实时关联转录组与细胞行为揭示成年神经干细胞在分子层面的命运不对称性及静息周期|北京沫之东生物技术有限公司

4 次围观

摘要

成年神经干细胞（NSCs）在转录层面具有异质性，但分子异质性与单个NSC轨迹之间的关系仍不清楚。本研究将转录特征与细胞特征及实时测量相结合，鉴定出隐藏于转录组空间中的分子轨迹。在自我更新的NSCs中，我们解析了与分裂时命运不对称相关的单细胞分子转变。我们还发现，在持续的静息期内，单个自我更新NSCs会逐步从深度静息的分子状态转变为浅度静息状态。总体而言，本研究揭示了NSCs在命运决定和状态转变过程中于转录组空间中的个体轨迹。尤其是，研究指出，成年NSCs遵循一种由转录编码的静息周期，该周期独立于谱系进程，通过平衡细胞分裂与细胞生长，使其能够随时间持续自我更新。

实时关联转录组与细胞行为，揭示成年神经干细胞中的分子命运不对称性与静息周期 | bioRxiv

跳转至主要内容

首页

关于

投稿

提醒 / RSS

搜索此关键词

高级搜索

最新结果

实时关联转录组与细胞行为，揭示成年神经干细胞中的分子命运不对称性与静息周期

查看 ORCID 个人资料

Tanya

Foley

，

查看 ORCID 个人资料

Isabelle

Foucher

，

查看 ORCID 个人资料

Gaëlle

Letort

，

查看 ORCID 个人资料

Jules

Samaran

，

Marion

Dussauge

，

查看 ORCID 个人资料

David

Morizet

，

查看 ORCID 个人资料

Nicolas

Dray

，

查看 ORCID 个人资料

Laura

Cantini

，

查看 ORCID 个人资料

Laure

Bally-Cuif

doi：

https://doi.org/10.64898/2026.07.05.736547

Tanya Foley

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，斑马鱼神经遗传学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

Tanya Foley 的 ORCID 记录

通信联系：

laure.bally-cuif{at}pasteur.fr

tanya.foley{at}pasteur.fr

Isabelle Foucher

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，斑马鱼神经遗传学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

Isabelle Foucher 的 ORCID 记录

Gaëlle Letort

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，果蝇发育决策动力学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

Gaëlle Letort 的 ORCID 记录

Jules Samaran

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，整合基因组学机器学习研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在以下平台上查找此作者

PubMed

在本站搜索此作者

Jules Samaran 的 ORCID 记录

Marion Dussauge

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，斑马鱼神经遗传学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

David Morizet

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，斑马鱼神经遗传学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

David Morizet 的 ORCID 记录

Nicolas Dray

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，斑马鱼神经遗传学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

Nicolas Dray 的 ORCID 记录

Laura Cantini

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，整合基因组学机器学习研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

Laura Cantini 的 ORCID 记录

Laure Bally-Cuif

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心 UMR3738，斑马鱼神经遗传学研究组

，F-75015 巴黎，

法国

在 Google Scholar 上查找此作者

在 PubMed 上查找此作者

在本站搜索此作者

Laure Bally-Cuif 的 ORCID 记录

通信联系：

laure.bally-cuif{at}pasteur.fr

tanya.foley{at}pasteur.fr

摘要

全文

信息／历史

指标

补充材料

预览 PDF

概要

成年神经干细胞（NSCs）在转录层面具有异质性，但分子异质性与单个神经干细胞变化轨迹之间的关系仍不明确。在此，我们将转录身份与细胞特征及实际时间测量相联系，以识别隐藏的分子轨迹

在转录组空间中。在具有自我更新能力的神经干细胞（NSC）中，我们解析了与分裂时命运不对称性相关的单细胞分子转变。我们还表明，在持续较长时间的静息期内，单个具有自我更新能力的NSC会逐步从深度静息的分子状态转变为浅度静息的分子状态。总体而言，本研究揭示了单个NSC在命运决定和状态转变过程中于转录组空间内的变化轨迹。尤其是，本研究强调，成年NSC遵循一种由转录程序编码、独立于谱系进展的静息周期，通过平衡细胞分裂与细胞生长来维持长期自我更新。

引言

为在神经发生与长期维持之间取得平衡，脊椎动物脑内的成年神经干细胞（NSC）在决定命运的细胞分裂与静息期之间交替；在静息期内，细胞经历长时间但可逆的细胞周期停滞¹–³。对于NSC而言，静息期对于维持干性至关重要，而持续增殖则会导致NSC耗竭⁴。退出静息状态后，决定命运的细胞分裂既可以是不对称分裂，使单个细胞实现自我更新并产生注定进入神经发生过程的子代细胞；也可以是对称分裂，以扩增NSC或祖细胞库¹,²,⁵–⁷。目前，调控NSC命运和状态决定的分子机制尚未得到充分阐明。弥补这一知识空白，需要将实时、原位测量的细胞行为与单个NSC分子身份的变化，即转录轨迹，联系起来。

通过活细胞成像和克隆分析对NSC进行实时追踪，揭示了其在增殖频率、分裂模式和静息持续时间等行为方面的异质性¹–³,⁵,⁸,⁹。转录组学分析已

同样揭示了单细胞水平上神经干细胞（NSC）的异质性，这些异质性对应于区域身份、谱系进程和静息深度的差异¹⁰–²⁰。然而，转录身份如何与单个细胞随时间变化的行为相关，仍有待研究，因为这需要进行实时实验测量，而此类测量难以与基于组学的方法相结合。尽管目前已开发出拟时序轨迹推断方法，但这些方法依赖于状态转变是连续的、且最可能发生于最相近状态之间这一假设，在群体水平上识别最可能的细胞状态转变²¹。因此，这些方法最适用于短时间尺度内的连续转变²²–²⁵；当应用于处于稳态的成体干细胞系统等群体时，所生成的轨迹往往难以解释，因为这些系统的动态变化缓慢，且状态转变复杂而不连续²⁶。发育系统中的纵向时间序列比较可以克服这些局限²⁷；然而，成体NSC受到群体稳态机制的调控，即尽管单个细胞的身份发生变化，各亚状态所占比例仍随时间保持恒定²⁸。因此，与发育系统不同，无法通过时间序列比较推断其状态转变。这些挑战阻碍了我们理解细胞分裂时与谱系进程相关的分子变化，以及静息期内可能发生的细胞状态转变。静息是一种主动维持且在转录层面具有异质性的状态¹²˒²⁹，NSC群体中的静息深度，即对激活的抵抗程度，呈梯度分布¹⁶–¹⁸˒³⁰。在先前的研究中，对促静息的短期药理学扰动

Notch 信号可诱导神经干细胞（NSC）产生分级的激活反应，提示其基础静息深度存在差异¹⁷。静息异质性究竟反映了不同的 NSC 亚群，还是静息亚状态之间的异步转换，目前仍不清楚。

为将 NSC 的行为与转录组联系起来，我们利用了成年斑马鱼（Danio rerio）的端脑背侧区（脑 pallium，即外套区）这一模型；在该区域，研究已在群体尺度上实时解析了 NSC 的行为¹˒²。此前，通过活体成像，研究人员对单个 NSC 的增殖、谱系进展和命运决定等行为进行了持续表征，鉴定出一群具有自我更新能力的 NSC，其分裂方式偏向不对称分裂，且经历的静息期估计可持续数月¹˒²˒⁵˒⁶˒⁹。我们推测，这些对 NSC 状态及命运转换的实时测量可作为参照框架，用于解读静息期间及分裂时的单细胞转录动态。为此，我们将多重单分子 RNA 荧光原位杂交（smFISH）技术应用于整体装载的外套区，以结合细胞形态及亲缘关系考察转录异质性。为阐明 NSC 分子状态之间的转换，我们通过 BrdU 时间标记，将转录身份与实际时间测量相结合。借此，我们区分了与命运进展相关的分子轨迹，以及静息状态内部转换所依循的分子轨迹。我们发现，分裂时由转录程序编码的命运不对称性会立即将子细胞划分至不同的转录细胞群。我们还发现，重新进入静息状态时，具有自我更新能力的子代 NSC 首先经历一种深度静息的分子状态，该状态随后得以解除

在延长的静息阶段，NSC在转录层面逐步向浅度静息状态转变。综上，通过将转录身份与细胞行为相联系的多模态方法，我们揭示了构成持续性成年神经发生基础的单细胞分子轨迹，这些轨迹既存在于细胞分裂时，也存在于静息期间。

结果

最小转录组编码可在原位确定端脑皮层神经干细胞和祖细胞的亚簇身份

此前，研究者对受精后3个月（mpf）的Tg(sox2:gfp)成年斑马鱼背侧端脑（端脑皮层）细胞进行了单细胞RNA测序（scRNAseq）²⁰。在所分析的细胞中，依据星形胶质细胞标志物的表达及pcna表达的缺失，鉴定出静息神经干细胞和祖细胞（NSPC）²⁰（图1a和1b）。随后的亚聚类分析鉴定出7个静息（q）亚簇（q1–q7）和3个增殖簇（p1–p3），其中亚簇q1–q5预计包含静息的端脑皮层NSPC（图1c和1d）²⁰。这些NSPC非常便于原位成像，它们在端脑皮层的脑室表面形成单层，胞体分布于表面以下最初10–15 µm的深度范围内。为在完整的微环境中研究亚簇q1–q5，我们定义了一套由12个基因组成的最小转录组编码，联合检测这些基因即可区分q1–q5（图1e和1f）。为在原位检测这些基因，我们对单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）方法进行了改进，使其适用于整体装载的端脑皮层组织，并结合了针对闭锁小带蛋白1（Zo1）和NSPC核标志物Sox2的荧光免疫组织化学（IHC）染色；前者标记勾勒细胞顶端边界的紧密连接¹,³¹。对这套12基因转录组编码的探针进行了原位多重检测，显示出

每轮同时检测三个基因，经过四轮迭代成像，捕获前部和内侧外套区（Da/Dm）NSPCs中的基因表达（图1g、1h和S1a）⁹。

下载图片

在新标签页中打开

图1. 基于scRNA-seq分析的最小“转录组编码”可在NSPCs中原位揭示。

a、b. 通过UMAP可视化NSPC群体中fabp7a（a）和pcna（b）的表达，虚线框标示静息祖细胞（pcna阴性）²⁰。

c. 按亚簇身份着色的NSPCs UMAP图²⁰。

d. 仅包含静息NSPCs、按亚簇着色的UMAP图²⁰。

e. 将12基因转录组编码与全部519个可变基因分别用于scRNA-seq数据的PCA分析，并通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）评估亚状态识别的预测准确性。

f. 蒙特卡罗模拟进一步支持了基因选择的合理性：从scRNA-seq在NSPCs中检测到的转录本中随机选取12种，进行1000次受试者工作特征分析模拟，所得AUC值的分布与使用12基因转录组编码获得的数值（虚线所示）相距甚远。

g. 经过四轮迭代多重smFISH（绿色、橙色、红色）及免疫染色（蓝色）后，对单侧外套进行三维重建（背侧观）。A，前；P，后。比例尺，100 μm。

h. （f）中方框所示外套区域的放大图，显示mRNA点状信号。比例尺，10 μm。

为定量分析整体组织中的基因表达，我们开发了图像分析工具，包括用于整合迭代共聚焦图像的Multireg，以及用于测量原位基因表达并结合分割后的Zo1染色测定细胞顶端面积的FishFeats（图S1b–e）³²。我们观察到沿转录连续谱分布的基因表达模式高度

与scRNAseq所得结果一致（图2a）²⁰,³²。在这两种检测方式中，pnp6和cspg5b均在连续谱的一端富集，其表达与神经干细胞（NSC）标志物mfge8a³³、slc4a4a和cxcl14重叠。timp4.3的表达与igfbp2a及draxin的表达相吻合，后者是小鼠海马成年神经发生所必需的³⁴,³⁵。gyg1b的表达水平较低；相比之下，dla和ascl1a均在连续谱的一端高度表达，并与细胞周期标志物pcna的表达部分重叠。这些基因表达模式以相关矩阵汇总呈现（图S1f），并在第二个生物学重复中得到重现（数据未展示）。为评估非特异性信号，另取一个端脑外套进行平行处理，使用靶向细菌L-2,3-二氢吡啶二羧酸还原酶转录本（dapB）的对照探针，与转录组编码中的12个探针一一对应（数据未展示）。由于每个细胞中检测到的斑点数远少于“真实”信号，因此未对原位基因表达值应用校正因子。

下载图片

在新标签页中打开

图2.

