MicroTron：用于小立碗藓单细胞研究的微流控平台|北京沫之东生物技术有限公司

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摘要

某些生物活性化合物对生物体的作用取决于其浓度及浓度梯度，例如激素和信号肽，它们决定细胞的身份、活性以及生物体的发育。目前仅有少数方法能够通过在植物上局部施用生化物质，产生空间受限的浓度峰，例如琼脂块法和显微注射法，但这些方法在精确性、通量和／或简便性方面存在不足。我们开发了MicroTron，这是一种基于微流控技术的方法，专门适用于丝状生物或生物生命周期中的丝状阶段，例如小立碗藓（Physcomitrium patens）的原丝体，可作为向单个细胞施用化学物质并研究细胞响应的平台。我们展示了如何使用染料和激素，从细胞侧面或顶端施用化学物质，靶向细胞壁、细胞膜、细胞质基质和细胞核。该方法可对单条丝状体进行处理，并在最佳条件下达到单细胞水平的精度。该方法可用于以高时空分辨率研究活细胞对化学物质的响应。

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摘要

一些生物活性化合物对生物体的作用取决于其浓度及浓度梯度，激素和信号肽便是如此；它们决定细胞的身份与活性，以及生物体的发育。

目前有少数方法可通过在植物上局部施用生化物质，产生空间局限的浓度峰值，例如琼脂块法和显微注射法，但这些方法在精确度、通量和/或简便性方面存在不足。

我们开发了 MicroTron，这是一种基于微流控技术的方法，专为丝状生物或其特定生命周期阶段设计，例如苔藓植物 *Physcomitrium patens* 的原丝体。该方法可作为在单个细胞上施用化学物质并研究细胞响应的平台。

我们展示了如何借助染料和激素对细胞进行化学物质处理，既可从侧面施用，也可从顶端施用，作用靶点包括细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核。

在理想条件下，处理可施用于单条丝状体，并能精确到单个细胞。

该方法可用于以较高的时空分辨率研究细胞对化学物质的实时响应。

引言

细胞在三维空间中的组织构成植物器官，这一过程需要对细胞分裂的启动及其取向进行精细调控。这种调控依赖于细胞对内源和外源空间信息的感知（Smith, 2001；Damme 等，2007）。外源信息包括机械和化学信号，这些信号可来自环境或邻近细胞（de Keijzer 等，2021）。以外源方式向细胞提供这些信号，并实现较高的空间和时间精度，有助于研究化学……

信号及其向细胞内的转导。这一认识有望加深我们对植物细胞分裂调控机制及其他过程精细调节的理解，正如动物细胞研究所展示的那样（Chen et al., 2020；Horowitz et al., 2020；Holler et al., 2024）。然而，将动物研究方法应用于植物细胞生物学绝非易事。专用于植物系统、具有细胞级精度的工具之所以匮乏，可能源于以下两点：（1）模式植物器官体积较大；（2）植物细胞壁具有较高的刚性，以承受细胞内较高的渗透压。这两个特征使得在天然细胞环境中与单个细胞进行交互并对其实施靶向操作面临挑战。因此，我们着手开发向单个植物细胞递送生化物质的新方法，以克服上述局限，为高精度生化物质施用提供新途径。

对于某一特定生化物质，局部处理与大范围处理可能产生不同的结果。例如，局部和大范围施用生长素会诱导不同的生长模式（Michniewicz et al., 2007）。一般而言，处理的局部性是指将处理的施用范围限制在整体的一部分。在器官层面，局部性可理解为将化学物质递送至器官特定亚区域内的一组细胞；在细胞层面，局部性则指将化学物质递送至细胞的特定一侧。鉴于生物活性化学物质（如激素、肽等）会影响其所能到达的所有细胞，并引发相应效应，例如激活或抑制基因表达等细胞过程，因此施用方法的局部性对处理结果至关重要（Morejohn et al., 1987；Etchells & Turner, 2010；Mähönen et

等，2014）。所施加生化物质的扩散速率和运输机制也会影响处理结果，不过这些因素本身也受到生物学过程的影响。处理的局部性与化合物动态特性的结合可形成所需的浓度梯度；CLE-41 肽和 pH 的相关研究表明，这些梯度在发育过程中发挥着重要作用（Scott & Allen, 1999；Etchells & Turner, 2010）。营养物质局部浓度峰值的存在也可诱导新器官形成（Remans 等，2006）。然而，某些梯度会因快速运输而仅短暂存在，例如生长素梯度（Etchells & Turner, 2010）。

局部施用化学物质并调节完整植物细胞微环境的一些策略早已存在，但仍未得到充分探索。以往曾利用琼脂糖块或阿拉伯胶贴片，在多个细胞的尺度上实施局部处理（Ketelaar, 2002；Remans 等，2006；Michniewicz 等，2007）。借助显微注射平台，研究人员已实现向单个根毛细胞内部及其表面施用生化物质（Ketelaar 等，2002；Ketelaar, 2002；Wang 等，2015；Baskaran 等，2016）。尽管该技术要求较高的操作技能和时间投入，且通量有限，但这些富有启发性的研究仍受益于其精确性。此外，刺穿细胞膜和细胞壁会导致细胞活动停滞，从而限制此类试验的应用潜力（Hajduk 等，2023）。这些方法大多无法同时提供具有重要价值的高精度研究所需的空间和时间控制。在此背景下，微流控技术凭借其设计的灵活性、高

