以及Day 6与Day 1（F）比较中，与显著调控的磷酸化位点相对应蛋白的基因本体生物过程和Reactome通路富集分析结果。柱长表示–log₁₀（经Benjamini校正的p值），圆点大小表示与各术语相关联的蛋白质数量；增加和降低的蛋白集合分别进行分析。
Day 3与Day 1的比较鉴定出339个上调和75个下调的磷酸化位点，表明在神经元命运确定过程中，磷酸化蛋白质组已发生早期重塑（图4A）。下调的磷酸化位点主要定位于与染色质组织、DNA复制和细胞周期调控相关的蛋白，包括LMNA、EZH2、POLA2、LIG1和MSH6。相比之下，磷酸化水平升高主要影响参与细胞骨架重塑和神经元形态发生的蛋白，包括ANK3、MAP2、MAP1B、DCX、BSN、RIMS1和EXOC4。此外，RHO依赖性细胞骨架信号传导调控因子以及神经元转录因子MYT1也观察到磷酸化增加，表明早期分化过程中发生了广泛的翻译后重塑。功能富集分析显示，上调磷酸化蛋白主要富集于细胞骨架组织、神经元突起发育和RHO GTP酶信号传导通路，而翻译中断。
下调的磷酸化蛋白与增殖相关过程有关联（图 4B；补充表 5）。
在第 6 天与第 3 天之间，磷酸化蛋白质组重塑显著加剧，共有 615 个上调和 954 个下调的磷酸化位点（图 4C）。在多种转录及染色质相关调控因子上观察到磷酸化水平降低，包括 ZBTB46、ZBTB18、NCOR2、SIN3A、CHD7 和 SON，同时还涉及参与细胞核组织和细胞内运输的蛋白。相反，磷酸化水平升高主要富集于与神经系统发育、轴突导向、细胞骨架重塑和 RHO GTP 酶信号通路相关的蛋白，而磷酸化水平降低仍与染色质组织和转录调控通路相关（图 4D；补充表 5）。
第 6 天与第 1 天的直接比较显示，磷酸化蛋白质组发生了广泛的双向重塑，共有 979 个上调和 907 个下调的磷酸化位点（图 4E）。下调的磷酸化位点主要定位于与染色质调控、RNA 加工、DNA 复制和基因组维持相关的蛋白，包括 NFATC4、SRRM2、NCOR2、LIG1、MDC1 和 CHAF1A。相比之下，在神经元细胞骨架蛋白和突触调控因子上检测到显著增强的磷酸化，包括 NEFM、DCX、MAP2、MAPT、ANK2/3、L1CAM、RIMS1 和 BSN，同时还涉及 MPRIP、FHOD3 和 SPAG9 等肌动蛋白及 RHO 相关的细胞骨架调控因子。功能富集分析表明，上调的磷酸化蛋白显著富集于神经元分化、细胞骨架组织、轴突导向和突触信号通路，而下调的磷酸化蛋白则与染色质重塑、RNA】【。
代谢和细胞周期调控（图4F；补充表5）。
为进一步探究磷酸化蛋白质组重塑的功能后果，我们利用第6天与第1天的比较结果开展了激酶–底物富集分析（KSEA）（补充图4；补充表6）。KSEA显示，分化过程中激酶活性发生了显著变化：包括DYRK2和MAPK7在内的神经元信号传导相关激酶活性增强，而包括CDK1、CDK2、PLK1和MAPKAPK2在内的多种增殖相关激酶活性受到抑制。对受显著调控激酶靶向的转录因子底物进行分析发现，来自11种激酶的67个转录因子底物发生了协调性的磷酸化变化，其中受抑制的CDK和PLK1的底物表现出广泛的磷酸化水平下降（补充图4A、B；补充表6）。
综上，这些结果表明，LUHMES分化过程中磷酸化蛋白质组发生了渐进式重塑，其特征包括激酶驱动的信号网络广泛重构、增殖相关和染色质相关信号的协调性抑制，以及神经元细胞骨架、突触和激酶信号通路的激活。
LUHMES神经元分化过程中调控蛋白类别的重塑
随后，我们考察了LUHMES分化过程中主要调控蛋白类别的变化，包括激酶、磷酸酶、转录因子（TF）、小GTP酶和G蛋白偶联受体（GPCR）（补充图5A）。在第3天与第1天的比较中，转录因子占显著调控蛋白的较大比例，其中21个TF上调、23个TF下调。在这一阶段，激酶和磷酸酶也表现出显著变化。在第6天与第3天的比较中，17个TF上调】【。
其中48个下调。最大幅度的变化出现在第6天与第1天的比较中，其中33个TF上调，85个TF下调。在所有比较中，激酶均呈现出相似的变化模式。
随后，我们评估了显著调控的转录因子中TF家族的分布情况（补充图5B；补充表1）。在所有比较中，C2H2锌指蛋白均构成最大的TF家族，尤其是在第6天与第1天比较中的下调TF中富集明显。在上调组和下调组中均检测到的其他TF家族包括bHLH/bZIP、Homeodomain、HMG/Sox、EBF1/Ets以及SMAD/STAT因子。
随后，我们整合了第6天与第1天比较中显著上调的转录因子的蛋白丰度和磷酸化数据（补充图5C；补充表1、4）。多个TF表现出显著的蛋白质水平上调，包括MYT1、ISL2、LHX2、DPF3、MEOX2、POU2F2、JUN和NHLH2。其中，BACH2、MYT1、ST18、SCRT1、LCOR、ZNF316和MECP2还表现出显著增强的磷酸化。其他上调的TF则表现出可检测但不显著的磷酸化变化，或缺乏磷酸化蛋白质组学测量数据。
为进一步表征不同调控酶类别的变化，我们分析了第6天与第1天比较中的差异调控酶及修饰酶（补充图6A、B；补充表7）。激酶和磷酸酶是上调酶类别中数量最多的两类，而甲基转移酶则表现出最强的下调。泛素连接酶、去泛素化酶、乙酰转移酶、RNA编辑酶和蛋白酶也观察到差异调控。火山图分析显示，
信号相关激酶以及染色质和 RNA 相关调节酶发生了广泛重塑（补充图 6B）。总体而言，这项类别层面的分析为识别 LUHMES 细胞从增殖前体转变为有丝分裂后神经元过程中逐渐凸显的调控过程，提供了一个与成熟相关的框架。激酶和磷酸酶协同增加，表明成熟过程中信号调控增强；而甲基转移酶显著下调，则提示某些染色质修饰程序受到抑制。与此同时，泛素连接酶、去泛素化酶及其他与蛋白质周转相关的酶呈现差异性调控，凸显蛋白质稳态是神经元分化过程中的另一调控层面。这些发现为后续实验研究提供了切入点，可用于界定促进神经元成熟的阶段特异性调控过程。
神经元早期分化过程中六种转录因子的功能分析
我们根据六种转录因子各自独特的时间表达模式以及蛋白质组和磷酸化蛋白质组特征，选取它们在细胞中进行功能验证（图 2 和图 5A）。在持续增加簇中，我们选择了 MYT1 和 LCOR，因为它们在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平均显著上调，其中 MYT1 的磷酸化位点数量最多。我们选择了晚期增加的 ISL2 和早期增加的 NHLH2；这两种因子均显著上调，但磷酸化水平没有显著变化。我们还从稳定簇中纳入 DACH1，依据是已有研究报道其参与纤毛生物学（Umair 等，2021）。研究表明，纤毛会影响神经元分化（Coschiera 等，2023）。ONECUT2 来自第 3 天的谷值型簇
簇，该簇因其高度动态的表达模式以及已知参与早期神经元分化过程而被选中（Sagner 等，2021）。
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图 5.
