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背景 近期发现，编码 Z 盘及肌膜连接区蛋白 supervillin 的 SVIL 基因中的罕见杂合性功能缺失（LoF）变异可导致肥厚型心肌病（HCM）。尽管 supervillin 被认为参与肌动蛋白依赖的机械信号转导，但 SVIL 缺陷与心肌病之间的关联机制仍知之甚少。纯合性 LoF 变异会导致一种新型骨骼肌肌原纤维肌病——肌原纤维肌病 10 型（MFM-10）；而杂合性 LoF 变异则会导致 HCM，但不伴有骨骼肌病。本研究采用人源模型系统，阐明支架蛋白 supervillin 在心肌细胞中的 LoF 致病机制及其临床意义。方法 我们利用 CRISPR/Cas9 技术，将代表性致病 LoF 变异 Q255X 敲入一株同基因背景的诱导多能干细胞（iPSC）系，构建了杂合型 SVILQ255X/+ 和纯合型 SVILQ255X/Q255X 细胞系。随后将这些细胞系分化为 iPSC 衍生心肌细胞（iPSC-CM），并通过整体 RNA 测序、液相色谱-质谱（LC-MS）蛋白质组学、电生理及钙处理分析、收缩力测量、肌节组织结构分析、Seahorse 代谢通量检测，以及使用 mavacamten 进行药理学干预来评估细胞表型。结果 Q255X 变异导致 SVIL 在 RNA 和蛋白质水平均发生单倍剂量不足，且未发现截短蛋白。与同基因背景对照相比，SVILQ255X/+ iPSC-CM 表现出动作电位缩短、钙瞬变延长、肌节结构紊乱和细胞肥大，以及线粒体呼吸受损。对 SVILQ255X/+ iPSC-CM 进行的多组学分析显示，其细胞应激与炎症、肥大及促纤维化信号通路均发生改变，并因呼吸作用减弱而呈现假性缺氧状态，以及一种HIF诱导的糖酵解转变。在SVILQ255X/Q255X心肌细胞中未观察到这些异常，这与既往关于纯合变异携带者相对有限的心脏表型报道一致。Mavacamten可改善SVILQ255X/+细胞中的肌节紊乱和肥大，但未能挽救能量代谢受损。结论 致病性杂合SVIL功能丧失可产生一种独特的细胞表型，其特征为机械传导受损、线粒体功能障碍以及适应不良性代谢重塑，并由此促进肥厚性和促纤维化信号传导。这些发现为SVIL相关心肌病确立了机制基础，并提示代谢功能障碍可能是肌节靶向治疗之外的潜在治疗靶点。临床意义研究新发现- SVIL单倍体不足通过不同于经典肌节疾病的机制导致HCM，其特征包括机械传导受损、线粒体功能障碍以及假性缺氧驱动的代谢重塑。- 杂合SVIL功能丧失产生的心肌细胞表型明显重于纯合功能丧失，这为心脏疾病主要发生于杂合变异携带者提供了机制解释。- Mavacamten可改善肌节组织结构，但无法恢复受损的线粒体呼吸，表明即使接受肌节靶向治疗，能量代谢功能障碍仍然持续存在。临床意义何在？- 我们的研究结果提供了功能性证据，支持将SVIL认定为具有临床意义的HCM致病基因，并将其纳入临床遗传学检测基因面板。- 这些发现确立了SVIL相关心肌病作为一种机制上不同的HCM形式，并为其提供了新的认识。Z-盘和肌膜骨架相关肥厚型心肌病的发病机制尽管肌球蛋白受到抑制，线粒体功能障碍仍持续存在，这表明靶向线粒体生物能量代谢的药物可能成为 SVIL 相关心肌病患者的一种治疗策略。
揭示 Supervillin：SVIL 单倍剂量不足通过损害机械转导和细胞能量代谢导致肥厚型心肌病 | bioRxiv
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揭示 Supervillin：SVIL 单倍剂量不足通过损害机械转导和细胞能量代谢导致肥厚型心肌病
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Yifan J. Li，
Yiangos Psaras，
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Hugh Watkins，
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Christopher N. Toepfer
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735949
Yifan J. Li
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
MBChB，BMedSci（荣誉学位）
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Yiangos Psaras
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
2
牛津类器官中心，牛津大学舍灵顿大楼，牛津，英国
DPhil，MSc，BSc（荣誉学位）
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Violetta Steeples
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系……
牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