可重复性、低成本、多路复用，以及细胞存活率的提高，从而支持处理后的长期成像（Horowitz et al., 2020）。拟南芥（Arabidopsis thaliana）根是最早被报道引入微流控装置，并在横向和纵向上接受监测与处理的植物器官（Meier et al., 2010；Grossmann et al., 2011；Stanley et al., 2018）。尽管根的尺寸为毫米级，相对于常规微流控装置而言较大，但利用聚焦流进行的横向激素处理仍可有效局限于宽度低至10 µm的区域内，且能够快速中断或更换（Meier et al., 2010）。另一方面，纵向流处理可对根的两侧分别施加不对称处理，为研究根对不对称生物和非生物信号的局部响应提供了宝贵数据，且这些信号可在不到1分钟内完成切换（Stanley et al., 2018；Allan et al., 2023, 2024）。花粉管是首个在微流控装置中培养的细胞尺度植物系统，并被用于定量研究朝向胚珠的向化性生长（Horade et al., 2013；Yanagisawa & Higashiyama, 2018）。

小立碗藓（Physcomitrium patens）在其生活史早期以类似花粉管的丝状方式生长，并因其简单的形态结构而在植物发育生物学领域受到日益广泛的关注（Rensing et al., 2020；Floriach-Clark et al., 2021）。孢子萌发后，小立碗藓以单细胞宽的丝状体（即原丝体）形式生长，宽度约为20 µm（Floriach-Clark et al., 2021）。这些原丝体细胞及后期组织已在大腔室微流控装置中成功实现培养、监测和表型分析，并通过共聚焦成像成功评估了常规生化处理的应用效果（

Bascom 等，2016）。类全内反射荧光（TIRF）显微成像已被证实适用于微流控装置中受到轻微压缩的原丝体，并可结合生化处理，在预定处理时间结束后将处理试剂洗脱（Kozgunova & Goshima，2019）。苔藓微流控研究的这些成功为提高处理的空间分辨率铺平了道路，是实现生化信号非对称递送和开展细胞间运输研究的重要一步（de Keijzer 等，2021）。小立碗藓（P. patens）原丝体能够在受到显著空间限制的条件下生长，而微管生长速度不受影响，甚至能够适应性地在宽度小于其天然细胞直径的通道内生长（Yanagisawa 等，2017；Kozgunova & Goshima，2019）。这一能力对于依靠通道布局实现功能的微流控平台具有重要价值。

在本研究中，我们利用苔藓的丝状生长特性，构建了一套局部化学递送系统，用于向处于原有细胞环境中的单个植物细胞递送化学或生化物质。该系统将微流控装置的优势与植物模式系统小立碗藓便于操控的生长方式及其细胞特征相结合。我们展示了该系统如何以细胞尺度的局部性实现高精度生化物质递送，并在处理前后进行监测，监测时长至少可达36小时。我们利用共聚焦显微镜观察了多种局部施用的染料，为向细胞壁、细胞膜和细胞质基质递送物质提供了可视化的概念验证。此外，我们还展示了局部生长素处理引发的生物学响应，以一个具有生物学意义的实例证实了该系统监测活体响应的能力。

结果

我们提出的局部施用方法采用了一种面向生物体设计的微流控装置

其具有丝状发育阶段。小立碗藓（Physcomitrium patens）从孢子萌发后，或从匀浆化的藓落组织再生时（图1A），以原丝体的形式生长（图1B）。原丝体是一种通过顶端生长并形成分枝的丝状体，最终形成相互缠结的毡状结构，并产生较大的茎叶体（图1A、1B）。原丝体分为两种类型：绿丝体和轴丝体。前者的细胞平均长100 µm、宽20 µm，含有大量叶绿体，分裂面垂直于细胞长轴，分枝频繁，生长速率较慢，约为每天2个细胞或200 µm，其功能是建立藓落并提供早期光合能力。相比之下，轴丝体是在氮耗竭条件下由绿丝体衍生的探索性丝状体，其叶绿体较少，细胞更细、更长（宽度可低至10 µm，长度可超过150 µm）；随着营养饥饿时间延长，细胞变异性增大，细胞表型也更为极端。轴丝体细胞的分裂面倾斜，通常不形成分枝，且生长速率显著更快。最终，轴丝体可能成熟为富含叶绿体的表型，或通过分枝重新转变为（次生）绿丝体细胞。我们选择藓类绿丝体作为处于早期发育阶段且细胞变异性较低的模型系统，以测试利用微流控装置向单个植物细胞递送（生物）化学物质的方法。因此，我们针对其细胞特征优化了装置的设计要素。

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图1.