神经元分化过程中转录因子的功能验证。
(A) LUHMES 分化过程中 DACH1、ONECUT2、LCOR、NHLH2、MYT1 和 ISL2 的时间表达谱。上方各图显示分化第 0 天至第 6 天（D0–D6）的 STRT-mRNA-seq 表达动态，下方各图显示总蛋白质组分析中第 1 天、第 3 天和第 6 天的相应蛋白丰度变化。误差线表示平均值 ± 标准差。
(B) 采用 siRNA 介导的基因敲低后，于第 3 天通过 qRT-PCR 测定所示转录因子的相对 mRNA 表达水平。表达值以 GAPDH 进行标准化，并以对照细胞为参照。
(C) 转录因子基因敲低后，于第 3 天对神经元分化阶段进行定量。根据表观神经突形态，将分化中的神经元分为第 1 阶段、第 2 阶段或第 3 阶段。
(D) 转录因子基因敲低后，于第 3 天对纤毛神经元进行定量。
(E) 转录因子基因敲低后，于第 3 天对多极神经元进行定量。
(F) 转录因子基因敲低后，于第 3 天对神经突直径进行定量。
(G) siRNA 介导的 ISL2、LCOR 和 NHLH2 基因敲低后，第 3 天分化中的 LUHMES 神经元与对照细胞的代表性荧光图像。比例尺，10 μm。B–F 中的数据表示为 n = 6 个独立生物学重复的平均值 ± 标准差。在基于成像的 C–F 定量中，在适用情况下每种条件下均定量了 >300 个细胞。B、D、E 和 F 中的数据均为
通过单因素方差分析（one-way ANOVA）并结合 Tukey 多重比较检验进行分析。C 中的数据通过双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析，并在每个分化阶段内采用 Tukey 多重比较检验。图中显示了所标示比较之间的统计学显著性。*P < 0.05，***P < 0.001。
对 LUHMES 分化过程（D0–D6）中的单细胞标记逆转录（STRT）-mRNA-seq 数据进行分析显示，六个基因均呈进行性上调（Coschiera et al., 2024）（图 5A）。为评估这些基因的功能作用，在分化诱导前不久的 D−1/D0 时期，对处于增殖状态的 LUHMES 前体细胞进行了 siRNA 介导的基因敲低，并在分化第 3 天（D3）对发育表型进行了分析。通过 qRT–PCR 确认了所有基因均实现了有效敲低（图 5B）。在 D3，通过鬼笔环肽染色评估细胞形态及分化进程中的不同阶段，从而评价神经元分化情况（Coschiera et al., 2024）。在对照条件下，大多数细胞达到第 3 阶段，较少细胞仍处于第 2 阶段，只有少数细胞处于第 1 阶段（图 5C）。第 2 阶段神经元具有长度相近的神经突起，但尚未表现出明确的极性；而向第 3 阶段的转变涉及对称性破坏，其中一条神经突起逐渐延长，形成正在出现的轴突，并建立明确的神经元极性（Coschiera et al., 2024）。在 D3 检测到的较早分化阶段比例增加，被解释为分化延迟。与分化延迟一致，敲低 NHLH2、MYT1 和 ISL2 导致了明显的分化延迟，而敲低 DACH1 和 ONECUT2 未产生可检测的影响。相比之下，敲低 LCOR 增加了处于第 3 阶段细胞的比例，表明分化得到增强（图 5C）。
通过定量分析 D3 时期的纤毛发生，对纤毛发生进行了评估。
纤毛细胞的比例（图5D）和纤毛长度（数据未展示）。敲低NHLH2、MYT1和ISL2均导致明显的纤毛表型，并伴随分化延迟，这与纤毛信号传导和神经元分化之间存在关联的观点一致（Coschiera等，2024）。尽管未检测到分化延迟，敲低DACH1也产生了纤毛表型，这与此前报道的DACH1在纤毛发生及纤毛功能中的作用一致（Umair等，2021），同时也表明，仅有纤毛发生缺陷未必足以导致分化延迟。进一步的详细形态学分析揭示了各基因对神经突结构的特异性影响。敲低NHLH2导致神经突直径减小，与神经突生长受损的表现一致（图5F、G）。相比之下，敲低LCOR促进了神经突延伸并改变了细胞极性，多极细胞及分支结构的比例升高（图5E、G），表明LCOR发挥转录抑制因子的功能。
综上，这些细胞功能分析明确了MYT1、ISL2、NHLH2和LCOR在神经元早期分化过程中的不同作用，将转录因子调控与分化中的LUHMES神经元的成熟、纤毛发生及神经突形态发生联系起来。
增强子–启动子互作组的动态变化
为研究LUHMES分化过程中由增强子介导的调控层级，我们整合了整个神经元分化轨迹（D0–D6）中的增强子–启动子互作图谱与转录组、蛋白质组及磷酸化蛋白质组谱。在所有时间点，共有5,990个启动子与49,282个推定增强子发生互作（Yoshihara等，2025）（补充表9A）。为鉴定动态变化的
在受调控区域中，我们比较了各启动子和增强子在不同时间点的相互作用伙伴，并根据其时间性相互作用模式对各元件进行分类（补充表9B、C）。增强子的相互作用动态性显著高于启动子，表明神经元分化过程中发生了广泛的增强子相互作用网络重塑（补充图7A）。为推断上游调控因子，我们对增强子进行了转录因子（TF）基序富集分析。结果显示，105个TF对应的基序显著富集，其中75个（71%）在分化过程中表现出差异表达、差异丰度或差异磷酸化（补充表9D）。相比之下，在表达水平和丰度发生差异变化的基因的启动子中，TF基序富集相对有限，表明增强子介导的调控是神经元分化过程中的一个主要调控层面（补充表9E，图6A）。
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图6.
