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全身性衰老和代谢过载可重塑血管系统；然而，内皮细胞如何跨器官整合这些应激仍不清楚。我们结合多器官单细胞与空间转录组学及功能验证，绘制了脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏中内皮细胞与造血细胞的应答图谱。器官特异性的内皮转录特征相对保守，而慢性应激则选择性地重塑了调控程序：衰老诱导了以Irf/Stat为核心的保守性内皮程序，而高脂饮食则启动了具有器官偏向性的脂质代谢与重塑程序。空间分析揭示了以衰老相关干扰素刺激性内皮活化为中心的血管周围生态位，其中邻近的免疫细胞和基质细胞表达C3及LRP1相关信号。这些生态位并非仅仅放大炎症，还包含限制干扰素（IFN）活化的机制，因为C3耗竭可上调血管IRF7的表达。与此同时，IFN下游效应分子BST2促进抗炎性巨噬细胞分化，并抑制动脉粥样硬化。这些发现将血管炎性衰老界定为一种具有器官特异性的生态位过程，其中内皮IFN活化与局部炎症制约相耦联。研究亮点• 衰老在不同器官中诱导共同的内皮I型IFN程序。• 高脂饮食触发具有器官偏向性的内皮重塑程序。• 血管周围干扰素生态位将炎症与局部制约相耦联。• IFN诱导的内皮BST2促进巨噬细胞形成与CD200R相关的调节性特征。
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器官分辨的内皮调控程序将衰老和代谢超负荷与血管免疫重塑联系起来
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Masataka
Yokoyama
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Akitoshi
Nakayama
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Yuki
Taki
，
Mingyang
Chen
，
Yingbo
Gong
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Moeko
Shiina
，
Takashi
Kono
，
Masanori
Fujimoto
，
Kaoru
Ito
，
Jun-ichiro
Ikeda
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Tomoaki
Tanaka
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.02.736039
Masataka Yokoyama
1
千叶大学医学研究生院分子诊断学系，千叶大学
，千叶 260-8670，
日本
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Akitoshi Nakayama
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Yuki Taki
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Mingyang Chen
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Yingbo Gong
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Moeko Shiina
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Takashi Kono
1
千叶大学医学研究生院分子诊断学系
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2
千叶大学灾害医学研究所
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Masanori Fujimoto
3
贝斯以色列女执事医疗中心内分泌、糖尿病与代谢科
，美国马萨诸塞州波士顿 02115
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Kaoru Ito
4
千叶大学医学研究生院先进生物医学数据科学系
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Jun-ichiro Ikeda
5
千叶大学医学研究生院诊断病理学系
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Tomoaki Tanaka
1
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全身性衰老和代谢超负荷会重塑血管系统；然而，内皮细胞如何跨器官整合这些应激仍不清楚。我们结合多器官单细胞与空间转录组学及功能验证，描绘了脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏中内皮细胞与造血细胞的应答图谱。器官特异性的内皮转录特征相对保守，而慢性应激则选择性地重构调控程序：衰老诱导了一种保守的、以 Irf/Stat 为核心的内皮细胞程序，而高脂饮食则启动了具有器官偏向性的脂质代谢与重塑程序。空间分析揭示了以衰老相关的干扰素刺激性内皮细胞活化为核心的血管周围生态位，其中邻近的免疫细胞和基质细胞表达 C3 及 LRP1 相关信号。这些生态位并非仅仅放大炎症，还包含限制干扰素（IFN）活化的机制，因为耗竭 C3 会上调血管中 IRF7 的表达。与此同时，IFN 下游效应分子 BST2 促进了巨噬细胞向抗炎表型分化，并抑制动脉粥样硬化。这些发现将血管炎症性衰老界定为一种具有器官特异性特征的生态位过程，其中内皮细胞的 IFN 活化与局部炎症抑制相耦联。
研究亮点
衰老在不同器官中诱导共同的内皮细胞 I 型 IFN 程序。
高脂饮食触发具有器官偏向性的内皮细胞重塑程序。
血管周围干扰素生态位将炎症与局部抑制机制相耦联。
IFN 诱导的内皮细胞 BST2 促进巨噬细胞形成与 CD200R 相关的调节性特征。
引言
内皮细胞（ECs）构成循环系统与实质组织之间的动态界面，协调血管
发育、器官维持与再生¹–⁴。它们作为具有转录特化特征的信号枢纽，释放血管分泌因子，并使血管功能适应局部组织的需求⁵。细胞类型分辨转录组学和单细胞转录组学技术的进步进一步证实，不同器官和血管床中的内皮细胞（ECs）具有独特的分子特征⁶。后续研究界定了各组织中特化的内皮细胞程序，包括肝窦分化、与血脑屏障特化相关的脑血管分区、肾脏血管特化，以及发育和再生过程中的肝脏内皮细胞成熟⁷–¹⁰。
随后，单细胞血管图谱将这些器官特异性发现整合为全身性视图，揭示了不同组织和血管床中广泛存在的内皮细胞异质性¹¹。此后的人类内皮细胞图谱进一步明确了多个组织中器官及血管床特异性内皮细胞的转录组特征¹²,¹³。近期，人类血管细胞图谱通过界定多个人体器官中的器官特异性血管细胞状态，进一步拓展了这一框架¹⁴。新近涌现的人类衰老内皮细胞图谱资源也开始描述不同组织中与年龄相关的内皮细胞转录变化¹⁵。包括 Tabula Muris Senis 在内的多器官单细胞图谱进一步探索了衰老相关的血管重塑，揭示了小鼠各组织中广泛存在的年龄依赖性转录变化¹⁶。尽管取得了这些进展，现有图谱大多仍以描述性研究为主。它们已证实，内皮细胞的身份特征因器官而异，并随年龄发生变化，但尚未阐明不同器官中的内皮细胞如何响应
通过共享的与器官特异性的转录调控程序应对慢性全身性应激。
衰老、代谢过载和慢性炎症等全身性应激作用于整个机体，但血管疾病的发生却表现出显著的器官选择性，涵盖冠状动脉和外周动脉粥样硬化，以及肝脏和脂肪组织血管的代谢性重塑。尽管血流动力学作用力和血管几何形态促成了这种选择性，但器官特异性的内皮调控程序以及免疫–基质细胞间通讯，可能决定各组织如何响应同一种应激。肥胖条件下的单细胞分析揭示了器官特异性的内皮易损性，并伴有炎症和代谢重塑¹⁷；衰老心脏的空间分析则揭示，血管相关生态位是心脏衰老和炎症性衰老的热点区域¹。然而，应激诱导的内皮炎症究竟是一种一致的全身性反应，还是会受到器官特异性调控网络和局部免疫–基质生态位的重塑，以及这些程序如何放大或抑制血管炎症，目前仍不清楚。
为填补这一研究空白，我们利用单细胞转录组学，分析了衰老和高脂饮食应激条件下脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏中的内皮细胞反应，以阐明器官特异性的内皮激活状态及其调控性转录因子网络。这一基于调控子（regulon）的分析框架揭示，衰老在不同器官中诱导了与Irf/Stat调控子相关的共享内皮I型干扰素（IFN）程序，而代谢应激则更多地启动具有器官偏向性的脂质代谢和组织重塑程序。通过将这些程序映射至组织空间结构，我们发现衰老相关的干扰素刺激基因
形成血管周围炎症生态位。对内皮–免疫细胞通讯的进一步分析揭示了这些生态位内的反向调节机制，包括与C3相关的血管周围干扰素（IFN）炎症调节，以及在心脏和骨骼肌中富集的内皮细胞BST2轴，后者可抑制巨噬细胞炎症扩散和动脉粥样硬化病变形成。我们的研究结果提示，靶向生态位调节内皮–免疫细胞通讯，可能有助于对血管衰老和疾病实施更精准的干预。
结果
内皮细胞中器官特异性基因表达与转录调控
为比较不同器官的内皮细胞对衰老和代谢应激的反应，将小鼠分为普通饮食组和高脂饮食（HFD）组，分别饲养3个月或1年（图1A）。衰老和高脂饮食负荷均导致体重和血糖水平升高，证实了这些干预的全身性生理效应（图S1A）。从脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏中分离血管内皮细胞（EC），这些组织代表了具有不同血管功能的代谢活跃器官。由于内皮细胞的应激反应与炎症重塑密切相关，因此还从相同组织中收集造血细胞，以便对内皮细胞和免疫细胞群体进行平行分析（图1A）。经过质量控制，单细胞RNA测序共获得100,730个细胞。UMAP分析将血管、基质和造血细胞区室区分开来（图1B）。细胞分布于全部四个器官中，从而能够对内皮细胞和免疫细胞区室进行跨器官比较（图S1B）。根据Pecam1和Cdh5的表达鉴定血管细胞，这些细胞与Ptprc阳性造血细胞及
Col1a1/Pdgfra阳性成纤维细胞（图1B、S1C和S1D）。代表性标志基因的特征图进一步证实了主要血管、基质和造血细胞群之间的区分（图S1E）。利用经典谱系标志物，将造血细胞注释为巨噬细胞/单核细胞/树突状细胞（DC）群（巨噬细胞谱系）、T细胞/自然杀伤（NK）细胞/固有淋巴样细胞（ILC）群（T细胞谱系）、B细胞/浆细胞群（B细胞谱系）、中性粒细胞和肥大细胞；所用标志物包括巨噬细胞谱系的Cd68和Csf1r，T细胞谱系的Cd3e、Cd3d和Nkg7，B细胞谱系的Ms4a1和Cd19，中性粒细胞的Ngp和S100a8，以及肥大细胞的Tpsb2（图S1C–S1E）。表达多个谱系标志物的小细胞簇被归类为混合细胞，增殖细胞则根据Mki67、Top2a和Cdk1的表达进行界定。这些细胞群被排除在后续内皮细胞分析之外。随后，我们对血管细胞重新进行聚类，以更细致地界定内皮细胞和血管壁细胞群（图1C和S1F）。根据Pdgfrb、Cspg4、Tagln和Acta2的表达鉴定周细胞/血管平滑肌细胞（VSMC），而淋巴管内皮细胞（EC）则根据Prox1、Pdpn和Lyve1的表达进行界定（图S1G和S1H）。在脂肪组织、心脏和骨骼肌中，采用既往内皮细胞图谱中确立的标志物¹¹，将血管内皮细胞分为动脉、静脉和毛细血管内皮细胞：动脉标志物为Fbln5和Hey1，静脉标志物为Vwf、Nr2f2和Vcam1，毛细血管标志物为Rgcc和Car4（图S1G和S1H）。鉴于肝脏独特的血窦结构，对肝脏内皮细胞进行了单独注释。利用Lyve1和Vwf区分肝血窦内皮细胞与大血管内皮细胞，并将Vwf阳性内皮细胞进一步细分为中央静脉和门静脉
利用Rspo3、Bmp4、Adgrg6和Nrg1鉴定静脉内皮细胞（图S1G和S1H）。
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图1.
