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在宽松的细胞外环境中，经典的肌动球蛋白驱动的变形虫样运动可提供迁移所需的机械能力；而在空间受限的组织中，细胞核则成为T细胞迁移的主要障碍。我们证实，动力蛋白–微管（MT）力传递轴是T细胞在受限条件下迁移及跨屏障迁移过程中实现细胞核移位的关键机制。我们提出，动力蛋白既作为分子马达，又作为锚定于丝状肌动蛋白（F-actin）的力传递元件（支点），使微管及与其耦联的细胞核沿细胞皮质滑动，从而驱动核迁移并实现有效的细胞位移。动力蛋白是核迁移的主要驱动力：抑制动力蛋白可使细胞核运动停滞，且这一效应不依赖于肌球蛋白II的活性，而F-actin动态变化与细胞核振荡在时空上始终保持解耦。在跨屏障迁移过程中，动力蛋白与肌动球蛋白协同发挥作用，且功能不可相互替代，只有同时抑制二者才能完全阻断细胞核通过。计算建模表明，动力蛋白介导的牵引力与细胞核所施加的体积排斥作用相结合，足以产生自组织的细胞核振荡。在斑马鱼朗格汉斯细胞中抑制动力蛋白会损害其原位突起动态，表明动力蛋白–微管轴是一种在进化上保守的力学生物学程序。综上，这些发现表明，动力蛋白–微管力学单元可作为工程化改造T细胞、增强其实体瘤浸润能力的潜在靶点。
1
宾夕法尼亚州立大学医学院细胞与生物系统系
，美国宾夕法尼亚州赫尔希
2
美国国立卫生研究院国立生物医学成像与生物工程研究所力学生物学研究组
，美国马里兰州贝塞斯达
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Alexander S. Zhovmer
3
美国食品药品监督管理局生物制品评价与研究中心
，美国马里兰州银泉
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Nandini Sarkar
1
宾夕法尼亚州立大学医学院细胞与生物系统系
，美国宾夕法尼亚州赫尔希
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Jorik Stoop
4
佐治亚理工学院与埃默里大学华莱士·H. 库尔特生物医学工程系
，美国佐治亚州亚特兰大
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Linjun Su
4
佐治亚理工学院与埃默里大学华莱士·H. 库尔特生物医学工程系
，美国佐治亚州亚特兰大
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Laurel Flezsar
2
美国国立卫生研究院国立生物医学成像与生物工程研究所力学生物学研究组
，美国马里兰州贝塞斯达
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Eric Peterman
5
华盛顿大学生物学系
，美国华盛顿州西雅图
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Jeffrey P. Rasmussen
5
华盛顿大学生物学系
，美国华盛顿州西雅图
6
华盛顿大学干细胞与再生医学研究所
，美国华盛顿州西雅图
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Alexander X. Cartagena-Rivera
2
美国国立卫生研究院国立生物医学成像与生物工程研究所力学生物学研究组
，美国马里兰州贝塞斯达
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Denis Tsygankov
4
佐治亚理工学院与埃默里大学 Wallace H. Coulter 生物医学工程系
，美国佐治亚州亚特兰大
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Erdem D. Tabdanov
1
宾夕法尼亚州立大学医学院细胞与生物系统系
，美国宾夕法尼亚州赫尔希
7
宾夕法尼亚州立大学医学院宾州州立癌症研究所
，美国宾夕法尼亚州赫尔希
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摘要
当超出经典的肌动蛋白–肌球蛋白驱动的阿米巴样运动在宽松细胞外环境中的力学能力时，细胞核便成为 T 细胞在……中迁移的主要障碍
限域组织。我们确立了动力蛋白–微管（MT）力传递轴是T细胞在限域迁移和跨屏障迁移过程中实现细胞核移位的关键机制。我们提出，动力蛋白既作为分子马达，也作为锚定于丝状肌动蛋白（F-actin）的力传递元件（支点），使微管及与其耦联的细胞核沿细胞皮质滑动，从而驱动细胞核运动和有效的细胞位移。动力蛋白是细胞核运动的主要驱动力：抑制动力蛋白可使细胞核运动停滞，且这一作用不依赖于肌球蛋白II活性，而F-actin动态变化与细胞核振荡在时空上仍保持解耦。在跨屏障迁移过程中，动力蛋白与肌动球蛋白系统协同发挥不可相互替代的作用，只有联合抑制二者才能完全阻断细胞核通过。计算建模表明，动力蛋白介导的牵引与细胞核产生的体积排斥共同作用，足以引发自组织的细胞核振荡。在斑马鱼朗格汉斯细胞中抑制动力蛋白，会损害其原位突起动态，表明动力蛋白–微管轴是一种进化上保守的力学生物学程序。综上，这些发现表明，动力蛋白–微管力学单元可作为工程化改造T细胞、增强其实体瘤浸润能力的潜在靶点。
引言
细胞在致密实体组织中的迁移及其伴随的细胞形态重排，是免疫监视¹–⁴、神经可塑性⁵–⁷和转移性运动⁸–¹¹的典型特征。对于穿行于狭窄组织间隙的细胞而言，致密三维组织施加的近乎连续的限域，在本质上不同于细胞外结构松散、彼此分离的纤维状障碍物（如胶原）所造成的拥挤效应
细胞外基质（ECM）和基质区域¹²–¹⁴。纤维状障碍物主要诱导细胞和去核细胞发生变形虫样迁移¹⁵–¹⁸，而连续或过度致密的限域则促进间充质样迁移行为，这种行为依赖于细胞黏附¹⁹,²⁰、协调的力生成²¹–²³，以及沿受限²⁷,²⁸、伸长和/或分支状（树突样）的细胞体树状结构²⁹–³¹进行的长距离力传递¹⁴,²³–²⁶。因此，理解细胞如何感知并适应环境约束，是理解其浸润深部组织（包括实体瘤）能力的关键。
近期研究强调，完整的微管（MT）网络是从时空层面调控并整合肌动蛋白-肌球蛋白收缩性信号的关键结构，从而使细胞能够在限域条件下实现力学协调的迁移。这种协调使细胞在不过度伸展或发生细胞体破裂的情况下实现净位移²⁷,²⁸,³²–³⁴。在因限域而变窄、伸长和过度伸展的迁移免疫细胞中，微管组织中心（MTOC）及其相关的致密微管网络有助于确定细胞的前导突起。相反，微管缺乏的细胞后部会激活GEF-H1→RhoA→非肌肉肌球蛋白II通路：局部微管的缺失使GEF-H1无法被隔离³⁵，从而促进肌动蛋白-肌球蛋白收缩，并产生牵引细胞后部的力，进而确立细胞后端²⁷。在部分受限的癌细胞中，被压缩在前移的细胞核与后部收缩性肌动蛋白-肌球蛋白皮层之间的后部微管发生机械断裂和解聚，释放GEF-H1，并进一步增强塌缩后部中依赖RhoA-肌球蛋白II的收缩性。因此，微管可能发挥一种
一种机械稳态调节器，其机械脆弱性决定了驱动细胞核移位和细胞运动的形变阈值³⁶。然而，这两种机制均强调微管（MTs）的信号传导功能，未涉及其作为细胞迁移过程中力产生与传递的直接介导者的潜在作用。
越来越多的证据支持微管及微管相关马达蛋白在迁移力的产生与传递中发挥更直接的力学作用³⁷–⁴³。例如，动力蛋白可通过动力蛋白激活蛋白复合体（dynactin，一种激活动力蛋白的辅助因子兼衔接复合体），在结构和力学层面整合到肌动蛋白细胞骨架中⁴⁴,⁴⁵。由于dynactin含有一条类似于丝状肌动蛋白（F-actin）的Arp1丝，且该丝经预激活后可成核启动F-actin聚合⁴⁶，因此它可能充当结构桥梁，将基于微管的动力蛋白所产生的力与肌动蛋白网络⁴⁵–⁴⁷、相关的整合素黏附复合体及细胞外基质（ECM）连接起来。或者，动力蛋白可通过Afadin-LGN-NuMA⁴⁸、ADAP⁴⁹、Spectrin-Dynactin⁵⁰及Annexin-A2⁵¹分子衔接复合体锚定于F-actin。因此，有研究提出，锚定于F-actin的动力蛋白能够产生推进力，在缺乏肌动球蛋白收缩力的情况下⁴⁰，或在依赖机械感知的肌动球蛋白收缩力减弱或缺失的柔顺基底上⁴¹，支持细胞运动。从结构上看，微管作为相对不可伸长的承重缆索，可在细胞内⁴⁰,⁵⁷及轴突等细胞突起中⁵⁸–⁶⁰，以极小的机械耗散长距离传递机械力，包括动力蛋白产生的力⁵²–⁵⁶。
细胞核是体积最大、刚度最高的细胞器，构成了细胞穿越狭窄组织间隙迁移时的主要结构和力学障碍²⁷,³⁶,⁶¹–⁶³。细胞
已演化出多种由肌动球蛋白驱动的策略，以在受限环境中移动细胞核，包括机械性³⁶,⁶⁴,⁶⁵或液压性¹⁷,⁶⁴,⁶⁶–⁶⁸核活塞机制，以及依赖肌动球蛋白的细胞核牵拉⁶²,⁶⁹或推挤⁶⁷,⁷⁰–⁷²机制。然而，另一种策略则依赖于微管（MT）相关的核迁移。在新皮质发育过程中，神经元前体细胞利用动力蛋白产生的牵引力，使微管和细胞核发生滑移⁶，从而使细胞核沿胶质纤维移动数十微米⁷²–⁷⁴。这一过程需要微管相关蛋白LIS1⁷⁵，该蛋白可促进动力蛋白复合物的组装⁷⁶–⁷⁸，并将微管锚定于丝状肌动蛋白（F-actin）皮层⁷⁹。类似地，在骨骼肌成肌细胞融合形成肌管的过程中，动力蛋白/动力蛋白激活蛋白马达复合物与细胞极性调控因子协同作用，使细胞核沿合胞体内的微管重新定位⁸⁰。综上，这些观察结果表明，细胞核与微管细胞骨架之间广泛的机械耦联能够支持细胞核的长距离转位，提示类似机制可能有助于免疫细胞和癌细胞在受限环境中迁移时的细胞核推进。
总之，细胞毒性淋巴细胞向实体瘤内的低效迁移仍是抗肿瘤免疫的主要障碍⁸¹–⁸⁵，其原因包括：（1）肿瘤与基质交界处致密的胶原⁸¹,⁸⁶；（2）异常的肿瘤血管系统和升高的间质液压力⁸⁷；以及（3）具有小于细胞核尺寸的间隙空间的限制性组织结构⁸⁸。尽管依赖肌动球蛋白的T细胞阿米巴样运动机制正日益得到清晰阐释，但对其他细胞类型的研究表明，动力蛋白驱动的细胞核沿微管束转位有助于细胞穿过致密组织迁移。这引出了
一种可能性是，类似的动力蛋白–微管（MT）–丝状肌动蛋白（F-actin）力传递机制能够使T细胞变形、极化，并推动其细胞核穿过拥挤的肿瘤间质。然而，动力蛋白和微管作为长程细胞内力传递系统⁴⁰˒⁴¹在T细胞中的作用仍缺乏充分表征。因此，我们假设，在T细胞穿越受限组织环境的迁移过程中，推动体积大且具有较高力学阻抗的细胞核这一主要负担，需要包括动力蛋白和微管在内的细胞骨架网络协调产生和传递力。阐明驱动细胞核运动和跨越迁移的机制，可能揭示一条此前未受到充分重视的细胞骨架协作轴，该轴调控T细胞在实体瘤内的运动能力，并为工程化改造免疫细胞以优化其深部组织浸润能力和持久抗肿瘤活性，补充一项尚缺失的力学生物学要素。
结果
阿米巴样与间充质样T细胞力学表型的概念框架
环境的物理性质，尤其是几何形态和受限程度，对迁移中的T细胞提出了不同的力学要求，从而筛选出不同的力产生、力感知和力传递策略，即力学表型。
在一个极端情形下，纤维状障碍物（如细胞外基质中的单根胶原纤维）造成的离散性拥挤会诱导阿米巴样力学表型（图1a-1）。在这种模式下，隔膜蛋白作为机械感受器和“本体感受器”，检测空间位阻性障碍物造成的细胞表面凹陷，并以这些位点为模板，引导形成由F-actin构成的环周皮质肌动球蛋白环¹⁵˒⁸⁹（图1b）。由此形成的皮质环将肌动球蛋白皮质分隔为
通过液压耦联的收缩区室，使蠕动性胞质流动和压力驱动的活塞式细胞核推进成为可能，二者共同驱动细胞在结构疏松的环境中进行变形虫式运动¹⁵,¹⁷。因此，蠕动驱动的胞质流动¹⁵与活塞式细胞核移位¹⁷协同作用，推动细胞穿过受限的组织间隙进行变形虫式迁移（图1a-1）。与这一模型一致，原代人CD4⁺ T细胞（图1b）在与胶原纤维相互作用的位点形成F-肌动蛋白环（图1b），支持微环境几何形态参与协调变形虫式肌动蛋白–肌球蛋白皮质的适应性重组。值得注意的是，药理性抑制隔膜蛋白（septin）的GTP酶活性会破坏隔膜蛋白丝的组装，阻止皮质环形成，并抑制变形虫式力学表型及运动能力¹⁵。此外，尽管变形虫式迁移不依赖整合素，也不需要强烈的细胞–细胞外基质（ECM）黏附或牵引力的长程传递，但其力学效率似乎受限于空间约束程度。例如，进行变形虫式（膜泡驱动）迁移的黑色素瘤细胞在致密、各向同性的三维胶原中的迁移速度仅为约0.027 μm/min²⁵，而以间充质模式迁移的乳腺癌细胞在类似基质中的迁移速度约为其六倍，达到约0.167 μm/min⁹⁰。
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图1.