单细胞转录组检测方式之间基因表达模式的一致性，使得在整体端脑外套中鉴定q亚簇q1–q5成为可能。

多重smFISH检测的12基因转录组编码的原始基因表达值与scRNAseq检测的归一化基因表达值的UMAP图比较²⁰。

将scRNAseq中的亚簇注释转移至通过smFISH测量基因表达的细胞。

UMAP图展示从scRNAseq转移至原位测量细胞的q亚簇注释。

注释转移后，原位测量细胞中各q亚簇身份的细胞所占百分比。

（左）与直接基于 scRNAseq 进行亚群聚类的结果（右）相比。

为将 scRNAseq 亚群身份转移至原位测量的 NSPC，我们利用两种模态共有的 12 个基因的表达值，将 smFISH 细胞投影至 scRNAseq 转录组空间，并将距离最近的 20 个 scRNAseq 邻近细胞中最常见的 q 亚群身份赋予原位检测的细胞（见方法）（图 2b）。在所分析的 821 个细胞中，817 个细胞成功被注释为 q1–q5、p1 和 p2 亚群（图 2c）。具有 q1 和 q2 身份的细胞位于转录连续谱的一端，靠近处于细胞周期中的细胞，而 q3、q4 和 q5 则富集于相反的一端。被注释为 q1–q5 的 smFISH 细胞的相对比例与直接基于 scRNAseq 进行亚群聚类所得的比例相当（图 2d）²⁰。综上，两种模态间一致的基因表达模式，以及注释转移后所有预期亚群身份的重现，凸显了我们所采用的 smFISH 方法及靶基因选择的稳健性。此外，这些数据表明，通常由整个转录组所表征的 NSPC 异质性，仅通过对 12 个差异表达基因进行单分子分辨率的原位测量，即可得到充分捕捉。

原位多模态分析将自我更新的 NSC 定位于由谱系进程主导的转录连续谱中

我们此前发现了维持干性的 NSPC 亚群层级结构，其中上游的“储备型”NSC 通过不对称分裂实现自我更新，并补充下游增殖更活跃、向神经发生方向定向程度更高的“运作型”细胞池¹˒²。为利用这一框架探索原位转录异质性，我们进行了

对smFISH数据进行层次聚类（图3a和S2a）。鉴定出两个主要簇，即簇1¹²和簇2¹²（上标表示用于聚类的基因数量），并为每个细胞赋予聚类稳定性评分（见方法）（图S2b）。

下载图片

在新标签页中打开

图3.

原位基因表达结合组织学特征及BrdU对分裂模式的追踪，可在转录水平上鉴定具有自我更新能力的神经干细胞（NSC）。

通过对smFISH数据进行层次聚类鉴定出的神经干/祖细胞（NSPC）簇，其中簇1¹²和簇2¹²分别包含355个和462个细胞。

在完成12基因smFISH检测后，对脑披整体装片进行Gs和Zo1免疫染色。细胞被分为Gs高表达、Gs低表达或Gs阴性。虚线标示各类别的代表性细胞。比例尺，10 μm。

c–e.

smFISH检测的NSPC的UMAP图，分别按Gs信号强度（c）、顶端面积（d）和q亚簇注释（e）进行颜色编码，其中自我更新¹²簇以虚线圈出。

自我更新¹²和定向分化¹²原位簇中，被归属于各scRNAseq亚簇的细胞百分比。

在分裂后24 h的细胞双联体中选取的代表性BrdU标记细胞双联体（图i中的克隆12），检测其mfge8a、pcna、cspg5b、timp4.3和draxin的表达，并对Zo1、BrdU和Gs进行免疫染色。比例尺，5 μm。

对435个脑披NSPC进行10 h的BrdU脉冲标记，随后追踪24 h，并检测mfge8a、pcna、cspg5b、timp4.3和draxin的表达。UMAP图中通过颜色编码标示簇身份和BrdU标记细胞。

标记后24 h，含有自我更新⁸细胞的双联体中的姐妹细胞以颜色编码标示。

分裂后24 h，BrdU阳性克隆中的细胞数量和

其所属的簇。

10小时BrdU脉冲标记后追踪24小时所监测的分裂模式及细胞特征的汇总示意图。

为确定簇1₁₂和簇2₁₂的生物学意义，我们考察了与谱系进程相关的细胞特征（谷氨酰胺合成酶——Gs——的强度及顶端大小）在转录空间中的分布¹,³⁶。为此，我们在多重smFISH的基础上，结合针对神经干细胞（NSC）标志物Gs的免疫组织化学（IHC）染色，并在第五轮成像中采集其信号²,³⁶。使用FishFeats，我们手动将细胞分为Gs^high、Gs^low或Gs^neg（阴性），从而区分NSC（Gs^pos）与已定向分化的神经祖细胞（NP；Gs^neg）（图3b）。我们发现，在转录层面，Gs^high NSC富集于连续谱的一端，与Gs^neg NP所在的一端相对（图3c）。对顶端面积的评估同样表明，顶端大小沿连续谱呈梯度变化，其中较大的细胞为Gs^high，而较小的细胞大多为Gs^neg，这与先前研究所揭示的顶端大小与自我更新潜能呈负相关的结果一致¹。

接下来，我们考察了这些特征在簇1₁₂和簇2₁₂中的分布。我们发现，簇1₁₂中的细胞几乎均为Gs^high，而簇2₁₂中的细胞Gs强度不一，但包含了所有Gs^neg NP（图S2c）。簇1₁₂中细胞的平均顶端面积（168 ± 74 μm²）也大于簇2₁₂中的细胞（54 ± 40 μm²）（图3d和S2d）。综上，这些数据证实，簇1₁₂富集NSC，而簇2₁₂包含分化定向程度更高的细胞，谱系进程是驱动神经干/祖细胞（NSPC）连续谱主轴上异质性的主要因素。基于干性潜能的差异，我们

推测簇1¹²和簇2¹²可能分别代表储备型和运作型NSPC池¹˒²。为验证这一点，我们使用了从成年Tg(dla:gfp)³⁷个体中分离的外套组织。在该品系中，由Notch配体deltaA（dla）表达驱动的GFP报告系统以高水平GFP标记运作型细胞，而储备型NSC则无GFP信号¹或仅呈弱信号（未发表的观察结果）¹。通过比较簇1¹²与簇2¹²之间以及储备型与运作型细胞之间的Gs强度、顶端面积和mfge8a表达，我们发现簇1¹²富集了储备型NSC，而簇2¹²则与运作型细胞池大致对应（图S2e–k）。为简便起见，下文将这两个簇分别称为“自我更新型”（簇1¹²）和“定向分化型”（簇2¹²）。

最后，为将scRNAseq鉴定的亚簇与自我更新型¹²和定向分化型¹²簇的身份相对应，我们考察了q1–q5和p1–p3注释在这两个簇中的分布。我们发现，自我更新型¹²簇几乎完全由注释为q3、q4和q5的细胞组成（图3e和3f）。相比之下，定向分化型¹²簇中很大比例的细胞被注释为q1、p1和p3。因此，这些发现不仅在转录空间中定位了功能不同的NSPC亚群，还表明scRNAseq亚簇q3、q4和q5代表了自我更新型NSC在静息期特有的转录亚状态。

分裂时的转录不对称性区分自我更新型与定向分化型NSPC群体

我们此前利用活体成像表明，运作型细胞由自我更新的储备型NSC通过分裂时的命运不对称性产生¹。如今，借助原位鉴定转录组身份的能力，我们考察了

能否在转录水平上检测到细胞分裂时的命运不对称性，即两个子细胞分别归入不同的转录组子空间。为此，对成年斑马鱼进行为期10小时的溴脱氧尿苷（BrdU）脉冲标记，以标记处于S期的细胞。在分裂后24小时，通过免疫组织化学（IHC）鉴定被标记的神经干／祖细胞（NSPC），未观察到单个BrdU标记细胞，表明所有被标记的细胞均在追踪期内完成了有丝分裂，未发生G2期阻滞。共鉴定出41个BrdU标记克隆，其中40个由两个细胞组成，1个由三个细胞组成（图3g）。采用单分子荧光原位杂交（smFISH）检测这些细胞以及同一脑半球内352个BrdU阴性细胞（共435个细胞）中cspg5b、mfge8a、timp4.3、draxin和pcna的表达，构建转录连续谱，并将BrdU阳性细胞映射至其中进行可视化（图3h和S3a）。层次聚类再次将细胞分为两大簇，即簇1⁵和簇2⁵；根据Gs信号强度、细胞顶端大小及基因表达模式，这两个簇分别大致对应于自我更新型¹²和定向分化型¹²细胞群（图3h和S3a–d）。在41个BrdU标记克隆中，仅5个含有至少一个自我更新型⁵子细胞，其余克隆均仅由定向分化型⁵子代细胞组成。在这5个克隆中，有4个的子细胞不对称地分布于自我更新型⁵和定向分化型⁵细胞簇中（图3i和3j）。例外的是，克隆29中的两个细胞（RH128和RH129）均为自我更新型⁵细胞，其中RH128的聚类稳定性评分相对较低（图S3d）。

综上，这些结果在转录水平上揭示了两种分裂模式：一种是较为罕见的不对称分裂，其产生的两个子细胞分别归入自我更新型⁵和定向分化型⁵细胞簇；另一种则是更为常见的扩增性

仅产生已定向⁵子代的分裂。尽管我们的方法无法评估母细胞分裂前的转录特征，但既往对NSC分裂模式的表征使我们能够推断，此处追踪到的不对称分裂源自具有自我更新能力⁵的母细胞¹。因此，这些数据表明，具有自我更新能力⁵的母细胞通过不对称分裂，在自我更新⁵细胞簇与已定向⁵细胞簇之间形成了转录层面的边界。此外，两个子细胞中有一个位于自我更新⁵细胞簇内，这提示此类子细胞在干性潜能方面与其母细胞，以及未因分裂而被标记的静息自我更新⁸细胞相当（图3k）。

长期BrdU时间标记将转录特征与细胞形态、谱系关系及实时命运相联系

为探究转录特征与细胞行为随时间变化的关系，我们采用了BrdU时间标记法。具体而言，对成年斑马鱼进行10小时的BrdU脉冲标记，随后设置逐渐延长的追踪时间，并在各时间点评估BrdU标记的NSPC的转录特征。在脉冲标记后第4天（4d）、第8天、第14天和第28天采集端脑外套，结果与此前一致，Da/Dm区域内均呈现稀疏的BrdU标记（图4a）。由于短时脉冲标记的持续时间短于估计的细胞周期长度³⁸–⁴¹，因此仅标记了一个谱系内的一次分裂，从而能够通过BrdU标记的继承追踪后续的扩增性分裂。再加上背侧NSPC及其子代既无侧向迁移，也无细胞死亡，因此能够将转录特征与随时间变化的谱系关系联系起来²˒⁵˒⁷˒⁹˒⁴²。我们检测了8个

12基因转录组编码中的靶标（pcna、ascl1a、dla、gyg1b、draxin、timp4.3、mfge8a和cspg5b；根据其互补的表达模式及其在细胞状态鉴定中的综合准确性进行选择）（图4b、S4a和S4b）。同时通过免疫组织化学（IHC）评估Gs信号强度和细胞顶端大小（图4b、4e和4f）。在所有追踪时间点，对两个端脑背侧区半球中顶端表面位于NSPC层内的BrdU阳性细胞进行定量，同时纳入足够数量的BrdU阴性细胞，以构建转录连续谱，并将BrdU阳性细胞定位于该连续谱上（图4c–g）。总共整合了来自BrdU脉冲追踪重复实验和初始数据集（图1f，“无BrdU”）的5106个细胞，得到沿转录连续谱分布的预期基因表达模式（图S4c）。层次聚类再次识别出两个主要簇，即簇1₈和簇2₈（图4d、S4d和S4e），二者仍分别大致对应自我更新型和命运定向型NSPC群体（图4d–f、S4c–h）。

下载图片

在新标签页中打开

图4.