单细胞图谱分析界定代谢器官中器官特异性的内皮细胞身份
(A) 实验设计。雄性小鼠接受普通饮食或高脂饮食（HFD）喂养，并于3个月或1年后进行分析。采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏中的内皮细胞及造血细胞进行分析。每组n = 1–2只小鼠。
(B) 通过质量控制的141,590个细胞的UMAP图。标注了主要的血管、基质和造血细胞群；混合谱系细胞簇被排除在下游分析之外。
(C) 对来自脂肪组织、骨骼肌和心脏的毛细血管内皮细胞（EC）以及肝窦内皮细胞进行重新聚类。
(D) 普通饮食喂养的年轻小鼠中，前100个器官富集表达的内皮细胞基因的相关性。采用Spearman相关分析和Ward.D2聚类。
(E) 普通饮食喂养的年轻小鼠内皮细胞中的SCENIC调控子活性。展示调控子特异性评分（RSS）> 0.01的调控子及细胞类型。
(F) 代表性器官特异性调控子和共有调控子的平均曲线下面积（AUC）及RNA表达水平。颜色表示不同器官。
(G) 16个器官-条件组中代表性调控子AUC值的小提琴图。
我们首先探究器官特异性的内皮细胞身份在慢性应激下是否得以维持。为聚焦于具有物质交换功能的血管，我们提取了脂肪组织、骨骼肌和心脏组织中的毛细血管内皮细胞以及肝窦内皮细胞，并对其进行重新聚类（图1C）。这些细胞主要按器官而非应激条件聚类，表明在衰老和高脂饮食负荷过程中，器官特异性的内皮细胞身份在很大程度上得以保留。与这些发现一致，器官富集表达的内皮细胞基因表现出
呈现出高度组织依赖性的表达模式，其中肝窦内皮细胞（ECs）构成了最为独特的群体，而脂肪、心脏和骨骼肌内皮细胞则表现出更高的相似性，并具有特定的器官偏向性模块（图1D）。为鉴定这些器官特异性内皮状态背后的转录调控因子，我们对正常饮食喂养的年轻动物的四种器官样本应用了单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC）¹⁸分析（图1E）。我们重点关注与器官富集的内皮基因或共有内皮调控程序相关的转录因子，并比较了其在不同组织中的推断调控子活性和RNA表达水平。这种平行评估有助于支持对基于调控子活性所揭示的器官特异性的解读（图S1I）。该分析发现，Maf、Nr2f2和Gata4是肝脏富集的调控因子；Wt1是心脏富集的调控因子；Pparg和Junb是脂肪组织富集的调控因子；而Klf2、Klf4、Klf6、Jund和Jun则是脂肪组织、心脏和骨骼肌共有的调控因子（图1F和1G）。Wt1、Gata4和Maf的富集与既往关于心脏内皮可塑性及肝窦内皮特化的报道一致⁸˒¹⁰˒¹⁹˒²⁰。这些器官相关的调控模式在不同应激条件下仍得以维持，但其相对活性随衰老和高脂饮食（HFD）负荷而变化（图1G）。这些结果表明，维持器官特异性内皮细胞身份的转录因子程序对衰老和饮食诱导的应激具有相对较强的抵抗力。
衰老介导的内皮细胞基因表达与转录调控
为明确不同器官中与衰老相关的内皮变化，我们对来自脂肪组织、骨骼
肌肉和心脏的内皮细胞（ECs），以及来自正常饮食饲养的年轻和老年小鼠的肝窦内皮细胞（图2A）。对于每个器官，我们选取了老年内皮细胞中表达上调最显著的100个基因（图S2A）。对这些器官特异性基因集进行基因本体（GO）分析发现，各器官呈现相似的功能富集，反复出现的条目涉及先天免疫反应、炎症调控和干扰素相关通路（图2B）。然而，对这100个基因进行比较发现，各器官仅共享部分基因，且相当一部分基因仍具有器官特异性（图2C）。因此，衰老在不同器官中诱导了相关的功能程序，但参与这些程序的基因集并不完全相同。接下来，我们探究了哪些转录调控因子与这些衰老诱导的基因变化相关。我们采用SCENIC分析，对各器官老年内皮细胞中激活的调控子进行排序（图2D）。尽管多个排名靠前的调控子为不同器官所共有，但另一些则表现出器官偏向性模式。为将这些候选调控子与衰老诱导的基因联系起来，我们整合了各器官中衰老相关表达上调最显著的100个基因和排名前10的衰老相关调控子，并基于SCENIC计算合并后的基因集合与调控子集合之间的共表达权重。该分析揭示了四个基因–调控子模块，分别命名为Aging_1至Aging_4，反映了器官间存在差异的基因与其候选上游调控子之间的强关联（图2E）。各模块所包含基因的分布进一步支持了共享性和器官偏向性衰老程序并存的观点（图S2B）。Aging_1模块包含在各器官中广泛上调的基因，并与干扰素相关调控子相关，包括
Irf7、Irf9、Stat1和Stat2。Aging_2模块富集了偏向脂肪组织的衰老相关基因，并与Junb相关联。Aging_3模块包含主要在心脏和骨骼肌内皮细胞（ECs）中发生改变的基因，并与Klf家族调控子相关联，而Aging_4模块则呈现出更为局限的分布模式，涉及肌肉和肝脏内皮细胞（图2E）。为验证这些模块是否代表协调一致的单细胞转录程序，我们使用表达水平匹配的对照基因，计算了Aging_1至Aging_4的特征评分。这些评分再现了共表达分析所推断的器官依赖性和年龄依赖性模式，证实每个Aging模块均反映了一种独特的衰老相关内皮细胞状态（图S2C）。各模块代表性基因的表达模式与相应模块评分一致（图S2D），而对Aging_1–Aging_4模块进行的基因本体分析进一步支持了其功能差异（图S2E）。
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图2.
与内皮衰老相关的器官特异性转录网络
（A）对普通饮食喂养的年轻和老年小鼠的内皮细胞进行重新聚类。
（B）对各器官中衰老上调最显著的前100个内皮细胞基因进行基因本体分析。
（C）各器官中衰老上调最显著的前100个基因的重叠情况。
（D）基于SCENIC对各器官中衰老富集的调控子进行排序；合并排名靠前的调控子用于下游分析。
（E）衰老上调最显著的基因与衰老相关调控子之间的共表达权重矩阵，据此定义Aging_1–Aging_4模块。
（F和G）调控子活性与对应Aging模块评分之间的单细胞水平相关性。图中标示了Pearson相关系数。
（H）调控子之间Pearson相关性的汇总矩阵
活性与 Aging_1–Aging_4 评分。圆圈大小表示相关系数。黄色阴影表示某器官贡献了相应模块中超过 30% 的基因，具体定义见图 S2B。
最后，我们考察了候选调控子在单细胞分辨率下是否与相应的衰老模块评分存在定量关联。对于每个器官，我们将衰老模块评分与 SCENIC 推导的 regulonAUC 值进行相关性分析；该值用于衡量每个细胞中转录因子调控子的活性。代表性散点图显示，模块评分与相应调控子活性呈正相关，包括 Aging_1 与 Irf7、Aging_2 与 Junb，以及 Aging_3/4 与 Klf 家族调控子之间的相关性（图 2F、2G 和 S2F）。汇总相关性矩阵证实，在 Aging_1–Aging_4 及各器官中，调控子活性与靶基因模块表达在单细胞水平上存在关联（图 2H）。值得注意的是，Aging_1 模块富集了干扰素刺激基因（ISGs），包括 Ifit1、Ifit3、Isg15、Rsad2、Usp18 和 Oasl2。与这些发现一致，Irf7、Irf9、Stat1 和 Stat2 被鉴定为跨器官共有且与这一富含 ISG 的衰老模块相关的调控因子。综上，这些发现表明，内皮衰老由共有的转录调控模块和具有器官偏向性的转录调控模块共同组织调控。
饮食介导的内皮细胞基因表达与转录调控
为明确饮食诱导的跨器官内皮变化，我们将正常饮食小鼠和高脂饮食（HFD）喂养 1 年小鼠的脂肪组织、骨骼肌及心脏组织中的毛细血管内皮细胞（ECs），与肝窦内皮细胞一同进行重新聚类（图 3A）。按器官对 HFD 上调的内皮基因进行分析发现，其在基因本体方面的重叠更为有限
富集程度高于衰老反应中的富集程度，表明在饮食应激下器官特异性更强（图3B和图S3A）。尽管如此，涉及细胞分化、氧化应激、脂质代谢和组织重塑的相关程序仍在多个器官中被检测到，而基因水平的重叠仍然较低（图3C）。随后，我们利用SCENIC对各器官中HFD富集的调控子进行了排序，发现其主要呈现器官偏向性的调控模式，其中Pparg和Cebpd成为多个组织中反复出现的调控因子（图3D）。将HFD上调基因与饮食相关调控子整合后，我们鉴定出7个基因–调控子模块，即Diet_1至Diet_7，这些模块将饮食变异基因与候选上游调控因子联系起来（图3E）。这些模块表现出不同的器官分布，包括多器官型、脂肪组织型、心脏型、骨骼肌富集型、心脏偏向型和脂肪组织偏向型模式（图S3B）。因此，HFD应激能够激活部分共享的转录因子，如Pparg和Cebpd，同时将其下游靶基因重新导向器官特异性的内皮程序。
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图3.
与饮食诱导的代谢应激相关的器官特异性转录网络
(A) 对来自1岁正常饮食和高脂饮食（HFD）喂养小鼠的内皮细胞（EC）进行重新聚类。
(B) 对各器官中HFD上调幅度最大的100个内皮基因进行基因本体（GO）分析。
(C) 各器官之间HFD上调幅度最大的100个基因的重叠情况。
(D) 按器官进行SCENIC排序得到的HFD富集调控子；将排名靠前的调控子合并用于后续分析。
(E) HFD上调幅度最大的基因与HFD相关调控子之间的共表达权重矩阵，据此定义Diet_1至Diet_7模块。
(F和G) 调控子活性与相应Diet】【。
模块评分。标示了 Pearson 相关系数。
(H) Diet_1–Diet_7 评分与 regulon 活性之间 Pearson 相关性的汇总矩阵。圆圈大小表示相关系数。黄色阴影表示在相应模块中贡献基因占比超过 30% 的器官，定义见图 S3B。
随后，我们计算了 Diet_1 至 Diet_7 的特征评分，这些评分再现了共表达分析推断出的器官依赖性和饮食依赖性模式，并凸显了饮食响应更强的器官选择性（图 S3C）。代表性基因和基因本体分析支持了模块划分及其功能多样性，其中包括 Diet_2 中的脂质代谢过程，以及心脏和肌肉模块中的血管生成或形态发生相关程序（图 S3D 和 S3E）。相关性分析进一步在单细胞分辨率下，将饮食模块评分与相匹配的 regulon 活性联系起来；根据器官和模块不同，代表性示例涉及 Cebpd、Pparg、Jun/Jund、Klf2、Fosl2、Maff 和 Wt1（图 3F 和图 3G）。汇总矩阵证实，反复出现的饮食相关 regulon 与不同组织中的特定饮食模块相关（图 3H）。因此，与衰老相比，高脂饮食（HFD）应激以更具组织特异性的方式重塑内皮基因调控；部分共享的上游调控因子则驱动不同器官中各异的内皮输出。
衰老与代谢应激条件下的应激特异性及血管床共享 regulon 激活
前述分析揭示了衰老和 HFD 比较中与应激相关的内皮 regulon。随后，我们利用 SCENIC 推导的 regulonAUC 值，将这些 regulon 投射到全部 16 个器官—条件组中，以判断其活性是否反映了共享的、器官特异性的，
或应激特异性模式（图 4A）。大多数 regulon 的活性具有情境依赖性，而非在不同应激条件下均一致激活。包括 Irf7、Irf9、Stat1 和 Stat2 在内的 IFN 相关 regulon 在衰老条件下优先激活，而饮食相关 regulon 则呈现更明显的器官偏倚和应激依赖性模式。因此，内皮细胞的转录应激反应同时受到应激类型和组织背景的影响。在衰老相关 regulon 中，Irf7、Irf9、Stat1 和 Stat2 在单细胞水平上彼此呈现最强的正相关（图 4B），表明衰老 EC 中协同激活了 I 型 IFN 调控轴。STAT1、STAT2 和 IRF9 介导干扰素应答性转录，而 IRF7 参与 I 型干扰素的诱导与放大；因此，这些结果提示衰老 EC 同时启动了 IFN 应答程序和 IFN 放大程序。
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图 4.