侧向流微流控系统用于小立碗藓（Physcomitrium patens）绿丝体的原理及使用流程图示。

（A）藓落，显示向外生长的毡状原丝体。（B）绿丝体和轴丝体的细胞类型及细胞数量示意图（1

= 顶端或尖端，2 = 亚顶端，3 = 次亚顶端，依此类推）。（C）简便的芯片接种流程：将苔藓在液体培养基中匀浆，并用移液器将其注入通道出口。（D）微流控装置及绿丝体组织在腔室和生长通道中定殖方式的示意图（黑色箭头 = 顶端生长方向）。（E）侧向流通道与生长通道交汇处的局部放大示意图，暴露窗口连接两条通道，仅使单个细胞暴露。（F）通过侧向流对单个细胞实施局部处理的概念示意图。

所提出的微流控装置设计允许绿丝体从组织入口生长进入八条平行的生长通道（GC），这些通道足够狭窄，仅能容纳一条丝状体（图1D，灰色）。内侧六条GC沿全长彼此隔离，外侧两条GC则分别与两条侧向流通道（LF，图1D，黄色）相切交汇，生化溶液可经由LF通道输送。该交汇处由一个V形接头构成，通过一个小开口或暴露窗口（EW）连通，使生长中的原丝体细胞表面可接触处理溶液（图1E）。这一设计使每个实验单元包含2条用于处理的GC和6条用作对照的GC（图1D）。EW（LF与GC的连接处）的尺寸以及GC的宽度和高度均经过专门选择，使细胞能够凭借其天然膨压封闭EW。由此形成的LF通道隔离状态使处理溶液能够流向出口，并单独处理位于EW处的细胞（图1F）。将EW设计得小于细胞长度，理论上可将受处理表面的总范围缩小至亚细胞尺度，从而提高空间精度或处理的局部性。

高

苔藓的再生能力使其组织能够被匀浆处理，并直接接种至预先充满液体培养基的微流控装置的苔藓入口中（图1C、2A），如先前报道所述（Bascom 等，2016；Yoshida & Kozgunova，2023）。在标准培养条件下培养48小时后，苔藓将启动新的细胞分裂，原丝体将逐渐占据各通道，包括EW测试区（图2E–2H）。无需更换培养基，仅需维持饱和湿度环境以防止干燥（图2B–D、2K，补充图1）。

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图2.

小立碗藓（P. patens）在本研究设计的微流控装置中的生长与表现。

（A）t = 0时接种的芯片，入口处可见绿色的匀浆绿丝体。（B）匀浆处理48小时后再生绿丝体的生长情况。丝状体开始占据通道前腔室的空间。（C）生长通道内的定殖情况。（D）接种后10天的装置外观。（D–H）绿丝体在平行生长通道（GC）中生长的时间序列图像。黑色箭头表示细胞分裂。（I）芯片接种后苔藓到达EW所需时间的频率分布图（n=152）。（J）进入通道前（n=532）和进入通道后（n=465）芯片内细胞的长度分布。（K）进入通道前（n=58）和进入通道后（n=12）的生长速率。比例尺 = 50 µm。

绿丝体进入通道所需的时间取决于芯片接种时匀浆细胞的落点。生长始于通道前方的开放腔室内（图2B）。苔藓向各个方向生长，未表现出明显的方向偏好。接种后9±3天内，外侧LF-GC中70%的绿丝体亚顶端细胞到达EW；接种后20天，这一比例升至90%（图2I）。其余10%的EW在空间上

由于装置的高度（19.2 µm，补充图2，补充表1）仅能容纳单层绿丝体细胞，因此会因其他丝状体的遮挡而无法接近。

在生长通道前方的腔室内，绿丝体细胞的特征（如细胞长度）基本不受影响。既往文献报道，8.5 µm的腔室高度不会影响微管聚合速率，而本装置的高度远高于该值（图2J，补充图2，补充表1；Kozgunova & Goshima, 2019；Floriach-Clark et al., 2021）。然而，生长通道（GC）在高度和宽度上均存在轻度限制，可能影响其内部的生长，并可能引起形变、应力或生长缺陷。例如，我们观察到生长通道内的分枝持续受到抑制（图2E–H）。事实上，我们的测量结果表明，通道内外细胞的长度非常接近，通道外（95 ± 11 µm，n = 532）与通道内（98 ± 9 µm，n = 465）的细胞长度仅存在微小但显著的差异（Welch双样本t检验，p = 2 × 10⁻⁷；图2J）。生长速率分析进一步证实，细胞在受限条件下仍保持良好活力并持续活跃生长，其生长速率与既往报道的绿丝体（5.4–7.2 µm h⁻¹）和轴丝体（16–20 µm h⁻¹）处于同一数量级（Bascom et al., 2016；Rawat et al., 2017；Bibeau et al., 2021）。具体而言，通道外（2.8 ± 0.8 µm h⁻¹，n = 58）和通道内（12.8 ± 3.3 µm h⁻¹，n = 13）的细胞均表现出持续生长（图2K）。本研究并未旨在系统量化多种条件下的生长速率差异。我们认为，通道中的约束程度在生物学上不会损害主丝的正常发育