LUHMES神经元分化过程中增强子介导的调控层级。
（A）
增强子和启动子相关调控区域中TF基序富集的比较。TF按其基序富集显著性的最大值排序，TF名称的颜色表示提供支持的组学层数。棒棒糖图中线杆的颜色表示富集偏向（增强子富集，绿色；启动子富集，红色），圆点的颜色表示评估各基序所在的调控区域（启动子，蓝绿色；增强子，橙色）。
（B）
中继TF和上游TF与基于Open Targets可信集关联优先确定的神经/脑相关全基因组关联研究（GWAS）靶基因的重叠情况。中继TF与GWAS靶基因的重叠程度高于上游TF。
（C）
增强子介导的调控层级
识别中继转录因子（TF）瓶颈。上游TF被定义为预测可与增强子结合的TF，中继TF被定义为受增强子调控且同时调控下游增强子的TF，终末靶基因则被定义为通过这些增强子介导的连接受到调控的基因。节点颜色表示推断的调控方向，节点大小表示提供支持的组学层数量。横轴表示每个TF接收的、具有组学证据支持的上游调控因子数量，纵轴表示其调控的D6优先终末靶基因数量，因此位于右上方的中继TF发挥调控瓶颈作用；插图示意图展示了其背后的增强子→中继TF→靶基因关系。
(D)
由TF介导的D3至D6增强子级联，将D3组学上调TF与D6激活的中继TF及选定的D6靶基因连接起来。边表示在D3或D6活跃的、由增强子介导的调控连接，突出了与神经元成熟相关的晚期调控程序。节点形状用于区分D3组学上调TF、D6激活的中继TF和选定的D6靶基因。橙色三角形表示D3组学上调TF，紫色菱形表示D6激活的中继TF，圆形表示选定的D6靶基因。深灰色和浅灰色边分别表示在D3和D6活跃的、由增强子介导的连接。选定的D6靶基因层中，基因名称的颜色表示提供支持的差异组学层数量，范围为0至3。
接下来，我们为每个时间点构建了TF–靶基因调控网络：若与基因相互作用的增强子含有相应TF的结合基序，则将该TF与该基因连接起来（方法）。所得网络包含7,506个节点和408,260条边（补充表9F、G）。在蛋白质水平上差异上调的TF的靶基因
其在转录水平上调的可能性高于随机预期（OR = 2.07，p = 0.012；2.72% vs 1.33%，Fisher精确检验）。类似地，磷酸化水平显著变化的转录因子（TF）的靶基因也更可能上调（OR = 1.29，p = 0.0427；18.9% vs 15.4%），支持分化过程中存在增强子介导的TF调控。对不同时间点的TF级联进行层级重建，揭示了不同的调控层次。包括NFIA、FOXD1和RFX7在内的若干上游调控因子主要在转录组层面被检测到，而TCF3、LHX9或ETV1等下游调控因子则在蛋白质组层面表现出显著的调控变化（补充图7B）。此外，FOXN3和PLAGL2等调控因子主要通过差异磷酸化分析被识别，表明整合多组学模态对于解析调控层级具有额外价值（补充图7B）。
接下来，我们利用增强子介导的TF–靶基因关系，根据其调控输入构建了调控层级。仅被预测与增强子结合的TF（即仅具有出边）被归类为上游TF，而自身受增强子调控且被预测与增强子结合的TF则被归类为中继TF（即同时具有出边和入边）。最后，仅受TF调控的基因被归类为终端基因；若其本身为TF，则归类为终端TF（图6C）。大多数靶基因与同时含有上游TF和中继TF基序的增强子相连。然而，包括ELK4、TIGD3或EBF1在内的若干中继TF形成了调控瓶颈，接收来自多个上游TF的输入，同时又通过其相关增强子调控众多下游靶标（Makadia等，2015）（图6C）。
鉴于中继转录因子（TF）在增强子介导的层级调控体系中发挥瓶颈调控作用，我们进一步探究，这一网络位置是否也与人类神经及脑相关遗传变异具有更强的关联。因此，我们比较了中继TF和上游TF与公共全基因组关联研究（GWAS）优先筛选的靶基因之间的重叠情况。结果显示，中继TF比上游TF更有可能成为神经及脑相关GWAS的靶基因（45% vs 22%；2.84倍；Fisher精确检验p = 0.046），提示这一调控层级可能优先富集疾病相关基因（图6B）。为识别晚期调控程序，我们重点关注在D3时丰度或磷酸化水平发生差异变化，且其结合基序富集于D3活性增强子中的TF；这些增强子所关联的TF在D6时丰度发生差异变化（图6D）。由此，我们重建了驱动神经元终末成熟的增强子介导的TF级联调控网络。其中，MEOX2成为一个突出的晚期调控枢纽。MEOX2的蛋白水平显著上调，其结合基序富集于与1,074个靶基因相连的活性增强子中。这些靶基因显著富集于多巴胺能神经发生相关过程（FDR = 1.6 × 10⁻²），包括NR4A2、DDC、RET、EN1、EN2、SHH、SLC6A3、SLC18A2和SOX2等关键调控因子和标志物。这些发现提示，MEOX2可能是一个以往未受到充分重视、与增强子相关的多巴胺能神经元晚期分化候选调控因子。
讨论
本研究采用LUHMES细胞模型，整合连续三个分化阶段的总蛋白质组、磷酸化蛋白质组、转录组及增强子–启动子互作组数据，对人类多巴胺能神经元分化进行了全面的多组学表征。这一整合的
该方法揭示了染色质相关、转录及翻译后调控层面协同发生的分子重塑，从系统层面呈现了人类神经元成熟过程背后的调控网络。
我们的蛋白质组分析在每个样本中鉴定出约7,600种蛋白质，其中超过7,000种在所有时间点均被检出，为LUHMES神经元蛋白质组建立了全面的基线。与第1天相比，第6天观察到广泛的蛋白质组重塑，包括1,087种蛋白质上调和1,168种蛋白质下调，凸显了细胞从增殖性的祖细胞样状态向分化的神经元表型转变过程中显著而大规模的变化。既往关于LUHMES分化的蛋白质组研究通过对未分化与已分化状态进行二元比较，定量检测了约4,000–5,000种蛋白质（Hao等，2026；Tüshaus等，2021）。本研究在提高蛋白质组覆盖深度的同时，提供了涵盖明确界定的中间分化阶段的时间分辨信息，从而拓展了这些研究。与既往报道一致，我们观察到L1CAM、MAPT、SYN1和α-突触核蛋白等公认的神经元标志物显著上调，同时细胞周期和DNA复制相关分子机制受到广泛抑制（Scholz等，2011；Tüshaus等，2021；Hao等，2026）。此外，更深的蛋白质组覆盖揭示了参与轴突导向、突触囊泡转运和离子通道信号传导的蛋白质协同上调，反映出细胞逐步获得神经元连接能力并实现功能成熟（Kolodkin和Tessier-Lavigne，2011；Südhof，2013；Alexander等，2015）。