衰老和代谢应激下器官特异性及血管床共享的转录 regulon 激活
(A) 基于 SCENIC 比较所有器官-条件组中具有代表性的衰老相关和饮食相关 regulon。
(B) 应激相关 regulon 活性的单细胞相关性分析。颜色表示 regulon 活性两两之间的 Spearman 相关系数。
(C) 不同内皮细胞亚型和年龄组的 Aging_1 特征评分。
(D) 衰老组织中的 IRF7 免疫荧光。PV，门静脉。比例尺：低倍视野，200 µm；高倍视野，50 µm。
(E) 来自脂肪组织、心脏组织和骨骼肌的动脉 EC 的 UMAP 图。
(F) 毛细血管 EC 与动脉 EC 之间应激响应性 regulon 的比较。坐标轴数值表示相对于排名最高的应激相关 Δ 值的差异，其中…
较小的差异表示在各个 EC 亚群内部具有更高的相对压力反应性。
（G）将 regulon 活性与基于 scGSVA 得到的 Reactome 通路评分相联系的网络。边的粗细表示 Spearman 相关强度；红色和绿色的通路标签分别表示多器官衰老相关 regulon 连接和饮食相关 regulon 连接。
（H）脂肪组织中的 JunB 免疫荧光染色。比例尺：低倍视野，100 µm；高倍视野，50 µm。
（I）在正常饮食条件下，依据 0.15 的 Junb regulon 活性阈值，将脂肪毛细血管 EC 重新聚类为 Junb-high 和 Junb-low 两个群体；该阈值对应于图 S4J 所示活性范围的中点。
（J）对老年 Junb-high 脂肪 EC 中富集基因进行 TRRUST 上游调控因子分析。
免疫染色显示，心脏和骨骼肌中 IRF7 阳性血管 EC 的数量随年龄增长而增加（图 4C 和图 S4A）；Aging_1 评分的 UMAP 投影同样表明，IFN 激活集中于部分 EC 中（图 S4B）。在肝脏中，老年组织内 IRF7 阳性的血管及血管周围信号也较年轻组织更加明显（图 4D）。与上述结果一致，毛细血管、动脉、静脉及器官特异性内皮细胞群中的 Aging_1 模块评分均随年龄增长而升高，表明衰老相关 IFN 程序并不局限于最初用于模块发现的毛细血管和窦状内皮细胞群（图 4E）。鉴于动脉内皮重塑具有重要的病理学意义，我们进一步研究了动脉 EC。由于肝脏动脉 EC 很少被捕获，该分析在脂肪组织、心脏组织和骨骼肌中进行（图 S4C）。采用相同的基于前 100 个基因的策略，我们发现，
动脉应激响应基因与毛细血管内皮程序在很大程度上重叠，而动脉选择性基因数量有限，且在不同器官之间几乎没有交叉重叠（图 S4D–S4G）。SCENIC 分析进一步显示，大多数应激响应调控子在动脉 EC 和毛细血管 EC 之间表现出相似的相对变化模式（图 4F）。这些发现表明，主要的内皮应激调控子在不同血管床之间具有广泛的共性。
为将调控子激活与功能通路状态联系起来，我们利用 scGSVA 进行了单细胞通路富集分析，并将通路评分与 regulonAUC 值进行相关性分析。对于每个调控子，我们提取相关性最高的 Reactome 通路，并将高度相关的调控子–通路关系汇总为网络（图 4G 和 S4H）。与衰老相关的 Irf/Stat 调控子与多个器官中的免疫相关通路相联系，包括抗原加工与呈递通路。这一模式与 Aging_1 模块的基因本体分析结果一致；该模块富集了免疫和干扰素相关程序（图 S2E）。相比之下，与饮食相关的调控子表现出更强的器官特异性。与图 3 所示的基因–调控子模块分析结果一致，这一单细胞通路分析进一步解析了在代谢应激条件下，组织偏倚性调控子活性如何与不同的功能通路状态相联系。与 Pparg 相关的活性与脂质处理及代谢通路相关，而 Klf 和 AP-1 家族调控子则与更具组织选择性的通路关系相关。在这些通路关系中，与 p53 相关的细胞周期停滞和应激反应通路选择性地出现在脂肪组织 EC 中，并与 AP-1 调控子的协同作用相关。
活性（图4G）。这一模式值得注意，因为我们先前的研究发现，在高血糖、缺血和肥胖相关应激条件下，内皮细胞中的 p53 信号传导会促进血管功能障碍^21,22，这提示即使是经典的内皮应激通路，也可能以组织特异性方式被优先激活。与此一致，Junb 调控子活性随年龄增长而升高，并且在 HFD 条件下进一步增强（图 S4I）；免疫染色证实，衰老脂肪组织 ECs 中的核内 JunB 信号增强（图 4H）。事实上，在衰老比较中，与 Junb-low 组分相比，衰老 Junb-high 组分的上游调控因子分析将 Trp53 定位为最主要的调控因子（图 4I、4J 和图 S4J）。综上，这些发现表明，内皮应激重塑同时涉及广泛共享的衰老程序（以 IFN 调控子协同激活为代表）和器官偏向性的应激状态，其中包括一个具有独特特征的脂肪组织内皮细胞组分，其标志为 p53 相关激活。
细胞间相互作用分析揭示应激特异性的内皮细胞–免疫细胞通信
为确定内皮应激程序是否与周围免疫细胞的变化相关，我们利用 CellChat^23，对血管内皮细胞亚群与巨噬细胞、T 细胞和 B 细胞谱系之间的单细胞水平细胞间相互作用（CCI）进行了分析（图 5A）。通过将衰老和 HFD 条件分别与其对应的对照组进行比较，提取出应激响应性信号通路（图 S5A）。当按照信号发送者和接收者的方向性对发生改变的信号通路进行分类时，内皮细胞到内皮细胞的通信在应激响应性相互作用中占据了较大比例（图 5B 和图 S5B）。其中，蓄意 truncated "Among" needs translate "其中，". Since source ends there.
在毛细血管–毛细血管信号中，EPHB通路在衰老和高脂饮食（HFD）应激条件下的骨骼肌内皮细胞（ECs）中均有所增强（图S5C）。与EPHB相关的配体和受体，包括Efnb1、Efnb2、Epha4和Ephb4，与衰老骨骼肌内皮细胞中的ephrin信号传导及Klf2/Klf4相关调控子活性相关（图S5D）。结合既往关于ephrin–EphB信号传导、内皮网络形成以及由细胞间通信驱动的转录反应之间联系的研究结果
23
–
26
，这些发现表明，ephrin–EphB信号传导是一个应激响应性内皮通信轴，并与器官偏倚性调控程序相一致。
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图5．
细胞–细胞相互作用分析揭示应激特异性的内皮–免疫细胞通信
(A) 内皮细胞亚群与免疫细胞谱系之间的细胞–细胞相互作用网络。
(B) 衰老或HFD应激条件下毛细血管内皮细胞和窦状内皮细胞中的差异调控信号通路。
(C) 改变的细胞–细胞相互作用（CCI）通路概览，分为毛细血管–毛细血管信号、内皮细胞输出信号或内皮细胞输入信号。
(D) 衰老或HFD应激条件下发生改变的免疫细胞–内皮细胞输入信号。中央方框表示信号通路及相应的内皮细胞受体分子，外围标签表示推断的造血细胞发送群体及其输入分子（括号内）。
(E–G) 巨噬细胞、T细胞和B细胞谱系的UMAP亚群聚类分析。Treg.：调节性T细胞；Mono.：单核细胞；Macro：巨噬细胞；DC：树突状细胞。
(H) HFD应激条件下免疫细胞亚群中与Sell和Fn1相关的来源信号。
(I) 正常饮食和HFD条件下Ly6c高表达单核细胞的流式细胞术定量分析。细胞取自Ly6G
−
CD11b
+
F4/80
+
细胞群；每组n = 5只小鼠。
(J) Tnf的表达。
不同条件下脂肪组织巨噬细胞谱系的亚群。
(K) 年轻和衰老脂肪组织中Ear2⁺和Trem2⁺巨噬细胞的数量。
(L) Trem2⁻CD36⁻和Trem2⁺CD36⁺脂肪组织巨噬细胞中TNF蛋白的表达。细胞从Ly6G⁻CD11b⁺F4/80⁺细胞群中设门选取；每组n = 5只小鼠。
(M) 通过与巨噬细胞共培养或使用重组TNFα刺激脂肪组织内皮细胞（EC）的实验设计。
(N) 与Trem2⁺CD36⁺巨噬细胞共培养或经TNFα刺激后表达上调基因的基因本体（GO）分析。
(O) 与巨噬细胞共培养或经TNFα刺激后Aging_1基因的表达。
在通路层面，内皮细胞的传入和传出信号在不同器官间的重叠有限，表明应激响应性血管通讯在很大程度上具有器官和情境依赖性（图5C），这与我们近期发现的组织情境塑造器官特异性免疫细胞程序的结果一致²⁷。随后，我们聚焦于免疫细胞向毛细血管或血窦内皮细胞传递的信号，并鉴定出衰老或高脂饮食（HFD）条件下，应激诱导的免疫细胞至内皮细胞通讯通路变化（图5D）。为在更高的细胞分辨率下解析这些免疫细胞至内皮细胞的通讯模式，我们对B细胞、T细胞和巨噬细胞谱系进行了亚群聚类（图5E–5G和S5E–S5J）。尽管在多个T细胞和B细胞亚群中可检测到Sell，但这些细胞群在骨骼肌中表现出的饮食相关变化有限（图S5K和S5L）。相比之下，在HFD条件下，骨骼肌和肝脏中的Ly6c⁺单核细胞表现出增强的Sell和Fn1相关信号（图5H）。与这些发现一致，单细胞分析和流式细胞术证实，HFD负荷后这些器官中Ly6c⁺单核细胞的积聚增加（图5I、S5M和
S5N），这与既往关于肥胖及脂肪性肝炎相关炎症中CCR2依赖性Ly6C⁺单核细胞募集的报道一致²⁸–³⁰。
随后，我们考察了脂肪组织中衰老相关的TNF信号。无论饮食条件如何，巨噬细胞谱系中的Tnf表达均随年龄增长而升高（图5J）。亚群分析表明，Trem2⁺巨噬细胞是与这种年龄依赖性升高相关的主要巨噬细胞群体，且在正常饮食条件下，老年脂肪组织中的Trem2⁺巨噬细胞数量显著增加（图5K）。Trem2⁺巨噬细胞也称为脂质相关巨噬细胞（lipid-associated macrophages，LAMs），在脂质代谢和代谢组织重塑中发挥关键作用³¹。基于既往将CD36用作脂质相关巨噬细胞状态标志物的报道，我们使用Trem2和CD36富集该细胞群体，以进行流式细胞术分析。流式细胞术证实，TNF蛋白表达随衰老而升高的现象特异性地发生于Trem2⁺CD36⁺巨噬细胞，而Trem2⁻CD36⁻巨噬细胞中的表达变化很小（图5L）。
为检验衰老相关脂肪组织巨噬细胞能否诱导内皮细胞应激程序，我们将脂肪组织内皮细胞（ECs）与从老年小鼠中分离的Trem2⁺CD36⁺或Trem2⁻CD36⁻脂肪组织巨噬细胞共培养，或使用重组TNFα刺激脂肪组织内皮细胞（图5M）。群体RNA测序显示，Trem2⁺CD36⁺巨噬细胞和TNFα诱导的转录变化存在重叠，而Trem2⁻CD36⁻巨噬细胞的作用较弱（图S5O和S5P）。对Trem2⁺CD36⁺巨噬细胞或TNFα诱导表达的基因进行基因本体分析，发现细胞因子介导的信号传导、对外部刺激的应答、对病毒的应答以及白细胞迁移相关条目富集（图5N），这与
在衰老响应性内皮细胞基因中观察到的炎症及干扰素相关富集（图S2A）。随后，我们考察了图2E中定义的Aging_1模块的各个基因。这些基因在Trem2⁺CD36⁺巨噬细胞和TNFα作用下普遍被诱导表达，而在Trem2⁻CD36⁻巨噬细胞作用下则未出现这种现象（图5O）。因此，Trem2⁺CD36⁺脂肪组织巨噬细胞提供了富含TNF的免疫信号输入，能够激活内皮细胞的Aging_1程序。尽管TNFα并非经典的I型干扰素配体，但既往研究表明，TNFα可汇聚于干扰素刺激基因的转录调控，并与干扰素信号协同作用³²，这支持了巨噬细胞来源的TNF在内皮细胞IFN相关信号放大中的作用。
空间转录组学描绘衰老组织中的血管周围ISG簇
单细胞分析和细胞间相互作用（CCI）分析揭示了具有器官偏向性的内皮细胞应激反应、共同的衰老相关IFN程序，以及与内皮细胞（EC）中Aging_1激活相关的免疫细胞来源TNF信号输入。接下来，我们对年轻小鼠和24月龄高龄小鼠进行了空间转录组学分析，以确定该程序在心脏和脂肪组织结构中的空间组织方式。我们利用本研究生成的单细胞数据集，以及包括Tabula Muris Senis和我们此前报道的衰老相关数据集在内的小鼠衰老图谱资源，通过标签转移确定空间细胞身份¹⁶˒³³。在每种组织、每个年龄组的两个生物学重复中，我们对心脏和脂肪组织中的主要细胞群进行了注释（图6A、6B、S6A和S6B）。将Aging_1模块评分投射到空间图谱后发现，心脏和脂肪组织中的评分均随年龄增长而升高（图S6C）。在心脏中，Aging_1高评分区域表现为空间局限的灶状分布，而非弥漫分布于整个组织
信号（图6C），脂肪组织中也观察到了类似的局灶性富集（图6D）。靶向原位基因表达谱分析进一步证实，多个器官中均存在与年龄相关的Aging_1高表达细胞局灶性积聚，其中心脏中的细胞簇尤为显著（图S6D）。我们将这些局灶性区域（包括Aging_1高表达区域及其局部周边区域）称为“ISG簇”，以反映Aging_1模块中干扰素刺激基因的富集。
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图6.