环境背景决定T细胞在离散约束、连续约束和屏障约束条件下的迁移力学表型。
a - T细胞在不同微环境中采用不同的迁移力学表型（力的产生与传递机制）：
（1）离散的细胞拥挤障碍诱导变形虫式力学表型：单根胶原纤维挤压T细胞，使其表面产生凹陷
表面。在凹陷部位，隔蛋白触发环周皮质环的形成。多个细胞骨架环将肌动蛋白–肌球蛋白皮质分隔为多个收缩区段。多个通过液压耦联的收缩区室使细胞质发生蠕动式移位，即阿米巴样运动。在这种模式下，细胞推进依赖于蠕动式、液压驱动的推力和膨胀力，而不依赖于细胞与细胞外基质（ECM）之间的牵引（拉）力及黏附。
(2)
实体组织内的持续受限诱导间充质型力学表型。T细胞在组织中紧密排列的组成细胞之间伸出细长的树突状突起。这些突起内产生的非液压牵引（拉）力通过黏附介导的力传递驱动细胞推进。与阿米巴样运动机制不同，间充质样运动模式需要较强的细胞–ECM黏附和显著的牵引性拉力。
(3)
T细胞跨越上皮或内皮屏障迁移时的混合推进模式。在跨屏障迁移（穿出）过程中，T细胞同时或先后利用推力和拉力。皮质压缩产生液压力，帮助细胞将细胞核楔入相邻细胞之间。当细胞核进入孔隙后，正在穿越的细胞利用牵引力或液压力，将细胞核拉过或推过细胞间隙。在穿出时，细胞后部的皮质压缩将细胞核推出细胞间隙。
b
- 阿米巴样力学表型：三维Ⅰ型胶原基质中的人原代CD4⁺ T细胞表现出由皮质环介导的细胞分段，以及由尾足界定的阿米巴样极性轴。
c
- 间充质型力学表型。皮肤驻留的……的三维重建图
小鼠CD3⁺ T细胞呈现分支状细胞形态，与组织组成细胞之间的间隙空间相适应。
d
- 人原代CD8⁺ T细胞穿过宽3 µm、长10 µm且包被ICAM1的聚氨酯孔道。
在另一极端情况下，细胞持续受限于致密排列的实体组织内，其中组织间隙比细胞体更窄，甚至往往比细胞核本身还窄⁸⁸；这种环境与离散的纤维状拥挤环境¹²–¹⁴存在根本差异，并促使细胞呈现间充质样力学表型⁹¹,⁹²（图1a-2）。此处，“间充质”指的是由T细胞的形态、黏附和力传递特性所界定的力学生物学状态，而非其谱系身份。
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图2.
Septin抑制可驱动原代人CD8⁺ T细胞发生从阿米巴样到间充质样的表型转变，并伴随微管网络扩展。
a
-
上排
（+DMSO）- 未经处理的对照人CD8⁺ T细胞呈现阿米巴样与间充质样混合表型（免疫荧光，三维重建，俯视图）。尽管淋巴细胞黏附于ICAM1微图案（蓝色），但仍保持以阿米巴样为主的形态，其特征为外形紧凑、不铺展，与下方黏附性微图案的几何形状对齐程度较低，且微管网络不发达（黄色）。
下排
（+UR214-9）- 使用UR214-9抑制Septin的GTP酶活性，导致人CD8⁺ T细胞丧失紧凑的阿米巴样表型。经UR214-9处理的细胞沿ICAM1条带排列，形成细长突起，其伸展长度可达对照条件下阿米巴样T细胞尺寸的5–6倍。
b
- 经UR214-9处理的人CD8⁺ T细胞的局部放大示例，显示细胞体极度伸长，
细胞核位于中央，F-肌动蛋白和微管沿ICAM1轨道纵向排列。在完全伸长时，T细胞不再具有形态上可明确区分的主体，细胞核（绿色）位于细胞中央区域，处于沿ICAM-1轨道排列的细长突起之间。
请注意包围细胞核的广泛微管网络。
c
- 代表性微管蛋白图像，显示UR214-9处理后微管网络的扩展和富集。与DMSO处理细胞中紧凑的微管相比，UR214-9处理的细胞形成了细长而致密的微管束，贯穿整个细胞长度并延伸至远端突起。
d
- UR214-9处理的hCD8⁺ T细胞沿ICAM1条带（绿色）铺展，其细胞核振荡性易位的活细胞图像。使用活细胞染色质染料DRAQ5（品红色）标记的细胞核，在静止不动的T细胞边界内呈现幅度高达约55 µm的振荡性位移。参见视频3。
e
- 通过活细胞流式细胞术分析微管（MT；使用SiR-tubulin活细胞染料标记），评估抑制septin GTP酶后细胞群体整体MT网络密度的变化（+DMSO与+UR214-9比较）。使用UR214-9抑制septin GTP酶活性，可增强hCD4⁺和hCD8⁺ T细胞中的聚合微管网络。
请注意，hCD4⁺和hCD8⁺ T细胞中的MT网络密度均增加至约两倍。
统计分析：采用两两t检验计算p值；n表示每种条件下三个生物学重复中技术测量的总次数。
在间充质迁移模式下，细胞依赖整合素介导的黏附¹⁹和强大的牵引力产生²¹–²³。间充质型T细胞的形态特征包括显著的细胞伸长、树枝状分支以及对周围环境的适应性贴合
组织结构，例如角膜³⁰、视网膜⁹³和表皮⁴,²⁹,⁹⁴中的组织驻留记忆T细胞所表现的那样（图1a-2）。这些观察结果凸显了T细胞在实体组织的几何限制中穿行、以维持组织免疫监视和驻留时所展现的显著可塑性⁹⁵。与这一解释一致，我们发现，CD3阳性小鼠T细胞在致密的小鼠皮肤间质间隙中穿行时呈现树枝状形态（图1c）。综合来看，这些观察结果表明，间充质型力学表型是T细胞在实体组织几何约束下活动时采取的一种具有生理意义的适应策略。然而，何种机制能够协调高度伸长且分支化的细胞形态中的长程力传递，从而产生细胞净位移，目前仍不清楚。
第三种混合力学模式出现在T细胞穿越上皮或内皮细胞层内狭窄孔隙的过程中，此时，高效通过需要推力和拉力同时或依次发挥作用（图1a-3）。在穿出过程中，肌动球蛋白驱动的细胞皮质压缩产生液压压力，将细胞核楔入相邻细胞之间；与此同时，黏附依赖性牵引力⁹⁶–⁹⁸将细胞核拉过细胞间隙，随后后部细胞皮质的压缩将其挤出至另一侧⁶⁷,⁹⁸–¹⁰⁰。这种推拉协作使跨层迁移处于阿米巴样策略与间充质型策略的力学交汇处，并凸显了细胞核这一体积最大、刚度最高的细胞器²⁷,³⁶,⁶¹–⁶³，是细胞通过小于细胞核尺度的狭窄空间时的主要力学瓶颈（图1d）。
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图3.