验证BrdU时间标记法，以在原位将细胞行为与转录身份随时间的变化联系起来。

端脑背侧区半球的三维重建；样本接受10小时BrdU脉冲标记，随后进行时长递增的追踪。方框标示的BrdU阳性细胞在（b）中放大显示。比例尺，70 μm。

各追踪时间点的代表性BrdU阳性细胞，通过smFISH测量其基因表达，并对Zo1、BrdU和Gs进行免疫染色。图中标注了BrdU阳性细胞的编号（第1轮），虚线勾勒出BrdU阳性细胞核的轮廓。比例尺，5 μm。

通过UMAP可视化展示8个整合smFISH数据集中的NSPC数量。

经……后，NSPC UMAP中的自我更新型₈和命运定向型₈簇

整合后的smFISH数据的层次聚类。

e-g.

整合后的NSPC UMAP中Gs信号强度（d）、顶端表面大小（e）以及各追踪时间点BrdU标记细胞的位置（f）。

实时单细胞轨迹揭示，分裂后的转录不对称性预示命运不对称性

利用这些整合数据，我们首先旨在确定分裂后24小时的转录不对称性（

图3g-k

）是否预示命运不对称性。我们比较了随追踪时间延长，各克隆内BrdU标记细胞的转录身份，其中每个克隆代表一个独立的细胞谱系（

图5、S5和S6

）。在各追踪时间点，对所有克隆中保留顶端表面的细胞数量进行了定量分析（

图5a-e

）。在各追踪时间点，克隆中具有顶端表面的细胞数量为1–3个，仅分裂后第4天的一个克隆含有5个此类细胞（

图5b

）。鉴于所有标记细胞均在24小时内从S期进入有丝分裂期（

图3h

），仅观察到一个具有顶端结构域细胞的克隆，在标记时必然存在一个姐妹细胞。这些姐妹细胞及其任何后代在追踪期间已脱离上皮层，因此未纳入基因表达分析。

下载图片

在新标签页中打开

图5.

随着追踪时间延长，自我更新的NSC后代之间的转录不对称性逐渐转化为命运不对称性。

在所示追踪时间点，对接受10小时BrdU脉冲标记的大脑外套半球进行三维重建，展示BrdU、Zo1和Gs的免疫染色。白色虚线标示保留顶端表面的细胞中的核内BrdU信号。灰色虚线标示目标克隆中已脱离上皮层的细胞的BrdU

阳性

细胞核。灰色箭头标示BrdU

阳性细胞核位于目标克隆附近，但与其分离。对分裂后8天的BrdU阳性克隆进行光学横断面观察（下图）。除非另有说明，比例尺均为5 μm。

b–e.

分裂后4天（a）、8天（b）、14天（c）和28天（d）时，每个BrdU阳性克隆中保留顶端表面的细胞数量。克隆内的细胞按其所属细胞簇进行颜色编码。

标记后不同追踪时间点含有自我更新型₈细胞的克隆所占百分比。

各个BrdU标记克隆中的细胞在整合UMAP图中的位置。

标记后4天和8天时克隆的推断谱系树。对于保留顶端表面的细胞，标出了细胞ID及其顶端面积。

分裂后4天和8天时，大多数BrdU标记细胞为命运已定型₈细胞（4天和8天时分别为46/54和62/73）（图5b和5c）。在少数含有自我更新型₈细胞的克隆中，我们观察到每个克隆仅含有一个自我更新型₈细胞（图5b–e、5g和S6）。这一结果与分裂时的命运不对称性一致，即其中一个子细胞（具有自我更新能力）重新进入静息状态。在较晚的追踪时间点，外套表面的BrdU标记克隆总数减少；标记后14天，14个此类克隆中有6个含有单个自我更新型₈细胞，而标记后28天则为9个中的5个（图5d、5e）。尽管克隆总数减少，但含有自我更新型₈细胞的克隆比例随时间增加（图5f），同时BrdU阳性细胞核在外套生发层下方积聚（图5a和S5）。⁵˒⁷˒⁹˒⁴³˒⁴⁴ 总之，自我更新型₈细胞持续存在于外套生发层内，而仅含命运已定型₈细胞的克隆消失，这与细胞脱层并进入下方的

实质，由在追踪期内经历终末分化的 BrdU 标记的定向分化⁸子代细胞所形成⁵˒⁷˒⁹˒⁴³˒⁴⁴。

既往研究表明，神经干/祖细胞（NSPC）的分裂产生顶端面积相近的子细胞，每个子细胞的顶端面积约为母细胞的一半¹。这一点可在分裂后第4天的克隆4中观察到，其中 LH24 和 LH25 的顶端面积分别为99 μm²和80 μm²（图5a［追踪4天］和5h）。我们根据 BrdU 阳性细胞核的总数、其相对信号强度以及克隆内各细胞的顶端面积，推断了含自我更新⁸细胞的克隆的谱系树（图5h、S5b和S5d）。例如，分裂后第4天的克隆35包含三个具有顶端结构域的细胞：RH6、RH7和RH8（图S5a和S5b［克隆35］）。根据其转录特征，我们推测 RH8 在分裂后已重新进入静息状态，这与其较大的顶端面积一致。然而，RH6 和 RH7 的顶端面积约为 RH8 的一半，且彼此相近，提示这两个细胞很可能是姐妹细胞，由使 RH8 获得标记的那次分裂之后的第二次扩增性分裂产生。这一解释也与 RH6 和 RH7 的转录特征一致，两者均属于定向分化⁸细胞簇（图S5b和S6a［克隆35］）。

综上，这些观察结果表明，通过追踪单个谱系内单细胞的转录特征，可以将状态转变与细胞行为随时间的变化联系起来。在所有追踪时间点，每个含自我更新⁸细胞的克隆中均仅鉴定出一个自我更新⁸细胞，且其顶端面积均较大，因此我们证明，自我更新⁸细胞在分裂后至少28天内维持静息状态。在

相比之下，我们发现，已定向分化的子代细胞会经历额外的扩增性分裂，并在进入分化过程时，随着时间推移逐渐从NSPC层中消失。最后，我们揭示了簇1⁸和簇2⁸在增殖频率、分裂模式和自我更新能力方面的差异，分别符合储备型和工作型身份的特征。

自我更新NSC中的转录异质性反映了不同静息深度构成的连续谱

在q1–q5亚簇中，单细胞RNA测序显示，它们对短暂的Notch阻断具有不同的敏感性¹⁷。尽管这一发现提示，q亚簇身份可能对应不同的静息深度，但尚无法将这些差异明确归因于自我更新NSC，也无法重建单个NSC在静息状态下的轨迹。为回答这些问题，我们将转录异质性分析限于可在原位识别的静息自我更新⁸细胞。在这些细胞中，我们重新整合了簇稳定性评分≥0.95的细胞（图6a）；所得子集主要局限于Gs^high细胞（图6b和图S7a）。

下载图像

在新标签页中打开

图6. 不同静息深度构成的连续谱是自我更新NSC转录异质性的基础。

各个整合的smFISH数据集中自我更新⁸细胞的数量（左）及其UMAP可视化结果（右）。

b–d.

通过UMAP可视化的自我更新⁸连续谱中，Gs强度（b）、基因表达（c）和静息评分（d）。

自我更新⁸连续谱中，静息评分与*ascl1a*、*dla*、*draxin*和*pcna*表达量的关系。

通过UMAP可视化的自我更新⁸细胞顶端面积。

静息评分作为

自我更新细胞群内顶端细胞面积的函数关系

，并附有通过线性回归得到的趋势线。

h. 基于顶端细胞大小预测短期 Notch 抑制的响应，其中处于浅层静息状态且顶端面积较大的自我更新

细胞对 Notch 抑制表现出增强的响应。

i. 利用 UMAP 可视化自我更新

细胞群内 2522 个未经处理细胞和 47 个 LY 处理细胞（黑色轮廓）的静息评分。

j. 未经处理细胞和 LY 处理细胞的静息评分分布。

k. 核密度图显示未经处理和 LY 处理的自我更新

NSC 在静息评分范围内的分布，其中细胞按顶端面积分组（每组间隔 50 µm

）。基于四分位距，面积超过 250 µm

的细胞被视为离群值。两种处理条件下各顶端面积区间内细胞所占百分比相近，表明未经处理群体与 LY 处理群体之间的取样不存在偏倚。

l. 在无 BrdU 条件下，顶端面积按每 50 µm

递增的区间划分时，细胞群稳定性评分 ≥ 0.8 且被注释为 q3、q4 和 q5 亚状态的自我更新

细胞百分比。

根据 scRNAseq 分析，

draxin

在对短期 Notch 扰动高度响应的细胞中富集，在亚簇身份中属于 q3

。当在整个细胞群中可视化通过 smFISH 检测到的全部 8 种转录本的表达水平时（

Figure 6c

），

draxin

转录本呈梯度分布，并与

ascl1a

和

dla

表达的增加相一致；这两者均与 NSC 激活相关

，同时也与升高的

pcna

水平相一致。总体而言，这些基因表达模式表明，在自我更新

细胞群内，存在一个由转录程序编码的、静息深度呈梯度变化的连续谱。在此基础上，我们根据主成分分析得到的结果，为细胞分配了分子静息评分。

（PCA）作为相对静息深度的衡量指标（图6d和图S7b）。PC1值被缩放至0–1之间，其中得分为1表示深度静息，其特征是draxin、dla、ascl1a和pcna表达水平较低；得分为0则表示浅度静息（图6d和6e）。在自我更新的连续谱中，顶端细胞大小沿同一轴进行分级，并且与分子静息评分呈反向关系（图6f和6g）；这一结果与此前活细胞成像的观察一致，即顶端细胞体积较大与NSC的激活倾向相关1,2。

为通过实验检验分子静息评分较低的大细胞是否确实处于功能性浅度静息状态，我们在体内使用γ-分泌酶抑制剂LY411575（LY）处理NSPCs 24小时，以扰动Notch信号传导。我们的推理是，如果静息深度与顶端细胞大小呈反向关系，那么自我更新8细胞群中的大细胞应对短期Notch抑制最为敏感（图6h）。处理后，我们对与此前相同的8种转录本进行了原位基因表达检测。mfge8a表达降低，同时ascl1a和dla表达升高，证实了相对于DMSO对照，处理确实有效（图S7c和S7d）。我们将98个经LY处理的细胞加入整合后的smFISH数据集（图S11e）；未处理组与LY处理组之间的Gs强度和顶端细胞大小相当（图S7f和S7g），表明两种条件之间不存在细胞类型偏倚。随后，我们评估了聚类稳定性评分≥0.8的自我更新8细胞的静息深度（共2522个细胞）（图6i）。未处理细胞中分子静息深度的正态分布在LY处理后转变为双峰分布，这是由于增加了

静息评分 < 0.5 的细胞比例（图 6j）。当按照顶端面积对细胞进行分箱时，我们发现，无论处理条件如何，较小细胞（50–100 和 100–150 µm² 分箱）的静息评分均较高（图 6k）。相比之下，与未处理细胞相比，Notch 抑制导致大细胞（150–200 和 200–250 µm² 分箱）的静息评分显著降低，这与较大细胞的静息深度较浅相一致。

最后，为了将分子静息评分与 scRNA-seq 亚簇身份进行比较，我们重新分析了“无 BrdU”数据集，因为该数据集成功转移了 scRNA-seq q 亚簇注释（图 2c）。在簇稳定性评分 ≥ 0.8 的自我更新¹²细胞中，我们以 50 µm² 为增量划分顶端面积区间，并确定各区间内 q3、q4 和 q5 注释所占的比例。我们发现，被归类为 q3（浅静息）的细胞比例随顶端面积增大而增加，尤其是在顶端面积大于 100 µm² 的细胞中（图 6l）。

综上，这些数据表明，在自我更新⁸细胞群中，存在一个独立于谱系进程、由深度静息向浅度静息连续过渡的转录状态连续谱。此外，这些结果也验证了使用分子静息评分作为相对静息深度定量指标的可行性，并强调了转录静息深度与细胞顶端面积之间的联系。