丝状细胞，正如我们的设计所预期的那样。

当细胞沿外侧GC生长时，我们观察到，EW处生长约束的解除促进了分枝的发生，其中47%的细胞发生分枝（n=34，图3A），24%的细胞未发生分枝（n=17，图3B），约四分之一的情况下，丝状体转入LF通道或通道保持空置（n=21；图3C）。这种变异提供了两种可施加处理的细胞状态：分枝细胞（顶端处理）和未分枝细胞（侧部处理）。这些处理位置在生物学上存在差异：顶端生长的分枝细胞的细胞壁正在发育，细胞膜也正在形成，因此其细胞壁和细胞膜的组成有所不同（Bibeau等，2021）。此外，这些细胞的内吞和胞吐途径高度活跃，代谢速率较高。相比之下，未分枝细胞的代谢活性较低，且具有发育完全的细胞壁（补充图4）。因此，我们将顶端施加处理和侧部施加处理视为在生物学上不同的情形，可分别作为独特的测试条件。

为检验该装置的精确性，我们首先测试了细胞壁染料荧光增白剂Calcofluor White（CFW）的施加效果，该染料可与结晶纤维素微纤丝结合（Bidhendi等，2020）。如图3E、F所示，无论是顶端处理还是侧部处理，施加范围均主要局限于EW内，但侧部处理偶尔会超出该范围（图3D）。处理的局部作用范围从0（单细胞）到±1、±2或±3个细胞（多细胞）不等，且在所有情况下均仅对EW邻近的细胞染色。结果的变异可能源于装置特性和生物学因素。我们的测量表明，装置的通道尺寸接近设计值，且十分规整，其宽度为

为16.5±0.2 µm，高度为19.0±0.2 µm。我们还评估了横截面轮廓，发现侧壁弯曲，且在与玻璃底面接触处宽度增大（补充图2，补充表1）。底部这些较宽的角隅可能解释了CFW偶尔会通过通道角隅扩散逸出的现象；由于黏附程度不同，这种现象可能存在批次间差异，并使原丝体无法完全封堵EW。在顶端施用CFW的结果表明，处理的局部性可达到单细胞水平，这可能得益于细胞长入处理通道后产生的额外封堵作用（图3E）。

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图3.

可在顶端和侧面位置对绿丝体的单个细胞进行染色。

（A）位于GC中并分枝进入LF通道的绿丝体。（B）位于GC中但未分枝进入LF通道的绿丝体。粉色箭头表示主要暴露位点。（C）分枝概率汇总（n=72）。（D）所施处理的局部性，其中0表示单细胞处理，±n表示除EW处细胞外受到处理的细胞数，“esc”表示顶端施用（n=11）和侧面施用（n=7）时发生逸出。（E–L）使用多种染料进行局部处理的细胞及其状态的共聚焦图像。比例尺=50 µm。（E–F）在顶端（E）和侧面（F）施用钙荧光白（Calcofluor White，CFW）对绿丝体细胞壁进行染色。（G–H）在顶端（G）和侧面（H）施用FM4-64对绿丝体细胞膜进行染色。（I–J）在顶端（G）和侧面（H）施用荧光素二乙酸酯（Fluorescein Diacetate，FDA）对绿丝体细胞质进行染色。（K）CFW局部染色的时间序列图像，显示处理物质的扩散。（L）FM4-64顶端局部染色的时间序列图像，显示染料内化进入内体系统。

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图4.

向生长素感应型R2D2报告株系施用具有生物活性的激素生长素，诱导局部和整体

生物学响应。

(A) t = 0 时，暴露处理的丝状体的 PMT 通道与所有荧光通道的合并图像。(B) 不含 PMT 通道的合并图像。(C) nVenus 通道图像，其中标示了用于后续生成时空图的路径轨迹。(D) nTdTomato 通道的时空图，显示信号在随后 30 分钟内逐渐减弱。生长素响应发生得越早，信号衰减时间越短。(E) 作为对照的 nVenus 通道时空图，显示细胞核信号未发生衰减。(F) nTdTomato 与 nVenus 通道的合并图像。

利用膜染料 FM4-64 和细胞质活力染料 FDA 进一步证实了处理的局部性。在顶端施用时，暴露的细胞膜和细胞质分别被立即局部染色，达到单细胞分辨率（图 3G、3I）。对于 FDA，经细胞间酯酶水解后，信号逐渐积累。我们在顶端施用区域检测到信号随时间积累，而在该区域之外仅检测到强度极低的信号。对于 FM4-64 和 FDA 的侧向施用，我们观察到受处理细胞的信号强度较低，需要更高的浓度才能获得较高的信号强度（图 3H、3J）。重复该处理时，部分细胞未出现预期的染色。因此，我们通过整体施用染料，检查所有细胞是否具有一致的响应，并证实情况并非如此，尤其是 FM4-64 和 FDA，其染色效果在不同细胞之间可能存在显著差异（补充图 4）。图 3D 展示了使用该微流控—藓类系统进行处理时，处理局部性的频率分布。大多数事件发生在直接暴露的细胞及其周围细胞中。