据我们所知，本研究的磷酸化蛋白质组学部分是首批全面的
LUHMES神经元分化过程中的位点特异性磷酸化分析。在所有比较中，磷酸化蛋白质组均呈现出渐进性转变：从细胞周期调控因子、染色质相关因子和DNA复制机器的磷酸化，转向细胞骨架支架蛋白、突触组分及神经元信号蛋白的广泛修饰。与这一转变一致，从第1天到第6天，MAPT、MAP2、NEFM、DCX和ANK3的多个残基位点均表现出显著的磷酸化水平升高，反映了成熟过程中神经元细胞骨架结构受到协调的翻译后调控（Hao等，2026；Lyu等，2025；Yoon等，2022）。这些磷酸化模式与近期关于诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元分化的磷酸化蛋白质组学研究结果一致（Hao等，2026），并强调在神经元分化过程中，磷酸化作为一个调控层面，与蛋白质丰度变化形成互补。与这些整体磷酸化蛋白质组变化一致，激酶活性估算表明，信号活动从CDK和PLK1驱动的增殖信号转向MAPK7（ERK5）和DYRK2介导的神经元通路（Salaün等，2008；Wang等，2014；Santos-Durán和Barreiro-Iglesias，2022）。这种激酶层面的重塑伴随着转录因子底物的协调性磷酸化变化，提示分化过程中信号网络与转录调控程序之间存在紧密耦联。综上，这些发现表明，激酶网络重塑构成了协调神经元成熟过程中磷酸化动态变化的另一调控层面。
除结构蛋白和信号蛋白外，我们还观察到多种调控蛋白受到动态调控
在分化过程中涉及多种类别，包括转录因子、激酶、磷酸酶、甲基转移酶及泛素相关酶。随着分化进程推进至第6天，发生差异调控的转录因子数量不断增加，提示细胞在逐步趋于神经元成熟的过程中，其转录图谱逐渐重塑。在各转录因子家族中，C2H2型锌指蛋白在整个分化过程中最为常见。鉴于C2H2型锌指蛋白在脑发育和神经元命运决定中的作用已得到证实（Al-Naama et al., 2020），这一富集现象可能反映了该转录因子家族广泛参与神经元调控程序。MYT1和LHX2等神经元谱系相关因子表达上调，与既往报道的其在神经元发育中的作用一致（Chen et al., 2020；Bose et al., 2025；Vasconcelos & Castro, 2017）。与此同时，各类调控酶也表现出广泛的重塑，包括信号传导相关激酶和磷酸酶的丰度增加，以及多种染色质相关甲基转移酶的下调。部分上调的转录因子，包括MYT1、ST18和MECP2，其磷酸化水平也有所升高，表明在LUHMES细胞分化过程中，转录调控因子在蛋白质丰度和翻译后调控两个层面受到协同调控。
功能性敲低实验进一步支持了通过蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学整合分析所鉴定的转录因子的重要性。敲低MYT1、ISL2和NHLH2会延缓神经元分化，并伴随纤毛发生相关表型，这与既往将初级纤毛功能与神经元相关过程相联系的研究一致
分化与信号传导（Coschiera 等，2024）。相比之下，DACH1 耗竭改变了纤毛发生，但未导致可检测到的分化延迟，表明仅有纤毛缺陷未必足以损害神经元成熟。值得注意的是，LCOR 耗竭促进了神经突延伸，并提高了形态成熟神经元的比例，提示 LCOR 可能作为早期神经元分化的负调控因子发挥作用。
将增强子–启动子相互作用图谱与转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据集相整合，为解析 LUHMES 神经元分化的调控架构提供了进一步见解。与既往染色质相互作用研究一致（Yoshihara 等，2025），增强子的相互作用动态变化显著大于启动子，支持这样一种模型：启动子作为相对稳定的调控枢纽发挥作用，而增强子则在神经元成熟过程中提供动态的细胞类型特异性调控输入。与该模型一致，动态增强子处的转录因子基序富集显著强于启动子处，进一步支持增强子介导的调控是神经元分化过程中的一个主要调控层面。多组学整合进一步揭示了转录因子在染色质、蛋白质丰度和磷酸化层面的协同调控。通过增强子相关基序富集鉴定出的若干转录因子，在分化过程中也表现出蛋白质丰度或磷酸化水平的差异，提示染色质重塑与翻译后调控机制在神经元成熟过程中存在汇聚。对增强子介导的转录因子调控层级的重建还将 MEOX2 鉴定为一种
作为一个与多巴胺能神经发生相关靶标相联系的突出晚期调控枢纽，支持了增强子相关转录因子（TF）级联可能参与神经元成熟晚期程序的观点。这一发现尤为值得关注，因为既往对 MEOX2 的研究主要集中于中胚层和血管相关背景，包括阿尔茨海默病相关的脑血管功能障碍（Wu et al, 2005；Soto et al, 2016；Kokotović et al, 2022），而其在中枢神经系统多巴胺能神经元分化中的作用仍鲜有探索。更广泛而言，我们构建的增强子介导的层级调控体系补充了近期界定人类神经元分化所需转录因子的功能研究和多组学研究，包括在 NEUROG1/2 诱导的神经发生过程中针对约 1,900 个转录因子开展的全基因组 CRISPR-Cas9 筛选，以及鉴定出 LBX1、NHLH1 和 NR2F1/2 可促进人类中脑多巴胺能神经元分化的时间分辨多组学分析（Lu et al, 2023；Gomez Ramos et al, 2023）。通过将 LUHMES 细胞中的增强子–启动子相互作用与转录组、蛋白质组及磷酸化蛋白质组层面的调控相整合，我们的框架将转录因子层级与多巴胺能神经元成熟过程中的动态增强子调控网络重构、蛋白质丰度及磷酸化变化联系起来，从而拓展了上述研究。
除了为神经元分化提供机制性见解外，我们的数据集对于理解神经退行性疾病也具有更广泛的意义。在 LUHMES 分化过程中上调的多种蛋白质，包括 α-突触核蛋白（SNCA）、MAPT 和 UCHL1，均直接涉及帕金森病、阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病（Padilla-Godínez et al, 2025；Porchietto et al, 2025）。这些疾病相关蛋白质也存在于……之中