Septin抑制诱导依赖动力蛋白、不依赖肌球蛋白且与F-actin动态解耦的振荡性细胞核迁移。
a - 以时空图展示加入septin GTP酶抑制剂UR214-9后，人CD8⁺ T细胞由阿米巴样表型向间充质样表型转变过程中的形态与结构动态变化。经处理的T细胞黏附于下方ICAM1网格微图案（绿色）中的一条ICAM1条带，并沿该条带扩展其边界（虚线），在细胞核振荡早期（t ≈ 80 min）显著伸长。见视频4。
b - 时空图展示在septin GTP酶受抑制（+UR214-9）期间，铺展T细胞的固定边界内振荡性细胞核迁移的后期稳定阶段。见视频5。
c - 动力蛋白对细胞核迁移至关重要。UR214-9处理诱导的人CD8⁺ T细胞振荡性细胞核迁移可被动力蛋白抑制剂Dynarrestin（+DA）阻断。上排 - 时空图展示UR214-9在静止的人CD8⁺ T细胞中诱导的稳定振荡性细胞核迁移（细胞边界以虚线标示）。见视频6。
d - UR214-9诱导的T细胞核迁移主要依赖动力蛋白，而基本不依赖非肌肉肌球蛋白II的活性，以下依次处理的结果表明了这一点：对照（+UR214-9）→ 非肌肉肌球蛋白II抑制（+UR214-9+Blebb）→ 动力蛋白和非肌肉肌球蛋白II抑制（+Blebb+UR214-9+DA）。见视频7和8。我们使用了稳定性更高、光毒性更低的blebbistatin衍生物——(-)-4′-对硝基blebbistatin。
（1）人CD8⁺ T细胞对上述依次处理的振荡性细胞核迁移反应：上排 - 稳定的细胞核迁移（+UR214-9）；中排 - 肌动蛋白–肌球蛋白收缩性受到抑制后，细胞核迁移仍持续，但更加不规则（+Blebb+UR214-9）；细胞核迁移停止
在同时抑制动力蛋白活性时（+DA+Blebb+UR214-9）。
（2）细胞核迁移机制示意图：细胞核通过动力蛋白相关衔接蛋白复合物与微管发生机械耦联，形成细胞核–微管（MT）力学单元。与丝状肌动蛋白（F-actin）机械耦联的动力蛋白复合物产生作用力，使微管滑动并带动与其相连的细胞核移位（细胞核迁移）。在双极性（即线性、纺锤形）T细胞沿ICAM1条带铺展的过程中，动力蛋白的参与驱动细胞核运动，进而诱导肌动蛋白动态过程的重新极化，将活动切换至相对一侧的突起，从而产生反复的细胞核迁移周期。
e - hCD8⁺ T细胞形态及细胞核迁移分析：
（1）在仅使用隔膜蛋白抑制剂（+UR214-9）及同时抑制肌动蛋白–肌球蛋白收缩性（+Blebb+UR214-9）的条件下，对UR214-9诱导的细胞核振荡半周期进行统计分析。
（2）分析不同处理条件下T细胞沿黏附性ICAM1条带的伸长（线性铺展），即对照（Ctrl，+DMSO）、隔膜蛋白抑制（+UR214-9）、非肌肉肌球蛋白II与隔膜蛋白抑制（Blebb+UR214-9）、动力蛋白–微管相互作用与隔膜蛋白抑制（+DA+UR214-9），以及动力蛋白运动活性与隔膜蛋白抑制（+DPA+UR214-9）。（3）分析成熟hCD8⁺ T细胞在对照条件（+DMSO）、肌动蛋白–肌球蛋白收缩性抑制（+Blebb）、动力蛋白抑制（+DA）及肌动蛋白–肌球蛋白与动力蛋白联合抑制（+Blebb+DA）条件下，处于间充质样（mes.）和阿米巴样（amoeb.）状态时沿ICAM1网格的铺展与伸长。
统计分析：采用两两比较t检验计算p值；n表示每种条件下三个生物学重复中技术测量的总次数。
总体而言，图1构建了一个概念框架：微环境的几何结构在阿米巴样至间充质样的连续谱中选择不同的T细胞力学表型。尽管阿米巴样运动程序非常适合结构疏松的环境，例如淋巴结或脾脏中由离散胶原纤维构成的网状三维基质，但在致密排列的实体组织以及穿越狭窄孔隙的跨迁移过程中，面对高度受限的空间，其力学能力则显不足。因此，我们着重鉴定使T细胞能够突破阿米巴样运动极限的细胞骨架机制，并首先研究了被认为介导这些力学表型之间转换的、依赖septin的分子开关¹⁰¹。
septin介导的力学表型转换使T细胞能够进行黏附驱动的接触引导
与原代人CD4⁺（hCD4⁺）T细胞类似³，原代人CD8⁺（hCD8⁺）T细胞在ICAM-1微图案化网格上呈现阿米巴样—间充质样混合表型，其特征为黏附较弱、铺展有限，且整体上与黏附性网格的几何形状契合程度较低（图2a，+DMSO）。值得注意的是，抑制hCD4⁺ T细胞中的septin可诱导显著的力学表型转换，使其转向明显的间充质样迁移模式，表现为强烈的整合素介导的黏附（LFA-1与ICAM-1结合）和铺展、与ICAM-1几何形状相契合的极度伸长或树枝状分支，以及受各向异性ICAM-1图案引导的定向迁移¹⁰²。因此，为研究hCD8⁺ T细胞的间充质样力学表型，我们尝试利用此前报道的septin驱动的力学表型转换开关来抑制其阿米巴样表型¹⁰²。为此，我们使用经氟化物稳定的常规真菌septin抑制剂处理活化的hCD8⁺ T细胞
氯吡脲（FCF）¹⁰³、UR214-9¹⁰⁴。与FCF不同，UR214-9更稳定，且对原代人T细胞的毒性更低¹⁵。
使用50 µM UR214-9处理可迅速破坏混合状态，并诱导显著的阿米巴样至间充质样力学表型转变，使人CD8⁺ T细胞失去紧凑的阿米巴样形态，转而紧密贴合具有黏附性的ICAM-1网格结构（视频1）。这种黏附引导的伸长使细胞平均长度从约15 µm增至约45 µm，个别细胞可长达约90 µm，为典型阿米巴样细胞尺寸的3至6倍，最终呈现梭形、过度伸长的形态（图2b，+UR214-9）。在充分伸长时，细胞不再具有形态上清晰可辨的中央胞体，而是呈现双极梭形形态，细胞核位于近中央位置，两个富含微管（MT）的突起沿ICAM-1条带向相反方向延伸（图2b）。
这种由隔膜蛋白抑制诱导的间充质样形态，与已报道的组织驻留记忆T细胞的结构特征高度相似（图1a-2），也与小鼠皮肤中CD3⁺ T细胞的树枝状形态一致（图1c）。这些观察结果共同支持如下观点：隔膜蛋白信号传导充当阿米巴样与间充质样力学表型之间的分子开关。
值得注意的是，UR214-9处理伴随两个显著变化：（1）整个细胞群体的微管网络大幅扩展（图2a–c）；（2）细胞核发生周期性往返位移（采用DRAQ5进行活细胞标记，视频2），位移距离可达约60 µm，且往往贯穿梭形细胞的整个长度（图2d，视频3）。在人CD4⁺和人CD8⁺淋巴细胞中，
使用 SiR-tubulin 进行的活细胞流式细胞术定量分析显示，抑制隔膜蛋白后，微管（MT）密度增至约两倍（图 2e）。伴随这一增加，微管重组为包围细胞核的笼状结构（图 2b–c）。这些观察结果表明，阿米巴样向间充质样的转变伴随着细胞骨架结构的广泛重塑，并提示扩展的微管网络及其相关分子马达可能参与下文所述的细胞核迁移⁷˒¹⁰⁵。
间充质样力学表型转变触发由动力蛋白–微管驱动的振荡性细胞核迁移
在 ICAM-1 网格上，一个代表性人 CD8⁺ T 细胞在 UR214-9 诱导下发生力学表型转变的详细过程（图 3a，视频 4）呈现如下进程：（1）加入 UR214-9 后，最初以阿米巴样形态为主的人 CD8⁺ T 细胞开始在黏附引导下沿 ICAM-1 条带伸长，随后（2）进入细胞核振荡阶段（例如，t = 5,500 秒时）。在后续阶段，细胞核振荡的周期趋于稳定（图 3b 和 c，视频 5 和 6），表现为沿伸长的 T 细胞发生规律的振荡性细胞核迁移，平均振幅约为 30 μm。细胞核发生位移时，梭形细胞的其余部分保持静止（图 3c，虚线）。在活细胞显微成像过程中，UR214-9 诱导的振荡性细胞核迁移可持续约 2 小时，此后 T 细胞会受到照明诱导的光毒性影响。
微管网络的扩展及其重组形成的“包裹细胞核的笼状结构”（图 2b–c）提示，微管相关分子马达可能在细胞核迁移中发挥作用。与这一可能性一致，抑制动力蛋白与微管之间的相互作用
使用 dynarrestin 处理可使 UR214-9 诱导的细胞核运动骤然停止，但不会导致细胞立即脱附（图 3c，视频 6）。因此，维持细胞在 ICAM1 上伸长且黏附的形态并不需要持续的动力蛋白活性，而细胞核移位则直接依赖于动力蛋白。我们采用 dynarrestin 对细胞质动力蛋白活性进行急性药理学干预，因为它可直接抑制动力蛋白依赖的微管运动，从而能够在活细胞成像过程中实现快速抑制，并降低长期遗传性耗竭或非药理学干预所引起的代偿性细胞骨架重塑或继发效应的可能性¹⁰⁶。
动力蛋白以不依赖肌动球蛋白收缩力的方式驱动细胞核运动
接下来，我们探究在 UR214-9 处理的人 CD8⁺ T 细胞中观察到的振荡性细胞核运动是否主要由动力蛋白的马达活性驱动，抑或由经典非肌肉 II 类肌球蛋白马达（非肌肉肌球蛋白 II，NM myosin II，NMII）¹⁰⁷,¹⁰⁸驱动的常规肌动球蛋白收缩力也发挥了重要作用。为回答这一问题，我们在活细胞延时成像过程中，使用光稳定性高、光毒性低的 blebbistatin 衍生物（−）-4′-对硝基 blebbistatin 处理正在发生 UR214-9 诱导的振荡性细胞核运动的 T 细胞，以抑制其 NMII 活性¹⁰⁹（图 3d-1，+DMSO→+Blebb）。在平行开展的终点测定/对照实验中，以终浓度为 50 μM 的（−）-blebbistatin 处理细胞。50 μM 的（−）-4′-对硝基 blebbistatin 浓度高于已报道的抑制肌球蛋白 II ATP 酶活性的半数抑制浓度（IC₅₀），因此预计可有效抑制 II 类肌球蛋白的马达活性，同时避免常规 blebbistatin 在活细胞成像过程中产生的光毒性¹¹⁰。
由于原代T细胞中的常规肌动蛋白–肌球蛋白收缩主要由MYH9/NMIIA编码的非肌肉肌球蛋白IIA（NM myosin IIA）驱动¹¹¹，因此，基于blebbistatin的处理是抑制NMII依赖性常规肌动蛋白–肌球蛋白收缩的适宜策略¹¹²,¹¹³。
在活细胞成像过程中，向经UR214-9处理的人CD8⁺ T细胞中加入50 µM (-)-4′-对硝基blebbistatin，在所观察的处理时间内（>10 min；图3d-1，+UR214-9+Blebb）并未消除振荡性核迁移。相反，细胞核仍在相对两侧的突起尖端之间反复移位，但核振荡的幅度和周期表现出更大的变异性。
预期50 µM (-)-4′-对硝基blebbistatin在较长时间暴露（>10 min）后可有效抑制II类肌球蛋白的马达活性，这与既往表明blebbistatin可快速起效的活细胞证据¹¹⁴，以及显示其可抑制肌球蛋白II ATP酶活性的生化测定结果¹¹³,¹¹⁵一致。因此，核移位的持续存在表明，在这些条件下，持续的NMII依赖性肌动蛋白–肌球蛋白收缩既不是振荡性核迁移的主要驱动力，也不是其严格必需的条件。
相反，向这些经UR214-9和对硝基blebbistatin处理且呈振荡状态的细胞中加入动力蛋白抑制剂dynarrestin（+DA），可迅速阻止细胞核运动（图3d-1，视频7和8，+UR214-9+Blebb+DA），这与仅暴露于UR214-9的细胞在接受dynarrestin处理后出现的核迁移停滞相似（图3c，+UR214-9+DA）。
因此，无论NMII依赖性肌动蛋白–肌球蛋白收缩处于何种状态，抑制动力蛋白均可消除核迁移。综上，这些结果表明，动力蛋白产生的力是细胞核的主要驱动力
易位，而肌动球蛋白收缩性可调节振荡行为的规律性，但并非维持该行为所必需。
动力蛋白使微管沿静止的F-肌动蛋白皮质滑动，从而驱动细胞核易位
为进一步检验微管–动力蛋白驱动的细胞核运动模型，我们考察了经UR214-9处理的人CD8⁺ T细胞中F-肌动蛋白相对于振荡细胞核的行为（补充图1、视频9和10）。具体而言，我们追踪了细长突起内F-肌动蛋白非均一结构（虚线）的位置，并比较了其动态变化与细胞核位置随时间的变化。
该分析表明，细胞核运动与突起内F-肌动蛋白非均一结构的运动相互解耦。当细胞核经过这些F-肌动蛋白非均一结构并完成一个完整的振荡周期时（补充图1，箭头），这些非均一结构仍从其初始位置（箭头头部）持续缓慢地沿直线向细长T细胞的中心向心位移。