空间转录组学绘制衰老组织中血管周围ISG簇的分布图
(A) 使用Visium HD 8 µm分箱数据对年轻和高龄心脏切片进行空间注释。
(B) 使用Visium HD细胞分割数据对年轻和高龄脂肪组织进行空间注释。
(C) 心室区域的Aging_1评分。Aging_1核心细胞、邻近细胞和远端细胞分别定义为评分较高的细胞、距核心≤100 µm的细胞以及其余细胞。
(D) 脂肪组织中的Aging_1评分。各区域的定义同(C)。
(E) 心脏和脂肪组织中Aging_1核心细胞的细胞类型组成。
(F) 高龄脂肪组织中Tnf、Cxcl13和Irf7的空间定位。比例尺：H&E染色全景图，100 µm；放大区域，50 µm。
(G) 高龄心脏和脂肪组织中Aging_1邻近细胞向核心细胞传递信号时富集的配体。
(H) Aging_1邻近细胞向核心细胞传递的共同配体–受体信号。连线粗细表示基于LIANA计算的配体–受体（LR）评分。
(I) 穿过高龄心脏中Aging_1核心–邻近区域的空间线段。将一个Aging_1高评分核心位置设为0 µm，数字表示距该点的距离。比例尺，0.5 mm。
(J) 沿(I)中空间线段各分箱的线剖面分析，显示Aging_1评分和基因表达水平。邻近区域为
以黄色突出显示。
(K) (I) 中黄色方框区域的放大图。左：H&E 染色；中：细胞类型注释；右：C3 和 Apoe 表达。比例尺，1 mm。
(L) 图 S6K 中标示的区域 ❶ 和 ❷ 的 Xenium 放大图。表达 C3 的细胞簇包含表达 Col1a1 的基质细胞、表达 Csf1r/Adgre1 的髓系细胞，或基质–髓系混合成分。比例尺，50 µm。
(M) PBS 或 CVF 处理的老年小鼠心脏切片中 IRF7 阳性内皮细胞（EC）的定量分析。每只小鼠分析 3 个区域，每组 4 只小鼠，共计每组 12 个区域。P 值基于区域水平的测量数据计算。**p < 0.001。
(N) 年轻、老年及 C3 耗竭的老年心脏中 IRF7、VE-cadherin、C3 和 DAPI 的免疫荧光图像。比例尺：概览图，200 µm；放大区域，100 µm。
为明确 ISG 簇的组织结构，将 Aging_1 高表达的空间单元定义为 Aging_1_core，将距其 100 μm 范围内的空间单元定义为 Aging_1_neighbor，其余单元定义为 Aging_1_distal（图 6C 和 6D）。随后，我们分析了 Aging_1_core 和 Aging_1_neighbor 区室的细胞组成。在心脏中，Aging_1_core 包含心室心肌，反映了周围的心肌组织结构；在非心肌细胞群中，EC 最为丰富，其次为成纤维细胞和巨噬细胞谱系细胞（图 6E）。在脂肪组织中，EC、脂肪基质细胞、巨噬细胞谱系细胞以及血管平滑肌细胞（VSMC）/周细胞共同构成 Aging_1_core，且这些细胞群随衰老而增加（图 6E）。Aging_1_neighbor 也随衰老而扩展，其中包含内皮细胞、成纤维细胞/基质细胞、VSMC/周细胞及巨噬细胞谱系细胞群（图 S6E 和 S6F）。综上，这些空间和细胞特征表明，
ISG簇常与血管相关区室相伴分布。
为定位上述鉴定出的免疫细胞来源TNF信号，我们对衰老脂肪组织进行了分析。在血管周围的脂质相关巨噬细胞（LAM）中检测到了Tnf（图S6G）。值得注意的是，Tnf也富集于动脉血管结构附近的B细胞富集聚集体中（图6F）。这些聚集体伴有表达Cxcl13的细胞，与慢性炎症中三级淋巴结构（TLS）样炎症组织化的特征一致³⁴,³⁵。在Tnf富集区域周围也观察到了Irf7阳性细胞，支持局部富含TNF的炎症输入与内皮细胞IFN激活之间存在空间关联。
接下来，我们使用LIANA³⁶进行空间细胞间通讯（CCI）分析，以绘制ISG簇内指向Aging_1_core的候选配体–受体相互作用图谱。对于每种组织，我们提取了从Aging_1_neighbor到Aging_1_core的信号强度高于从Aging_1_distal到Aging_1_core的通路（图S6H和S6I），并重点关注在高龄组织中表达升高的配体。心脏和脂肪组织共有六种配体：C3、Apoe、App、Lpl、Col1a1和Col1a2（图6G）。配体–受体可视化结果显示，这些共有的传入信号汇聚于Aging_1_core中表达的若干受体，包括Lrp1、Cd74、Cd36和Aplp2（图6H）。在这些受体中，Lrp1是两个器官共有配体相互作用中最常出现的Aging_1_core端受体，包括涉及C3和Apoe的相互作用。对这两种与Lrp1相关联的配体进行分析表明，Aging_1_neighbor区室中的Apoe主要富集于巨噬细胞谱系，而C3在成纤维细胞或基质细胞群中较为突出，在巨噬细胞谱系中也有检出（图S6J）。因此，我们
重点关注表达 Lrp1 的 Aging_1_core 区域与富集 C3 或 Apoe 的 Aging_1_neighbor 区室之间的空间关系。对代表性 ISG 簇进行的线剖面分析显示，在极高龄心脏中，Lrp1 的表达与 Aging_1_core 区域在空间上吻合，而 C3 和 Apoe 则富集于周围的 Aging_1_neighbor 区室（图 6I 和 6J）。在极高龄脂肪组织中也观察到了类似模式（图 S6K）。心脏 ISG 簇的放大图进一步显示，Aging_1_core 区域靠近空间上相邻但彼此大体分离的 C3 和 Apoe 表达区域（图 6K）。靶向原位基因表达分析进一步表明，衰老心脏中表达 C3 的区域呈血管周围簇状分布，其中包含表达 Col1a1 的基质细胞、表达 Csf1r/Adgre1 的髓系细胞，或基质–髓系混合细胞组分（图 6L 和 S6L）。鉴于 C3 可能涉及不同的受体背景，我们考察了 C3、Lrp1 和 C3ar1 之间的空间关系。双变量映射显示，表达 C3 的区域位于 Lrp1 阳性区域附近，而 C3ar1 则呈现出不同的分布模式（图 S6M）。这一发现提示，C3 可能与 Lrp1 相关的清除或缓冲反应有关，促使我们检验 C3 活性是否调节血管周围的 IFN 炎症。因此，我们使用眼镜蛇毒因子（CVF）耗竭 C3，并评估心脏中的 IRF7 表达。IRF7 阳性血管区域随年龄增长而增多，而 C3 耗竭进一步增加了 IRF7 阳性区域的数量（图 6M 和 6N）。这些发现表明，衰老相关的内皮 IFN 激活在空间上呈血管周围 ISG 簇状组织，其中 C3 相关信号可能参与局部的
对血管 IFN 激活的抑制。
IFN 信号下游的内皮细胞 BST2 促进抗炎性巨噬细胞分化
为将应激激活的转录因子与参与细胞间通讯的下游效应分子联系起来，我们重新采用内皮细胞–免疫细胞的细胞间相互作用（CCI）分析框架，考察了应激响应性调控子中与 CCI 相关的分子（图 7A）。对于每个调控子–分子配对，我们在单细胞水平上分析了 regulonAUC 与靶基因表达的相关性，并按 R² 进行排序。在排名最高的配对中，包括 Irf7、Irf9、Stat1 和 Stat2 在内的 IFN 相关调控子与 Bst2 表达相关。这一关联选择性地见于心脏和骨骼肌内皮细胞（EC）（图 7B 和 7C）。在这两个器官中，包括毛细血管、动脉和静脉 EC 在内的多种内皮细胞亚型，其 Bst2 表达均随年龄增长而升高（图 7D）。BST2 又称 tetherin，是一种干扰素诱导型膜蛋白，最初被鉴定为一种抗病毒限制因子，可阻止包膜病毒粒子从感染细胞中释放³⁷–³⁹。近期研究还表明，BST2–PIRA2 通讯参与调控肿瘤微环境中血管平滑肌细胞的可塑性⁴⁰。然而，在衰老相关应激过程中，血管 EC 中 BST2 诱导表达的功能意义仍不明确。我们还鉴定出其他与衰老相关的内皮细胞分子，包括 Cxcl12 和 Lgals9（图 S7A）。在心脏中，Cxcl12 随衰老而升高，而 Ackr3（又称 Cxcr7）则降低，提示 Cxcl12 相关通讯可能不仅限于内皮细胞之间的信号传递。
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图 7.