分化调控靶标表明，驱动神经元成熟的分子程序与疾病状态下受到扰乱的分子程序存在部分重叠。磷酸化蛋白质组学数据通过鉴定 MAPT（tau）等疾病相关蛋白上的磷酸化事件，进一步支持了这一观点；其中，tau 的过度磷酸化是 tau 蛋白病的标志性特征（Wegmann et al, 2021；Watamura et al, 2025）。LUHMES 细胞具有多巴胺能特性，且对神经毒性损伤敏感¹⁶˒¹⁷，因此特别适合用于探索发育程序与疾病易感性之间的交集。我们的多组学资源为研究驱动神经元成熟的调控网络受到扰动后如何促成神经退行性病理改变，提供了分子层面的框架。
本研究存在一些局限性，在解读结果时应予以考虑。LUHMES 细胞模型虽然具有出色的可重复性和近乎同步的分化过程，但仅代表单一神经元亚型（多巴胺能神经元），可能无法全面反映不同神经元谱系中调控机制的多样性。所采样的三个时间点（第 1 天、第 3 天和第 6 天）提供了信息丰富的分化过程快照，但可能遗漏这些阶段之间发生的短暂调控事件。此外，尽管磷酸化蛋白质组分析覆盖较为全面，但由于所采用的富集策略，其主要捕获丝氨酸和苏氨酸的磷酸化；泛素化、乙酰化和甲基化等其他翻译后修饰很可能在神经元分化过程中提供额外的调控层次。未来研究若纳入更多时间点、单细胞分辨率以及更广泛的
扩大翻译后修饰的覆盖范围，可进一步深化我们对神经元成熟过程中时间动态变化的理解。
总之，本研究为探究调控人类神经元分化的调控网络提供了多层次资源。通过整合染色质相互作用动态与蛋白质组、磷酸化蛋白质组及转录组数据，我们揭示了不同分子层面的协同变化如何驱动增殖性祖细胞向功能性神经元转变。鉴定出在多个分子层面受到调控的转录因子，并结合动态的增强子–启动子相互作用重构，凸显了分化调控的多层次特征。该数据集为LUHMES及其他人类神经元细胞模型提供了全面的参考资源，并提供了丰富的候选调控因子和通路，这些因子和通路可能与神经发育性疾病及神经退行性疾病相关。
方法
LUHMES细胞的体外增殖与分化
LUHMES神经元细胞系购自美国典型培养物保藏中心（ATCC；CRL-2927），并按照既往报道的方法（Lauter等，2020；Coschiera等，2023），在标准条件（37 °C、5% CO₂）下培养。培养瓶先用50 μg/mL聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐（Sigma-Aldrich，P3655）预包被1 h，再用1 μg/mL人纤连蛋白（Sigma-Aldrich，F1056）包被1 h。用无菌蒸馏水洗涤一次后，以2.5–3.5 × 10⁴个细胞/cm²的密度接种LUHMES细胞，并在DMEM/F-12 Ham生长培养基（Sigma-Aldrich，D6421）中培养，培养基中补充2.5 mM L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，G7513）、1× N-2补充剂（Gibco，17502-048）和40 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；
Thermo Fisher Scientific，PHG0369）。当细胞汇合度达到约80%时，使用TrypLE Express（Thermo Fisher Scientific，12605010）或0.025%胰蛋白酶/EDTA进行传代。进行神经元分化时，以1 μg/mL盐酸四环素（Sigma-Aldrich，T7660）替代bFGF，以抑制v-myc转基因的表达并诱导细胞退出细胞周期。加入分化培养基后，继续培养细胞，并于第1天、第3天和第6天收获，以监测神经元分化进程。收集前，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，使用TrypLE Express酶（Thermo Fisher Scientific，12605010）解离细胞，并以200 × g离心5分钟，弃去上清液。随后将细胞沉淀速冻，并储存于−80 °C，用于后续分析。
染色与显微成像
染色与显微成像分析参照既往报道的方法（Coschiera等，2024）进行，并作部分修改。简而言之，在诱导分化前24小时，将2.5 × 10⁴个LUHMES细胞接种于12孔板中预包被的盖玻片上。用2%多聚甲醛（PFA）固定细胞5分钟，再用含0.2% Triton X-100的PBS透化12分钟。用含2%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Tween-20的PBS封闭30分钟后，将盖玻片与Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽（Thermo Fisher Scientific，A12379）于4 °C孵育过夜，并用Hoechst 33342复染细胞核。使用ProLong Glass抗荧光淬灭封片剂封片，并在室温下避光固化24小时，以达到最佳折射率。使用配备Crest Optics X-Light V3转盘共聚焦扫描单元和Kinetix sCMOS相机的Nikon Ti2倒置显微镜采集共聚焦图像。
总蛋白质组与磷酸化蛋白质组样品
样品制备
对于总蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析，每个分化阶段均分析三个独立的生物学重复。将LUHMES细胞沉淀（每个重复2 × 10⁶个细胞）裂解于用50 mM碳酸氢铵（AMBIC；Sigma-Aldrich）配制的8 M尿素溶液中，并添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，P2745和P8340）。裂解在冰上进行，随后进行两轮水浴超声处理，每轮15 min，两轮之间在冰上孵育10 min。将裂解液于4 °C、16,000 × g离心20 min，收集上清液用于后续处理。采用BCA蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定总蛋白浓度，并对分取的样品进行调整以降低尿素浓度，确保测量准确。