如果细胞核振荡主要由肌动球蛋白收缩性驱动，那么在这些经UR214-9处理的高度伸长、呈梭形的人CD8⁺ T细胞中，F-肌动蛋白非均一结构的运动应始终与细胞核位置保持耦合。然而，观察到的F-肌动蛋白动态与细胞核振荡之间的解耦现象，不支持细胞核运动由肌动球蛋白整体易位直接驱动的机制。这些观察结果与缆索状微管细胞骨架及非肌球蛋白马达系统参与其中的机制一致，该马达系统能够使细胞核相对于周围的F-肌动蛋白网络发生易位。
当经UR214-9处理的人CD8⁺ T细胞打破对称性、不再振荡而是
开始沿宽度为1 µm的ICAM-1条带迁移。在这些细胞中，F-actin的不均一性结构在前导突起内保持静止（补充图2，视频11）。在这些条件下，前导突起表现出踏车式动态：各突起节段在空间上保持静止，而突起尖端通过F-actin聚合向前延伸，细胞核则从后方跟进。这些结构动态同样符合如下模型：细胞核相对于基本静止的F-actin支架发生移位，且这一过程由基于微管的马达系统驱动。图3d-2展示了一个整合上述观察结果的工作模型，阐明了振荡性核迁移过程中F-actin、动力蛋白、微管与细胞核之间的力学耦合，即细胞核相对于T细胞由F-actin界定、并顺应ICAM1条带形状的边界发生周期性运动。在该模型中，动力蛋白马达复合物与皮质及突起相关的F-actin发生力学耦合⁴⁰,⁴⁶,⁴⁷,⁵⁰，后者充当动力蛋白驱动微管沿细胞皮质滑动的支点。当微管沿F-actin框架滑动时，细胞核通过其与微管细胞骨架之间已得到充分证实的力学连接，随微管一同移位¹¹⁶。该模型基于本文呈现的观察结果及既往研究：这些研究表明，细胞核与微管细胞骨架可通过依赖动力蛋白和驱动蛋白的连接实现力学耦合⁷⁵,¹⁰⁵,¹¹⁷–¹¹⁹，并且动力蛋白能够将微管与F-actin耦合，驱动微管沿肌动蛋白结构滑动⁴⁶,⁵⁵。事实上，目前已从因果关系层面证实，这种耦合与依赖动力蛋白的力学及结构协调性有关，这种协调性存在于
微管和丝状肌动蛋白（F-actin）⁴⁶,⁵⁵,⁵⁶,¹²⁰。
值得注意的是，尽管使用50 µM的(-)-4′-对硝基布雷他汀抑制肌动球蛋白收缩性会导致振荡性核迁移出现不规则性（图3d-1，+Blebb），但并不改变振荡的总体周期性（图3e-1，+UR214-9→+UR214-9+Blebb），表明肌球蛋白活性并非决定细胞核振荡节律的唯一因素。同时，这一结果提示，肌动球蛋白收缩性有助于维持核迁移周期的稳定性，其可能通过稳定F-actin网络发挥作用，该网络为动力蛋白介导的力传递提供力学基底（支点）。这些观察结果引出了一个问题：动力蛋白和肌动球蛋白驱动的收缩性如何以不同方式参与核迁移，以及T细胞在微环境中的黏附与铺展。
动力蛋白与肌动球蛋白协同维持间充质型T细胞的黏附与铺展
与成熟中神经元的单步式核迁移⁷³不同，发生间充质转化的（经UR214-9处理的）T细胞表现出持续的振荡性核迁移（图3a–3d），提示动力蛋白支持一种持续运行的力学程序，适于受限环境中依赖黏附的迁移。这与T细胞浸润实体组织尤为相关，因为淋巴细胞必须首先在穿出血管过程中跨越血管壁形成的受限边界¹²¹，随后穿行于狭窄的组织间隙²³,³³,¹²²。这些极端条件可能超出肌动球蛋白驱动的阿米巴样迁移的力学能力¹⁴,²⁰,¹²³,¹²⁴，使通常维持这一迁移模式的皮质阿米巴样蠕动和细胞核推进机制不堪重负¹⁵,¹⁷。这些观察结果
提示存在这样一种可能性：在如此严重的空间限域下，呈间充质型力学表型的T细胞利用动态的类流体F-肌动蛋白网络探索并适应可用空间，而由动力蛋白介导的沿微管的力传递可能有助于细胞核推进及全细胞的力学协调。
与这一模型一致，已有研究表明，在肌动球蛋白收缩力降低或缺失的情况下，动力蛋白产生的力可驱动癌细胞迁移；这种收缩力的降低或缺失可通过直接抑制非肌肉肌球蛋白II实现，也可源于细胞在柔顺基底上因力学感知依赖性机制而无法形成较强的肌动球蛋白收缩力⁴⁰,⁴¹。此外，动力蛋白驱动的细胞铺展⁴²和迁移⁴⁰机制在细胞大幅伸长和分支形成过程中尤为高效，适于细胞在极端限域条件下穿行（图1a–2和1c）。进一步而言，动力蛋白复合物组分的失调与癌症进展及转移侵袭性相关¹²⁵–¹³⁰，并被用作多种肿瘤类型临床结局的预测标志物¹³¹。
为检验动力蛋白是否更广泛地参与T细胞间充质型力学表型及细胞表型的形成，我们考察了其在黏附和铺展中的作用。动力蛋白活性与肌动球蛋白收缩力共同决定T细胞通过LFA-1整合素在ICAM-1上的黏附和铺展¹³²,¹³³。在基线条件下，新近活化的人CD8⁺ T细胞黏附于ICAM-1网格，并呈现紧凑的阿米巴样–间充质混合表型³,¹⁵,¹⁰²（图2a，+DMSO）。UR214-9处理破坏了这一状态，驱动细胞沿ICAM-1条带进行间充质型黏附引导的铺展¹⁰²，并使平均细胞长度由约18 μm增加至约40 μm（图2a–c、3a，+DMSO与+UR214-9比较），最大长度约为95 μm（图2b
，+UR214-9）。对UR214-9处理细胞中的力生成系统进行药理学解析，揭示了以下作用层级：使用blebbistatin抑制肌球蛋白II，可使ICAM-1驱动的细胞伸长小幅但具有统计学显著性地减少（图3e-2，+UR214-9+Blebb）；而使用dynarrestin（DA）或dynapyrazole A（DPA）抑制动力蛋白，则对T细胞铺展产生明显更强的抑制作用（图3e-2，+UR214-9+DA和+UR214-9+DPA）。
这一作用层级在成熟的耗竭型人CD8⁺ T细胞中得到证实。这些细胞无需UR214-9处理，即可沿ICAM-1微图案以间充质样方式铺展：抑制动力蛋白而非肌球蛋白II，可使细胞的细长形态显著塌缩（图3e-3，+Blebb对比+DA对比+DPA）；而只有同时抑制动力蛋白和肌球蛋白II，才能完全消除细胞伸长（图3e-3，+Blebb+DA）。综上，这些发现表明，动力蛋白与肌动球蛋白对间充质样力学表型具有互补但非冗余的作用。动力蛋白–微管系统似乎在间充质样铺展和核移位所需的长程力传递中发挥主导作用，而肌动球蛋白则提供互补性的收缩支持，帮助维持有利于动力蛋白依赖性细胞核振荡的细长形态（图3d-2）。
高效的T细胞跨内皮迁移需要动力蛋白与肌动球蛋白之间非冗余的协作
在表征了由septin GTP酶抑制所诱导的间充质样T细胞力学表型及其相关的动力蛋白驱动的核移位后，我们进一步探究，这种在力学生物学上具有独特性的状态是否更适于穿越高度受限的空间，尤其是在跨内皮迁移过程中。为了
为回答这一问题，我们重点研究了T细胞穿越包被ICAM1的狭窄孔道（宽3 µm、长10 µm）的过程。该过程要求细胞体和细胞核均发生显著形变（图4a），从而超出已知的阿米巴样运动的力学极限⁸,¹³⁴。
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图4.
Septin抑制通过动力蛋白与肌动蛋白–肌球蛋白协同产力，促进T细胞穿越狭窄限缩通道
a - 人原代CD8⁺ T细胞穿越宽3 µm、长10 µm孔道的三维免疫荧光成像。
b - T细胞穿越宽3 µm、长10 µm孔道的示意图。该孔道迫使穿越中的T细胞及其细胞核发生形变，其程度超出阿米巴样运动机制通常所能适应的范围。
c - 穿越中的T细胞位于孔道内的部分呈现伸长和变窄，其中肌动蛋白–肌球蛋白皮层与微管协同作用：通过动力蛋白激活蛋白复合体（dynactin）等与丝状肌动蛋白（F-actin）形成力学耦联的动力蛋白复合体，将微管（MT）与肌动蛋白细胞骨架交联，并沿微管网络产生牵引力；该网络发挥着一组相对不可伸长缆索的作用。这些力通过微管–细胞核衔接复合体（如LINC复合体）传递至细胞核。
d - Septin抑制（+UR214-9）条件下人原代CD8⁺和CD4⁺ T细胞的穿越效率。
e - Rho激活或花萼海绵诱癌素A（Calyculin-A）处理均可增强肌动蛋白–肌球蛋白的收缩性，进而促进人CD8⁺ T细胞穿越；相反，Rho抑制通过抑制肌球蛋白II活性而降低细胞穿越效率。
f - 呈双腔形态、进行阿米巴样（非黏附性）运动的人原代CD8⁺ T细胞将其细胞核推过极为狭窄的皮层环（约1.5 µm），表明
T细胞利用液压（阿米巴样）力推动细胞核穿过极狭窄收缩通道的能力。
统计分析：采用两两t检验计算p值；n表示每种条件下三个生物学重复中技术测量的总次数。
在此，我们旨在检验细胞核成功穿过小孔是否同时需要推核力和拉核力¹⁰⁰（图1a–3），其中，拉力可能由动力蛋白产生，并通过微管网络传递（图4b、c）。具体而言，穿越狭窄孔隙可能需要两种分子马达系统的主动参与及其力学协作。在这一概念框架中，与F-actin发生力学耦联（例如，通过动力蛋白激活蛋白复合体⁴⁶）的动力蛋白复合体将微管与F-actin皮质交联（图4c）。该复合体可作为不可伸长的缆索系统，利用动力蛋白产生的拉力，通过LINC复合体等微管–细胞核衔接复合体，使细胞核穿过狭窄的受限空间。
值得注意的是，使用UR214-9抑制septin可使原代人CD8⁺和CD4⁺ T细胞的跨孔迁移效率均显著提高约30%（图4d，+UR214-9），表明这种力学表型转换使T细胞更适于在高度受限的空间中迁移。这一增强效应与septin抑制所诱导的动力蛋白依赖性核迁移（图2c）以及通过微管细胞骨架进行的协调力传递相一致。
为进一步研究调控T细胞跨孔迁移的产力机制，我们考察了肌动蛋白–肌球蛋白系统与动力蛋白活性的单独及联合作用。单独抑制实验表明，
动力蛋白与肌动球蛋白对跨迁移发挥协同且不可相互替代的作用（图4d）。在原代人CD4⁺和CD8⁺ T细胞中，单独选择性抑制动力蛋白（+Dynarrestin，DA）或非肌肉肌球蛋白II（NM myosin II；(-)-4′-对硝基布比他汀），均仅使跨迁移部分减少40%–45%。相比之下，联合抑制动力蛋白和肌球蛋白（+Blebb+DA）产生了最强的抑制作用，几乎完全阻断了跨迁移（图4d，+Blebb+DA）。
值得注意的是，使用dynarrestin抑制动力蛋白，可完全消除UR214-9对人CD4⁺和CD8⁺ T细胞跨迁移的增强作用（图4d，+DA+UR214-9）。具体而言，跨迁移水平降至未经处理的对照基线（图4d，+DMSO）以下，并接近单独使用dynarrestin处理时的水平（图4d，+DA），表明UR214-9增强T细胞跨迁移的作用依赖于动力蛋白活性。
综上，这些结果表明，推力和拉力均对高效跨迁移至关重要。在图1a–3所示的模型中，肌动球蛋白收缩力与经微管束传递的动力蛋白产生的力在跨迁移过程中协同作用：肌动球蛋白皮质通过液压作用将细胞核推入孔隙¹⁷，而动力蛋白–微管系统则提供拉力。这一解释与我们的发现一致：通过激活RhoA（+Rho activator II）或使用Calyculin A增强肌动球蛋白收缩力，可显著增加人CD8⁺ T细胞的跨迁移；而抑制RhoA（+Rho inhibitor I）或肌球蛋白II（(-)-4′-对硝基布比他汀）则会部分降低跨迁移水平（图4e）。液压推力的重要性还进一步得到以下能力的支持：
T细胞利用此类力将其细胞核推过极狭窄的皮质环（约1.5 µm）（图4f）。综上，这些发现表明，T细胞要高效穿越高度受限的空间，需要肌动球蛋白收缩与基于动力蛋白–微管的力传递在力学上协同作用。
整合性力学–化学模型再现自组织的细胞核振荡
我们利用计算机模拟，检验一个耦合细胞与细胞核形态动力学、细胞极化以及动力蛋白–微管（MT）力的最简力学–化学模型，能否再现实验中观察到的稳定振荡性核移位（图5a-1）。为此，我们扩展了先前开发的细胞形态动力学框架¹³⁵,¹³⁶。该框架将细胞表示为一个精细像素化的区域，其边界通过随机的突出–回缩事件演化，这些事件受肌动蛋白聚合（反应–扩散模块）、黏着斑（基于智能体的模块）、曲率和细胞面积调控，详见“方法”。
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图5.