IFN 信号下游的内皮细胞 BST2 促进抗炎性巨噬细胞
分化并抑制动脉粥样硬化
(A) 连接器官与细胞间通讯（CCI）相关效应通路及分子的桑基图。颜色表示内皮细胞输出、内皮细胞输入或双向通路。
(B) 基于相关性分析排序的调控子–效应分子–器官组合。
(C) 心脏和骨骼肌内皮细胞（EC）中，IFN相关调控子活性与Bst2表达之间的代表性单细胞相关性。
(D) 心脏和骨骼肌毛细血管、动脉及静脉内皮细胞中的Bst2表达。
(E) 在先经IFNα处理、随后经LPS处理的原代心脏内皮细胞中，对Bst2基因座进行的STAT1染色质免疫沉淀（ChIP）分析。
(F) 衰老应激下内皮细胞向免疫细胞输出的信号。中央方框表示信号通路及相应的内皮细胞输出分子，外围标签表示推断的免疫受体细胞群，括号内为其接收分子。
(G) 巨噬细胞谱系各亚群中的Pira2表达。点的大小表示表达该基因的细胞百分比；颜色表示平均表达水平。
(H) 使用CD11b⁺骨髓细胞和重组小鼠BST2进行的骨髓来源巨噬细胞（BMDM）分化实验。
(I) 重组BST2刺激后第3天的细胞总数。
(J) CD11b⁺F4/80⁺和CD11b⁺F4/80⁻细胞的ViaFluor 488增殖分析。*p < 0.05。
(K) 第6天BST2高剂量组细胞中表达上调基因的基因本体（GO）分析。BST2低剂量组：0.1 μg ml⁻¹重组小鼠BST2；BST2高剂量组：1.0 μg ml⁻¹重组小鼠BST2。
(L) 参与“对外部刺激反应的负调控”条目的基因，其中特别标出了Cd200r1。
(M) 第6天CD11b⁺F4/80⁺Ly6G⁻Ly6C低表达至阴性细胞中CD200R的平均荧光强度。*p < 0.05。
(N) 高胆固醇饮食喂养的ApoE缺失小鼠的重组BST2给药方案。重组
每周注射BST2三次，持续9周。
(O) 对按(N)所述方式处理的小鼠进行全主动脉铺片油红O染色，分析斑块负荷。每组n = 9只小鼠，其中雄性6只、雌性3只，数据合并自三个独立的处理队列。比例尺，5 mm。*p < 0.05。
(P) 对按(N)所述方式处理的小鼠进行主动脉根部斑块分析。展示了距窦管交界处200 µm的代表性切片及连续切片定量结果。每组n = 5只小鼠，其中雄性2只、雌性3只，数据合并自两个独立的处理队列。比例尺，500 µm。*p < 0.05，双侧t检验。
我们考察了Bst2的诱导表达是否与Bst2基因座的转录调控直接相关。Bst2属于Aging_1基因集，在原代心脏内皮细胞（EC）中进行的STAT1染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，IFNα和LPS刺激后，STAT1在Bst2转录起始位点上游的结合增加（图7E），支持Bst2受IFN相关信号直接调控。接下来，我们分析了应激调控的、由内皮细胞向免疫细胞谱系传出的信号。Bst2与通过Pira2向巨噬细胞谱系细胞传递的信号相关，尤其是在心脏和骨骼肌中（图7F和S7B）。Pira2在Ly6c⁺单核细胞中的表达最高（图7G），提示这些细胞可能是信号的接收者，但仅凭细胞间相互作用（CCI）分析尚无法确定这一相互作用的功能方向。鉴于既往研究报道BST2–PIRA2相关通讯与免疫调控有关⁴⁰,⁴¹，我们采用骨髓来源巨噬细胞（BMDM）分化实验检测了BST2的功能效应。在巨噬细胞分化条件下，将CD11b⁺骨髓细胞与重组小鼠BST2共同培养（图7H）。BST2增加了第3天的细胞总数（图7I），并促进了CD11b⁺F4/80⁺细胞的增殖
巨噬细胞谱系细胞，而CD11b⁺F4/80⁺细胞未受到显著影响（图7J和S7C）。随后，我们在第6天检测了转录和表型变化。群体RNA测序（bulk RNA-seq）显示，细胞对BST2呈剂量依赖性的转录应答（图S7D），其中富集的调控程序包括对外部刺激应答的负调控、髓系细胞分化以及炎症反应的负调控（图7K）。在参与形成这一调控特征的基因中，Cd200r1表达升高（图7L），这与骨骼肌在衰老应激下CD200相关的内皮细胞向巨噬细胞谱系细胞的信号传导增强相一致（图7F）。流式细胞术证实，单个细胞的CD200R蛋白表达水平升高，而CD200R阳性细胞的比例在不同样本间存在差异（图7M和S7F）。其他巨噬细胞标志物，包括CX3CR1、I-A/I-E和CD206，均未发生明显变化（图S7E和S7G）。因此，尽管BST2的诱导表达位于IFN信号通路的下游，但它可能通过增强巨噬细胞中与CD200R相关的调控特征，参与代偿性抑制机制。
在心脏和骨骼肌这两个与动脉粥样硬化性血管疾病密切相关的器官中，均鉴定出了Bst2相关的细胞通讯通路。此外，已有研究报道，CD200–CD200R免疫检查点可在动脉粥样硬化进展过程中限制单核细胞–巨噬细胞的活化与募集⁴²。鉴于BST2可在巨噬细胞分化过程中提高CD200R的表达，我们检验了BST2是否能够在体内影响动脉粥样硬化的发生。对喂食高胆固醇饮食的ApoE缺失小鼠给予重组小鼠BST2，持续9周（图7N）。持续BST2处理显著降低了
整个主动脉及主动脉根部的动脉粥样硬化斑块负荷（图7O、7P和S7H）。我们证实，两组主动脉根部病灶中的巨噬细胞均表达CD200R（图S7I）。综上，这些发现表明，衰老相关的内皮细胞IFN程序不仅与炎症激活有关，还可诱导调节性效应分子的表达。BST2即为此类由IFN诱导的内皮效应分子之一，将炎症性IFN激活与CD200R相关的巨噬细胞调控及动脉粥样硬化病灶形成的抑制联系起来。
讨论
在本研究中，我们阐明了不同器官的血管内皮细胞（EC）如何整合衰老与代谢过载的影响。通过对脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏中的内皮细胞及造血细胞群体进行分析，我们将内皮细胞转录重塑与免疫细胞组成及细胞间通讯联系起来。空间转录组学进一步解析了血管生态位，其中内皮细胞、基质细胞和髓系细胞围绕衰老相关炎症程序形成空间组织。这些分析表明，血管炎症性衰老具有局部组织化特征，炎症激活信号与抑制性信号共存于血管周围邻域内。尽管存在慢性全身性应激，器官特异性的内皮细胞转录特征仍相对保留。这一发现与既往研究一致，即内皮细胞具有器官和血管床特异性，并非构成均一的血管内衬⁶˒¹¹˒¹⁴，且血管床身份由发育期及出生后的内皮模式形成程序塑造²˒³˒²⁵˒⁴³˒⁴⁴。我们的数据进一步拓展了这一认识，表明衰老和代谢过载作用于既有的血管床特化特征，从而产生共有的及具有器官偏向性的内皮细胞
应激反应。
衰老与高脂饮食应激以不同方式重塑了内皮细胞的调控网络。衰老诱导了一个广泛保守的干扰素相关程序，涉及 Irf7、Irf9、Stat1 和 Stat2；而高脂饮食应激则优先激活具有器官偏向性的脂质代谢与重塑程序，包括与 Pparg 和 Cebpd 相关的调控子。与这一衰老相关特征一致，近期的多器官内皮细胞单细胞分析同样发现，衰老可在不同器官中诱导共同的干扰素应答和抗原呈递程序，其中包括与本研究所分析器官重叠的器官⁴⁵。既往关于内皮衰老和代谢应激的研究也描述了炎症及干扰素应答程序的激活，同时伴随血管生成程序和内皮再生能力的减弱¹⁷,⁴⁶,⁴⁷。本研究进一步拓展了这些观察结果，表明内皮细胞的干扰素（IFN）程序与器官特异性的内皮细胞–免疫细胞通讯相耦联，并局限于局部血管微环境。
尽管衰老在概念上常与细胞衰老相联系，但时序性衰老并不对应于一种均一的细胞衰老状态。p53 信号通路体现了这一区别，因为包括本团队研究在内的既往研究已表明，p53 活性可产生依赖于应激类型和具体情境的多种效应，涵盖选择性基因调控、代谢性炎症以及细胞命运改变⁴⁸–⁵⁰。这一视角与血管衰老密切相关，因为其中的炎症程序可能反映了有组织的组织应激反应。衰老伴随着慢性、低度炎症，通常称为炎症性衰老（inflammaging），这一概念与持续性无菌性炎症以及心血管、代谢和
衰弱相关表型⁵¹–⁵³。慢性炎症也被认为是衰老的标志之一，而减弱持续性炎症信号传导已被提出作为改善年龄相关组织功能障碍的一种策略⁵⁴。我们的研究结果在血管衰老背景下进一步细化了这一观点。我们通过对内皮细胞（ECs）的单细胞分析，定义了富集干扰素刺激基因（ISGs）的 Aging_1 程序。将该程序映射回衰老组织后，其标记出围绕血管结构组织的局灶性炎症位点，表明血管炎症具有空间局限性。因此，即使是这种可被广泛诱导的干扰素（IFN）程序，也呈现出围绕衰老血管系统的空间组织特征。这一发现支持如下血管炎症性衰老观点：内皮细胞不仅是全身性炎症的被动响应者，也是免疫和基质炎症反应聚集并发生的空间锚点。Irf7、Irf9、Stat1 和 Stat2 的协同富集提示 I 型 IFN 调控轴被激活⁵⁵–⁵⁷。cGAS–STING 激活等无菌性损伤通路可能将 DNA 损伤、细胞衰老、I 型 IFN 诱导及衰老相关炎症联系起来⁵⁸–⁶¹。
空间转录组学阐明了 IFN 响应性内皮细胞状态在衰老组织中的组织方式。Aging_1 高表达区域形成了血管周围 ISG 簇，并嵌于包含内皮细胞、基质细胞、髓系细胞和血管壁细胞群的多细胞邻域中。这种组织方式与近期空间研究的发现一致，即血管相关生态位是心脏衰老和炎症性衰老的主要热点区域⁴⁶。我们的数据进一步拓展了这一概念，将血管周围 ISG 簇鉴定为衰老心脏和脂肪组织中内皮细胞 IFN 激活的局部单元。重要的是，这些簇并非仅仅是
炎症聚集部位。在衰老脂肪组织中，富含 TNF 的免疫细胞聚集体位于 ISG 阳性血管区域附近，这与局部炎症输入相一致。同时，对 C3 相关信号的空间定位分析显示，C3 表达区域邻近 Lrp1 阳性区域，而 C3ar1 则呈现不同的分布。鉴于 LRP1 的清道夫功能和内吞作用，这种 C3–Lrp1 空间关系可能反映了衰老血管微环境中的局部清除或缓冲作用⁶²,⁶³。与这些发现一致，C3 缺失进一步提高了衰老心脏中 IRF7 的表达，提示补体相关空间信号可能调节血管周围的 IFN 相关炎症。
BST2 提供了一个例证，说明内皮细胞 IFN 程序除引发炎症激活外，还可产生调节性效应。在我们的功能实验中，BST2 促进了与 CD200R 相关的巨噬细胞状态，并减少了动脉粥样硬化病变的形成，提示 IFN 诱导的内皮细胞分子能够以保护性方式调控髓系细胞行为。这一概念与更广泛的原则一致，即干扰素刺激分子既可限制炎症反应，也可促进其扩展⁶⁴。因此，内皮细胞 BST2 可能代表一条下游途径，通过该途径，慢性 IFN 激活可转化为以巨噬细胞为作用对象的血管保护效应。
我们的研究将血管炎症性衰老重新界定为一种局部调节过程，而非均一的炎症状态。保守的内皮细胞 IFN 反应是这一过程的组成部分之一，其效应受到器官背景、邻近免疫细胞和基质细胞、补体相关清除信号以及 BST2 等内皮细胞效应分子的共同影响。这些发现不支持不加区分地抑制
IFN信号传导，而是支持靶向病变血管微环境中特定的内皮–免疫细胞通讯程序。这一观点可能有助于解释器官选择性血管疾病，并指导针对血管衰老和动脉粥样硬化的更精准免疫干预。
研究局限性
本研究存在若干局限性。多器官单细胞RNA测序分析起始时，各条件下的生物学重复数量有限。因此，细胞水平的转录组分析和细胞间通讯分析主要被用作探索性框架，以筛选候选的内皮应激程序和内皮–免疫细胞相互作用，随后通过空间转录组学、基于图像的验证及功能扰动实验确定优先研究对象。未来仍需开展进一步的遗传学及器官特异性扰动研究，以明确C3和BST2相关通路的因果层级关系。尽管如此，经过验证的研究结果支持：在衰老血管中，内皮应激反应、血管周围免疫微环境与炎症性重塑之间存在以IFN为中心的联系。
资源可用性
主要联系人
如需进一步信息或索取资源与试剂，请联系主要联系人Tomoaki Tanaka（tomoaki{at}restaff.chiba-u.jp），其将负责处理相关请求。
材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。
数据和代码可用性
本研究生成的RNA测序、单细胞RNA测序、Visium HD空间转录组及Xenium原位基因表达数据集已存储于日本DNA数据库（DDBJ）的基因组表达档案库（GEA）。登录号为E-GEAD-1267、E-GEAD-1268、E-GEAD-1269、E-GEAD-1270和E-GEAD-1277。
与这些GEA记录关联的原始测序读段已存储于DDBJ序列
测序读段档案库（DRA）。
本研究使用的公开可用数据集列于关键资源表和方法部分。
用于复现转录组分析的自定义代码见 Supplementary_Code_Transcriptomic_Analyses.md。
重新分析本文所报告数据所需的任何其他信息，均可向主要联系人提出请求获取。
经费支持
本研究获得了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目（KAKENHI）的支持：授予 M.Y. 的科学研究资助（C）20K08397 和 23K07571；授予 T.T. 的科学研究资助（B）19H03708、21H02974 和 23K27500；授予 T.T. 的开拓性研究资助 23K17429；以及授予 T.T. 的科学研究资助（C）26K10123 和 25K10723。本研究还获得了以下资助：武田科学振兴财团、上原纪念生命科学财团以及持田纪念医学药学振兴财团向 M.Y. 和 T.T. 提供的资助；细胞科学研究财团、千叶大学治疗学推进计划、金原一郎纪念医学医疗振兴财团、滨口生物化学振兴财团以及山口内分泌疾病研究振兴财团向 M.Y. 提供的资助；以及内藤纪念科学振兴财团、第一三共生命科学研究振兴财团、诺华科学振兴财团（日本）和下一代激素学院人类健康与长寿捐赠基金向 T.T. 提供的资助。
作者贡献
M.Y. 和 T.T. 设计了本研究。M.Y.、A.N.、Y.T. 和 M.C. 进行了实验，M.Y.、M.C. 和 M.S. 分析了数据。Y.G. 制备了 RNA-seq 文库。M.F. 参与了单细胞分析流程构建和工具选择，K.I. 统筹了数据分析。J.I. 协助进行了组织学制样。M.Y. 撰写了手稿，而 T.T.