取等量蛋白质（250 µg），使用三（2-羧乙基）膦（TCEP；Sigma-Aldrich）进行还原，并使用碘乙酰胺进行烷基化。用50 mM AMBIC将样品稀释4倍，使尿素浓度降至2 M以下，然后加入测序级修饰胰蛋白酶（Promega），按1:50至1:20的酶与蛋白质比例于37 °C过夜酶解。所得肽段使用C18 Macrospin柱（Nest Group）脱盐，并分为两部分：一部分用于总蛋白质组分析，另一部分用于磷酸化肽富集。在磷酸化蛋白质组样品制备过程中，将肽段上样至填装有Ti⁴⁺-IMAC微球的StageTip微柱，微球预先用上样缓冲液［80%乙腈（ACN）、6%三氟乙酸（TFA）］平衡。结合后，依次使用洗涤缓冲液I（50% ACN、6% TFA、200 mM NaCl）和洗涤缓冲液II（50% ACN、0.1% TFA）洗涤，以去除非特异性结合的肽段。使用10%氢氧化铵洗脱磷酸化肽，并将洗脱液冷冻干燥。
在LC-MS/MS分析之前。
LC-MS/MS分析
脱盐后的肽段样品使用Evosep One液相色谱系统进行分析，该系统通过CaptiveSpray纳升电喷雾离子源与timsTOF Pro 2混合型捕集离子淌度四极杆飞行时间质谱仪（Bruker Daltonics）联用。肽段分离采用填充1.5 µm C18颗粒的8 cm × 150 µm色谱柱（EV1109，Evosep），使用每日60个样品的工作流程，梯度时长为21分钟。流动相分别为含0.1%甲酸的水溶液（溶剂A）和含0.1%甲酸的乙腈（ACN）溶液（溶剂B）。数据非依赖性采集（DIA）在正离子模式下进行，采用DIA-PASEF采集策略，并针对不同样品优化参数。为指导DIA-PASEF参数优化，首先对混合样品进行PASEF模式下的数据依赖性采集（DDA）。随后，使用timsControl软件（Bruker Daltonics）针对各样品类型进一步优化DIA-PASEF采集设置。对于磷酸化蛋白质组样品，DIA-PASEF参数包括433–1684 m/z的质荷比范围、0.85–1.30 1/K₀的离子淌度范围以及1.80 s的预计循环时间。对于总蛋白质组分析，质荷比范围设为370–1370 m/z，离子淌度范围保持不变，预计循环时间为1.27 s。离子淌度窗口根据相应DDA采集获得的离子云分布确定。采集完成后，总蛋白质组和磷酸化蛋白质组实验的原始数据均使用DIA-NN软件（1.8.1版）进行处理。对于总蛋白质组分析，检索参数包括最多允许1个漏切位点、最多3种可变修饰、N端甲硫氨酸切除、半胱氨酸固定氨甲酰甲基化修饰、甲硫氨酸可变氧化修饰，以及发生于……的乙酰化修饰
蛋白质N端。肽段长度限定为7–30个氨基酸，前体离子电荷数为2–4，前体离子m/z范围为300–1600，碎片离子m/z范围为100–1700。前体离子和MS1的质量精度均设为15 ppm。对于磷酸化蛋白质组学，DIA-NN的设置基本相同，但排除了甲硫氨酸氧化修饰，以避免其与磷酸化修饰重叠而造成混淆。
总蛋白质组与磷酸化蛋白质组数据分析
分别使用MSstats和MSstatsPTM R软件包对总蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据进行定量分析（Kohler等，2023b，2023a）。对于总蛋白质组分析，对前体离子层面的强度进行对数转换、归一化，并汇总为蛋白质层面的丰度，其中包括采用Tukey中位数抛光法进行汇总。针对每个蛋白质，使用线性混合效应模型进行第3天与第1天、第6天与第3天以及第6天与第1天之间的两两差异丰度检验。将校正后p值 < 0.05且|log₂（倍数变化）| > 1的蛋白质视为丰度显著差异蛋白质。对于磷酸化位点分析，使用MSstatsPTM处理DIA-NN输出的磷酸化肽段层面强度数据，并评估不同条件之间的差异磷酸化水平。将校正后p值 < 0.05且|log₂（倍数变化）| > 1的磷酸化位点视为受到显著调控的位点。
基因本体与通路富集分析
为研究神经元分化相关的功能变化，我们使用DAVID知识库v2025对丰度差异蛋白质进行基因本体（GO）富集分析（Huang等，2009；Sherman等，2022）。通过第1天与第3天、第3天与第6天以及第1天与第6天之间的两两比较，鉴定丰度发生显著变化的蛋白质
分化。在基因本体（GO）的三个类别中开展了富集分析：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。此外，采用Reactome通路分析（Ragueneau等，2026）鉴定与分化相关蛋白质动态变化有关的信号传导和代谢通路。这些分析有助于深入理解LUHMES细胞神经元分化进程所涉及的分子过程和通路。
增强子–启动子互作组分析
LUHMES细胞的染色质互作数据来源于既往发表的研究（Yoshihara等，2025），并使用R中Bioconductor软件包提供的liftOver工具，将其转换为hg38基因组坐标。所有转换后的互作坐标（包括启动子–增强子配对）均列于补充表9A。
重连指数
根据各互作在第1天（D1）、第3天（D3）和第6天（D6）存在与否，对分化过程中的启动子–增强子互作进行动态分类。参与互作的元件被划分为以下类别：
早期获得（Gained_early）：
D1不存在，D3和D6存在，
早期丢失（Lost_early）：
D1存在，D3和D6不存在，
晚期丢失（Lost_late）：
D1和D3存在，D6不存在，
晚期获得（Gained_late）：
D1和D3不存在，D6存在，
稳定（Stable）：
D1、D3和D6均存在，
其他模式（Other_pattern）：
任何其他组合。
对于每个启动子或增强子元件，列出其在各时间点的互作伙伴。对于每个启动子，列出各时间点与其互作的增强子集合，并计算相邻时间点转换阶段（D1–D3、D3–D6）的Jaccard相似度。重连指数定义为：
按动态类别进行汇总时，采用与各类别在生物学上相关的转换阶段（早期类别：D1–D3；
晚期类别：D3–D6；稳定类：两者的均值）。启动子和增强子的分类见补充表9B、C。
基序扫描与富集分析