自发极化与细胞核介导的体积排斥驱动动力蛋白交替参与及细胞核振荡。
a - 细胞核振荡的活细胞成像及其结构关联（见视频12）：
（1）经UR214-9处理的人CD8⁺ T细胞黏附于宽1 µm的ICAM1条带上，并沿条带线性铺展和伸长；延时活细胞显微成像序列显示，细胞核（DRAQ5，品红色）在两个相对的突起之间反复振荡运动。选定的方框区域（黄色）突出显示了在细胞核运动方向反转前（下）和反转后（上），与细胞核位移相关的短暂F-肌动蛋白积聚事件。下方相应的时空图
描绘黏附性 ICAM-1 微图案的空间排列（左下）以及突起之间交替出现的激活动态（方框区域，右下）。
（2）高分辨率免疫荧光成像（三维图像堆栈，最大强度投影）显示了与突起激活相关的接收侧突起结构变化：接收侧突起内 F-肌动蛋白的积聚伴随着整个突起体积内微管（MT）与 F-肌动蛋白相互穿插程度的增加（散束），且发生在细胞核向接收侧区室推进之前。
b—细胞核驱动竞争性突起交替激活的机制模型。
（1）肌动蛋白聚合激活与动力蛋白参与作用的时序模型。在 t₀ 时，突起体积低于临界值，其内部主要为成束微管，产力能力有限。在 t₁ 时，F-肌动蛋白积聚和突起扩张增加了微管与 F-肌动蛋白相互穿插的程度，导致微管在扩大的突起体积内发生“散束”（t₂）。接收侧突起中 F-肌动蛋白–动力蛋白复合物产生的牵引力（F_R）驱动细胞核移位。
（2）细胞示意图概述了 T 细胞在 1 μm 宽的 ICAM1 条带上发生细胞核振荡时的力平衡。富含肌动蛋白、微管呈散束状态且动力蛋白参与作用的接收侧突起产生占主导地位的牵引力（F_R），而对侧突起则施加较弱的后向牵引力（F_T）。细胞核在相互竞争的突起之间充当中央扩散屏障和力学屏障；因此，细胞核的位置会影响两个突起的有效延伸范围。
（3 和 4）“激活–力学”概念模型，展示细胞核的运动如何使突起活动重新极化。当突起体积超过激活临界体积（V > V_crit）时，
F-肌动蛋白聚合调控信号“A”自发激发，启动F-肌动蛋白的积累和动力蛋白的募集，从而产生牵拉细胞核的力。当细胞核向这一已激活的（接收端）突起内移动时，会减小该突起的可用体积，抑制激活信号“A”并使其转变为非活性状态“I”，同时增大对侧突起的有效体积，从而实现再极化和力的反向。
(4)
调控F-肌动蛋白聚合激活因子自发极化及体积排阻破坏该极化的最简信号回路。当局部突起体积V高于临界值（V > V_crit）时，F-肌动蛋白聚合的上游调控因子（统称为信号“A”）维持活性状态。细胞核的侵入使可用体积降至临界阈值以下（V < V_crit），促进该调控因子失活（进入“I”状态）、F-肌动蛋白解聚，并重置极化过程。
c
- 基于激活–力学耦合的细胞核振荡模拟。
(1)
模拟中，通过将黏附动力学限制在宽度为1 µm的ICAM1条带上，形成了梭形T细胞的几何形态，其中细胞核将细胞体积分隔为两个相对的突起。
(2)
两个相互竞争的突起之间交替募集动力蛋白的动态序列。细胞核位移抑制其当前所在突起中的极化斑块，并允许对侧重新激活，因此细胞核位置、F-肌动蛋白聚合的激活状态以及动力蛋白产生的力均呈周期性变化。
(3)
激活–力学模型的模拟输出，显示细胞核在交替出现的F-肌动蛋白激活位点之间振荡迁移
相对突起中的调节因子。绿色，细胞核；白色，突起活跃状态；黄色，突起非活跃状态。
我们引入了两项关键扩展。首先，将细胞核显式建模为具有特定刚度的内部可变形区域。其次，将动力蛋白–微管（MT）–丝状肌动蛋白（F-actin）相互作用表示为作用于细胞核的有效牵引场，并使其在空间上与极性活性升高的区域耦合。在未显式施加振荡行为的情况下，该模型再现了实验观察到的事件序列：自发极化驱动F-actin积累（图5a-2，视频12），动力蛋白介导的牵引使细胞核向活跃位点移位（图5b-1、2），而细胞核到达后通过排除细胞质体积触发局部再极化，从而降低该位点的活性（图5b-3）。自发极性、动力蛋白介导的牵引与细胞核触发的去极化之间的这种最小耦合，无需引入额外的调控假设，即足以在相对突起之间产生持续的、自组织的细胞核振荡（图5c）。所产生的动力学行为具有稳健性，并与实验观察到的节律性核迁移高度相似（视频13）。重要的是，振荡性核迁移并非外加设定，而是由自发极性动力学、动力蛋白介导的细胞核移位以及细胞核诱导的局部肌动蛋白聚合抑制之间的耦合涌现而来。从机制上看，振荡源于一个反馈回路：细胞核的到达破坏局部极性位点，而可激发反应–扩散系统则在远处建立新的极性斑块（通常位于具有高曲率且
体积足够大：V > V_crit），从而使细胞核的运动方向逆转。
最后，细胞核振荡的定性模式取决于动力蛋白的接合如何与丝状肌动蛋白细胞骨架及极化动力学相耦合。关于动力蛋白介导的力的作用时序和空间分布的不同假设（见“方法”）产生了不同的振荡行为，包括对称运动以及不对称的加速或减速阶段（图6a和6b，视频14和15）。这些模拟模式重现了实验中观察到的各类振荡行为（图6c），表明动力蛋白接合及力传递的差异足以产生多样化的振荡行为。
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图6.
突起长度和动力蛋白的延迟接合调控振荡性核迁移的运动学特征。
a - 细胞核加速和减速的力学模型。
（1）示意图：动力蛋白在活化（末端散开）的突起中延迟接合，导致细胞核加速。当接收侧突起形成肌动蛋白聚合的高活性位点时，动力蛋白向肌动蛋白皮质的募集及其与微管（MT）的接合开始启动，但这些过程需要一定时间才能充分建立，随后牵引力才开始引起显著的细胞核位移。因此，动力蛋白随时间逐步接合（t₀至t₄），产生不断增大的累积牵引力F_R，从而使细胞核运动加速。
（2）示意图：接收侧突起的缩短如何导致细胞核减速。当细胞核接近细胞接收侧突起的远端时，可用的微管“轨道”长度逐渐缩短（t₀至t₄）。微管的减少
长度限制了参与作用的动力蛋白dynein马达数量，从而导致牵引力降低，并使细胞核到达突起尖端时呈现出特征性的减速现象。
b
- 计算模型生成的细胞核振荡运动图（图5c(3)；方法）。肌动蛋白聚合调控因子的激活水平采用黑色—青色—黄色（由低到高）的色彩图表示。三行分别展示了关于dynein参与作用的三种不同假设：
顶行
- 直接激活模型：随着肌动蛋白聚合组分被激活，dynein马达复合物立即参与作用。见视频13。
中间行
- 延迟激活模型：代表dynein参与作用的组分随时间在肌动蛋白聚合组分高活性区域内逐渐积累。见视频14。
底行
- 具有长度依赖性的直接激活模型：该模型考虑了沿突起分布并参与作用的dynein马达，其产生的微管牵引力与突起长度成正比。见视频15。
细胞核以洋红色表示，其运动模式取决于关于dynein参与作用的假设。在“延迟激活”情况下（顶行），极性转换后，细胞核开始缓慢地向接收突起中新形成的极性斑块移动；随着dynein达到完全参与状态，其运动速度逐渐增加（顶行中的“加速”模式）。在“直接激活”情况下（中间行），每次发生极性转换时，细胞核均以近似恒定的速度在两个突起尖端之间移动（中间行中的“恒定速度”模式）。在“具有长度依赖性的直接激活”情况下（底行），由于参与作用的dynein数量较少，细胞核在接近突起尖端时会减速，因为更少的参与作用的
驱动蛋白马达仍位于正在缩短的突起内（底行中的“减速”模式）。
考察了两类 ICAM1 基底（网格）：垂直平行的 ICAM1 条带（1D，左列）以及纵横交错的垂直和水平 ICAM1 条带（2D，右列）。在模拟中，假设交叉的 ICAM1 条带可促进细胞在交叉点处更稳定地黏附。因此，在 1D ICAM1 条带上，细胞核振荡期间细胞整体形状会向上或向下漂移。相比之下，在 2D 网格上，细胞突起大多停滞于与水平条带相交处，而细胞核则继续在这些稳定的突起锚定点之间振荡。两类模拟均与相应的 1D 和 2D 实验设置相符。
c—实验运动图显示，人原代 CD8⁺ T 细胞沿宽 1 µm 的 1D ICAM1 条带迁移时，核发生振荡性运动的多种模式；这些模式在定性上与 b 面板所示的不同模型假设相对应。
(1)—振荡细胞核（洋红色，DRAQ5 标记）及其下方宽 1 µm 的黏附性 ICAM1 条带（绿色）的荧光成像。
(2) 明场运动图。
(3) 核运动与细胞边界的运动图轮廓（虚线）。
顶行—细胞核在转向点之间以近似恒定的速度作之字形运动，类似于直接激活模型。参见影片 13。
中行—细胞核加速运动，即随着细胞核接近转向点，其速度逐渐增大，类似于延迟激活模型。参见影片 14。
底行—细胞核减速运动，即随着细胞核接近转向点，其速度逐渐减小，类似于具有长度依赖性的直接激活模型。参见影片。
15.
振荡性核移位是间充质T细胞步进式跳跃迁移的基础
一旦在伸长的T细胞体内建立起来，振荡性核运动就不再仅仅表现为核的反复前后位移。相反，它作为一种基本的运动学单元，支撑着经间充质转化的hCD8⁺ T细胞的净细胞移位。在ICAM-1图案化基底上迁移的UR214-9处理hCD8⁺ T细胞的延时成像显示，细胞通过一种特征性的跳跃式、步进式运动模式向前推进（图7a，影片16）。这意味着，细胞并非进行平滑、连续的移位，而是通过一系列离散的迁移事件逐步前进；每个迁移事件均由竞争性动态突起之间的核位移所锚定。
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图7.