监督本研究。
利益声明
作者声明不存在任何竞争性利益。
生成式人工智能及人工智能辅助技术使用声明
在本研究的准备过程中，作者使用了ChatGPT辅助修改稿件的英语语法，提升表述的清晰度和可读性，并通过实现既有计算方法，辅助分析代码的编写与调试。所有分析、解释和结论均由作者审查并核实，作者对已发表文章的内容承担全部责任。
补充信息
文档S1. 图S1–S7及补充图图注
数据S1. 补充数据文件_regulonTargetsInfo，与图1–3相关
数据S2. 补充数据文件_scRNA分析数据，与图1–4相关
数据S3. 补充数据文件_实验原始数据，与图5–7及图S1相关
Supplementary_Code_Transcriptomic_Analyses.md. 用于复现转录组分析的自定义代码，与STAR方法相关
STAR★方法
关键资源表
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实验模型与研究参与者详细信息
小鼠
所有动物实验均按照机构指南进行，并获得千叶大学动物伦理委员会批准。小鼠饲养于无特定病原体条件下，环境温度为22 °C，采用12小时光照/黑暗周期，湿度为40%–70%，可自由摄食和饮水。在采集样本时、获取组织前测量体重。雄性C57BL/6J小鼠于6周龄时购自日本SLC公司，用于单细胞RNA测序分析。为比较衰老相关差异，在小鼠3月龄或12月龄时进行分析。对于饮食诱导的代谢应激
实验中，小鼠饲喂普通饲料或脂肪供能占比为60%的高脂饲料（Research Diets，D12492）。对于Visium HD空间转录组学分析，选取3月龄和24月龄小鼠，分别代表年轻和高龄小鼠。对于动脉粥样硬化实验，ApoE缺失小鼠（B6.129P2-Apoe/J）自12–15周龄起饲喂高胆固醇饲料（Research Diets，D12079B）。按照方法部分所述，向ApoE缺失小鼠给予重组BST2。对于补体耗竭实验，按照方法部分所述，使用眼镜蛇毒因子或PBS处理15月龄的野生型C57BL/6J小鼠。除非另有说明，单细胞和空间转录组学分析均使用雄性小鼠。部分动脉粥样硬化和补体耗竭实验同时纳入雄性和雌性小鼠。未将性别作为主要生物学变量进行分析，这限制了研究结果在不同性别间的推广。
方法详情
用于单细胞分析的细胞分选
使用FACSMelody细胞分选仪（BD Biosciences）分离内皮细胞和造血细胞。首先，在3%异氟烷麻醉下，经小鼠眶后注射25 μg与Alexa Fluor 647 NHS酯（Thermo Fisher）偶联的抗VE-钙黏蛋白抗体（Biolegend，克隆BV13），进行活体VE-钙黏蛋白染色，10分钟后对小鼠实施安乐死。使用10 ml PBS灌流后采集样本。脂肪组织取自双侧附睾脂肪。肌肉组织取自双侧股四头肌、胫骨前肌、趾长伸肌、比目鱼肌和腓肠肌。对于脂肪组织以及心脏和肝脏样本，将剪碎的组织样本与一种
使用胶原酶-II（2.5 mg ml⁻¹，Worthington Biochem）/Dispase-II（2.5 ml⁻¹，Gibco）混合液于37°C孵育30 min。对于肌肉组织，使用胶原酶-IV（2.0 mg ml⁻¹，Worthington Biochem）/Dispase-II（0.7 mg ml⁻¹，Gibco）混合液，于37°C孵育40 min。将细胞经40 μm细胞滤网过滤，以500 × g离心5 min，随后使用ACK缓冲液（Thermo Fisher）在冰上进行红细胞裂解处理2 min，制备单细胞悬液。在抗体染色前，首先使用抗CD16/32抗体（2.4G2）封闭单细胞悬液。进一步染色使用以下抗体：抗CD31抗体（PE-Cy7，克隆390，BioLegend）、抗CD45抗体（Alexa Fluor 488，克隆30-F11，BioLegend）和抗Ter119抗体（Pacific Blue，BioLegend）。将DAPI⁺细胞定义为死亡靶细胞。排除死细胞或Ter119⁺细胞后，将VE-cadherin和CD31双阳性细胞分选为内皮细胞，将CD45⁺细胞分选为造血细胞。
单细胞RNA测序文库制备
按照10× Genomics的规范制备scRNA-seq文库。针对每个文库，将分选得到的内皮细胞和造血细胞按相同数量混合，并加载至10× Genomics Chromium Controller或10× Genomics Chromium Connect。将来自1岁龄小鼠的样本加载至10× Genomics Chromium Controller以生成GEM微珠，并按照制造商说明，使用Chromium Next GEM Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v3.1进行逆转录、cDNA扩增和文库构建。将来自3月龄小鼠的样本加载至10× Genomics Chromium Connect。10× Genomics Chromium Next GEM Automated Single Cell 3′文库及
使用 Gel Bead Kit 构建文库。使用 Agilent TapeStation 对文库进行定量和质量评估。所得文库使用 NovaSeq 6000 试剂盒 v1.5（SP 或 S1），在 NovaSeq 6000 平台上采用双端测序流动槽进行测序。随后，使用 Cell Ranger 流程（7.0.0）处理测序数据，生成用于下游分析的基因表达矩阵。
单细胞 RNA 测序数据分析
将 raw_feature_bc_matrix.h5 文件作为输入，使用 CellBender v0.3.2 去除数据中的背景噪声。所有数据分析均使用 Seurat 5.0.3 版本进行。依据以下阈值筛选细胞：nFeature_RNA > 1000、nFeature_RNA < 5000 且 percent.mt < 10。筛选后，对每个样本使用 SCTransform 进行归一化。假定双细胞形成率为 7.5%，在开展下游分析前，应用 DoubletFinder（v3）算法通过计算方法去除双细胞。为合并多个数据集，使用 SelectIntegrationFeatures 函数确定高变特征。对基因进行过滤，去除通常与线粒体基因、核糖体 RNA、假基因、非编码 RNA 及其他功能不明确基因相关的基因。具体而言，排除与以下模式匹配的基因："mt-"、"MT-"、"MMU"、"SNO"、"Gm"、"Rn6"、"RNA"、"7SK"、"SNORD"、"SNORA"、"SCARNA"、"B3g"、"Vmn"、"Mir"、"Rik"、"Snora"、"Snord"、"LOC"、"Rn4"、"OTTMUSG"、"Scarna"、"Rnu"、"Rmr"、"Rpl"、"Rps"、"AW"、"BC"、"Malat1"、"H2-"、"B2m"、"Actb"、"AA"、"AB"、"AC"、"AF"、"AI"、"AL"、"AU"、"AV"、"AW"、"AY" 和 "Hist"。进行此过滤旨在确保仅将具有生物学相关性的基因纳入下游分析。其分子表达……
使用 FindAllMarkers 函数，采用以下参数，鉴定来自四个器官的内皮细胞中表达水平最高的前100个基因：only.pos = TRUE、min.pct = 0.25 和 logfc.threshold = 0.25。为提取衰老或饮食比较中排名前100的差异表达基因，我们首先应用了 PrepSCTFindMarkers。随后，针对每个器官使用 FindMarkers 函数，并设置参数 logfc.threshold = 0.25 和 recorrect_umi = FALSE。根据每个器官中校正后 p 值（p_val_adj）从小到大的排序，选取前100个基因。使用 enrichGO 函数进行基因本体分析，参数设置如下：OrgDb = org.Mm.eg.db、keyType = "ENTREZID" 和 ont = "ALL"。p 值校正方法设置为“BH”（Benjamini–Hochberg），p 值阈值和 q 值阈值均设为0.05。为计算特征评分，我们采用了一种改良的二维评分方法。根据表达水平及检测到各基因的细胞比例选择对照基因。对于目标列表中的每个基因，均鉴定出一组具有相似表达模式的对照基因。最终特征评分通过从目标基因集的平均表达量中减去对照基因的平均表达量计算得出。特征评分使用自定义函数 calculate_signature_score 计算，该函数首先通过 get_controls 函数选择对照基因。对于每个细胞，计算目标基因列表的平均表达量，并减去一组对照基因的平均表达量。该方法确保特征评分针对细胞复杂度进行校正，从而降低整体转录活性的影响。
单细胞 RNA 测序
预处理与细胞注释
聚类后，基于经典标志基因的表达进行细胞注释。通过 Pecam1 和 Cdh5 的表达鉴定血管内皮细胞，并将其与 Ptprc 阳性的造血细胞及 Col1a1/Pdgfra 阳性的成纤维细胞区分开。造血细胞被注释为巨噬细胞/单核细胞/树突状细胞（DC）群体（巨噬细胞谱系）、T 细胞/自然杀伤（NK）细胞/固有淋巴样细胞（ILC）群体（T 细胞谱系）、B 细胞/浆细胞群体（B 细胞谱系）、中性粒细胞和肥大细胞。用于注释的代表性标志基因包括：巨噬细胞谱系的 Cd68 和 Csf1r；T 细胞谱系的 Cd3e、Cd3d 和 Nkg7；B 细胞谱系的 Ms4a1 和 Cd19；中性粒细胞的 Ngp 和 S100a8；以及肥大细胞的 Tpsb2。表达多个谱系标志基因的细胞簇被标记为混合细胞，增殖细胞则通过 Mki67、Top2a 和 Cdk1 的表达进行鉴定。混合谱系细胞和增殖细胞被排除在后续内皮细胞分析之外。对血管细胞进行亚聚类，以界定内皮细胞和血管壁细胞群体。使用 Pdgfrb、Cspg4、Tagln 和 Acta2 对周细胞/血管平滑肌细胞进行注释。使用 Prox1、Pdpn 和 Lyve1 对淋巴管内皮细胞进行注释。在脂肪组织、骨骼肌和心脏组织中，使用以下公认的血管标志基因，将血管内皮细胞分为动脉、静脉和毛细血管内皮细胞：动脉内皮细胞的 Fbln5 和 Hey1，静脉内皮细胞的 Vwf、Nr2f2 和 Vcam1，以及毛细血管内皮细胞的 Rgcc 和 Car4。肝脏内皮细胞单独进行注释。使用 Lyve1 和 Vwf 区分肝窦内皮细胞与大血管内皮细胞，而 Vwf
阳性肝内皮细胞根据 Rspo3、Bmp4、Adgrg6 和 Nrg1 的表达进一步细分为中央静脉内皮细胞和门静脉内皮细胞。根据经典标志物的表达对 B 细胞谱系细胞进行细分。以 Il7r、Rag1 和 Myb 的表达定义早期 B 细胞（pro-B 细胞），而将高表达 Vpreb3 的 Ms4a1 阳性 B 细胞簇指定为前 B 细胞（pre-B 细胞）。利用 Ighd、Fcer2a、Zbtb20、Zbtb32 和 Bhlhe41 对成熟 B 细胞和记忆 B 细胞进行注释。将 Cd19 阴性、Ms4a1 阴性且 Jchain 阳性的细胞簇归类为浆细胞。对于 T 细胞谱系，使用 Cd3e 和 Cd3d 定义 T 细胞。对于表达 Nkg7 和 Klrb1c 的 Cd3 阴性细胞，根据 Gzma 和 Xcl1 的表达将其归类为 NK 或 ILC1 细胞群，而 ILC2 细胞则通过 Gata3、Il1rl1、Klrg1 和 Rora 进行鉴定。在 Cd3 阳性 T 细胞中，以 Tmem176a 和 Tmem176b 的表达定义 Th17 细胞，以 Trdc 和 Trdv4 的共表达标记 γδTh17 细胞。将 Foxp3 阳性且 Ctla4 阳性的细胞簇注释为调节性 T 细胞。通过 Cd4 和 Cd8a 的表达区分 CD4 阳性和 CD8 阳性 T 细胞亚群，并以 Ccr7 和 Lef1 标记初始 T 细胞。对于巨噬细胞谱系，使用经典髓系标志物对单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞亚群进行注释。利用 Cd209a、Siglech、Ccr9、Ccr7 和 Il4i1 对树突状细胞亚群（moDC：单核细胞来源的树突状细胞；pDC：浆细胞样树突状细胞；mRegDC：成熟相关/调节性树突状细胞）进行注释。将 Plac8 阳性细胞指定为单核细胞，并根据 Ly6c2、Chil3、Ace 和 Ccr2 的表达进一步细分。利用 Cd163、Retnla、Ear2、Ccr2、Cx3cr1 和 Trem2 对巨噬细胞亚群进行注释。库普弗细胞被鉴定为一种肝脏特异性巨噬细胞