对局部施用进行时间追踪表明，如果将染料或处理试剂留在 LF 通道中，染料扩散也会发挥作用。在图 3K 中，侧向施用的 CFW 信号在随后一小时内向外扩展，

而图3L展示了FM4-64在随后30分钟内被内化至内膜系统的过程，表明了这一过程的动态变化，以及细胞在观察和处理期间保持活力。综上，这些结果证明，可以在局部实施精确至单细胞的（生物）化学处理，并进行持续监测，以评估高度局部化处理的效果。

捕捉细胞对激素等局部施用的生物活性化学物质的响应尤为重要。然而，细胞作出反应并产生可检测信号变化所需的时间，使激素处理有别于染料的局部施用。因此，我们测试了生长素吲哚-3-乙酸（IAA）的局部施用。IAA是一种参与多种发育过程并维持植物特定细胞身份的激素。在细胞核中，Aux/IAA蛋白通过其DII结构域感知IAA；在缺乏IAA时，Aux/IAA蛋白与ARF蛋白形成基因表达抑制复合物。当IAA存在时，Aux/IAA的降解使该复合物迅速解离，ARF随即在数分钟内激活关键基因的转录。R2D2报告系统最初针对拟南芥（A. thaliana）构建，利用这一机制快速、定量地检测生长素的存在（Liao等，2015）。在小立碗藓（P. patens）中，该系统由两个在相同启动子驱动下表达的荧光报告蛋白（nVenus和nTdTomato）组成，二者分别携带不同版本的DII结构域：一种对IAA敏感（野生型，DII），另一种对IAA不敏感（突变型，mDII）。由于使用相同的启动子和基因组区域，两种蛋白的表达水平相同，但IAA敏感型融合蛋白nTdTomato-DII的最终丰度受IAA水平调控，而nVenus-mDII则不受影响（Brunoud

等，2012）。当 IAA 浓度升高时，nTdTomato-DII 会立即被标记以进行降解，施用 IAA 后 30 分钟内，nTdTomato/nVenus 比值便会下降（Thelander 等，2019）。

我们发现，从侧面施用 IAA 可诱导 nTdTomato 信号减弱，在激素施用后 30 分钟即可检测到（图 4D–4F），而 nVenus 信号则维持在较高且恒定的水平（图 4E）。我们对处理过程进行了长达 90 分钟的时间监测，观察到局部施用 IAA 会使直接暴露于 IAA 的细胞中的 nTdTomato 信号迅速下降，并在半小时内完全消失。有趣的是，图 4D 中的时空图显示，这一现象也发生在直接暴露细胞之外的细胞中。两个方向上的相邻细胞均表现出 nTdTomato 信号下降，但其信号降至不可检测水平的时间晚于直接接受处理的细胞。这表明，可以对不依赖于单个细胞的动态过程进行时间追踪，并将其与已知的 IAA 胞间运输过程相对应。位于平行生长通道（GC）内、与受处理细胞直接相连的绿丝体分枝也对 IAA 处理产生了响应，提示存在运输过程；而在同一微流控装置内其他生长通道中，距离较远的对照原丝体在相同时间内未表现出 TdTomato 信号下降。然而，处理后 24 小时，通道内所有细胞均对 IAA 产生了响应。

讨论

我们针对 P. patens 的丝状生长方式和细胞形态可塑性，对微流控装置的特征进行了适配。经匀浆处理并接种至芯片两天后，绿丝体正常再生，并在生长通道中定殖。由于细胞在形成性分裂后不再伸长，每个绿丝体细胞所处的位置是固定的，并且

因此，丝状体的位置不会随时间发生变化。这一特性对于与所提出的装置概念相兼容至关重要。我们的设计布局和尺寸允许每个实验单元设置两个技术重复，而一块尺寸为24 × 60 mm、与标准显微镜载玻片相近的大盖玻片可容纳三个这样的实验单元，用于生物学重复。此外，该方法无需使用泵和控制系统等先进设备（尽管也可使用），而更复杂的聚焦流方法则需要此类设备，因此，任何缺乏微流控经验或完全没有相关经验的细胞生物学实验室都更容易采用和利用这一方法。

进入通道后，侧向分枝受到抑制，但在空间约束解除后，新生细胞恢复了分枝，表明分枝抑制仅限于受到约束的细胞。偶尔可观察到苔藓细胞使PDMS通道壁向外弯曲，这暗示细胞填满了通道内所有可用空间，同时通道结构具有一定的柔性以容纳细胞，也表明空间限制的影响较为温和，细胞的力学特性足以应对。细胞长度等其他细胞参数在通道内外均表现出规律性和相似性。值得注意的是，装置内绿丝体的生长速率与此前报道的微流控装置中的生长速率相当。综上，这些数据表明，细胞能够感知轻度的空间约束，但其生长并未因此受到损害。考虑到在自然条件下，原丝体可穿过土壤或岩石中的狭窄缝隙生长，以发挥探索和定殖功能，我们认为，在本装置中受到轻度约束的生长在生理上是