DPhil，理学学士（荣誉学位）
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Josephine M. Watkins
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
3
美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所，美国马里兰州贝塞斯达
理学学士
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Charlotte Hooper
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
博士，理学学士
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Marta Moya-Jódar
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
2
牛津类器官中心，牛津大学谢灵顿大楼，牛津，英国
博士，理学硕士，理学学士
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Thomas Nicol
4
牛津大学生理学、解剖学与遗传学系，谢灵顿大楼，牛津，英国
博士，生物医学科学学士
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Alexander J. Sparrow
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
博士，理学硕士，理学学士（荣誉学位）
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Marcos Garcia-Lacarte
5
牛津大学纳菲尔德医学系人类遗传学中心，牛津，英国
博士、理学硕士、理学学士
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Samuel TM Jones
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
生物学硕士
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Isabelle Bond
6
伦敦大学学院人口健康科学学院心血管科学研究所，伦敦，英国
理学硕士、理学学士（荣誉）
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Niklas Beyhoff
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
7
柏林夏里特医科大学德国心脏中心；该机构为柏林自由大学和洪堡大学的法人成员，柏林，德国
医学博士
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Paul Robinson
1
英国心脏基金会卓越研究中心，牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部，牛津，英国
哲学博士、理学学士（荣誉）
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Marieluise Kirchner
8
柏林健康研究所（隶属柏林夏里特医科大学）与马克斯·德尔布吕克分子医学中心蛋白质组学核心平台，柏林，德国
博士
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Philipp Mertins
8
柏林夏里特医科大学与马克斯·德尔布吕克分子医学中心柏林健康研究所蛋白质组学核心单元
，德国柏林
博士
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James S Ware
10
伦敦帝国理工学院国家心肺研究所及医学研究委员会医学科学实验室
，英国伦敦 W12 0NN
11
伦敦帝国理工学院医疗保健 NHS 信托基金哈默史密斯医院
，英国伦敦 W12 0HS
12
盖伊和圣托马斯 NHS 基金会信托皇家布朗普顿医院及哈里菲尔德医院
，英国伦敦 SW3 6NP
博士、医学科学院院士
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R Thomas Lumbers
9
伦敦大学学院健康信息学研究所
，英国伦敦
医学学士、博士
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Betty Raman
1
牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学分部英国心脏基金会卓越研究中心
，英国牛津
医学学士、哲学博士
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Hugh Watkins
1
牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学分部英国心脏基金会卓越研究中心
，英国牛津
5
牛津大学纳菲尔德医学系人类遗传学中心
，英国牛津
英国皇家学会院士、医学科学院院士
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Christopher
N. Toepfer
1 英国牛津大学拉德克利夫医学系心血管医学部英国心脏基金会卓越研究中心，英国牛津
2 英国牛津大学谢灵顿大楼牛津类器官中心，英国牛津
博士，理学学士（荣誉）
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通讯作者：
christopher.toepfer{at}cardiov.ox.ac.uk
摘要
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摘要
背景
近期研究发现，编码 Z 盘和肌膜连接处蛋白超维林（supervillin）的 SVIL 基因罕见杂合性功能丧失（LoF）变异可导致肥厚型心肌病（HCM）。尽管超维林参与肌动蛋白依赖性机械转导，但 SVIL 缺陷与心肌病之间的联系机制仍知之甚少。纯合性 LoF 变异可导致一种新型骨骼肌肌原纤维病——肌原纤维肌病-10（MFM-10），而杂合性 LoF 变异则导致 HCM，但不伴有骨骼肌病。在本研究中，我们利用人类模型系统，解析支架蛋白超维林在心肌细胞中的 LoF 致病机制及其临床意义。
方法
我们利用 CRISPR/Cas-9 技术，将具有代表性的致病性 LoF 变异 Q255X 引入同基因背景的诱导多能干细胞（iPSC）细胞系，构建了杂合性 SVIL^Q255X/+ 和纯合性 SVIL^Q255X/Q255X 细胞系。随后将这些细胞系分化为 iPSC 来源的心肌细胞（iPSC-CM），并通过整体 RNA 测序、液相色谱-质谱（LC-MS）蛋白质组学分析、电生理学与钙处理分析、收缩力测定、肌节组织结构分析、Seahorse 代谢通量检测，以及使用马伐卡坦（mavacamten）的药理学干预，对细胞表型进行了评估。
结果
Q255X 变异
导致 SVIL 在 RNA 和蛋白水平均发生单倍剂量不足，且未发现截短蛋白。与同基因对照相比，SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 表现出动作电位缩短、钙瞬变延长、肌节排列紊乱和肥大，以及线粒体呼吸受损。对 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 进行的多组学分析显示，其细胞应激与炎症、肥大和促纤维化信号，以及由呼吸减弱和 HIF 诱导的糖酵解转变所驱动的假性缺氧状态。SVIL^Q255X/Q255X 心肌细胞中未见这些异常，这与纯合变异携带者所报告的相对轻微心脏表型一致。Mavacamten 改善了 SVIL^Q255X/+ 细胞的肌节排列紊乱和肥大，但未能纠正能量代谢受损。
结论
致病性杂合 SVIL 功能缺失（LoF）会产生一种独特的细胞表型，其特征为机械传导受损、线粒体功能障碍和适应不良的代谢重塑，并促进肥大及促纤维化信号。这些发现揭示了 SVIL 相关心肌病的机制基础，并指出代谢功能障碍可能是肌节靶向治疗之外的潜在治疗靶点。
研究新发现
SVIL 单倍剂量不足通过不同于经典肌节疾病的机制导致肥厚型心肌病（HCM），其特征为机械传导受损、线粒体功能障碍，以及假性缺氧驱动的代谢重塑。
与纯合功能缺失相比，杂合 SVIL 功能缺失会导致严重得多的心肌细胞表型，为心脏疾病主要发生于杂合变异携带者提供了机制解释。
Mavacamten 可改善肌节组织结构。
但未能恢复受损的线粒体呼吸功能，表明即使采用靶向肌节的治疗，能量代谢功能障碍仍然存在。
临床意义是什么？
我们的研究结果提供了功能性证据，支持将 SVIL 视为具有临床意义的 HCM 致病基因，并将其纳入临床基因检测 panel。
这些结果确立了 SVIL 相关心肌病是一种机制上不同的 HCM 亚型，并为理解 Z 盘及肌膜骨架相关 HCM 的发病机制提供了新的见解。
尽管使用肌球蛋白抑制剂，线粒体功能障碍仍持续存在，这提示靶向线粒体生物能量代谢的药物可能成为 SVIL 相关心肌病患者的一种治疗策略。
引言
HCM 是一种复杂的遗传性疾病，其致病基础包括单基因和多基因因素。八种核心肌节基因中的罕见致病变异导致大多数单基因病例，约占病例总数的 35%（HCM_SARC+）；而非肌节基因中的常见变异则参与多基因疾病的发生（HCM_SARC−）。然而，一部分非核心肌节 HCM 基因同时参与单基因和多基因疾病的发生¹˒²。这类基因通常参与肌节调控（例如 FHOD3³、ALPK3⁴）、钙信号传导或细胞应激反应（例如 PLN、CRYAB），或与 Z 盘／肌膜骨架相关（例如 CSRP3、FHL1、FLNC、ACTN2、MYOZ2）⁵˒⁶。
近期一项结合罕见变异关联分析的全基因组关联研究（GWAS）荟萃分析鉴定出 SVIL（编码多结构域、肌动蛋白结合型 Z 盘蛋白 supervillin）这一新的 HCM 致病基因；在杂合子患者中，罕见截短变异与 HCM 风险增加 10.5 倍相关²。SVIL 位于 10 号染色体的反向链上，具有多个蛋白质编码转录本，其中最…
