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AAA+金属蛋白酶FtsH与HflK和HflC结合，形成兆道尔顿级的FtsH-HflKC复合物（FHC），参与大肠杆菌的膜蛋白质量控制。近期的结构研究揭示了不对称的HflKC架构及可变的FtsH占据情况，这与早期通过交联获得的、由四个六聚体构成的对称笼状结构形成对比。在本研究中，我们采用单颗粒冷冻电镜、体积排阻色谱联用小角X射线散射（SEC-SAXS）及生化活性测定，分析了由单个多顺反子质粒共表达、经月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG）增溶的野生型、未经交联的FHC。二维分类鉴定出含有HflKC并结合一个或两个FtsH六聚体的颗粒，以及一类独立存在的游离FtsH颗粒。对FtsH胞质结构域进行聚焦重构，获得了分辨率为5.32埃的结构，在未引入稳定性替换突变或添加核苷酸类似物的条件下，呈现了野生型、未经交联的FtsH的结构特征。该重构保留了AAA+环与蛋白酶环的特征性堆叠排列，但与经稳定化处理的参考结构相比，其AAA+环在侧向上更为张开，而蛋白酶环的整体包络形状则大致相似。在C1对称性下获得的分辨率为9.63埃的HflKC共识重构及三维变异性分析（3DVA）进一步揭示了显著的构象变异，其支架几何形态涵盖类开放状态至更收拢的状态。对选定的、较晚洗脱的LMNG增溶组分进行SEC-SAXS分析，获得了紧凑且具有各向异性的包络，其估算的最大尺寸（Dmax）约为110–115埃，但尚无法将该组分归属于具有明确化学计量组成的完整FHC。在所测试的条件下，FHC制备样品的表观ATP酶活性和蛋白水解活性也低于游离的FtsH。总体而言，这些发现凸显了未交联FHC在组成和构象上的异质性，并揭示了与稳定化的参考结构相比，野生型FtsH中的AAA+结构域排列在横向上更为张开。
未交联 FtsH-HflKC 组装体的结构异质性包括可变的 FtsH 占据数及独特的野生型 FtsH 架构 | bioRxiv
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Ugurlar
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Imre
Berger
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Christiane
Schaffitzel
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Burak V.
Kabasakal
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.10.12.758600
Gunce Goc
1
土耳其安卡拉，土耳其加速器与辐射实验室；土耳其科贾埃利，科贾埃利大学生物学系；
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Deniz Ugurlar
2
荷兰埃因霍温，赛默飞世尔科技材料与结构分析部门；
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Imre Berger
3
英国布里斯托尔，布里斯托尔大学生物化学学院；英国布里斯托尔，布里斯托尔大学化学学院及马克斯·普朗克布里斯托尔最简生物学中心；
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Christiane Schaffitzel
4
英国布里斯托尔，布里斯托尔大学生物化学学院；
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Burak V. Kabasakal
5
土耳其安卡拉，土耳其加速器与辐射实验室；英国布里斯托尔，布里斯托尔大学生物化学学院；系别：
土耳其安卡拉，中东技术大学生物科学系
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bvkabasakal{at}tarla-fel.org
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AAA+ 金属蛋白酶 FtsH 与 HflK 和 HflC 结合，形成兆道尔顿级的 FtsH-HflKC 复合物（FHC），参与大肠杆菌的膜蛋白质量控制。近期的结构研究揭示了不对称的 HflKC 架构和可变的 FtsH 占据数目，这与早期经交联获得的、包含四个六聚体的对称笼状结构形成对比。在本研究中，我们采用单颗粒冷冻电镜、体积排阻色谱联用小角 X 射线散射（SEC-SAXS）以及生化活性测定，分析了由单个多顺反子质粒共表达、并用月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG）增溶的野生型、未经交联的 FHC。二维分类鉴定出与一个或两个 FtsH 六聚体结合的含 HflKC 颗粒，以及一类独立存在的游离 FtsH 颗粒。对 FtsH 胞质结构域进行聚焦重构，达到了 5.32 埃的分辨率，呈现了未经交联、未引入稳定化氨基酸替换且未添加核苷酸类似物的野生型 FtsH 的结构。该重构保留了 AAA+ 环与蛋白酶环的特征性堆叠排列，但与经稳定化处理的参考结构相比，其 AAA+ 环呈现更明显的侧向张开，而蛋白酶环的整体包络形态则大体相似。分辨率为 9.63 埃的 HflKC 共识重构，以及在 C1 对称性下进行的三维变异性分析（3DVA），进一步揭示了显著的构象变异，其支架几何形态涵盖近似开放状态至更为收缩的状态。对选定的某一……进行的 SEC-SAXS 分析
较晚洗脱的 LMNG 增溶组分呈现出紧凑的各向异性包络，其估算的最大尺寸（Dmax）约为 110–115 埃，但无法将该组分归属于具有明确化学计量比的完整 FHC。在所测试的条件下，FHC 制备物的表观 ATP 酶活性和蛋白水解活性也均低于单独的 FtsH。综上，这些结果凸显了未交联 FHC 在组成和构象上的异质性，并揭示了与稳定化参考结构相比，野生型 FtsH 的 AAA+ 排列在横向上更为张开。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
已声明的资助方信息
土耳其科学技术研究理事会，
，118C225
英国生物技术与生物科学研究理事会
，BB/P000940/1
版权
本预印本的版权归作者／资助方所有，其已授权 bioRxiv 永久展示本预印本。
本预印本依据
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发布于 2026 年 10 月 13 日。
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未经交联的 FtsH-HflKC 组装体的结构异质性包括可变的 FtsH 占据率和独特的野生型 FtsH 架构
Gunce
Goc
，
Deniz
Ugurlar
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Imre
Berger
，
Christiane
Schaffitzel
，
Burak V.
Kabasakal
bioRxiv
2026.10.12.758600；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.10.12.758600
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未经交联的 FtsH-HflKC 组装体的结构异质性包括可变的 FtsH 占据率和独特的野生型 FtsH 架构
Gunce
Goc
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Deniz
Ugurlar
，
Imre
Berger
，
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Burak V.
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2026.10.12.758600；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.10.12.758600
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关键词：FtsH-HflKC复合物 · 冷冻电镜 · 结构异质性 · 膜蛋白质量控制 · AAA+金属蛋白酶 · 构象变异
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.12.758600v1?rss=1