单个自我更新的神经干细胞经历一个由转录编码、沿深度静息状态向浅度静息状态定向的静息周期

静息深度的差异可能源于不同的神经干细胞亚群，这些亚群的增殖频率存在差异，因而在带有 BrdU 标记的阳性⁺子代细胞中所占比例不同；或者也可能源于单个细胞在不同状态之间转换的动态轨迹。

深层和浅层状态（图 7a）。为区分这两种可能性，我们利用了 BrdU 时间标记数据。我们重点分析了分裂后 BrdU 阳性的自我更新^8 细胞。与整个自我更新^8 细胞群体相比，所有 BrdU 标记细胞均定位于转录连续谱的一侧（图 7b）。这些细胞的静息评分均介于 0.5–1 之间，且在不同时间点之间未表现出明显的时间顺序（图 7c–e），这提示 NSCs 在分裂后会重新进入深度静息状态，并且该状态最长可维持 28 天。

下载图像

在新标签页中打开

图 7。

自我更新的 NSCs 经历了从深度静息到浅层静息的分子轨迹，并伴随着顶端细胞面积的逐步增大。

a．与静息深度差异相关的自我更新^8 NSCs 的转录异质性，可能源于不同亚群增殖频率的差异（左图），圆形箭头的粗细表示这种差异；也可能源于静息状态内部的转录轨迹，即细胞随时间从浅层静息转变为深度静息，或从深度静息转变为浅层静息。

b．根据追踪时间进行颜色编码后，定位于自我更新^8 UMAP 中的 BrdU 阳性 NSCs。

c、d．2055 个自我更新^8 细胞的静息评分，分别以 UMAP（c）和小提琴图（d）表示。BrdU 阳性细胞叠加显示，并根据追踪时间进行颜色编码。

e．随着静息持续时间增加，BrdU 标记的自我更新^8 细胞的静息评分变化。

f．2055 个自我更新^8 细胞的顶端面积值，以 UMAP 表示。BrdU 阳性细胞叠加显示，并根据追踪时间进行颜色编码。

g．2055 个转录定义的自我更新^8 NSCs 群体中的顶端细胞大小分布，与 20 个 BrdU 阳性细胞相比。

自我更新的

NSCs 分裂后（所有追踪时间点），以及来自四个 Tg(

dla

:GFP) pallia

、分裂前的 40 个 GFP

neg

母细胞（MCs）。各细胞群的平均顶端面积以黑色标示。星号表示具有统计学显著性的差异，该差异通过 Welch 单因素方差分析，并经 Games–Howell 事后检验及针对三重比较进行 Bonferroni 校正后确定。

h. 不同分裂后追踪时间点，自我更新的

BrdU

pos

细胞的顶端细胞大小测量值。虚线表示最佳拟合线性回归（斜率 = 1.4 µm

/天；双尾 t 检验，p = 0.2）。阴影区域表示 95% 置信区间。圆形表示在原位测量的细胞。菱形表示各追踪时间点的均值 ± s.d.。

i. 在四个 Tg(

dla:GFP

) 成体 pallia 中，通过活体成像连续追踪 43 天所得的非分裂 GFP

neg

细胞，其平均顶端面积随时间的变化。阴影区域表示 95% 置信区间。黑色竖线表示标准误。

j. 自我更新的

NSCs 内部存在一条转录轨迹，细胞随时间推移由深度静息状态转变为浅度静息状态，并伴随顶端细胞大小增加。这与先前的活体成像观察结果一致：在 dla:GFP

neg

NSCs 中，顶端细胞大小会随静息持续时间增加，且细胞体积较大的细胞具有更高的分裂概率

。

在自我更新的 NSCs 中，静息阶段预计持续数月，其持续时间远超本研究所考察的 28 天追踪期

。为探究单个自我更新 NSCs 是否会在这些延长的静息阶段中逐渐向静息状态的浅层亚状态转变，我们首先利用了静息深度与顶端细胞大小之间的关系。我们比较了娱乐主管

深度静息的 BrdU 阳性细胞在分裂后与整个自我更新⁸细胞群体的平均顶端大小进行了比较（图 7f 和 7g）。正如预期，BrdU 标记细胞相对较小，其平均顶端面积为 113 ± 8 µm²，而所有自我更新⁸细胞的平均顶端面积为 152 ± 2 µm²（图 7g）。利用此前记录的 Tg(*dla:GFP*) 端脑实时成像影片，在这些影片中，细胞于分裂前 2–3 天通过活体成像进行追踪¹，我们还比较了 GFP 阴性（储备库）母细胞（MCs）的平均顶端面积（图 7g）；这些细胞同样具有自我更新能力，并且接近分裂时点。GFP 阴性母细胞的顶端面积为 193 ± 12 µm²，约为分裂后第 4 天 BrdU 阳性自我更新⁸细胞（102 ± 10 µm²）顶端面积的两倍，也显著大于自我更新⁸细胞群体。综合这些数值可推断，子细胞（分裂后）若要成为母细胞（分裂前），必须在静息期间使其顶端面积增加一倍。此外，由于顶端大小与静息深度相关，且母细胞的平均顶端大小显著大于自我更新⁸细胞群体，因此在任一时间点，可能只有少数神经干细胞处于浅度静息状态。

最后，我们考察了分裂后不同追踪时间点 BrdU 标记的自我更新⁸细胞的顶端表面积；这些细胞均为经历了逐渐延长静息时长的神经干细胞（图 7h）。尽管各追踪时间点细胞之间存在较大变异，导致差异未达到统计学显著性，但数值总体呈上升趋势。作为比较，我们还评估了 43 天内非分裂 GFP 阴性细胞平均顶端面积的时间变化过程；此前，这些细胞已在四个 Tg(*dla:GFP*) 端脑中通过实时成像进行了测量¹。其平均顶端面积呈渐进性增加，开户链接

随着时间的推移，观察到顶端细胞大小的变化，其幅度与采用 BrdU 时间标记法获得的静态测量结果相近（图 7i，与图 7h 比较）。综上，这些数据表明，自我更新型 NSC 在分裂后，随着其从深度静息状态向浅度静息状态推进，会经历整个转录组空间；这一过程可通过顶端细胞大小的逐步增加加以量化（图 7j）。由此形成一个从深度静息状态指向浅度静息状态的静息循环，并最终促使细胞进入细胞周期，从而实现分裂时的自我更新。

讨论

本研究提出了一个实验框架，用于解析单个 NSC 在状态决定和命运决定过程中的转录轨迹。通过 BrdU 时间标记法以及一种可在原位操作的分子编码体系，我们解析了单个 NSPC 之间的细胞状态转换。这些转换涉及细胞分裂、谱系进程，以及对于自我更新型 NSC 而言，静息期间的分子状态变化。关于谱系进程，我们揭示了 NSPC 按照干性潜能沿转录连续体的主轴排列，分为两个命运不同的细胞簇，并且细胞通过隐匿性分裂事件从自我更新细胞簇转变为已承诺细胞簇。在处于静息状态的自我更新型 NSC 中，转录异质性反映了不同程度的静息深度；我们证明，单个 NSC 会经历一系列具有时间顺序的转录亚状态。这些亚状态构成一个静息循环，NSC 在两次分裂之间经由该循环发生状态转变。在这一循环过程中，NSC 逐步探索从深度静息亚状态延伸至浅度静息亚状态的整个转录空间。这些结果解析了单个 NSC 的主要分子轨迹，揭示了确保干性维持的状态转换和命运转换，以及

成体脊椎动物端脑中的持续神经发生。尽管分子细胞轨迹的调控可能也发生在转录后水平^47，而这并未在本研究中进行分析，但我们的结果表明，单个NSC之间的转录身份能够反映关键的NSC决策，从而确立了转录身份作为NSC状态与命运的主要读出指标。

结合转录身份与原位真实时间测量对于解析单细胞轨迹至关重要

目前已发展出多种用于解析单细胞轨迹的计算方法，这些方法依赖转录相似性及快速的时间动态，在群体尺度上通过推断的伪时间来识别可能的状态转换^22–26。然而，当这些方法应用于跨越较长时间范围的渐进性细胞状态转换时，例如体细胞成体干细胞之间的转换，由于动态的群体稳态调节阻碍了不同时点之间的比较，所生成的轨迹往往难以解释。为克服这一问题，我们对原位NSPC轨迹进行了研究，从而能够在细胞形态、亲缘关系以及真实时间测量的背景下评估其转录身份。开展这项工作需要进行若干方法学改进。首先，需要对多重smFISH进行适配，使其能够应用于整体组织，并以差异表达转录本的最小子集为靶标。同时，还需要采用Multireg和FishFeats等图像分析工具，以便对跨多个成像轮次获取的多重smFISH数据进行定量^32。最后，我们应用了一种多模态转录组数据整合方法，以实现scRNA-seq与smFISH两种模态之间的转换，这是当前单细胞分析中的主要瓶颈之一。综合而言，这些工具使我们能够

将 scRNA-seq 的 q1–q5 身份映射到原位测量基因表达的细胞上，从而能够在群体水平和单个谱系内部确定转录异质性的生物学意义。随后结合基于 BrdU 的时间标记，这些方法揭示了隐藏在转录异质性中的细胞状态转换，并发现两类主要轨迹：一类支撑由扩增性分裂推动的谱系进展，另一类则体现自我更新的 NSC 在静息深度不同的亚状态之间转换。

与谱系进展相关的 NSPC 轨迹涉及转录组空间中隐藏的细胞分裂

通过将 smFISH 与 BrdU 标记相结合，可以在转录空间中追踪姐妹细胞。这表明，静息态端脑 NSPC 的转录连续谱会被一系列细胞分裂打断，而伪时序分析此前并未预测到这一现象

。此外，该方法还允许比较姐妹细胞的转录身份，结果显示，大多数分裂会扩增已承诺细胞群，且命运呈对称性。研究还观察到较少见的分裂命运不对称情况，其特征是姐妹细胞立即出现转录不对称，并分别归入自我更新簇和已承诺簇。这类分裂源自自我更新母细胞，进一步表明自我更新的母细胞与子细胞属于同一转录子空间，提示存在

真正的

转录自我更新。

在自我更新的 NSC 中，转录异质性与静息深度的生理变异相关

我们多模态方法的一项重要成果是，将 scRNA-seq 与…

结合使用 smFISH、IHC 和 BrdU 示踪后，转录特征的鉴定被限定于具有自我更新能力的 NSC。我们发现，这一群体在此由具有自我更新能力的 n 簇代表，并等同于 scRNA-seq 亚簇 q3–q5，其内部存在一个独立于谱系进程编码特征的转录连续体。我们提出，这一连续体反映了细胞在不同深度的静息亚状态之间发生转变；沿静息深度连续体的进展，可以量化为分子静息评分。若干相互印证的论据支持这一解释。首先，与 NSC 激活相关的基因在这一进程中呈梯度式表达。这些基因包括参与 DNA 复制并在细胞周期 G1 晚期被诱导表达的 pcna^48,49，以及在活化 NSC 中表达的斑马鱼 Dll1 同源基因（dla）和 Ascl1 同源基因（ascl1a）^45,46。已知 Notch2/3 信号可促进成体 NSC 的静息状态，因此，浅静息 NSC 中 Dla 配体的表达可能通过顺式抑制 Notch 受体，短暂下调该信号，从而促进细胞激活^50–55。浅静息状态下 ascl1a 表达增加进一步支持了这一模型；已知小鼠 ascl1 是 Notch 介导的抑制靶基因，并且是 NSC 增殖所必需的^45,56–58。

其次，将 smFISH 与顶端面积测量相结合后发现，分子静息评分与顶端细胞大小之间存在反向关系，表明顶端面积较大的 NSC 处于较浅的静息深度（图 6d 和 6f）。这一结果与既往活细胞成像数据一致，后者显示顶端面积增大与更高的细胞分裂概率相关^1；同时也与近期研究相符，即顶端面积较大的具有自我更新能力的 NSC 中 mTORC1 活性升高^59。