通过TFBSTools R包从JASPAR 2024数据库（使用CORE智人子集）获取转录因子基序。使用toPWM(type = “log2probratio”, pseudocounts = 0.8)转换位置权重矩阵（PWM）。从TFBSTools元数据中提取基序名称和家族注释。对于特定时间点的分析，前景集由给定比较中动态变化的启动子或增强子组成，背景集由稳定的启动子或增强子组成。我们计算了每个元件的GC含量和长度，并将其作为富集模型中的协变量，以控制序列组成和长度的影响。针对每个基序，通过拟合比较前景集（y=1）与背景集（y=0）的二项广义线性模型（GLM）来估计基序富集：
提取系数β₁及其标准误（fit_one），得到每个基序的优势比（OR）、Wald检验p值以及经Benjamini–Hochberg方法校正的假发现率（FDR，padj）。当coef > 0且padj < 1×10⁻³时，认为该基序富集。补充表9D、E分别列出了动态增强子和动态启动子中所有富集的转录因子。
上游和中继转录因子与公共GWAS靶基因的重叠
为评估在增强子介导的调控层级中处于不同位置的转录因子与人类遗传关联的联系是否存在差异，我们比较了上游转录因子和中继转录因子与公共GWAS优先确定的靶基因的重叠情况。转录因子的层级角色取自已注释的转录因子层级网络，其中根据转录因子基因在增强子介导的转录因子–靶基因网络中的调控位置，将其分为上游转录因子或中继转录因子（图6C）。该分析在
在转录因子（TF）基因本身的层面，而非其下游靶基因的层面进行分析，以避免上游 TF 与中继 TF 所调控基因之间的大量重叠所造成的混杂影响。公共 GWAS 基因关联数据取自 Open Targets Platform 的靶标–疾病关联，并仅限于 gwas_credible_sets 数据源。对于层级结构中的每个 TF 基因，检索其 Open Targets 关联，并通过筛选保留涵盖广泛神经和脑相关性状的关联。性状筛选依据疾病/性状标签是否包含与脑生物学、认知、神经发育、神经系统疾病、神经退行性疾病、精神疾病及部分脑相关疾病有关的术语，包括精神分裂症、孤独症谱系障碍、注意缺陷多动障碍、双相障碍、抑郁障碍、癫痫/癫痫发作表型、帕金森病、阿尔茨海默病和痴呆。排除可能涵盖非神经性脑部病变的宽泛标签，包括脑癌/脑肿瘤、脑动脉瘤、脑受压和颅内出血。若某个 TF 基因在性状筛选后至少具有一项保留的 Open Targets GWAS 可信集关联，则将其视为公共 GWAS 数据中的神经/脑相关靶基因。随后比较中继 TF 与上游 TF 中具有 GWAS 关联的 TF 基因比例。基于 TF 的层级角色以及是否存在保留的 GWAS 靶基因关联构建 2 × 2 列联表，并采用双侧 Fisher 精确检验评估富集情况。报告中继 TF 相对于上游 TF 的优势比及 Fisher 精确检验的 p 值。作为背景比较，还使用所有 Open Targets GWAS 可信集关联进行了相同分析，不进行神经/脑相关性状筛选。
siRNA 转染
转染操作采用
按照制造商说明，使用 Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific，13778075）进行转染（Coschiera 等，2024）。简而言之，将 LUHMES 细胞以每孔 5×10⁴ 个细胞的密度接种于 12 孔板中。次日，使用阴性对照 siRNA 或靶基因特异性 siRNA（补充表 8）转染细胞。所有 siRNA 的终浓度均为 50 nM，细胞与 siRNA–脂质复合物共孵育 24 小时后，将培养基更换为分化培养基。在 37°C 下培养 72 小时后，通过 qRT-PCR 评估转染效率。
RNA 提取与 qRT-PCR
按照制造商方案，使用 RNA 提取试剂盒（Qiagen，74104）提取总 RNA。使用 Nanodrop ND-100（Thermo Fisher Scientific）评估 RNA 纯度。使用 7500 Fast 实时 PCR 平台和 FastStart Universal SYBR Green Master Mix（Roche，4913850001）进行 qRT-PCR。采用 2⁻ΔΔCt 法计算相对 mRNA 水平，并使用 GAPDH 作为管家基因进行归一化（Coschiera 等，2024）。
数据可用性
本研究分析的所有样本（总蛋白质组和磷酸化蛋白质组）的原始质谱文件名均列于补充表 10。所有原始质谱数据均已存储于 MassIVE 数据库（https://massive.ucsd.edu），登录号为 MSV000102026。
作者贡献
D.M.P. 和 X.L. 开展了蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学实验。H.L. 和 A.C. 完成了所有 LUHMES 细胞培养、免疫细胞化学、显微观察及成像工作。H.L. 开展了 siRNA 基因敲低实验。Y.J. 参与了生物信息学分析和图表制作。增强子数据由 M.Y. 获取。
及 J.K.。P.Sa. 整合了增强子–启动子相互作用数据及其余模态的数据，并进行了分析和解读。D.M.P. 分析了数据、制作了图表、整合了不同数据集，并在全体作者的意见支持下撰写了稿件。本项目的构想源于 M.V.、J.K.、P.Sa.、P.Sw. 和 M.Y. 各研究团队之间的紧密合作，他们还共同指导了本研究，并为各自的实验室筹措了经费。所有作者均审阅并批准了最终稿件。
利益冲突
作者声明不存在利益冲突。
补充图
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补充图 1.
全局蛋白质组和磷酸化蛋白质组样本聚类。
(A)
对第 1 天、第 3 天和第 6 天采集的分化中 LUHMES 神经元的总蛋白质组谱进行主成分分析（PCA）。
(B)
对第 1 天、第 3 天和第 6 天采集的上述 LUHMES 神经元的磷酸化蛋白质组谱进行主成分分析（PCA）。
(C)
热图展示第 1 天、第 3 天和第 6 天各生物学重复样本中总蛋白质组丰度的层次聚类。
(D)
热图展示第 1 天、第 3 天和第 6 天各生物学重复样本中磷酸化蛋白质组丰度的层次聚类。
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补充图 2.