其生长可塑性所促成的、适宜且自然的生长条件。因此，我们提出，与标准琼脂培养或液体培养相比，空间受限条件下的生长可能更接近自然状态，这或许可以解释该藓类为何易于在这些装置内培养。除上述参数外，在培养的前15天内，我们未检测到细胞胁迫的迹象。此后，一些绿丝体细胞偶尔会分裂为两半或死亡，这是一种胁迫相关反应，可归因于未更换培养基及由此导致的营养耗竭、代谢废物排出和自毒作用，尽管许多其他细胞仍存活并继续生长。

接种后平均9天，绿丝体已生长至超出装置暴露窗口的位置，此时可进行顶端和侧向局部施加处理。我们通过顶端和侧向局部施加处理，均实现了对细胞壁、细胞膜和细胞质的染色，并通过侧向处理实现了基于R2D2的细胞核内传感检测。在施加FM4-64、FDA和IAA后，对细胞进行了30至90分钟的动态观察，结果表明，在这些条件下细胞保持存活、具有活性并能对处理作出响应。

侧向局部施加处理在第三个细胞（即次次顶端细胞）或更老的细胞上效果最佳。从次次顶端细胞开始，仅在少数处理事件中观察到处理液经生长通道泄漏或逸出，且对更老细胞进行处理时，这种情况的发生频率更低。对主丝状体的顶端和次顶端细胞均未能实现单细胞局部处理，因为所有尝试中都发生了处理液逸出。我们观察到，较细的顶端细胞周围存在未被占据的通道空间，而次顶端细胞则较宽。当处理液经生长通道逸出时，多个细胞会暴露于处理液中，从而降低处理的局部性

处理，且主要发生在顶端一侧（因此，几乎没有流体流向较老的细胞）。

基于这些观察结果，我们推测处理液逸出可能通过两种机制发生。首先，在空间限制较强、细胞与通道紧密贴合而不太可能发生渗漏的情况下，逸出可能是使用注射器手动快速施加处理时产生的瞬时高压峰值所致。手持注射器施加处理方便快捷，但操作人员的差异以及生物碎屑可能造成的堵塞会引入变异，易于产生压力冲击。这可能使暴露的细胞或聚二甲基硅氧烷（PDMS）发生可逆形变，从而在某些情况下扩大处理范围，即使未发生逸出也是如此。在这些情况下，注射泵及类似系统可提供更低且更稳定的流速，从而实现更好的控制。其次，生物体尺寸及通道尺寸的变异可能导致生长通道未被完全填满，而细胞的圆形轮廓与通道的方形轮廓之间角落处的微小间隙可能无法阻断流动，从而为处理液逸出提供通路（补充图2）。我们的结果显示，对主丝状体的第一个和第二个细胞进行侧向处理时，处理液均发生了逸出。鉴于原丝体表现为顶端生长，而不存在扩散生长或次生细胞生长，第一个细胞可能尚未达到其最终直径，因此预期会发生逸出；而第二个细胞应已具有成熟细胞的宽度（图1B、1F；Menand等，2007）。因此，从第二个细胞（图1F）开始，通道壁和细胞壁产生的阻力应足以阻止流动，但由于阻力随长度增加而增大，较老细胞处的逸出可能更少。根据这一流动阻断机制，顶端处理（

图3A、3E、3G、3I）所示的情况应具有最少的逸出和最高的局部性（即最小的处理面积），因为进入通道的细胞最大限度地阻碍了流向GC的任何液流。这恰好涵盖了因逸出而无法在主丝状体中实施顶端处理的生物学情形。考虑到实验变异可能导致逸出，并且为了验证处理的局部性，我们建议在任何生化处理过程中同时施用染料，或在处理后序贯施用染料，以在少量重复实验中确认暴露分布。

我们注意到，侧向施用有时需要比顶端施用更高的处理浓度，才能获得较强的信号。尽管这可能部分归因于处理物被PDMS吸附（Wang等，2012），但也可能受到侧向流道内流速分布的影响。Saadat等（2024）表明，通道几何结构中夹角的尖锐程度，例如我们所用侧向通道从暴露窗口前至窗口后这一段的夹角尖锐程度，会影响流速分布，尤其是在转弯处。这可能影响到达暴露窗口处细胞的处理物量。我们提出的几何结构由于夹角较为平缓（90°），具有最有利的处理物分布；与所有其他模拟几何结构相比，其流速最大值的位置更接近暴露窗口。然而，对于单个封闭通道（不存在通向另一通道的暴露窗口），通道两侧的流速接近0。尽管我们的研究基于充分发育的绿丝体细胞会封堵暴露窗口这一假设，但通道角落处的微小间隙仍可能允许少量净流量流向暴露窗口，尤其是在较高压力下。在