这些观察结果进一步支持了我们所定义的、基于转录特征的静息评分，表明其可作为衡量静息深度的相关指标。作为功能性验证，我们发现，顶端面积较大的自我更新型神经干细胞（NSCs）（150–250 µm²），因而被预测为在转录层面更接近激活状态的细胞，确实是对Notch阻断反应最为显著的细胞。与同一细胞簇中较小的细胞（50–150 µm²）相比，这些细胞的静息评分发生了明显变化，提示其在分子层面向激活状态转变；而后者则未表现出此类变化（图6k）。最后，注释转移分析显示，顶端面积增加与q3亚状态所占比例增加相关（图6l）。此前研究表明，q3亚状态对短期Notch阻断敏感，因而代表浅层静息；相比之下，q4–q5对Notch扰动仍具有抵抗性，因此被解释为深层静息17。

自我更新型NSCs在分裂间期经历一个有序且由转录编码的静息周期

我们发现，静息状态的异质性具有时间上的有序性，反映出一种从深层静息向浅层静息推进的分子进程，NSCs会随时间经历这一转变。通过将BrdU时间标记与smFISH相结合，我们直接证明，分裂后即刻产生的自我更新型子代NSCs处于深层静息状态。此外，我们发现，该状态至少可维持28天（图7a–e）。基于进一步相互印证的论据，我们提出，随后细胞会依次经历一系列分子状态，并最终达到浅层静息。对分裂后自我更新型NSCs的顶端面积进行测量显示，其顶端大小会随时间逐渐增加（图7h），而NSCs

由 smFISH 定义的浅静息状态细胞，以及动态成像观察到的分裂前 MC，均属于顶端面积最大的细胞（图 6d、6f 和 6g）。鉴于静息深度与顶端细胞大小之间的关系，这些观察结果支持这样一种模型：自我更新型 NSC 逐步探索整个自我更新转录组连续谱，并在一个静息周期内达到浅静息状态；该静息周期持续时间超过了本研究考察的 28 天时间范围。

根据不同分裂后追踪时间点 BrdU 标记细胞的平均顶端面积，估算顶端面积的平均增长速率为每天 1.4 µm²。按此增长速率，子细胞需要 73 天才能达到 MC 的顶端面积；这一估算假定 MC 的大小是子细胞的两倍（根据标记后 4 天子细胞的平均顶端面积估算，MC 为 204 ± 20 µm²）。这一对平均静息持续时间的估算短于既往研究的结果；先前研究预测静息持续时间超过 120 天¹,²。这些差异可能由多种因素共同造成，包括各研究考察的端脑区域、用于界定自我更新细胞群的方式，以及追踪细胞分裂的方法。然而，在这三项研究中，自我更新型端脑 NSC 的静息阶段均持续数月，从而确立了以数月为尺度的静息周期。

静息深度的差异反映了细胞进入细胞周期的准备程度，这通常表现为细胞对刺激作出反应时激活速度不同¹⁶,¹⁷,⁶⁰–⁶³。此前，研究者根据损伤条件下出现的浅静息状态，提出肌肉干细胞（MuSC）中存在静息周期⁶⁴。我们的结果将这一观点扩展至生理状态下的干细胞。

轨迹，并表明这一周期由转录进程所编码。该周期可能作为一种内在的细胞自主性时钟，据此可以衡量细胞为下一次分裂所做的准备程度；然而，控制这一周期的分子序列及其运行节律的机制仍有待确定。由于NSC的激活受细胞自主性输入和来源于微环境的输入共同调控

，

–

，因此，这些输入中的每一种都可能汇聚于一种共同的调控机制，通过调节细胞在静息周期中的推进速率发挥作用。

深度静息状态主导静息周期，且静息深度与持续时间呈反比

值得注意的是，我们发现，在端脑背侧的NSC中，静息深度与持续时间呈反比，即静息深度会随时间推移而降低。这与其他系统中的情况相反；在其他系统中，静息持续时间的延长通常与静息深度的增加相关，细胞需要更强的刺激才能恢复增殖

，

。然而，这些研究并未探讨生理条件下单细胞状态的变化。相反，它们是在非生理性诱导静息的信号作用下，依据不同细胞群体之间的差异来测量静息深度，例如细胞密度、黏附性和营养物质可利用性的变化，或在时间性衰老等病理情境下进行测量。鉴于已知静息状态的转录特征取决于启动该状态的刺激

，这里所描述的静息深度与持续时间之间的反向关系，可能是生理性诱导静息的一项特征。

从深度静息状态向浅度静息状态的转变是渐进性的，需要一个规模相当大的基因组来区分不同的亚状态，因此无法采用活细胞成像

用于测量深层和浅层阶段的相对持续时间。然而，每个阶段的相对持续时间可以通过观察到的各亚状态细胞比例进行推断，因为在任一给定时间点，持续时间较长的阶段预计会包含更大比例的细胞群体。通过注释转移，我们发现，自我更新细胞（q3–q5）中有41%在身份上属于q3，这与通过直接scRNA-seq亚群聚类注释为q3的细胞比例40%高度一致。相比之下，仅有22%的自我更新细胞具有较低的分子静息评分（介于0–0.5之间），这表明这些评分可能代表q3内部的一个亚群，即在转录层面最接近激活状态的细胞。尽管如此，两种指标均显示，处于深度静息状态的细胞比例高于处于浅层静息状态的细胞。假设所有细胞均经历向激活状态的渐进式转变，这些观察结果表明，浅层静息可能是一个相对短暂的阶段，而深度静息则是静息循环中的主要状态。

研究局限性

本研究未将雄性和雌性个体分别进行分析，因此无法探讨静息循环中与性别相关的差异。此外，研究通过BrdU标记引入了时间维度的测量，从而使我们对NSPC轨迹的理解偏向于分裂细胞中的轨迹。如果自我更新细胞群中存在某一亚群，其分裂速率特别低，则该亚群不会在本研究中得到体现；同样，如果确实存在不经历静息循环转变的细胞，这些细胞也不会被纳入分析。此外，由于成像过程中难以对完整铺片的端脑进行定向，smFISH实验基本局限于背侧端脑（Dm）。因此，本研究未涉及端脑NSPC身份可能存在的区域特异性。尽管

尽管我们课题组此前的 scRNA-seq 研究未能鉴定出端脑 NSPC 中具有区域特异性的特征

，但其他研究已报道了此类特征

，因此未来研究应对此加以考虑。已知 Notch 活性在端脑单层中呈空间分布

，且可能介导静息状态亚态之间的转换；因此，随着 NSC 以异步但协调的方式经历静息周期，不同静息深度的空间分布模式很可能也会在该生态位中呈现类似分布。本研究虽未对此进行探讨，但本研究开发的工具将有助于进一步从分子层面揭示 NSPC 不同亚态的时空协调机制。

资源可用性

主要联系人

如需进一步信息或资源，请联系主要联系人 Laure Bally-Cuif（laure.bally-cuif{at}pasteur.fr）；相关请求将由其负责处理。

材料可用性

本研究未生成新的独特试剂。

数据与代码可用性

本文分析了现有的公开 scRNA-seq 数据。该数据已存入 GEO 数据库，登录号为 GSE225863，可通过以下网址获取：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE225863

单细胞 smFISH 基因表达数据及其分析所用的自定义代码，可向主要联系人索取。重新分析本文所报告数据所需的任何其他信息，也可向主要联系人索取。

作者贡献

概念化：L.B.C.、D.M.、T.F.；数据整理：T.F.、J.S.、N.D.、I.F.、D.M.；正式分析：T.F.、D.M.、J.S.、M.D.、N.D.；经费获取：L.B.C.；研究实施：T.F.、I.F.、J.S.、D.M.、M.D.；方法学：T.F.、I.F.、J.S.、L.C.、N.D.、G.L.、D.M.；项目

行政管理，L.B.C.；资源，L.B.C.、N.D.、L.C.；可视化，T.F.；验证，L.B.C.、T.F.、J.S.、L.C.；监督，L.B.C.、T.F.；软件，N.D.、G.L.；论文撰写——初稿，T.F.、J.S.；论文撰写——审阅与编辑，L.B.C.、L.C.和T.F。

利益声明

作者声明不存在利益冲突。

补充图标题与图注

补充图 S1. 全封片组织中多重smRNA-FISH与荧光免疫组织化学联合应用的工作流程及相关图像分析工具。a. 全封片端脑中多重smRNA-FISH的工作流程。12种RNাসcope Hiplex v2探针与mRNA靶标杂交，并通过4轮连续成像以每组三种的形式显示；与探针相关联的荧光团在各成像轮次之间被切除。针对Sox2和Zo1的荧光免疫染色在所有成像轮次中均存在。针对内源性Gs的免疫染色在第5轮成像中采集。b. Multireg可将多张共聚焦全封片图像进行配准。A，前部；P，后部。比例尺，100 μm。

c. 使用fishfeats对配准后的图像进行顶端细胞轮廓和mRNA信号点的分割与定量。方框标示了(d)中所示的放大区域。A，前部；P，后部。比例尺，100 µm。

d. Sox2（细胞核）和Zo1（顶端细胞轮廓）免疫染色的放大图，其中使用Zo1信号进行分割（图1）。mRNA信号点以三维方式进行分割（图2），并通过二维投影分配至相应的细胞表面（图3）。比例尺，50 μm。

e. 通过二维投影将mRNA分配至细胞表面的示意图。对于顶端表面积较小、而较大的细胞体嵌套于邻近细胞顶端表面下方的细胞，需要进行人工校正。图中显示了顶端Zo1轮廓，介于

深蓝色；分段表面以红色、紫色和浅蓝色表示；mRNA puncta 以细胞体内的实心圆表示；二维投影的 puncta 以上方的虚线圆表示。箭头表示投影 mRNA 的轮廓与其内部颜色之间的不匹配，已对此进行手动校正。

f. 总结原位测量转录本之间关系的相关性矩阵。

补充图 S2。原位测量的基因表达和顶端细胞大小可区分自我更新型 NSC 与已定向祖细胞。a. 基于使用 12 基因转录组编码检测到的基因表达值，对一个端脑半球内 821 个细胞进行层次聚类所得的树状图。

b. 层次聚类后的稳定性评分，以 UMAP 进行可视化。

c. 以百分比表示簇 1₁₂ 和 2₁₂ 中 Gs 强度的分布。簇 1₁₂：98.5% Gs^high、1.1% Gs^low、0.4% Gs^neg；簇 2₁₂：35.5% Gs^high、17.2% Gs^low 和 47.3% Gs^neg。

d. 簇 1₁₂ 和 2₁₂ 中的顶端细胞大小。星号表示通过 Wilcoxon 秩和检验确定的高度显著差异（p < 2.2 × 10^-16）。

e. 对 Tg(dla:GFP) 整装端脑进行 Zo1、Sox2、Gs 和 GFP 免疫染色后获取的共聚焦图像进行三维重建。箭头所指示区域表示不同的 Gs 和 GFP 水平。比例尺，10 µm。

f，g. 两个 Tg(dla:GFP) 端脑中按 GFP 类别划分的 Gs 强度分布（f）及百分比（g），其中分别纳入了 404 个和 304 个细胞。图（g）中的数值表示平均值 ± 标准差。

h. 对 Tg(dla:GFP) 整装端脑进行 Zo1、Sox2 和 GFP 免疫染色，并结合针对 mfge8a 的 smRNA-FISH 后获取的共聚焦图像进行三维重建。箭头所指示区域表示具有代表性的 GFP 强度。Zo1 轮廓的

每种 GFP 类别的代表性细胞以虚线勾勒。比例尺，10 µm。

i. 两个 Tg(dla:GFP) 端脑中 GFP^neg、GFP^weak、GFP^med 和 GFP^high 细胞顶端面积的分布（rep1 和 rep2，每个重复至少 500 个细胞）。

j. 使用 12 基因转录组编码，通过 smRNA-FISH 在 821 个细胞中测定的 cluster 1^12 和 cluster 2^12 内 mfge8a 的表达。数值表示每个细胞的转录本数量。星号表示经 Wilcoxon 秩和检验确定的高度显著差异（p < 2.2 × 10^-16）。

k. 在两个 Tg(dla:GFP) 端脑中测定的 GFP^neg、GFP^weak、GFP^med 和 GFP^high 细胞中的 mfge8a 表达（rep1 和 rep2，每个重复至少 500 个细胞）。数值表示每个细胞的转录本数量。