LUHMES 分化过程中上调的神经元相关蛋白和未注释蛋白。
(A)
点图展示第 6 天相较于第 1 天上调幅度最大的 40 种蛋白，这些蛋白根据基因本体和通路数据库具有已知的神经元相关注释。蛋白按 log₂ 倍数变化（横轴）绘制，点的大小表示 −log₁₀（校正后 p 值）。
(B)
点图展示第 6 天相较于第 1 天上调幅度最大的 40 种此前无神经元相关注释的蛋白。各点按蛋白类别着色
（转录因子、激酶或其他），点的大小表示 −log₁₀（校正后 p 值）。
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补充图 3.
LUHMES 分化过程中蛋白质表达轨迹的扩展聚类分析。
折线图展示了第 1 天、第 3 天和第 6 天的蛋白质丰度谱，并根据其时间表达模式分为九个簇：持续升高（1）、持续降低（2）、第 3 天达到峰值（3）、第 3 天达到谷值（4）、晚期升高（5）、晚期降低（6）、早期升高（7）、早期降低（8）和稳定表达（9）。每条细线代表一种蛋白质。彩色粗线表示转录因子（TF），黑色粗线表示该簇的平均表达谱。每个面板均标注了归入相应簇的转录因子数量和蛋白质总数。
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补充图 4.
基于 LUHMES 磷酸化蛋白质组学推断激酶活性（第 6 天与第 1 天比较）。
（A）
激酶活性棒棒糖图。展示第 6 天与第 1 天磷酸化蛋白质组比较中，所有检出底物数 ≥5 的 58 种激酶的 KSEA z 分数。每个点代表一种激酶；水平位置表示 z 分数（正值表示相对于整体磷酸化蛋白质组背景推断为活化，负值表示推断为受抑制）。达到显著性阈值（|z| ≥ 1.5 或 p < 0.05，双尾检验）的激酶予以突出显示。点的颜色表示推断的活性变化方向（红色表示活化，蓝色表示受抑制）。
（B）
激酶–转录因子底物热图。展示由 11 种具有显著活性变化的激酶磷酸化的 67 种转录因子（TF）底物的 log₂ 倍数变化（第 6 天相对于第 1 天）。行代表各转录因子底物；列代表按 z 分数排序的激酶（从左至右由受抑制程度最高排列至活化程度最高）。色标：
红色表示磷酸化水平升高，蓝色表示磷酸化水平降低。星号（*）表示符合显著性标准的磷酸化位点（|log2FC| ≥ 1 且校正后 p < 0.05）。
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补充图5。
LUHMES神经元分化过程中主要蛋白质类别的整体动态变化及转录因子的磷酸化状态。
(A)
堆叠柱状图显示，在所示两两比较（第3天与第1天、第6天与第3天以及第6天与第1天）中，主要蛋白质类别内显著上调和下调的蛋白质数量，包括激酶、磷酸酶、转录因子（TF）、小GTP酶和G蛋白偶联受体（GPCR）。
(B)
柱状图显示，在各组比较（第3天与第1天、第6天与第3天以及第6天与第1天）中，显著上调和下调的转录因子所属家族的分布。
(C)
点图显示，第6天相较于第1天在蛋白质水平上显著上调的转录因子。每个点代表一个转录因子，其横坐标为该蛋白质的log₂倍数变化。点的大小表示每个转录因子检测到的磷酸化位点数量，点的颜色表示磷酸化状态（磷酸化水平显著升高、检测到磷酸化但变化不显著，或无磷酸化蛋白质组学数据）。
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补充图6。
LUHMES神经元分化过程中酶/修饰酶类别的调控。
(A)
第6天相较于第1天酶/修饰酶类别的净调控情况。柱状图显示各类别中显著上调（橙色）和下调（紫色）的蛋白质数量（校正后 p ≤ 0.05，|log2FC| ≥ 1.0）。数字表示净调控方向得分和显著变化蛋白质总数（n）。激酶和磷酸酶均呈净上调（各为+14），而甲基转移酶表现出最强的净
下调（−11）。
(B)
第6天与第1天酶/修饰蛋白的火山图。彩色点表示按类别分类的酶/修饰蛋白；灰色点表示其他蛋白。虚线表示 |log2FC| = 1.0 和校正后 p 值 = 0.05。基因标签标示校正后 p 值 ≤ 0.001 且 |log2FC| ≥ 1.0 的蛋白。倍数变化表示 LUHMES 多巴胺能神经元分化第6天相对于第1天的变化。
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补充图7。
LUHMES 神经元分化过程中增强子–启动子相互作用的动态变化及特定天数的增强子介导的转录因子子网络。(A)
根据启动子和增强子在第1天（D1）、第3天（D3）和第6天（D6）是否存在染色质相互作用，对其进行分组。如示意图所示，相互作用模式分为早期丧失、早期获得、晚期丧失、晚期获得、稳定及其他模式。条形图显示各类别中启动子和增强子的数量及百分比，表明增强子的相互作用变化更具动态性，而启动子的相互作用则更常保持稳定。
(B)
根据 D1、D3 和 D6 时动态相互作用的增强子推断的特定天数转录因子子网络。节点表示具有特定天数组学证据支持的转录因子（TF），边表示转录因子之间由增强子介导的调控连接。节点颜色表示提供支持的组学类型，包括差异表达、蛋白丰度、磷酸化或其组合，节点大小则反映其在各子网络中的连接度。图中标注了部分高连接度转录因子。
致谢
D.M.P. 获得了 iCANPOD 博士后项目的部分资助，Y.J. 为 iCANDOC 博士生，两者均由 iCANDOC 精准肿瘤医学博士教育试点项目资助。本研究……
本研究获芬兰科学院（项目编号：288475和294173；M.V.）、西格丽德·尤塞柳斯基金会（M.V.、J.K.）、芬兰癌症基金会（M.V.）、芬兰生物中心（M.V.）、赫尔辛基生命科学研究所（HiLIFE；M.V.）、瑞典研究理事会（P.Sw.、J.K.、P.Sa.）、卡尔·特吕格基金会（P.Sa.）、瑞典脑基金会（P.Sw.、J.K.）、奥勒·恩奎斯特基金会（P.Sw.）、奥伦基金会（P.Sw.）、卡罗琳斯卡医学院博士生奖学金（A.C.、H.L.）及中国国家留学基金管理委员会博士生奖学金（H.L.）资助。我们还感谢Akshara Urs在实验室工作早期阶段提供的技术协助。
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