振荡性核移位支撑原代hCD8⁺ T细胞的步进式间充质迁移。
a
- 间充质T细胞迁移的延时成像（见影片16）。UR214-9处理的hCD8⁺ T细胞在ICAM1图案化基底上的荧光及明场成像（ICAM1，绿色；染色质/DRAQ5，洋红色；明场，灰色）。编号标记（1–8）和白色箭头追踪了8个时间点（t = 660–5,160秒）处连续的核位置，揭示出具有特征性的跳跃式（步进式）间充质迁移模式。细胞核在相互竞争的突起之间反复发生振荡性移位，细胞交替探索黏附网格并沿其向前推进。在每次重新定位过程中，后方突起发生类似弹弓式的脱离，释放张力，使细胞核能够向前迈入新生的前导突起中。
b
- 核振荡转化为净向前的】【。
跃迁式迁移过程中的位移。（1）UR214-9 处理的 hCD8⁺ T 细胞明场时序图像叠加，展示了探索性突起形成的序列，这些突起共同勾勒出连续的迁移轨迹。
（1）单细胞细胞核追踪（n，图钉标记）描绘了同一成像时段内的振荡式步进轨迹，编号路径点（1–8）对应细胞核的连续位置。不规则的往复振荡最终产生了净定向位移，这与“逐步细胞核易位是跃迁式细胞运动的基本单元”这一观点一致。
c—连接微管–动力蛋白产力系统与探索性 F-actin 铺展的机制模型。（1）在时间 t□，探索性 F-actin 铺展（前缘呈流体样行为）以及与 F-actin 整合的动力蛋白复合物共同支持新生突起的形成；这些复合物与从细胞体延伸出的微管相互作用。（2）在时间 t□₊₁，与 F-actin 整合的动力蛋白驱动突起内的微管滑动，产生推动突起尖端前进、使细胞核移位并促进细胞净移动的力。在此过程中，前缘持续发生的探索性 F-actin 铺展维持突起的延伸。（3）一种可能的 F-actin 整合型动力蛋白复合物基本分子组合。分支状探索性 F-actin 招募动力蛋白激活复合物（dynactin），后者激活微管（MT）晶格上的动力蛋白，并引导其朝向微管正端（+）产生作用力，从而在机械上耦联肌动蛋白与微管系统，协调细胞核易位和突起驱动的细胞迁移。
由微管网络传递的动力蛋白产生的力推动细胞核向前易位，进入一个新生的前导……
突起，随后发生弹弓式后突起脱离：后部黏附解除，细胞主体围绕新近前移的细胞核重新定位。这种逐步式行为在成熟、耗竭的 hCD8⁺ T 细胞中尤为显著；这些细胞后突起黏附失效的频率更高，这与其后部脱离阈值较低相一致。对单个细胞进行细胞核追踪证实，局部的双向振荡随时间推移最终转化为净向前位移（图 7b），每一步都沿黏附性引导线索产生净定向位移。
对其潜在细胞骨架结构动态的分析，为每一步的形成机制提供了深入认识（图 7c）。在步进开始时（tₙ），前缘突起的探索性动态由其前沿铺展的流体样动态 F-actin 网络支撑；与此同时，整合于 F-actin 的动力蛋白复合物与来自核周区域的微管结合，建立起力传递所需的机械连接。随着步进推进（tₙ₊₁），细胞核向前缘突起转位，这与通过微管网络进行动力蛋白介导的力传递相一致；与此同时，突起尖端持续发生的 F-actin 聚合维持其延伸。在分子层面，这些动态与此前描述的相互作用相符：分支状 F-actin 招募动力蛋白激活蛋白复合物（dynactin），从而促进动力蛋白激活，并在机械上耦联肌动蛋白与微管细胞骨架。综上，这些观察结果表明，振荡式细胞核转位是该 T 细胞状态下间充质迁移的标志性运动学特征，并支持这样一种模型，即这种 T 细胞……
动力蛋白-微管-F-肌动蛋白轴是驱动跳跃式运动的主要机械引擎。
在活体组织中观察到依赖动力蛋白的突起动态
我们目前的研究结果表明，在采用间质型机械表型的原代人T细胞中，动力蛋白是驱动核移行和跨组织迁移的主要因素。为评估依赖动力蛋白的力产生机制是否更广泛地适用于其他组织驻留免疫细胞，我们考察了动力蛋白在调控朗格汉斯细胞突起动态中的作用。朗格汉斯细胞特别适合用于此项分析，因为它们位于表皮内，而表皮是一个受到机械限制且细胞高度紧密排列的上皮环境
（图8a、b）。
朗格汉斯细胞持续伸展和回缩树突样突起，以监测周围组织中的抗原
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,
137
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。这种持续的突起重塑与间质型转化T细胞中观察到的探索性突起行为在功能上具有相似性（图5和图7），提示一种共同的、依赖动力蛋白的细胞骨架程序，可能支撑不同组织驻留免疫细胞类型中由突起驱动的运动。
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图8.
动力蛋白抑制会抑制原位组织驻留朗格汉斯细胞的突起动态。
a
- 朗格汉斯细胞在由黏附性角质形成细胞构成的受限表皮中伸展树突样突起的示意图。
b
- 朗格汉斯细胞（以
Tg(mpeg1.1:YFP)
标记）在斑马鱼表皮基底细胞膜（以
Gt(ctnna-citrine)
标记）之间伸展突起（箭头所示）的代表性共聚焦显微图像。
c
- 对照条件（+DMSO）下以及随后进行……处理后，朗格汉斯细胞突起尖端伸展-回缩速度的定量分析。
动力蛋白抑制剂 Dynapyrazole A 处理（+DPA），见影片 17。每个点代表一个被追踪的突起尖端；箱线图显示中位数和四分位距，须线表示分布范围。与对照组相比，抑制动力蛋白显著降低了突起尖端的动态性（p < 0.0001；+DMSO，n = 74 个突起；+DPA，n = 69 个突起）。
d—代表性延时成像图像，显示对照条件下（+DMSO，上）和 Dynapyrazole A 处理后（+DPA，下）朗格汉斯细胞在 60 分钟成像期间各个突起尖端的颜色编码追踪结果。t = 0 min 时的彩色虚线表示被追踪突起尖端的初始位置，后续时间点的彩色轨迹则显示其位移情况。在对照条件下，突起尖端呈现显著的伸展—回缩动态；而抑制动力蛋白则明显限制了突起尖端的运动性及突起整体重塑。比例尺：20 µm（上）和 10 µm（下）。
成年斑马鱼皮肤离体组织为研究细胞骨架扰动对表皮内朗格汉斯细胞动态的影响提供了易于操作的实验系统
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。为检验朗格汉斯细胞突起的运动性是否依赖动力蛋白，我们使用动力蛋白抑制剂 Dynapyrazole A 处理斑马鱼皮肤离体组织，并通过延时显微成像对突起动态进行定量分析
（图 8c、d，影片 17）
。对一组被追踪突起（n = 74）的突起尖端位移速度进行定量分析，证实了其显著的基础动态性
（图 8c，+DMSO）
。具体而言，在对照条件下（+DMSO），朗格汉斯细胞突起尖端在 60 分钟成像期间呈现显著且快速的伸展—回缩循环
这一窗口期与活跃的细胞骨架重塑及动态突起周转相一致（图 8d，上图）。
与对照组相比，使用 DPA 抑制动力蛋白显著降低了突起尖端的运动性（p < 0.0001；n = 69 个突起；图 8c，+DPA）。延时成像进一步证实了这一结果：与对照组相比，DPA 处理的朗格汉斯细胞突起尖端位移明显受限，整体突起重塑能力也有所减弱（图 8d，下图）。这一发现进一步支持了以下假设：在受机械限制的组织环境中，动力蛋白活性广泛参与免疫细胞的探索性运动。
讨论
Jurii Vasiliev 和 Yuri Gelfand 的开创性研究确立了微管对间充质细胞运动至关重要。¹⁴¹ 本研究重新审视了这些早期观点，并将间充质细胞运动的概念框架¹⁴²拓展至肌动球蛋白收缩性较低的状态⁴⁰,¹⁴³–¹⁴⁵；这种状态是实现显著形态顺应性³⁹,⁴⁰,¹⁴⁴,¹⁴⁶,¹⁴⁷、并使细胞能够在空间结构复杂且常常高度受限的环境中迁行的必要条件¹⁴³–¹⁴⁵。这些条件与 T 细胞浸润实体瘤这一长期难题直接相关⁸¹–⁸⁵,¹²²；在此过程中，细胞毒性 T 细胞必须挤过间质空间¹,²⁹,³⁰，而这些空间往往狭窄到难以通行⁸,¹⁵,¹³⁴。本研究揭示，动力蛋白—微管（MT）力传递轴是驱动 T 细胞在受限环境中迁移时细胞核转位的基本力学生物学机制。我们证明，该力传递轴无需依赖经典的肌动球蛋白收缩，即可帮助细胞穿越物理…
超出变形虫样运动能力所能应对的环境。通过将急性药理学解析与计算建模相结合，我们证明，依赖动力蛋白的核质运动是一种自组织振荡过程，对于细胞导航至关重要。
尽管形态适应性在免疫环境中尤为显著，但事实上，许多基本生物学过程中都具有类似需求。神经嵴细胞在高度拥挤的胚胎组织中迁移[148]，神经元生长锥[58]以及树突在神经系统的拥挤环境中延伸[149,150]，而转移性癌细胞则浸润致密的健康组织[13,40,151]。尤其对于癌细胞而言，在致密的三维胶原基质中迁移依赖于动力蛋白和微管[42]。临床研究还反复表明，微管马达及其辅助因子的失调与癌症转移相关[125–130]。生物信息学分析[152]和基因组特征分析[131]显示，动力蛋白活化复合物亚基5和动力蛋白重链1的高表达与乳腺癌患者显著较低的生存率相关。动力蛋白活化复合物亚基2（DCTN2）和/或亚基5（DCTN5）的上调与乳腺癌的转移侵袭性呈正相关[153]。通过药理学手段破坏动力蛋白[50,154–159]和驱动蛋白[74,160,161]产生的机械力，会损害微管依赖的乳腺癌细胞形态及接触引导[37,38]。综上，这些发现有力地表明，微管及其马达蛋白参与受限环境中的细胞迁移。
以原代人细胞毒性T细胞作为实验模型，我们证明，与F-actin相连接的动力蛋白—微管力生成机制是一种至关重要但此前被忽视的机械生物学程序，能够在受限环境中驱动细胞核前进。
迁移与跨内皮迁移。当经典的阿米巴样力学表型受到抑制或不再有效时，该程序便会出现。使用UR214-9抑制剂¹⁰⁴对septin蛋白——阿米巴样力学表型的关键结构与信号调控因子⁴⁰,⁸⁹——进行药理学抑制，可发挥分子开关的作用，不仅破坏阿米巴样程序¹⁵，还可启动一种独特的间充质样力学表型，增强黏附驱动的细胞伸长，并通过扩展的微管网络触发由动力蛋白驱动的振荡性核迁移（图2c）。
多种相互独立且结论一致的证据确立了动力蛋白在T细胞运动和核迁移中的主要作用：使用dynarrestin抑制动力蛋白的运动活性，无论非肌肉肌球蛋白II处于何种活性状态，均可使振荡性核迁移停止，表明仅由动力蛋白产生的力就足以驱动细胞核位移。另一方面，间充质样T细胞的结构动力学特征表现为：F-actin在T细胞突起内向心流动，而细胞核则独立于F-actin流动而快速振荡。这提示T细胞可能利用缆索状微管远距离传递动力蛋白产生的力，并通过动力蛋白激活蛋白复合体等细胞骨架衔接因子与F-actin耦联。尽管其机制与神经前体细胞及其他发育背景下由动力蛋白驱动的细胞核运动相似⁷⁴，T细胞的细胞核运动却具有重复性，提示核迁移在组织导航中可能发挥探索性作用。
我们对核迁移的解析依赖于一组急性药理学扰动，而非遗传学方法；选择这一策略是为了分离出各细胞骨架系统对细胞核转位的即时、马达特异性贡献。遗传性耗竭
shRNA、基于CRISPR的基因敲除或诱导型降解标签系统等策略，通常需要数小时至数天才能实现有效的蛋白质耗减。在此期间，原代T细胞会发生与扰动相关的表型漂移，并伴随代偿性细胞骨架重塑，从而掩盖所研究的特定分子马达的贡献。急性药理学干预可同时规避这两个问题：在单次成像过程中，每个细胞均可作为自身处理前后的对照；同时，从加药到表型读出之间的短时间窗可限制细胞骨架继发性、代偿性重组的影响。
在这一药理学框架下，我们选择的每种化合物均靶向参与细胞核迁移的细胞骨架机械装置中机制不同的节点。为扰动依赖septin的细胞皮质组织，我们使用了UR214-9。这是一种通过对母体化合物氯吡脲（forchlorfenuron，FCF）进行构效关系优化而开发的氯代类似物，可在个位数微摩尔浓度的低值范围内抑制细胞增殖¹⁰⁴。本课题组此前的研究已证实，使用该化合物急性抑制septin的GTP酶活性，足以使septin迅速从皮质肌动蛋白–肌球蛋白结构中解离，这与septin–肌动蛋白支架结构受到即时破坏的机制一致¹⁰¹。为抑制非肌肉肌球蛋白II（NMII）的活性，我们使用了blebbistatin类II型肌球蛋白ATP酶抑制剂：在终点实验中使用常规的(-)-blebbistatin，在活细胞成像中则使用(-)-4′-对硝基blebbistatin，以避免母体化合物相关的光毒性（详细的药理学依据见“结果”部分）。为检验基于微管–动力蛋白的力的贡献，我们使用了dynarrestin；该化合物可结合动力蛋白马达结构域的AAA3位点，从而抑制