补充图 S3. 在含有自我更新细胞的克隆中，BrdU 标记的姐妹细胞之间存在转录不对称性，可在细胞分裂后 24 h 检测到。

a. BrdU 标记（10 h）后 24 h，在一个端脑的 435 个 NSPC 中检测到的 mfge8a、cspg5b、timp4.3、draxin、pcna、Gs 表达及顶端面积。

b. 基于多重 smRNA-FISH 测得的五种基因表达，对 435 个 NSPC 进行层次聚类，识别出两个主要簇：cluster 1^5（自我更新）和 cluster 2^5（已承诺分化）。

c. 以 UMAP 表示的单细胞簇稳定性评分。

d. 含自我更新细胞的克隆中，BrdU 标记的姐妹细胞的稳定性评分。

补充图 S4. 8 基因 smRNA-FISH 数据集可在整合的原位数据集中区分自我更新细胞与已承诺分化细胞。a. 在一个半球中通过 smRNA-FISH 测得的 821 个细胞中，mfge8a、cxcl14 和 slc4a4a，以及 timp4.3 和 igfbp2a 的两两比较。数值表示每个细胞的转录本数量。

使用上述 8 个基因的联合表达对亚状态进行分配的准确性，通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）进行估算。

整合数据集中的基因表达模式，以 UMAP 进行可视化。

对整合的 smRNA-FISH 数据集进行层次聚类后得到的树状图。方框表示自我更新⁸和已承诺⁸细胞簇。

通过 UMAP 可视化的单个细胞簇稳定性评分。

自我更新⁸和已承诺⁸细胞簇中 Gs^high、Gs^low 和 Gs^neg 细胞所占的百分比。簇 1⁸：93% Gs^high、6% Gs^low 和 1% Gs^neg；簇 2⁸：26% Gs^high、26% Gs^low 和 48% Gs^neg。

自我更新⁸和已承诺⁸细胞簇中的顶端面积分布。簇 1⁸：142 ± 69 µm²；簇 2⁸：40 ± 37 µm²（平均值 ± s.e.m.）。

mfge8a 在自我更新⁸和已承诺⁸细胞簇中的分布。簇 1⁸：每个细胞 56 ± 26 个转录本；簇 2⁸：每个细胞 10 ± 14 个转录本（平均值 ± s.e.m.）。

补充图 S5。随着分裂后追踪时间的延长，单个谱系内 BrdU 标记的子代细胞表现出命运不对称性。a、c、e、f.

含有自我更新⁸细胞的 BrdU^pos 克隆在标记后 4 d（a）、8 d（c）、14 d（e）和 28 d（f）的共聚焦图像三维重建。白色虚线分别表示 BrdU^pos 克隆内保持顶端表面的细胞的 Zo1（左）和 BrdU（右）免疫信号，并与 Gs 信号一同显示。在分裂后 8 d，还进行了 Sox2 免疫染色。灰色虚线表示克隆内缺乏顶端表面、发生脱层的细胞所对应的 BrdU^pos 细胞核（未进行定量）。箭头所指为来自其他克隆的 BrdU^pos 细胞核。在分裂后 4 d 和 8 d，对发生脱层的 BrdU^pos 细胞核进行了光学横截面评估（下方），其中

白色虚线标示克隆内自我更新的 8 号细胞的细胞核轮廓（细胞 ID 标注于上方）。比例尺，5 µm。b、d. 根据每个克隆中 BrdU 阳性细胞的数量、顶端面积以及克隆内细胞 BrdU 染色的相对强度，在分裂后第 4 天（b）和第 8 天（d）逻辑推断的谱系树。对于克隆中所有保留顶端表面的细胞，均标注了细胞 ID 和顶端细胞大小。

补充图 S6. BrdU 标记克隆内子代细胞的命运不对称性在转录组空间中可视化。a–h. 分裂后第 4 天（a、b）、第 8 天（c、d）、第 14 天（e、f）和第 28 天（g、h）时，含有自我更新 8 号细胞的克隆中的 BrdU 阳性细胞（a、c、e、g）以及仅含有定向分化 8 号细胞的克隆中的 BrdU 阳性细胞（b、d、f、h）在整合后的 smFISH UMAP 中的位置。

补充图 S7. 分子静息评分反映体内静息深度的功能性指标。a. 在 2055 个自我更新 8 号细胞中，Gs 高、Gs 低和 Gs 阴性细胞所占比例；这些细胞的聚类稳定性评分均 ≥ 0.95。b. 对归一化的 cspg5b、mfge8a、timp4.3、draxin、gyg1b、dla、ascl1a 和 pcna 表达进行主成分分析（PCA）后，PC1 和 PC2 的基因载荷；上述表达通过多重 smRNA-FISH 测得。c. 用 DMSO（对照）或 LY 处理 Pallia 24 小时后，通过 smRNA-FISH 检测 cspg5b、mfge8a、timp4.3、draxin、gyg1b、dla、ascl1a 和 pcna 的表达（左）。全装片 Pallia 共聚焦图像的 3D 重建显示了 smRNA-FISH 与 Zo1 和 Sox2 免疫标记的结合结果（右）。比例尺，5 µm。d. DMSO 和 LY 处理的 Pallia 中 mfge8a、dla 和 ascl1a 的表达分布，以每个细胞的转录本数量表示。e. 将 98 个 LY 处理的细胞与 BrdU 脉冲追踪实验中的未处理细胞整合，并且……

在无 BrdU 处理的实验中，利用归一化表达量对 cspg5b、mfge8a、timp4.3、draxin、gyg1b、dla、ascl1a 和 pcna 进行分析，共涉及 5016 个细胞；通过 smRNA-FISH 测定，并采用 UMAP 进行可视化。

f. 未处理组和 LY 处理组端脑中 Gs^high、Gs^low 和 Gs^neg 细胞的比例。

g. 未处理组和 LY 处理组细胞顶端面积的分布，显示两个数据集中的细胞大小代表性不存在偏倚。

关键资源表

实验模型与研究对象详情

斑马鱼

所有与斑马鱼（*Danio rerio*）饲养和处理相关的操作均遵循欧洲议会和欧盟理事会第 2010/63/EU 号指令。本研究使用野生型 AB/AB 和 Tg(*dla:gfp*) 斑马鱼^37，均为受精后 3–4 个月，未区分性别。斑马鱼饲养于 3.5 L 水箱中，水温维持在 28.5°C、pH 值为 7.4，最大饲养密度为每升 5 条，具体方法此前已有描述^13。根据教育、研究与创新部的指南，斑马鱼在冰水中安乐死 10 分钟。

方法详情

转录组编码与亚群预测

采用受试者工作特征曲线估计由 8 个或 12 个基因组成的转录编码的敏感性与特异性，并使用 R 软件包 *pROC*^73 计算曲线下面积（AUC）所反映的置信区间。采用蒙特卡洛模拟，对 1000 次受试者工作特征模拟所得的 AUC 值进行比较；每次模拟均从 scRNA-seq 检测到的基因中随机组合 12 个基因。

BrdU 标记

为标记增殖细胞，将斑马鱼置于装有 1 L 溶液的烧杯中进行处理。该溶液含 1 mM BrdU，BrdU 以 500 μM 储备液形式溶于 DMSO，随后稀释于 500 ml 鱼水中；水温维持在 28°C，并持续通气 10 小时。处理结束后，斑马鱼被

转移至装有1 L鱼水的烧杯中，最长可达48小时；期间每天喂食一次并换水一次。随后将鱼放回15 L水箱，并在动物设施中饲养至追踪期结束，之后实施安乐死并解剖。追踪时间分别为24小时、4天、8天、14天和28天。

药理学抑制Notch信号

通过使用γ-分泌酶抑制剂LY411575处理斑马鱼，实现对Notch活性的短暂抑制。LY411575以DMSO配制成100 µM储备液，避光保存于−20°C。将LY411575稀释至鱼水中的终浓度为10 µM，总体积为500 ml。处理期间，鱼在28°C、持续通气条件下饲养24小时；对照组则以等体积DMSO处理。处理结束后，先用鱼水冲洗鱼两次，再实施安乐死并解剖。

组织分离、固定与处理

从成年斑马鱼中解剖出完整脑组织，并在4°C下于摇床上振荡过夜，置于以补充了0.1% Tween-20的1× PBS（PBS-T）配制的4%多聚甲醛（PFA）中固定。随后用PBS-T清洗样本，并在室温下依次以甲醇浓度递增的PBS-T（25% / 50% / 75% / 100%）进行脱水，每次清洗5分钟；之后将样本保存在−20°C的100%甲醇中。处理时，使用甲醇/PBS-T洗液按相反顺序对组织进行复水，随后以PBS-T进行最后一次清洗。将样本置于1 ml色素去除液（以水配制，含3% H₂O₂、5%甲酰胺和0.5× SSC）中，在光照下孵育15分钟。随后在室温下轻柔摇动，用PBS-T清洗脑组织5分钟。

对于BrdU标记的样本，在复水前进行抗原修复；首先将样本置于……中孵育。

将2N储备液以100%甲醇稀释配制成0.2N HCl，在室温下振荡处理30分钟。随后，样品用100%甲醇冲洗，并通过一系列甲醇洗液进行再水化；各步骤均在室温下振荡处理5分钟，且甲醇浓度依次降低（75% / 50% / 25%），所用洗液均以PBS-T配制。最后单独使用PBS-T清洗后，将组织置于1X RNAscope™ Target Retrieval Reagent中，在98°C下振荡处理5分钟；该试剂由10X储备液以水稀释至1X。

单分子mRNA荧光原位杂交（smFISH）

为检测整体包埋的脑顶组织中的基因表达，按照制造商说明书进行RNAscope™ HiPlex v2检测，并针对整体包埋组织进行了部分调整。所有RNAscope™ HiPlex v2试剂在使用前均恢复至室温。完成再水化和色素去除后，将样品置于含50μl RNAscope™ HiPlex v2稀释缓冲液的Eppendorf管中，在40°C下振荡预杂交3小时。将每种探针各取1μl，以1:50的比例稀释于稀释缓冲液中，最终体积为50μl（下文称为探针溶液），随后在40°C下预热10分钟。移除组织样品中的稀释缓冲液，并以探针溶液替代，随后在40°C下振荡孵育过夜。之后移除探针溶液，样品在室温下轻柔振荡，于1ml 1X RNAscope™洗涤缓冲液中清洗两次，每次10分钟；随后加入50μl Amp1，在40°C下振荡孵育30分钟，之后在室温下使用1ml 1X RNAscope™洗涤缓冲液清洗两次，每次10分钟。对Amp2和Amp3重复相同的孵育和清洗步骤。随后以50μl FluoroT1-T3替换1X RNAscope™洗涤缓冲液，并将样品在40°C下孵育。

在振荡条件下孵育 15 分钟。样品用 1 ml 1X RNAscope™ 洗涤缓冲液洗涤三次，每次 10 分钟；随后进行免疫染色（如下所述），并封片于显微镜载玻片上成像（称为第 1 轮）。图像采集完成后，将组织从载玻片上取下，在室温下用 PBS-T 洗涤 5 分钟。随后再用 4X SSC 洗涤 5 分钟。然后，将样品置于新鲜配制的 4X SSC 稀释液中的 10% RNAscope™ HiPlex V2 切割液内，在室温下轻柔摇晃孵育 15 分钟。用 PBS-T 洗涤 5 分钟后，再次将样品置于 10% 切割液中，在室温下轻柔摇晃孵育 15 分钟。随后将组织转移至 15 ml Falcon 管中，在室温下轻柔摇晃，用 14 ml PBS-T 洗涤五次。再将样品转回 Eppendorf 管中，加入 50 μl FluoroT4-T6，在 40°C 振荡孵育 15 分钟。样品用 1 ml 1X RNAscope™ 洗涤缓冲液洗涤三次，每次 10 分钟，然后封片于显微镜载玻片上成像（第 2 轮）；封片时需注意，使端脑半球的方向尽可能与首次成像时一致。图像采集完成后，将组织从载玻片上取下，转移至 Eppendorf 管中，并于 4°C 下置于 PBS-T 中过夜保存。次日上午，先用 4X SSC 洗涤 5 分钟，随后按照 FluoroT4-T6 所述步骤进行相同的切割和荧光团杂交操作，直至显现并成像与 FluoroT7-T9（第 3 轮）及 FluoroT10-T12（第 4 轮）相关的探针。采用 12 探针多重检测方案显现的各转录本的定量结果，与在单次实验中检测探针的实验结果进行比较。