在这种情况下，要利用本研究的几何结构实现我们所观察到的有效处理物递送，就需要更高的压力、更高的浓度和/或更长的扩散时间，使处理物到达暴露窗口处的细胞。此外，在静态条件下，生长通道与侧向通道之间的距离较短，扩散可使生化物质的递送量随时间增加。在顶端施加处理中，细胞直接暴露于流速最大的位置，从未观察到处理物暴露不足的情况。有趣的是，我们注意到，尤其是在使用疏水性染料 FM4-64 时，暴露的膜表面信号并不均匀：细胞直接面向流体入口的一侧较“亮”（信号强度较高），而朝向流体出口的一侧则出现处理“阴影”（信号强度较低）。我们设想，可利用这一现象在目标细胞内沿纵向实施不对称处理。

施加 IAA 后，随着时间推移，既产生了局部效应，也产生了远端效应。这可能与 PIN 蛋白介导的生长素主动运输有关，该过程在植物中已有充分描述。据报道，苔藓中的这一运输过程没有优先方向，因此，原丝体的所有细胞均应随时间推移而丧失 nTdTomato 信号。有趣的是，局部施加后，我们能够随时间追踪各细胞中的生长素水平，并观察到 nTdTomato 以不同速率降解。

总之，这些结果证实了细胞对生物学相关分子的实时响应，以及更远处细胞随时间产生的响应，凸显了该装置在研究化合物动态、长距离信号传导及细胞间运输方面的应用潜力。我们认为，这一微流控系统可提供一种工具，用于

触发相关过程；在这些过程中，这一级别的细胞分辨率有助于回答更深入的生物学问题，或检验（生物）化学物质与植物细胞之间的相互作用，并实现对细胞响应的高精度表征。

我们实现了在活体条件下，以可实施干预的单细胞分辨率研究植物细胞的发育。处理效应可实时监测数小时，并可借助适当的显微成像—培养装置持续追踪数天。处理被施加于单个细胞并对其产生即时影响，随后，生物化学物质通过细胞间运输对邻近细胞产生影响。该方法为在植物细胞生物学模型系统中精确调控外部信号提供了途径。尽管其应用仅限于小立碗藓（P. patens）等丝状生物，但精度的提高有望使我们获取以往无法获得的信息。

方法

微流控器件的设计与制作

使用 AutoCAD 2023（Autodesk，美国加利福尼亚州）设计器件，并使用 KLayout v0.25（Free Silicon Foundation）调整设计以用于曝光。按照制造商说明，使用 Laurell WS 旋涂仪在直径为 76.2 mm 的硅片（Si-Mat，德国）上涂覆一层厚度为 20 µm 的 Kayaku SU-8 25 永久性负性环氧光刻胶。使用 MicroWriter ML® 3 Pro（Durham Magneto Optics，英国）进行光刻胶曝光，曝光能量为 200 mJ/cm²，不进行全局焦点校正。曝光后烘烤步骤调整为在 65 °C 下烘烤 90 s，随后在 96 °C 下烘烤 270 s；冷却至室温并静置 120 min 后，在纯 PGMEA（Sigma-Aldrich，美国）中以 100 rpm 进行轨道振荡显影 20 min，然后用异丙醇和 MilliQ® 水清洗，并用 N₂ 彻底吹干。使用 DOW SYLGARD 184 浇铸 PDMS 芯片，并在 70 °C 下烘烤过夜。随后开孔

使用宽度为1 mm的活检打孔器（KAI，日本）。如REF所示，通过等离子体键合将芯片与60 × 24 mm的CORNING 1½号盖玻片结合。通过向通道内填充高浓度碱性荧光素溶液并进行共聚焦显微成像，验证芯片各结构的实际尺寸。采用该方法测得的芯片高度为17±1 µm，暴露窗口宽度（EW）在最宽处为12.3±0.7 µm。

装置经高压蒸汽灭菌（121°C、15 psi，20 min）后，在烘箱中干燥（130°C，3 h）。随后，在接种前进行30 min紫外线照射。

苔藓培养

基因型与繁殖

根据实验要求，使用小立碗藓（Physcomitrium patens）野生型生态型Reute（Hiss et al., 2017）和Gransden（Ashton & Cove, 1977）。报告株系R2D2由Thelander et al., 2019在Reute遗传背景下构建，而其他所有报告株系或突变株系均在Gransden遗传背景下构建。常规繁殖每周进行一次：在无菌Milli-Q®水中将组织匀浆，随后倒入铺有玻璃纸的BCDAT或BCD培养皿中，并在25°C、持续白光照射条件下培养（Nishiyama et al., 2000）。

微流控装置培养

使用将注射器与装置的三个入口相连的歧管，向微流控装置预先填充液体BCDAT培养基，以确保完全充满并排除气体。将用于繁殖的组织培养5天后收集至液体BCDAT培养基中，匀浆制成低浓度组织悬液。随后，使用1 ml微量移液器，通过中央入口向预先填充的装置中注入300 µl混匀的组织悬液，并持续推注，直至中央出口形成液滴。使用无菌吸水纸吸干多余液滴或其他润湿部位。该装置为