微管刺激的ATP酶活性和步进活性¹⁰⁶。我们优先选用dynarrestin，而非ciliobrevin类细胞质动力蛋白抑制剂，因为后者在有效浓度下还会抑制蛋白酶体和其他AAA+ ATP酶；我们也未采用破坏动力蛋白激活蛋白复合物（dynactin）的策略，例如p150Glued CC1显性负性表达或p50/dynamitin过表达，因为这些策略作用于货物结合环节，而非马达的产力过程。
总体而言，这套药理学工具使我们能够在同一次活细胞实验中，从功能上区分三种不同细胞骨架系统的贡献：在UR214-9与(-)-4′-对硝基blebbistatin联合处理下，待振荡性核迁移已经建立后，再抑制细胞质动力蛋白，从而直接检验在肌动球蛋白收缩性受到抑制后，细胞质动力蛋白依赖性力是否仍然必需。这种序贯扰动设计无法通过起效较慢的遗传学方法实现。
穿越狭窄空间的迁移需要细胞质动力蛋白与肌球蛋白II之间的“推—拉”协作。单独抑制肌球蛋白II或细胞质动力蛋白均使穿越迁移减少约40%–45%，而联合抑制则几乎使其完全消失。这提示，肌球蛋白II在细胞后部产生收缩力，以建立液压并推动细胞核¹⁷,¹⁰⁰；而定位于细胞前部的细胞质动力蛋白马达则可能通过扩展的微管网络将细胞核向前牵拉，该网络发挥力传递缆索系统的作用。这种协作得以实现，有赖于septin受抑制后微管网络的重组：微管扩展、环绕细胞核并延伸至细胞突起内，作为主动承载负荷的缆索，介导长距离力传递。我们的计算模型进一步支持了这一框架，
表明，由自发极化驱动的动力蛋白不对称接合，以及随后由细胞核触发的再极化，足以产生实验中观察到的持续性、自组织的细胞核振荡。尽管我们的简化模型未明确描述分子间相互作用，但从机制上看，细胞核与微管（MT）马达的耦联很可能涉及由分子衔接蛋白组成的LINC复合体，包括位于内核膜的SUN蛋白¹⁶²,¹⁶³和位于外核膜的KASH蛋白¹⁶⁴–¹⁶⁶；该复合体通过Nesprin-2⁵及动力蛋白复合体的衔接蛋白BicD2⁵,¹⁶⁹,¹⁷⁰，将细胞核¹⁶⁷锚定至动力蛋白马达¹⁶⁸。Nesprin1/2还可能通过LEWD基序¹⁷¹与驱动蛋白-1的Kif5耦联，以辅助细胞核运动¹⁷²；而动力蛋白则可能通过RanBP2-BicD2和Nup133-CENP-F衔接蛋白复合体⁶,¹⁷³与核孔复合体相互作用，从而促进细胞核运动、细胞推进及极性维持¹⁷⁴。
振荡性核迁移不仅是发生间充质转化的T细胞的一种结构特征，而且构成其迁移程序的基本力学单元。在经UR214-9处理的人CD8⁺ T细胞中，细胞核在相互竞争的突起之间持续振荡，并通过跳跃式、逐步跨越的运动转化为净定向位移。每一步均以一次独立的细胞核移位事件为支撑，该事件由动力蛋白产生的力驱动；这些力沿微管网络传递，并锚定于突起相关的丝状肌动蛋白（F-actin），最终以后部突起如弹弓般脱离而完成。这一行为在成熟、耗竭的人CD8⁺ T细胞中最为显著，与其较低的后部脱离阈值及持续性间充质样铺展倾向一致。这一反复发生的力学化学循环包括突起
延伸、动力蛋白参与、细胞核移位及尾部脱附，在本质上不同于阿米巴样T细胞中由压力驱动、不依赖黏附的蠕动运动，也不同于发育中神经元所表现出的特征性单步式细胞核移位，并将动力蛋白驱动的细胞核迁移这一概念框架拓展至适应性免疫细胞的运动。
此外，在斑马鱼朗格汉斯细胞中，使用Dynapyrazole A对动力蛋白进行药理学抑制，显著减弱了突起尖端的延伸—回缩动态（图8），表明在生理原生且具有机械限域作用的上皮环境中，动力蛋白产生的力能够原位维持细胞骨架重塑。由于朗格汉斯细胞的突起动态在功能上类似于发生间充质样转变的T细胞中所观察到的探索性F-肌动蛋白铺展，这一发现提示，依赖动力蛋白的力生成是表型不同的组织驻留免疫细胞类型所共有的一种细胞骨架调控程序，反映了免疫细胞在实体组织几何约束下运动的一种更为普遍、在生理上保守的机制。
总体而言，这些发现对癌症免疫治疗具有直接启示意义，因为T细胞向实体瘤内迁入不足仍是限制治疗效果的一大障碍。本研究鉴定的动力蛋白—微管力传递轴与肌动球蛋白收缩系统并行运作，且在一定程度上独立于后者。这两个系统在跨屏障迁移过程中的非冗余协作提示，同时靶向这两条轴可能比单独干预任一系统带来更大的治疗获益。尽管本研究在很大程度上依赖于抑制隔蛋白作为诱导间充质样
在力学表型方面，未来研究应优先在具有生理相关性的三维环境中，对阿米巴样–间充质样力学表型连续谱开展遗传学解析，以指导CAR-T细胞的工程化改造，使其在实体瘤环境中具备通过遗传增强实现的自主持续性深部组织穿透能力。
方法
细胞实验
使用EasySep人CD4⁺ T细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies Inc.，美国，货号17952）和EasySep CD8⁺ T细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies Inc.，货号17953），从人全血（STEMCELL Technologies Inc.，美国，货号70507.1）中分离原代人CD4⁺和CD8⁺ T细胞。按照厂商提供的操作方案，使用ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂激活分离得到的CD4⁺ T细胞，并在含有人重组白细胞介素-2（IL-2；STEMCELL Technologies Inc.，美国）的ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基（STEMCELL Technologies Inc.，美国，货号10981）中，于37 °C、5% CO₂条件下进行扩增。CD8⁺ T细胞在额外添加了30 mL分离过程中收集的人血清的完全RPMI-1640培养基（Gibco，61870-036）中进行激活。使用ImmunoCult™人CD3/CD28 T细胞激活剂（STEMCELL Technologies Inc.，10971）和IL-2进行激活。在扩增过程中去除T细胞激活剂，并补充新鲜IL-2以支持最佳生长。
细胞跨膜迁移实验
将经等离子体处理、孔径为3 µm的Transwell插入式小室（Corning，货号3415）用10 µg/mL重组人ICAM-1蛋白（R&D Systems，货号720-IC）于37 °C包被1小时，随后用PBS洗涤三次，以去除多余的ICAM-1。向24孔板各孔中加入1 mL含0.1 µg/mL人重组IL-2的完全RPMI-1640培养基。随后将包被后的插入式小室置于各孔中，并将100 µL完全RPMI-1640培养基加入至
向插入式培养小室中加入活化的 CD8⁺ T 细胞（5×10⁴ 个）。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 6 小时后，移除插入式培养小室，并使用明场显微镜对迁移至下室的 T 细胞进行计数。
预染色胶原凝胶
我们在冰上使用预冷的试管预混凝胶：1 体积的 6 mg/mL I 型胶原，例如 CellAdhere I 型胶原（牛源，STEMCELL Technologies Inc.，美国）、8/10 体积的 ImmunoCult-XF T 细胞扩增培养基、1/10 体积的 10× 磷酸盐缓冲盐水（PBS；Thermo Fisher Scientific，货号：10010023）、1/20 体积的 1 M HEPES，以及 1/20 体积的 1 M Atto 647 N-羟基琥珀酰亚胺酯（Sigma-Aldrich，货号：18373），或 Alexa Fluor 568 酯（Molecular Probes，货号：A20003），或 Alexa Fluor 488 酯（Molecular Probes，货号：A20000）。立即用移液器吸头将一滴凝胶预混液（约 50 μL）铺展于经等离子体处理的 35 mm 玻底培养皿（MatTek Corp.，货号：P35G-1.5-14-C）的玻璃表面。为使凝胶聚合，在其表面覆盖 1 mL 矿物油（Sigma-Aldrich，货号：M8410）以防止水分蒸发，并于室温孵育过夜。用 PBS 冲洗聚合后的凝胶，以去除未聚合的凝胶组分。
斑马鱼饲养
斑马鱼饲养于 26–27 °C、光照/黑暗周期为 14/10 小时的条件下。本研究使用月龄为 6–18 个月的雌雄斑马鱼。所有斑马鱼实验均经华盛顿大学实验动物管理与使用委员会批准（方案编号：4439-01）。
斑马鱼鳞片取出
取鳞时，将成年斑马鱼置于含 200 μg·mL⁻¹ 缓冲三卡因的养殖系统水中进行麻醉。用镊子逐片取下鳞片，将其表皮面朝上置于 6 mm 塑料培养皿中，静置贴附 30 秒后加入 L-15
预温至室温（22 °C）的培养基（Gibco，美国，货号：21083027）。去除鳞片后，将动物放回养殖系统水中恢复。
Dynapyrazole处理、活细胞显微成像及朗格汉斯细胞树突定量
斑马鱼鳞片用11.5 µM dynapyrazole A（Sigma-Aldrich，美国，货号：SML2127）或等体积百分比（% v/v）的DMSO（Acros Organics，美国，货号：295522500，作为溶剂对照）预处理2小时。将培养皿置于正置Nikon Ti-E显微镜的载物台上，该显微镜配备A1R MP+共聚焦扫描器、压电z轴驱动器（Mad City Labs Nano-F450）和25×水浸式物镜（数值孔径1.1；Nikon MRD77220）。每分钟采集一次共聚焦z轴堆栈图像，持续1小时，随后使用NIS-Elements中的降噪功能进行后处理。
为定量分析树突动态，使用ImageJ插件MTrackJ¹⁷⁵，以1分钟为间隔手动追踪单个朗格汉斯细胞的树突末端。随后计算每条树突在1小时内的平均运动速度并绘图。
Blebbistatin处理T细胞
为在活细胞成像过程中急性抑制非肌肉肌球蛋白II依赖的肌动蛋白–肌球蛋白收缩性，使用50 µM (-)-4′-para-nitroblebbistatin（Cayman Chemical，美国，货号：24171）处理T细胞。该化合物是一种光稳定、低光毒性的blebbistatin衍生物，可在活细胞成像条件下急性抑制非肌肉肌球蛋白II（NMII）/II类肌球蛋白的马达活性。将活细胞接受(-)-4′-para-nitroblebbistatin处理期间观察到的反应，与使用50 µM (-)-blebbistatin（Sigma-Aldrich，美国，货号：203391）开展的平行终点/对照实验进行比较。选择50 µM这一浓度的依据是已报道的其在活细胞中的快速作用¹¹⁴，以及表明其可抑制肌球蛋白II ATP酶活性的生化测量结果¹¹³,¹¹⁵。
Dynarrestin处理T细胞
使用 dynarrestin（AAA3 位点马达结构域抑制剂；Tocris-Biotechne，美国，货号：6525¹⁰⁶）急性抑制细胞质动力蛋白（dynein-1）的活性。在活细胞延时成像采集过程中，将 dynarrestin 溶液直接加入成像培养基，使其最终工作浓度达到 50 µM。鉴于 dynarrestin 可在数分钟内快速起效，本研究采用该药物替代遗传性耗竭，以避免长期丧失动力蛋白活性所引起的细胞骨架重塑产生混杂效应，并实现同一细胞处理前后的比较。
UR214-9 处理 T 细胞
使用 UR214-9 急性抑制隔膜蛋白（septin）的 GTP 酶活性。UR214-9 是一种氯代氯吡脲（forchlorfenuron，FCF）类似物，通过对母体化合物进行构效关系优化而开发，并因其效力显著高于 FCF 而被选用¹⁰⁴。在活细胞延时成像采集过程中，将 UR214-9 直接加入成像培养基，使其终浓度达到 50 µM，以诱导阿米巴样向间充质样的力学表型转变¹⁰¹及振荡性细胞核运动。UR214-9 最初由 Rakesh Singh 博士（美国罗切斯特大学医学中心）提供，随后购自 Focus Biomolecules（美国，货号：10-4397）。