在不进行任何切割的情况下进行相应处理，以确认荧光团切割溶液不会影响全组织样本中的基因表达计数（数据未显示）。

免疫染色

为检测原位蛋白，将样本置于1 ml封闭液（以1× PBS配制，含0.1% Triton X-100、4%正常山羊血清和0.1% DMSO）中，在室温下摇动孵育3小时。将一抗稀释于500 μl封闭液中，并于4°C孵育过夜，稀释比分别为：小鼠IgG1抗Zo1，1:250；小鼠IgG1抗Sox2，1:250；小鼠IgG2a抗Gs，1:1000；鸡抗GFP，1:1000；兔抗BrdU，1:1000。次日，样本在室温下摇动，以1 ml PBS-T清洗三次，随后置于500 μl封闭液配制的二抗（稀释比1:1000）中，于4°C孵育过夜。再过一天，样本以1 ml PBS-T清洗三次后进行成像。由于Zo1和Sox2的空间定位不同，两者与smFISH联合使用时可在同一通道显示。

共聚焦显微镜

使用配备40×油镜物镜和ZEN black软件的正置Zeiss LSM980 Axio Examiner共聚焦显微镜采集端脑整体样本图像。将样本置于厚度为0.5 mm的塑料间隔片内，间隔片粘附于Polysine™黏附载玻片上，并覆盖22 mm × 22 mm的#1号盖玻片。成像参数如下：在15–20 µm范围内以0.4 µm的z轴步进采集；xy平面分辨率为0.15–0.25 µm/像素；各通道的针孔设为1个艾里单位（AU），每条扫描线平均2次；分辨率为1024 × 1024像素，位深为16位。每次实验的激光功率保持在0.8–2%，并根据染色质量调整探测器增益。

图像分析

图像分析在 Imaris（v10）和 Napari（v0.4.19）中使用 Python（v3.9）完成。

BrdU 标记细胞核的鉴定

在缺乏其他核标记物的情况下，为了将 BrdU 阳性细胞核归属于相应的顶端表面，在 Imaris 中对共聚焦图像视图进行三维重建，并考察了多种细胞特征。这些特征包括：BrdU 阳性细胞核与顶端细胞表面之间的距离、BrdU 强度、细胞核的取向，以及根据缺乏胞质 Gs 免疫染色所推断的细胞核体积内 BrdU 免疫信号的连续性；对于每个 BrdU 阳性细胞，均在三维重建图像和二维 z-stack 图像中对上述特征进行了仔细检查。ZO-1 染色不连续的细胞，或由于不同图像之间组织取向发生变化而无法测量全部 8 个转录本的细胞，均未纳入分析。每个细胞均被赋予一个字母数字组合的 Cell ID，该编号由图像分析过程中细胞被分割的先后顺序确定，并以观察到该细胞的大脑半球作为前缀（例如：RH16，表示右半球内的第 16 个细胞）。每个 BrdU 阳性克隆还被赋予一个数字型 Clone ID，用于追踪细胞之间的亲缘关系。

使用 Multireg 对多重 smFISH 图像进行配准

我们开发了 napari 插件 multireg，用于对同一视野、且所有图像均包含一个共同颜色通道的三维图像进行配准（在本研究中为 ZO-1 染色）。在重复进行探针杂交的过程中，当组织从显微镜载玻片上取下并重新安装到载玻片上时，组织的形状和取向可能发生变化；该插件可对这些变化进行配准和校正。对于每幅图像，均使用 Python 配准库 itk-Elastix^40，在应当保持一致的共同通道上计算图像的对齐方式和变换参数，随后将其应用于所有其他通道。首先，进行仿射……

基于标志点的配准（在参考图像和移动图像上手动标注）用于对图像进行全局对齐，使相似区域彼此对应。此初始步骤有助于识别共同区域，并校正已安装图像之间的大幅位移和旋转。随后，使用基于 B 样条的配准进行自动细化。该步骤进一步提高配准精度，同时校正实验过程中发生的组织变形。最后，将计算得到的变换应用于移动图像的所有其他颜色通道。对待配准的 3–4 个图像堆栈（拆卸/重新安装迭代）重复这一流程。该插件的最终输出为一幅复合图像，其中包含公共通道（在完成对齐后，对全部或部分迭代结果取平均）以及经过配准的所有其他通道。由此，可对多重 smFISH 实验中的 smFISH 信号进行准确的定量分析；在此类实验中，不同转录本是在同一块全组织铺片的同一区域内依次成像的。

Multireg

为开源软件，可在 GitLab 上获取（gitlab.pasteur.fr/gletort/multireg），并可作为 pip 模块安装（pip install multireg），也可通过 Napari 的插件界面安装。

原位基因表达与细胞特征

使用第二个 Napari 插件 FishFeats²³² 对 Multireg 生成的 14 通道复合图像进行分析。该定制插件提供了一套灵活的分析流程，用于分析经连接部标记物（Zo1）、细胞核标记物（DAPI）和 smFISH 染色的细胞三维图像。通过基于形态学滤波（顶帽变换）的方法以及一个专门训练用于区分线性结构（连接部）与大体积结构（细胞核）的神经网络，将在同一通道中采集的连接部和细胞核染色信号分离。

（见 https://gitlab.pasteur.fr/gletort/fishfeats/-/wikis/Separate-junctions-…）。将提取的连接部位染色信号通过局部最大值投影转换为二维图像，并使用 EPySeg⁷⁴ 进行分割。必要时，借助特定的 napari 插件选项对分割结果进行人工校正，以便于手动修正。使用 Big-FISH⁴² 的自动阈值估计功能对 smFISH 信号进行分割。随后，根据细胞顶端区域在垂直方向上的投影位置，将分割得到的信号点初步分配给相应细胞（直接投影）。我们测试了多种初始分配方法（见 FishFeats 插件中的选项），对于大多数 mRNA，Z 轴投影的初始分配效果最佳。距离任何顶端区域过远（位置过低或偏向侧方）的信号点被视为未分配。随后通过插件中的特定选项对初始分配结果进行人工校正，使每个分割后的 RNA 信号点都分配给最可能的细胞。同时出现在多个颜色通道中的信号点（在 FishFeats 中称为“重叠信号点”）可能属于染色伪影，因此不予分配。分割完成后，使用 FishFeats 插件定量每种 mRNA 的每个细胞内 smFISH 点数，并测量顶端细胞面积等其他细胞特征。通过手动将细胞分配至用户定义的类别，定量细胞质免疫染色强度（FishFeats 中的“ClassifyCells”选项）。

通过注释转移整合多模态数据

使用 Python 软件包 scanpy v1.9.2⁷⁵ 对 scRNA-seq 数据进行预处理。预处理包括三个步骤：首先按每个细胞的所有基因总计数进行归一化，然后对数据进行对数转换，最后使用 scanpy.pp.highly_variable_genes 选择高变基因，参数如下：

“min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5”。随后，使用 Python 软件包 SciPy v1.10.1，基于两项实验中共同测量的 12 个基因，计算每个 scRNA 细胞与 smFISH 细胞之间的 Pearson 相关距离。利用该距离矩阵，通过 20 近邻分类将 scRNA 数据中的簇注释转移至 smFISH 细胞。具体而言，根据距离矩阵，为每个 smFISH 细胞赋予其 20 个最近邻 scRNA 细胞中出现频率最高的簇注释。821 个细胞中有 817 个成功获得 q 亚簇身份；其余 4 个细胞在所检测的 12 个基因中表达水平均极低，因此无法归入任何可能的 q 亚簇注释。

BrdU 标记的 smFISH 数据集整合

对于未施加 BrdU 的 12 探针 smFISH 实验，对一个端脑半球中的 821 个细胞进行了定量分析。为确保结果可重复性，还以另一个测量了 200 多个细胞的端脑半球进行了同样的分析（数据未显示）。

对于在 10 小时 BrdU 脉冲后进行 24 小时追踪的 smFISH 实验，仅分析了一个端脑；对两侧半球中的 BrdU 标记细胞以及一侧半球中的未标记细胞进行基因表达定量，以构建可将标记细胞定位其中的转录连续谱。共分析了 435 个细胞。

对于从经 10 小时 BrdU 脉冲后分别追踪 4、8、14 和 28 天的斑马鱼中解剖获得的端脑所进行的 smFISH 实验，BrdU 标记样本采用了两个生物学重复，即分别取自两条独立鱼的端脑：追踪 4 天的样本分别包含 461 和 863 个细胞，追踪 8 天的样本分别包含 621 和 512 个细胞，追踪 28 天的样本包含 626 个细胞。

以及标记后431个细胞；对于14天追踪实验，仅纳入一个端脑（775个细胞）。将这些实验各自的基因表达值与未添加 BrdU 的条件下的表达值合并，进行对数转换并以0为中心缩放，随后使用 R 软件包 sva 中的 ComBat 函数进行批次校正；该函数是在比较不同批次校正方法后选定的⁷⁷˒⁷⁸。使用 R 软件包 umap⁷⁹ 对 smFISH 细胞特征进行二维 UMAP 降维，参数设为 n_neighbors = 50、min_dist = 0.5，以优先保留数据的全局结构而非局部邻域；采用欧氏距离，并固定随机种子为123以确保结果可复现。

层次聚类

在 R 中使用基础软件包 stats，基于原位基因表达数据进行层次聚类，采用欧氏距离和 Ward 方法（Ward D2）。对于使用12个或5个探针测量基因表达的实验，聚类基于原始基因表达值进行。对于整合了多个数据集并进行了批次校正的8探针实验，则使用经对数转换和缩放后的数值。通过对表达数据进行100次有放回自助抽样评估聚类稳定性。对于每个自助抽样样本，均对细胞进行层次聚类，并记录各次迭代中细胞两两共同聚类的频率，从而生成细胞间稳定性矩阵；该矩阵按每对细胞在重抽样数据中共同出现的次数进行归一化。所得矩阵表示任意两个细胞在重抽样条件下被分配至同一聚类的概率。随后，将每个细胞与其所属原始聚类中其他细胞的共同聚类频率取平均，计算该细胞的稳定性得分。

静息评分

静息评分源自

使用 R 基础 stats 包进行主成分分析（PCA）后，获得第一主成分（PC1）值。随后将 PC1 值缩放至 0 至 1，使较低的值代表处于较浅静息深度的细胞。

数据可视化

使用 R 的 ggplot2 包⁸⁰及其扩展包 ggpubr⁸¹绘制条形图、小提琴图、箱线图和点图。使用 R 包 ggcorrplot⁷²根据缩放和标准化后的基因表达数据绘制相关矩阵。针对 12 探针和 8 探针 smFISH 实验生成的二维 UMAP 嵌入，分别使用 R 包 umap⁷⁹，并分别设定 n_neighbors = 75 和 n_neighbors = 50；两种实验条件均设定 min_dist = 0.5，以优先保留数据的全局结构，而非局部邻域。对于仅检测到 5 个基因的实验，设定 n_neighbors = 100 和 min_dist = 0.9。所有情况下均采用欧氏距离度量，并固定随机种子为 123，以确保结果可复现。使用 R 包 ape⁸²构建 BrdU 标记克隆的谱系树；纳入的克隆包含具有顶端域的细胞，且其中所有标记细胞核（包括 NSPC 层内及其下方的细胞核）均可被可靠识别。随后使用 R 的 ggplot2 包⁸⁰绘制 UMAP 坐标。

为可视化顶端面积与静息评分之间的关系，并比较 LY 处理与未处理条件下不同顶端面积区间的情况，分析仅纳入顶端面积为 50–250 µm² 的细胞；50 µm² 为自我更新细胞⁸的最小面积，面积更大的细胞则被视为离群值（面积 > 1.5 倍四分位距）。在每个面积区间内，分别绘制 LY 处理组和未处理组细胞的核密度估计（KDE）。使用带宽调整因子为……的高斯核对曲线进行平滑。