通过盖玻片用无菌胶带将其固定于培养皿内，并在其周围加入一滩液体 BCDAT 培养基，以保持皿内湿度饱和。培养皿用微孔透气胶带（3M，美国）密封。在 25°C、持续光照条件下培养最长 20 天，无需培养基流动，每日监测生长情况，直至苔藓原丝体到达暴露于侧向流的窗口。最长 72 h 的活体成像采用不同的培养条件：同样保持持续光照，但光谱和光照强度不同，并在所有入口和出口处添加液体 BCDAT 储液池。

显微镜观察

光学显微镜观察

每日观察使用 Nikon Diaphot 200 霍夫曼调制衬度倒置显微镜，配备 PSM-2120 光源、Nikon Digital Sight DS-Fi1-U2 相机（1920 × 1200 像素）及 NIS Elements 4.60 软件。

共聚焦显微镜观察

局部施加处理的观察采用 Leica Stellaris 5+ 倒置激光扫描共聚焦显微镜。该显微镜配备白光激光器（485–685 nm）以及波长为 405、448、488 和 561 nm 的固态激光器，可根据所测试的探针按需选择。图像采集和处理均使用 Leica Application Suite X（4.8 版）软件。持续 72 h 的活体成像使用 Andor Revolution（2013）转盘式共聚焦显微镜，该显微镜配备 TOKAI HIT 的 INU 温湿度控制模块。

化学试剂

荧光增白剂 28，又称 CalcoFluor White（“CFW”，CAS 4193-55-9），购自 Sigma Aldrich，为 25%（m/v）水溶液，使用 BCDAT 培养基稀释至 2 mg/ml。FM™□4-64（CAS 162112-35-8）以粉末形式购自 Invitrogen（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州），用 BCDAT 培养基溶解，配制成 10 µM 溶液。

二乙酸荧光素（“FDA”，CAS 596-09-8）以粉末形式购自 Sigma Aldrich，溶于丙酮配制成 5 mg/ml 储备液，随后用 BCDAT 稀释至 20 µg/ml。用于植物细胞培养的吲哚-3-乙酸（IAA，87-51-4）以粉末形式购自 Sigma Aldrich，在高 pH 条件下溶解，并用 BCDAT 配制成 1 mM 储备液。

生化物质递送

施用

处理溶液储备液用 BCDAT 稀释至相应浓度，以尽量减小渗透胁迫。施用操作采用手动方式：使用外径 1/16 英寸、内径 1/32 英寸的 PTFE 微流控管，将实验单元选定的处理入口或出口（取决于所需的施用方向）与装有处理溶液的 1 ml 注射器连接，并手动施压。在最佳条件下，处理溶液以极小阻力流向处理出口，流出时形成液滴。用纸巾吸干多余液滴，随后继续通入处理溶液，直至至少有五滴液体流出并被吸干，以充分置换 LF 通道约 100 µl 的内部容积。对于限时处理暴露，在设定的孵育时间结束后，采用相同方法通入 BCDAT。在处理溶液通入前后对装置进行成像，作为对照。在条件允许时，依次施用发射光谱不重叠的染料，未观察到信号干扰。

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数据分析

图像分析使用 ImageJ（版本 1.54g，美国国立卫生研究院）完成，数据处理、统计分析和绘图使用 RStudio IDE（版本 2025.9.1.401，Posit Software，美国波士顿）完成。

利益冲突

无利益冲突需要声明。

作者

作者贡献

Jordi Floriach-Clark

：器件设计、制作、表征及故障排查；器件使用方案的开发与实施；实验设计与执行、数据处理、论文撰写。

Viola Willemsen

：器件设计中的故障排查；器件使用方案的开发；实验设计、论文审阅。

数据可用性

可应要求提供。

补充信息

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补充图1.

微流控器件在使用过程中的外观。

使用前的器件，展示了三个实验单元的组合（左）。将匀浆组织接种至苔藓接种入口，大部分容积未被使用（中）。器件以半浸没于培养基中的方式进行培养，其上表面暴露于空气中（右）。

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补充图2.

通过对充满荧光素的器件进行共聚焦显微成像测得的实际通道截面尺寸。

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补充表1.

器件暴露窗口及相邻生长通道的实测尺寸，单位为

µm

。

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补充图3.

顶端施加染料，显示所有通道。

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补充图4.

侧向施加染料，显示所有通道。

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补充图5.

整体施加染料所呈现的变异性。荧光增白剂（Calcofluor White，左）、FM4-64（中）和二乙酸荧光素（右）。

即使经过反复混匀，整体施加染料仍表现出显著差异。比较单个细胞时，可观察到较大差异，这可能是由细胞壁、细胞膜和代谢活性的生物学变异或细胞移位所致，也解释了为何局部施加染料无法产生完全均一的

结果。高精度的处理施加更易受到生物学变异的影响。

致谢

我们感谢 Martijn van Galen 和 Joris Sprakel 就首个微流控装置的初步设计与制作进行的宝贵讨论。我们感谢 Ben Scheres 就本项目及论文进行的宝贵讨论，并感谢 Norbert de Ruijter 在显微成像技术方面提供的建议。

声明的资助方信息

TKI Agri & Food，

https://ror.org/036br4307

，LWV20.390 TU-2020-004

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