Rho Activator II 处理 T 细胞
使用 Rho Activator II（Cytoskeleton Inc，美国，货号：CN03）激活 RhoA、RhoB 和 RhoC。该试剂是细菌 CNF 毒素的衍生物，可使 Switch II 区域的第 63 位谷氨酰胺脱酰胺，从而阻止 GTP 水解。在为期 6 小时的跨膜迁移实验中，按照制造商推荐的浓度，将 Rho Activator 直接加入培养基，使其终浓度达到 1.0 µg/ml¹⁷⁶。
Rho Inhibitor I 处理 T 细胞
使用 Rho Inhibitor I（Cytoskeleton Inc，美国，货号：CT04）抑制 RhoA、RhoB 和 RhoC。该试剂是肉毒梭菌 C3 转移酶的衍生物，可使 GTP 酶中第 41 位天冬酰胺发生 ADP 核糖基化
效应分子结合结构域，并阻断Rho信号传导。在为期6小时的跨内皮迁移实验中，将Rho抑制剂按推荐浓度1.0 µg/ml直接加入培养基中¹⁷⁷。
Calyculin A处理T细胞
为在跨内皮迁移过程中诱导肌动球蛋白收缩性，使用1.0 ng/ml的海洋来源毒素Calyculin A（Sigma Aldrich，美国，货号：C5552）处理T细胞。Calyculin A是一种强效肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）抑制剂，可增强肌球蛋白II的磷酸化及肌动球蛋白收缩性¹⁷⁸。
T细胞显微成像与图像处理
使用PBS配制的4%多聚甲醛（PFA；Sigma-Aldrich，货号：P6148）于4 °C过夜或室温下30 min固定组织和细胞样本。经PFA固定的组织用PBS冲洗后，置于30%蔗糖溶液中，随后使用Leica CM1860进行冷冻切片。将厚度为100 µm的切片保存在含0.1%叠氮化钠（Sigma-Aldrich，货号：2002）的PBS中，于4 °C存放，直至进一步处理。进行免疫染色时，先用PBS配制的1%牛血清白蛋白（BSA；Thermo Fisher Scientific，货号：BP9704）溶液冲洗经PFA固定的样本，再用PBS配制的0.1% Triton X-100（Sigma-Aldrich，货号：X100）溶液透化30 min，随后用PBS配制的1% BSA溶液封闭60 min。染色所用的所有一抗均以PBS配制的1% BSA溶液稀释。使用所列任一种一抗溶液时，均在室温下孵育2小时。一抗包括：Alexa Fluor® 647标记的大鼠IgG2b单克隆抗小鼠CD3抗体（BioLegend，货号：100209），以及大鼠抗α-微管蛋白单克隆抗体YL1/2（Thermo Fisher Scientific，货号：MA1-80017）。这些试剂及其他关键资源的货号列于关键资源表中。使用Alexa Fluor偶联二抗（Thermo Fisher Scientific）进行标记的条件为
在室温下，于含1% BSA的PBS中以5 μg/mL的终浓度孵育1小时。洗去多余的二抗后，根据需要，分别使用1:1000稀释的Hoechst溶液（Tocris，货号5117）和SiR-actin（Cytoskeleton Inc.，货号CY-SC001）或鬼笔环肽偶联物（Sigma-Aldrich，货号49409；Thermo Fisher Scientific，货号A12380）标记染色质和肌动蛋白。使用以1×PBS配制的90%甘油（Sigma-Aldrich，货号G5516）封片，以供成像。
成像采用以下系统进行：配备Olympus UPLAPO-HR 100×/1.5 NA物镜的即时结构光照明显微成像（iSIM）系统（VisiTech Intl，英国桑德兰）、配备Plan-Apochromat 63×/1.4 Oil物镜的Zeiss LSM 980 Airyscan 2系统（Zeiss Microscopy，德国奥伯科亨），以及采用LIAchroic Lightning系统和LAS-X Lightning Expert反卷积软件的Leica Microsystems TCS SP8激光扫描共聚焦显微镜。三维成像所用的默认光学配置为：40×/1.3 NA油浸物镜（Leica，德国）、HyD 2.0-SMD探测器、0.85 AU针孔及100 Hz扫描频率。通过Nyquist LAS-X优化图像采集设置。各荧光通道依次采集，以防止通道间激发和发射信号串扰。活细胞成像采用Leica DMi8宽场落射荧光显微镜或Leica SP8显微镜系统（Leica，德国），置于维持37 °C、5% CO₂及受控湿度的环境培养箱内。使用LAS-X软件（Leica，德国），在20×、40×和63×放大倍数下采集明场和荧光延时图像。
使用FIJI中的Microvolution（美国加利福尼亚州库比蒂诺）商业化iSIM专用插件以及Zeiss Zen Blue软件（德国奥伯科亨）对图像进行反卷积处理。
使用 Leica LAS-X 软件（Leica，德国）和 ImageJ/Fiji 进行分析。使用 Adobe Illustrator CC 2024（Adobe），以 LAS X 和 Zeiss Zen Blue 生成的未经修改的图像编排图件。°C
高精度微图案化
ICAM-1 微图案化采用间接、高分辨率、亚微米尺度的聚丙烯酰胺凝胶（PAA）微图案化技术，改编自先前建立的方案¹⁷⁹。为防止微印章塌陷，我们使用了复合微印章，其由厚度为 0.5–0.8 mm 的硬质 PDMS（hPDMS）微印刷表层和厚度为 5–8 mm 的常规 PDMS（rPDMS）块体缓冲层组成³⁷˒¹⁸⁰。
将 3.4 g VDT-731（Gelest, Inc.，货号 VDT-731）、18 µL 铂催化剂（Sigma-Aldrich，货号 479543）和一滴交联调节剂（Sigma-Aldrich，货号 396281）充分混合，制备 hPDMS 混合物。使用前，加入 1 g HMS-301（Gelest, Inc.，货号 HMS-301），涡旋混合 30 秒，随后在高速离心机中脱气（3000 rpm，4 °C，3 分钟）。为防止 hPDMS 在使用前固化，必须将混合物置于冰上低温保存。
制备微印章时，在模具（明尼苏达大学明尼苏达纳米中心）上涂覆一层厚度为 0.5–0.8 mm 的 hPDMS，并在 70 °C 下固化 30 分钟。在 hPDMS 层上浇注一层厚度约为 8 mm、无气泡的 rPDMS（Sylgard-184，固化剂与基料比例为 1:5），并使其固化（70 °C，约 1 小时）。随后将固化的复合材料剥离，并切成 1 × 1 cm 的小块。
PAA 预混液采用 40% 丙烯酰胺（40% AA）基液（BioRad，货号 161-0140）和 2% 双丙烯酰胺（bis-AA）交联剂（BioRad，货号 161-0142）配制¹⁸¹˒¹⁸²。加入链霉亲和素-丙烯酰胺（Thermo Fisher，货号 S21379）至终浓度为 0.133 mg/mL，以使 PAA 凝胶与生物素化蛋白质交联。对于 50 µL 的 G’
= 50 kPa 的 PAA 凝胶预混液，各组分按以下用量混合：40% AA：15 µL，2% bis-AA：14.40 µL，2 mg/mL 链霉亲和素-丙烯酰胺：3.33 µL，10× PBS：5 µL，去离子 Milli-Q 水：11.17 µL，TEMED：0.1 µL。
将预混液脱气后于 4 °C 保存。浇铸前立即向 50 µL PAA 预混液中加入 1 µL 10% APS，以启动固化。
ICAM-1 图案组装顺序：
中间转印：
用 0.2 mg/mL 抗人 Fc 的 Fab 抗体片段（Jackson Immunoresearch，货号：109-007-008，溶于 PBS）在 37 °C 下包被微印章 40 min。随后用去离子水冲洗印章，并在软光刻前立即用氩气或氮气流彻底吹干。为实现与 PAA 的交联及荧光标记，按照制造商的操作规程，将针对 ICAM-1-hFc 的 Fab 与生物素（(+)-生物素 N-羟基琥珀酰亚胺酯，Sigma-Aldrich，货号：H1759）和荧光 AF488 NHS 酯（Lumiprobe，货号：11820）进行共价偶联。
玻璃活化：
为确保 PAA 与 35 mm 细胞培养皿（MatTek Corp.，货号：P35G-1.0-20-C）的玻璃底嵌片发生共价交联，按照制造商的操作规程，使用 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯（Sigma-Aldrich，货号：6514）对玻璃表面进行活化。
PAA 浇铸：
加入固化催化剂（过硫酸铵，APS）后，立即将 5 µL 含 5% 链霉亲和素-丙烯酰胺（ThermoFisher，货号：S21379）的 PAA 预混液（G′ = 50 kPa，见 PAA 弹性凝胶预混液）夹在活化玻璃表面与带有微图案的中间转印玻璃表面之间，形成“三明治”结构。
图案转移：
将 PAA 三明治结构置于去离子水中孵育（20 °C，1 h），以诱导低渗溶胀并使盖玻片温和脱离。
蛋白质孵育：
将所得 PAA 凝胶与
在冷PBS中配制的10 µg/mL ICAM1-hFc溶液（R&D Systems，货号720-IC）中于4 °C孵育12小时，用冷的无菌PBS冲洗三次后用于实验。
活细胞微管密度的流式细胞术分析
为分析活细胞中的微管密度，我们按照商业试剂盒的操作规程，在37 °C、5% CO₂条件下，使用SiR-Tubulin对经对照（DMSO）处理和UR214-9（25 µM）处理的CD4⁺和CD8⁺ T细胞进行活细胞染色。简而言之，将一份细胞样本分装至八支试管中，具体如下：未染色的对照细胞和UR214-9处理细胞；用碘化丙啶（PI，0.5 mg/mL，按1:200稀释，于流式细胞术检测前染色10分钟）染色的对照细胞和UR214-9处理细胞；用SiR试剂染色的对照细胞和UR214-9处理细胞；以及用PI和SiR试剂双重染色的对照细胞和UR214-9处理细胞。所有UR214-9处理细胞均在加入SiR试剂前与UR214-9孵育1小时，并在加入SiR试剂后继续孵育1小时。第二个小时的孵育结束后，根据需要加入PI，随后进行流式细胞术分析。
细胞形态动力学与细胞核动力学的计算模型
我们开发了一个细胞形态动力学的整合力学–化学模型，将细胞边缘的突出动力学与细胞内信号传导及力的产生相耦合。该模型基于我们先前描述的框架¹³⁶，并通过显式纳入细胞核及动力蛋白介导的力传递对其进行了扩展。
细胞表示与边缘动力学
细胞被表示为方形晶格上的二值区域 \(m_{i,j}(t) \in (0,1)\)，其形态演变由细胞轮廓处随机发生的突出和回缩事件控制。在每次迭代中，根据以下规则选择边缘处的候选像素进行突出或移除
概率：
其中：
：依赖于局部曲率的几何因子
：细胞体积调控因子
：肌动蛋白调控因子
：黏附存在因子
几何因子取决于根据每个边界像素 \((i,j)\) 的邻域计算得到的局部曲率，使凸出区域倾向于回缩，凹陷区域倾向于突出：
其中，\(r_{i,j}\) 为像素位置，\((i',j')\) 为邻域像素的索引，\(g\) 为对曲率的敏感度，\(k\) 控制该因子对总概率的贡献。
体积因子用于维持细胞的整体大小：
其中，\(V\) 为当前细胞的二维面积，\(V_0\) 为目标（或初始）面积，\(T\) 为对面积偏离目标值的敏感度。
肌动蛋白因子取决于局部成核促进因子（NPF，如 Arp2/3）或 GTP 酶（如 Rac1 或 Cdc42）的活性：
其中，\(A_{\mathrm{local}}\) 为像素邻域内活性形式的 NPF 或 GTP 酶的平均浓度，\(A_{\max}\) 为细胞内的最大浓度，\(s\) 为概率随活性水平变化的斜率。
黏附因子由黏附场定义，该黏附场根据黏附位置 \(r_n\) 的掩膜计算得到，经高斯滤波平滑处理，并缩放至 0 到 1 之间。
关键词：动力蛋白 · 微管力传递 · T细胞迁移 · 细胞核移位 · 跨内皮迁移 · 细胞力学生物学
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.736211v1?rss=1