数值为 1.2，图表使用 R 包 dplyr 和 ggplot2 生成。

为估算顶端大小随时间的增长，使用 R 基础 stats 包进行了线性回归。

定量分析与统计分析

统计分析

均值比较、误差线和统计检验的详细信息见图例。进行 Welch 单因素方差分析，随后进行 Games-Howell 事后检验，并针对三次比较采用 Bonferroni 校正。使用 R 基础 stats 包进行了双侧 Wilcoxon 秩和检验。使用 R 包 emmeans 在各实验条件下估算最小二乘均值，并通过 Tukey 校正的对比评估数据集之间的成对差异。所有统计检验均以 p < 0.05 为显著性标准。

致谢

感谢 Sebastien Bedu 和 Nathan Guibert 提供专业的鱼类照护，也感谢 ZEN 实验室全体成员在项目期间进行的深入讨论。感谢巴斯德研究所发育与干细胞生物学系，以及 Florian Muller 和 Christophe Zimmer 提供的专业建议和建设性交流。感谢 BioTechne 的 Ludovic Arnold 和 Melissa Turan 提供技术支持。本研究获得法国国家研究署（ANR）（向 LBC 提供的 ANR PRC QDynamics 项目及 Labex Revive，ANR-10-LABX-0073）、医学研究基金会（向 LBC 提供的 EQU202203014636）、法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、巴斯德研究所及欧洲研究委员会（ERC）（向 LBC 提供的高级资助与协同资助项目 595 101071786 – PEPS）的资助。此外，本研究还获得一项由 ANR 管理、法国 2030 计划下的政府拨款支持，项目编号为 ANR-24-EXCI-0001、ANR-24-EXCI-0002、ANR-24-EXCI-0003、ANR-24-EXCI-0004 和 ANR-24-EXCI-0005。TF 获得了 Roux-Cantarini 奖学金。

来自巴斯德研究所。JS的工作由Inception计划资助（Investissement d’Avenir资助项目ANR-16-CONV-0005，授予LC），LC的工作由欧盟资助（ERC StG项目MULTIview-CELL，项目编号101115618，授予LC）。

资助方信息声明

法国国家研究署（Agence Nationale de la Recherche），

https://ror.org/00rbzpz17，PRC QDynamics，

ANR-10-LABX-0073，

ANR-24-EXCI-0001，

ANR-24-EXCI-0002，

ANR-24-EXCI-0003，

ANR-24-EXCI-0004

欧洲研究委员会（European Research Council），

https://ror.org/0472cxd90，AdG SyG 595 101071786 – PEPS，

StG项目MULTIview-CELL，项目编号101115618

法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale），

https://ror.org/04w6kn183，EQU202203014636

脚注

↵

主要联系人

参考文献

↵

Mancini，L.，Guirao，B.，Ortica，S.，Labusch，M.，Cheysson，F.，Bonnet，V.，Phan，M.S.，Herbert，S.，Mahou，P.，Menant，E.，等（2023）。

顶端大小和deltaA表达可预测成年神经干细胞沿谱系进展过程中的命运决定。

Sci. Adv.

9。

doi：10.1126/sciadv.adg7519。

OpenUrl

CrossRef

PubMed

↵

Than-Trong，E.，Kiani，B.，Dray，N.，Ortica，S.，Simons，B.，Rulands，S.，Alunni，A.，以及Bally-Cuif，L.（2020）。

Than-Trong等：谱系层级和随机性确保成年神经干细胞的长期维持。

↵

Bottes，S.，Jaeger，B.N.，Pilz，G.A.，Jörg，D.J.，Cole，J.D.，Kruse，M.，Harris，L.，Korobeynyk，V.I.，Mallona，I.，Helmchen，F.，等（2021）。

通过活体成像鉴定的成年小鼠海马中长期自我更新的干细胞。

Nat. Neurosci.

24，225–233。

doi：10.1038/s41593-020-00759-4。

OpenUrl

CrossRef

PubMed

↵

Ehm，O.，Göritz，C.，Covic，M.，Schäffner，I.，Schwarz，T.J.，Karaca，E.，Kempkes，B.，Kremmer，E.，Pfrieger，F.W.，Espinosa，L.，等（2010）。

RBPJκ依赖性信号传导对于成年海马中神经干细胞的长期维持至关重要

《神经科学杂志》

，13794

–

13807

。

doi：

10.1523/JNEUROSCI.1567-10.2010

。

开放链接

摘要

免费

全文

↵

Barbosa

，

J.S.

，

Sanchez-Gonzalez

，

Di Giaimo

，

Baumgart

E V

，

Theis

F J

，

Götz

，和

Ninkovic

（

2015

）。

在完整及损伤斑马鱼脑中对成年神经干细胞行为的活体成像

。

《科学》

。

348

，

789

–

793

。

doi：

10.1126/science.aaa2729

。

开放链接

摘要

免费

全文

↵

Dray

，

Mancini

，

Binshtok

，

Cheysson

，

Supatto

，

Mahou

，

Bedu

，

Ortica

，

Than-Trong

，

Krecsmarik

，

等

（

2021

）。

成年脊椎动物脑中神经干细胞命运决定的动态时空协调通过局部反馈实现

。

《细胞·干细胞》

，

1457

–

1472

.e12。

doi：

10.1016/j.stem.2021.03.014

。

开放链接

交叉引用

↵

Rothenaigner

，

Krecsmarik

，

Hayes

，

J.A.

，

Bahn

，

Lepier

，

Fortin

，

Götz

，

Jagasia

，

，和

Bally-Cuif

，

。（

2011

）。

通过不同的病毒载体进行克隆分析，鉴定成年斑马鱼端脑中真正的神经干细胞，并刻画其分裂特性和命运

。

《发育》

138

，

1459

–

1469

。

doi：

10.1242/dev.058156

。

开放链接

摘要

免费

全文

↵

Pilz

，

G.-A.

，

Bottes

，

Betizeau

，

Jörg

，

D.J.

，

Carta

，

April

，

Simons

，

B.D.

，

Helmchen

，

，和

Jessberger

，

。

成年小鼠海马神经发生的活体成像

。

↵

Dray

，

Bedu

，

Vuillemin

，

Alunni

，

Coolen

，

Krecsmarik

，

Supatto

，

Beaurepaire

，

，和

Bally-Cuif

，

（

2015

）。

其内源性微环境中成年神经干细胞的大规模活体成像

。

《发育》（剑桥）142，3592–3600。

doi：10.1242/dev.123018。

OpenUrl

摘要

免费

全文

10.

↵

Cebrian-Silla，A.，Nascimento，M.A.，Redmond，S.A.，Mansky，B.，Wu，D.，Obernier，K.，Rodriguez，R.R.，Gonzalez-Granero，S.，Garcia-Verdugo，J.M.，Lim，D.A.，等（2021）。

单细胞分析脑室-室管膜下区揭示背侧和腹侧成年神经源性谱系的特征。

《eLife》10。

doi：10.7554/eLife.67436。

OpenUrl

CrossRef

11.

↵

Cebrian-Silla，A.，Nascimento，M.A.，Mancia，W.，Gonzalez-Granero，S.，Romero-Rodriguez，R.，Obernier，K.，Steffen，D.M.，Lim，D.A.，Garcia-Verdugo，J.M.，以及Alvarez-Buylla，A.（2025）。

成年小鼠脑室-室管膜下区中从B1细胞到B2细胞的神经干细胞接力。

《细胞报告》。

44。

doi：10.1016/j.celrep.2025.115264。

OpenUrl

CrossRef

PubMed

12.

↵

Shin，J.，Berg，D.A.，Zhu，Y.，Shin，J.Y.，Song，J.，Bonaguidi，M.A.，Enikolopov，G.，Nauen，D.W.，Christian，K.M.，Ming，G.L.，等（2015）。

利用Waterfall进行单细胞RNA测序揭示成年神经发生的分子级联。

《细胞干细胞》17，360–372。

doi：10.1016/j.stem.2015.07.013。

OpenUrl

CrossRef

PubMed

13.

↵

Mitic，N.，Neuschulz，A.，Spanjaard，B.，Schneider，J.，Fresmann，N.，Novoselc，K.T.，Strunk，T.，Münster，L.，Olivares-Chauvet，P.，Ninkovic，J.，等（2024）。

解析成年神经干细胞的时空多样性。

《分子系统生物学》20，321–337。

doi：10.1038/s44320-024-00022-z。

OpenUrl

CrossRef

14.

↵

Cosacak，M.I.，Bhattarai，P.，Reinhardt，S.，Petzold，A.，Dahl，A.，Zhang，Y.，以及Kizil，C.（2019）。

神经干细胞异质性和情境依赖性可塑性的单细胞转录组学分析。

在一种

斑马鱼淀粉样蛋白毒性脑模型。《Cell Reports》27：1307–1318.e3。doi：10.1016/j.celrep.2019.03.090。

Rigo, P.，Ahmed-de-Prado, S.，Johnston, R.L.，Choudhury, C.，Guillemot, F. 和 Harris, L.（2025）。连续转录程序支撑海马干细胞的激活。
Harris, L.，Rigo, P.，Stiehl, T.，Gaber, Z.B.，Austin, S.H.L.，Masdeu, M. del M.，Edwards, A.，Urbán, N.，Marciniak-Czochra, A. 和 Guillemot, F.（2021）。细胞行为的协同变化确保海马干细胞群的终身维持。《Cell Stem Cell》28：863–876.e6。doi：10.1016/j.stem.2021.01.003。
Morizet, D.，Foucher, I.，Mignerey, I.，Alunni, A. 和 Bally-Cuif, L.（2025）。Notch信号通路阻断将静息神经干细胞的转录组异质性与其再激活途径及潜能联系起来。
Rigo, P.，Ahmed-de-Prado, S.，Johnston, R.L.，Choudhury, C.，Guillemot, F. 和 Harris, L.（2025）。连续转录程序支撑海马干细胞的激活。
Dulken, B.W.，Leeman, D.S.，Boutet, S.C.，Hebestreit, K. 和 Brunet, A.（2017）。单细胞转录组分析揭示成年神经干细胞谱系的异质性与转录动态。《Cell Reports》18：777–790。doi：10.1016/j.celrep.2016.12.060。
Morizet, D.，Foucher, I.，Alunni, A. 和 Bally-Cuif, L.（2024）。通过跨物种单细胞转录组分析重建大胶质细胞与成年神经发生的演化。《Nature Communications》15。doi：10.1038/s41467-024-47484-1。
Tritschler, S.，Büttner, M.，Fischer,】【。

D.S. Lange、M. Bergen、V. Lickert、H. Theis（2019）。从单细胞基因组学数据中学习发育轨迹的概念与局限。发表于 *Company of Biologists Ltd* 的预印本，doi：10.1242/dev.170506，https://doi.org/10.1242/dev.170506。

摘要 / 免费全文

M. Lange、V. Bergen、M. Klein、M. Setty、B. Reuter、M. Bakhti、H. Lickert、M. Ansari、J. Schniering、H.B. Schiller 等（2022）。用于定向单细胞命运图谱绘制的 CellRank。*Nat. Methods* 19，159–170。doi：10.1038/s41592-021-01346-6。
V. Bergen、M. Lange、S. Peidli、F.A. Wolf、F.J. Theis（2020）。通过动力学建模将 RNA 速率推广至瞬态细胞状态。*Nat. Biotechnol.* 38，1408–1414。doi：10.1038/s41587-020-0591-3。
X. Qiu、Q. Mao、Y. Tang、L. Wang、R. Chawla、H.A. Pliner、C. Trapnell（2017）。反向图嵌入解析复杂的单细胞轨迹。*Nat. Methods* 14，979–982。doi：10.1038/nmeth.4402。
K. Street、D. Risso、R.B. Fletcher、D. Das、N. Nga

关键词：成年神经干细胞 · 转录组异质性 · 细胞命运不对称 · 静息周期 · 单细胞转录组

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.05.736547v1?rss=1

来源出处

实时关联转录组与细胞行为揭示成年神经干细胞在分子层面的命运不对称性及静息周期 https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.05.736547v1?rss=1