共表达Cd5l和Clec4f的细胞群。比较了不同器官和条件下这些免疫细胞亚群的相对丰度，以支持CCI分析中的来源细胞归属判定。
用于转录因子网络表征的SCENIC分析
采用在R中实现的单细胞调控网络推断与聚类（SCENIC，v1.3.1）推断转录因子–靶基因调控网络。使用了两个基序数据库：“mm10 refseq-r80 10kb_up_and_down_tss.mc9nr.feather”和“mm10 refseq-r80 500bp_up_and_100bp_down_tss.mc9nr.feather”。在extended模式下鉴定调控子，该模式同时纳入高置信度和低置信度的基序注释（highConfAnnot = TRUE/FALSE）。对于每个器官数据集，使用regulonAUC函数量化各细胞中的调控子活性，并使用calcRSS计算调控子特异性评分（RSS）。保留RSS > 0.01且Z > 1.0的调控子用于后续分析。调控子的层次聚类采用欧氏距离和ward.D连接法，相关性分析采用Spearman方法。在多个分析层面开展器官特异性和条件特异性比较。对于衰老分析，分别对正常饮食的年轻和老龄小鼠的内皮细胞亚群独立进行SCENIC分析。根据RSS差异对调控子进行排序，并为每个器官筛选在老龄样本中富集程度最高的转录因子。合并这些器官层面的结果，以鉴定共有的和组织局限性的衰老响应调控子。从regulonTargetsInfo中获取各调控子与其靶基因之间的共表达强度（CoexWeight参数），并用于定义衰老相关调控簇。对于饮食相关分析，
在应激分析中，对来自正常饮食或高脂饮食（HFD）条件下的内皮细胞采用了相同的分析流程。对差异富集的调控子进行排序，并通过跨器官比较界定饮食响应性调控模块。为对所有条件（四种器官 × 四种状态：年轻/正常饮食、衰老/正常饮食、年轻/HFD、衰老/HFD）进行整合评估，计算了各数据集的 regulonAUC 和 RSS，以比较不同应激类型和组织中的调控子活性。使用
cor(method = "spearman")
和
hclust(method = "ward.D2")
构建相关性矩阵并进行层次聚类，以识别共调控模块。在基因–调控子模块分析中，将各器官中排名靠前的应激响应基因的并集与 SCENIC 鉴定出的排名靠前的应激响应调控子的并集相结合。利用 CoexWeight 参数从 regulonTargetsInfo 中提取各调控子与其靶基因之间的共表达权重，并构建基因–调控子矩阵。通过对该矩阵进行层次聚类，界定应激响应性基因–调控子模块。为评估所鉴定的调控子是否在单细胞水平上与相应基因模块相关，使用表达水平匹配的对照基因计算各基因模块的特征评分。随后，在单个内皮细胞中，将 SCENIC 得到的 regulonAUC 值与相应的模块特征评分进行比较。计算各调控子–模块对的 Pearson 相关系数并进行汇总，以识别与共有或器官偏向性应激响应模块相关的调控子。
转录因子调控子活性与通路富集之间的相关性分析
为探究应激响应性转录因子（TF）调控子在功能上如何
为探究其与细胞信号传导状态的关联，我们在单细胞水平评估了调控子活性与通路富集评分之间的相关性。针对每个器官（脂肪组织、骨骼肌、肝脏和心脏），从 Seurat 对象中提取内皮细胞，并分别在衰老和饮食条件下进行分析。对于每项比较，筛选出在 SCENIC 调控子活性分析中呈现应激相关变化的转录因子（TF）调控子，用于后续通路相关性分析。采用 UCell 软件包（v2.3.0）和 Reactome 通路注释，通过单细胞基因集变异分析（scGSVA）量化通路活性。使用 buildAnnot() 函数构建 Reactome 参考矩阵，参数设置为 species = “mouse”、keytype = “SYMBOL” 和 anntype = "Reactome"。使用 scgsva() 函数计算富集评分，参数设置为 method = "UCell" 和 maxRank = 5000。将所得通路评分整合至 Seurat 对象的元数据中，用于下游分析。对于每个选定的 TF 调控子，从 SCENIC 的 regulonAUC_extended assay 中提取调控子活性值，并在每个器官及每项应激条件比较中，基于单个内皮细胞计算调控子活性与 Reactome 通路富集评分之间的 Spearman 相关系数。仅保留正相关结果用于后续排序。将 Spearman 相关系数的平方记为 R²，用于评估关联强度。R² > 0.1 的通路被认为与相应调控子相关。按 R² 排序，汇总每个调控子正相关程度最高的前 20 条通路，并使用 ggplot2（v3.5.1）进行可视化。为考察 TF 调控子与通路之间的整体关系，通过连接构建相关性网络
将每个转录因子（TF）调控子与其跨器官相关性最高的通路相连接。根据斯皮尔曼相关系数，通过加权边连接代表TF调控子和通路的节点，并使用igraph（v1.5.0）进行可视化。选择性标注相关系数大于0.3的通路或TF调控子所对应的节点，并突出其节点边框，以强调高度关联的关系。同样，与基准边相比，相关系数大于0.3的边以更粗的线条绘制，以突出转录因子–通路网络中较强的关联。
细胞间通讯推断
使用CellChat（小鼠数据库），基于经SCTransform标准化的计数数据，推断四种条件（年轻与衰老；普通饮食与高脂饮食）下四个器官（脂肪组织、心脏、骨骼肌和肝脏）的细胞间信号传导，共开展16项独立分析，并将结果保存为RDS对象，以供下游比较。对于每个器官–条件数据集，使用经整理的主要细胞类别作为分组变量构建CellChat对象（毛细血管、动脉和静脉内皮细胞；T细胞/自然杀伤细胞/固有淋巴样细胞；B细胞/浆细胞；巨噬细胞/单核细胞/树突状细胞）。依次执行标准流程：normalizeData、subsetData（筛选CellChatDB.mouse中的信号传导基因）、使用软件包默认参数运行identifyOverExpressedGenes和identifyOverExpressedInteractions、可选地投射至小鼠蛋白质–蛋白质相互作用（PPI）网络（projectData）、computeCommunProb（基于质量作用定律表述配体–受体使用情况，并通过内置的置换检验评估显著性）、filterCommunication（min.cells = 1）、computeCommunProbPathway和aggregateNet。使用netVisual_circle根据相互作用权重/强度对全局汇总结果进行可视化；这些数值即为报告于
正文主图。在每个器官内，使用 rankNet(mode = "comparison", stacked = TRUE, do.stat = TRUE) 对不同条件进行两两比较，以提取条件间（衰老和饮食比较）信息流发生显著变化的通路。在以内皮细胞为中心的汇总分析中，我们聚焦于毛细血管内皮细胞，并基于通路层面的网络（@netP）量化各通路的传入（入度）和传出（出度）中心性。为处理不同条件下的零膨胀现象，我们以比值、log2 倍数变化和绝对差值的形式，报告入度、出度及其总和（传入 + 传出）在条件间的变化。使用 netAnalysis_signalingChanges_scatter（idents.use = "Capillary Endothelial cell"）生成聚焦于毛细血管内皮细胞的散点图。为映射差异使用的配体–受体对，在比较对象中重新运行 identifyOverExpressedGenes，设置 group.dataset = “datasets”，将 pos.dataset 设为应激条件（例如 "Normal_Aged" 或 "HFD_Aged"），并设置阈值 thresh.pc = 0.1、thresh.fc = 0.1、thresh.p = 1，以收集广泛的候选集合，随后通过 netMappingDEG 将其与推断的细胞通信边取交集。用于比值、log2FC 和差值汇总的通路子集经过筛选，排除了普遍存在的细胞连接模块（例如 PECAM1、ESAM、PTPRM、CDH5、MPZ 和 KIT），并保留了应激响应相关家族（例如 MIF、CXCL、JAM、SEMA6/7 和 LAMININ）。所有分析均在 R 中使用固定随机种子完成；边层面的显著性检验和通路层面的差异检验采用该软件包中实现的 CellChat 置换检验框架。
CellChat 推断的信号传导与转录调控子及通路活性的整合
为将内皮细胞通信动态与
为关联转录调控与细胞功能，我们整合了 CellChat 输出、SCENIC 调控子活性以及通过 UCell 计算的单细胞通路评分。调控子活性通过对按器官划分的单细胞对象以扩展模式运行 SCENIC regulonAUC 进行量化；器官特异性和应激特异性转录因子（TF）取自本研究的发现阶段，并用于下游关联检验。单细胞通路活性采用 UCell 计算（使用 Reactome 小鼠基因集，以 SYMBOL 为键），设置 maxRank = 5000；所得评分存储于 Seurat 的 meta.data 中，以用于联合分析。对于每个 TF，我们在相应的器官–条件数据集内，计算其 regulonAUC 与所有 Reactome 通路评分在细胞间的 Spearman 相关性，为每个 TF 保留排名前 20 的通路，并以网络图进行汇总（使用 igraph，采用 Fruchterman–Reingold 布局）。节点代表 TF 或 Reactome 通路，边以相关系数加权。为便于解读，仅标注相关系数 > 0.3 的节点以及所有 TF 节点，并将相关系数 > 0.3 的边加粗显示（边宽 = 3）。在将细胞间相互作用（CCI）边与 TF 调控相联系的补充性基因层面分析中，我们将 CellChat 通路中存在的内皮细胞配体/受体基因与 SCENIC regulonTargetsInfo（包含共表达权重和基序证据，包括 highConfAnnot、nMotifs、bestMotif、NES 及共表达统计量）取交集，随后依据这些基因是否属于根据各器官 Reactome 注释汇编的器官特异性 Reactome 通路进行筛选。经过上述筛选后，使用桑基图（ggalluvial）汇总组织 → 基因 → TF 的关系。为在单细胞分辨率下量化 TF–基因耦合，我们在各器官中基于单细胞数据拟合线性模型（基因表达 ∼ regulonAUC），并报告 R²；基因–TF
R² > 0.08 的配对被保留，并在所有器官中进行排序。对于跨器官汇总，柱状图按器官着色，并限制为通过 R² 截断值筛选的配对。在整个研究过程中，所有器官和比较均统一采用相同的截断值和展示规则，以保持可比性：UCell maxRank = 5000；根据 Spearman 相关性为每个 TF 选取排名前 20 的通路；相关性 > 0.3 时标注节点；相关性 > 0.3 时使用粗边；TF–基因回归采用 R² > 0.08 作为筛选标准。跨器官汇总毛细血管内皮细胞（EC）分析的图形采用与 CellChat 散点图完全一致的坐标轴范围和图形样式，从而能够直接比较传入/传出影响及其 TF–通路耦合关系的变化。
Visium HD 空间转录组文库制备
取小鼠心脏和内脏脂肪组织，并置于 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中固定。样本经梯度乙醇溶液脱水、二甲苯透明化后，包埋于石蜡中（Tissue-Tek Paraffin Wax II 60，Sakura Finetek）。将 FFPE 包埋块切割为厚度 10 µm 的切片。为进行 RNA 质量控制，使用 RNeasy FFPE Kit（QIAGEN，73504）从脱蜡切片中提取 RNA，并使用 Agilent TapeStation 对 RNA 质量进行评估。DV200 值大于 30% 的样本用于文库制备。按照制造商的操作规程，使用 Visium Mouse Transcriptome Probe Kit v2 制备 Visium HD 空间转录组文库。文库在 Illumina NovaSeq 6000 测序系统上采用双端测序，并使用 S1 流动槽进行测序。
用于空间细胞类型注释的参考数据集构建
构建了组织特异性参考数据集，用于空间细胞类型注释。小鼠衰老图谱公共数据集被
从 CZ CELLxGENE Discover 以 h5ad 文件格式获取的数据集，包括 Tabula Muris Senis 图谱中的心脏、脂肪组织和性腺脂肪垫数据集，均从 CZ CELLxGENE Discover 以 h5ad 文件格式获取。在下游处理前，将细胞类别列转换为字符串格式。对于心脏分析，将 Tabula Muris Senis 心脏数据集与本研究生成的单细胞 RNA 测序数据集合并，随后进行归一化和整合，以构建参考数据集。所得心脏参考对象保存为 reference_rctd_heart.rds，并使用 spacexr 进行基于 RCTD 的注释。对于脂肪组织，将 Tabula Muris Senis 脂肪组织和性腺脂肪垫数据集与我们此前分析的脂肪组织单核 RNA 测序数据集合并，以构建参考数据集；后者已存储于 BioProject，登录号为 PRJDB17809³³。所得脂肪组织参考对象保存为 adipose_merged_obj_reference.rds，并使用 Seurat 的 FindTransferAnchors 和 TransferData，将标签基于锚点转移至经细胞分割的 Visium HD 脂肪组织数据集。
Visium HD 数据处理与细胞类型注释
使用 Space Ranger v4.0.1 处理原始测序数据。心脏样本采用 8 µm 分箱输出矩阵进行分析，而内脏脂肪组织样本则采用基于细胞分割的输出矩阵进行分析。下游分析使用 Seurat v5.0.3 完成。对于每种组织，使用 BPCells 将四个样本加载为磁盘存储矩阵，并转换为 Seurat 对象。以 nCount_RNA 为 25 作为阈值，去除测序深度较低的空间单元。对数据集进行归一化，识别高变特征，并利用通过杠杆值选取的 50,000 个细胞进行基于草图的降维
评分。对 sketch assay 进行主成分分析，随后使用第 1–30 维进行基于 Harmony 的整合、UMAP 可视化和聚类。随后将整合后的 sketch 分析结果投影回完整数据集。
使用 biomaRt 将基因标识符由 Ensembl ID 转换为 MGI 基因符号，同时保留未能映射的 Ensembl ID。对于心脏样本，使用 spacexr 对 nCount_RNA ≥30 的空间单元进行 RCTD 分析。从组织位置文件中获取各样本的空间坐标，并与相应的 8 µm 条形码匹配。使用心脏参考数据集，以双细胞模式运行 RCTD。将 RCTD 分类为“reject”的标签赋值为“Unknown”。通过整合基于标志基因的聚类注释、RCTD 预测以及对包括心脏瓣膜区域在内的解剖区域的人工校订，生成最终的心脏细胞类型标签。
对于脂肪组织，使用 Seurat 基于锚点的标签转移方法，从脂肪组织参考数据集中转移细胞类型标签。将最高预测评分低于 0.4 的细胞标记为“Unknown”。通过基于 Harmony SNN 的重新聚类和基于标志基因的注释，进一步明确归属不清的内皮细胞、髓系细胞及未知细胞群。将最终标签合并为简化的细胞类型注释。对于脂肪组织中经分割识别的细胞，从 Space Ranger 细胞分割 GeoJSON 文件中提取分割区域面积和质心坐标，并添加至 Seurat 元数据中，用于空间可视化和基于距离的分析。使用 Loupe Browser v9.0.0 对 Visium HD 处理过程中生成的 H&E 染色细胞图像进行可视化。采用相同的归一化方法及
所比较样本之间的色标设置。
使用 LIANA 进行空间细胞间相互作用分析
使用 LIANA 进行空间细胞间相互作用分析。采用预定义的干扰素刺激基因特征集，通过 Seurat 的 AddModuleScore 计算干扰素相关的 Aging_1 模块评分。在心脏样本中，于左心室感兴趣区域内开展分析，并将 Aging_1 评分 ≥0.3 的细胞定义为核心细胞。在脂肪组织中，将 Aging_1 评分 ≥0.05 的细胞定义为核心细胞。将距核心细胞 100 µm 范围内的非核心细胞定义为邻近细胞，其余所有细胞定义为远端细胞。根据细胞的空间关系和最终细胞类型注释，将空间相互作用分组标记为 Core、Neighbor_ 或 Distal_。
为构建 LIANA 输入数据，从 Seurat 对象中导出归一化表达矩阵及包含空间相互作用分组的元数据。心脏分析使用 Spatial.008um 数据层，脂肪组织分析使用 SCT 数据层。将导出的矩阵载入 Python，构建 AnnData 对象，并使用小鼠共识配体–受体资源进行 LIANA 排名聚合，以 CCI_group 作为分组变量。从邻近和远端来源组中提取以核心细胞为靶标的配体–受体相互作用。针对每种来源细胞类型及每个配体–受体对，分别计算邻近细胞至核心细胞和远端细胞至核心细胞相互作用的平均 lrscore 值。当邻近细胞至核心细胞的平均 lrscore 高于对应的远端细胞至核心细胞的平均 lrscore 时，保留该邻近富集相互作用。对两个年轻样本和两个衰老样本的结果进行汇总，并将在两个生物学重复中均可重复检测到的配体–受体相互作用
在至少一个年龄组中满足条件的条目被保留用于下游可视化。
Xenium 原位基因表达分析
按照上述方法对小鼠心脏、股四头肌和内脏脂肪组织进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）处理。通过 DAPI 染色和 Gapdh 原位杂交评估切片质量，并将另外制备的 5 µm 厚 FFPE 切片贴附于 Xenium 载玻片（PN-1000465；10x Genomics）上。按照《Xenium In Situ FFPE 组织制备指南》（CG000578 Rev F；10x Genomics）进行脱蜡和交联逆转。
使用 Xenium 平台（10x Genomics）进行原位基因表达分析。在包含 379 个基因的 Xenium Mouse Tissue Atlassing Panel v1 基础上，添加了使用 Xenium Panel Designer 设计的含 100 个基因的定制附加面板（设计 ID：BE76YW；BE76YW_mMulti_100g）。该定制面板包含 Aging_1 至 Aging_4 模块中的基因，以及通过我们的单细胞 RNA 测序分析鉴定的炎症细胞和内皮细胞注释标志基因。
按照 10x Genomics Xenium 实验方案进行探针杂交、连接、扩增、细胞分割染色、自发荧光淬灭、成像和解码。使用仪器软件版本 4.0.1.4 和分析软件版本 4.0.1.0，在 Xenium Analyzer 上处理载玻片。Xenium 运行结束后，在同一载玻片上进行苏木精-伊红（H&E）染色。使用 Xenium Explorer 版本 4.1.1 评估 Xenium 输出文件，并将 H&E 图像与 Xenium 数据进行配准。通过审查 Xenium Analyzer 汇总 HTML 文件并确认未报告任何运行级别错误来进行质量控制。基于 Aging_1 基因集计算 Aging_1 评分，并使用细胞分割输出结果界定细胞的
区室并绘制靶基因表达图谱。Xenium细胞边界采用默认的多模态分割工作流程生成，该流程整合了基于DAPI的细胞核分割、使用通用18S rRNA标记的细胞内部RNA染色，以及针对ATP1A1、E-cadherin和CD45的抗体介导的细胞边界染色。
脂肪组织内皮细胞中Junb调控子活性的分析
为研究脂肪组织内皮细胞中应激响应性转录程序，我们重点关注通过SCENIC调控子分析推断的Junb活性。对正常饮食条件下脂肪组织中的内皮细胞进行重新聚类，并确定其Junb调控子活性评分（RegulonAUC，扩展模式）。采用0.15作为截断值，将细胞分为“Junb高”和“Junb低”两组，该值对应于调控子活性分布的中位数范围。在这些细胞亚群内，进一步按年龄（年轻和老年）划分样本，形成四个亚组进行比较。为鉴定衰老过程中与Junb依赖性转录激活相关的基因，使用Seurat中的FindMarkers函数，在老年组内的“Junb高”和“Junb低”细胞亚群之间进行差异表达分析（log₂FC阈值 = 0.1）。根据平均log₂倍数变化由高到低，选取前100个差异表达基因。随后，使用Metascape（www.metascape.org）对这些候选基因进行功能富集分析，并利用TRRUST数据库对上游转录调控因子进行排序，以鉴定可能介导老年脂肪组织内皮细胞中Junb相关转录程序的关键因子。
冰冻切片的免疫荧光染色
活体内VE-cadherin染色通过以下方式进行：
在3%异氟烷麻醉下，向小鼠眶后注射25 µg预先偶联Alexa Fluor 647染料（Invitrogen，A37573）的抗VE-cadherin抗体（BioLegend，克隆号BV13）。注射10 min后，对小鼠实施安乐死，采集器官，并于4 °C下在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜。进行免疫染色时，样本经PFA固定后，置于30%蔗糖溶液中进行冷冻保护处理过夜，随后用OCT包埋剂包埋，并切成厚度为5 µm的切片。进行C3染色时，将未经预先固定的新鲜组织用OCT包埋剂包埋，冷冻、切片后，于−20 °C下用预冷甲醇固定10 min。组织切片使用含0.1% Triton X-100的PBS于室温下透化10 min，或使用预冷甲醇于−20 °C下透化10 min。使用含1%牛血清白蛋白（BSA；Thermo Fisher，37525）和5%正常驴血清的PBS于室温下封闭1 h。使用以下一抗进行免疫荧光染色：抗LYVE1抗体（AF2125，1:100）、抗IRF7抗体（MA5-41165，1:100）、抗JunB抗体（ab128878，1:100）、抗C3抗体（Invitrogen，PA1-29715，1:500）、抗CD200R抗体（Invitrogen，PA5-47345，1:50）、抗-
关键词：内皮细胞 · 血管炎性衰老 · 代谢过载 · I型干扰素信号 · 血管周围免疫生态位 · 巨噬细胞分化
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.02.736039v1?rss=1