在心脏中表达的是骨骼肌和心肌特异性亚型 SVIL-201（Ensembl，第 114 版⁷），其编码一种约 250 kDa 的蛋白质（又称 Archvillin⁸）；其次是平滑肌和非肌肉组织特异性亚型 SVIL-203（约 200 kDa）。SVIL 的组织整体基因表达数据（GTEx Portal 第 10 版⁹）显示，SVIL 在骨骼肌中的表达水平最高，其次为平滑肌（分布于多种器官），再其次为心肌（补充图 1）。Supervillin 与丝状肌动蛋白（F-actin）结合，定位于 Z 盘和细胞核，并在肌膜下致密区与肌营养不良蛋白和 nebulin 共定位；它作为一种额外连接结构，参与肌动蛋白丝与肌膜之间的侧向力传导，对实现高效传力至关重要⁸˒¹⁰。Supervillin 在肌细胞中的其他作用包括肌原纤维形成¹¹；在非肌细胞中的作用则包括胞质分裂¹²˒¹³、细胞黏附¹⁴、铺展¹⁵、运动¹⁶和存活¹⁷。此前一项机器学习研究将 SVIL 确定为影响左心室直径的候选基因；在斑马鱼中敲低该基因的 morpholino 可导致心脏水肿¹⁸。在人类中，SVIL 功能缺失（LoF）与降主动脉直径较小相关¹⁹；在 4 名患者中观察到的纯合 LoF 则表现为一种新型骨骼肌病，称为肌原纤维肌病 10 型（MFM-10），并伴有轻微心脏表现²⁰。近期一项研究发现，SVIL 位点在排除肥厚型心肌病（HCM）影响后，仍与非缺血性心肌病达到全基因组关联研究（GWAS）的显著性；使用 siRNA 敲低 SVIL 的功能研究则显示，小鼠心肌细胞出现肥大、凋亡及存活能力受损²¹。
目前对 SVIL 功能缺失引发 HCM 的机制知之甚少。此前提出的 HCM 病理性肥大的统一机制认为，心肌过度收缩和舒张功能不全会导致低效的……
能量消耗，导致能量耗竭和钙稳态失调，并汇聚于下游肥厚性信号通路
22
。该模型与近期及经典研究所发现的病理机制相吻合，这些机制解释了由错义
MHY7
23
或截短型
MYBPC3
变异
24
,
25
所致的典型肌节超收缩性HCM表型；同时，该模型在一定程度上也解释了细丝HCM变异如何通过直接破坏钙稳态调控而驱动HCM
26
–
28
。然而，仍需进一步阐明其机制，以解释为何部分丧失一种与Z盘及肌膜下结构肌动蛋白相互作用的蛋白（如supervillin）会驱动HCM疾病进程，而完全功能丧失（LoF）却未表现出这一现象。
在本研究中，我们结合使用诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）和CRISPR/Cas-9，在培养皿中构建并模拟
SVIL
Q255X/+
和
SVIL
Q255X/Q255X
患者变异。通过这一方法，我们首次在RNA、蛋白质及细胞功能层面揭示了杂合和纯合
SVIL
LoF的后果；大规模转录组学和蛋白质组学数据提示，
SVIL
心肌病与杂合变异携带者相关。因此，我们提出了一种符合能量耗竭假说的病理性心脏肥厚新机制，该机制独特且特异于杂合
SVIL
LoF，并据此建立了用于治疗干预的机制框架。
方法
**同基因型iPSC-CM
SVIL
截短模型的构建**
Tadros等人
2
所描述的两名HCM表亲携带LoF
SVIL
变异（p.Gln255X）。按照既往所述方法
29
，采用基于同源定向修复（HDR）的CRISPR/Cas-9技术，将该变异引入HPSI0114i-kolf_2（KOLF2）iPSC细胞系，构建同基因型野生型（WT）
SVIL
+/+
、
SVIL
Q255X/+
和
SVIL
Q255X/Q255X
细胞系（
见补充方法
）。随后对iPSC进行分化，生成……
如前所述，将其诱导分化为心肌细胞（CMs）30,31（见补充方法）。
同基因型 iPSC-CMs 的免疫荧光分析
将重新铺板的 iPSC-CMs 用 4% 多聚甲醛固定、通透化处理，并使用抗 SVIL 抗体（Sigma-Aldrich，HPA020138-25UL）、抗 ACTN2 抗体（Sigma-Aldrich，EA53）或罗丹明鬼笔环肽（Invitrogen™，R415）进行染色（补充表 1）。小鼠和猪左心室（LV）组织用作阳性对照，猪肝组织用作阴性对照（补充图 2）。为观察线粒体并开展细胞核研究，将固定后的细胞使用线粒体标志物 ATP5A（Abcam，Ab14748）、抗肌节 α-辅肌动蛋白抗体（Abcam，ab68167）以及 Hoechst 33342（ThermoFisher，R37605）进行染色。采用 Leica SP5 共聚焦显微镜在 63 倍放大倍数下成像。使用 Fiji（ImageJ，NIH；版本 1.54p）进行分析，应用自动阈值处理和图像分割，并利用内置分析工具完成测量。
功能分析：动作电位、钙瞬变、收缩性和肌节组织
在第 30～33 天（D30–33）期间，使用重新铺板的 iPSC-CMs 进行活细胞成像（见补充方法）。采用 FluoVolt™ 膜电位检测试剂盒（ThermoFisher Scientific，F10488）测量膜动作电位（AP）。对于钙瞬变和二维收缩性分析，按照既往报道27，使用编码 RGECO（一种红色荧光钙指示剂）和 α-辅肌动蛋白-GFP 融合蛋白的复制缺陷型腺病毒载体（AV）对 iPSC-CMs 进行转导。急性药物处理采用溶于二甲基亚砜（DMSO）的 1 μM mavacamten，处理 1 小时。单个视频定义为一个技术重复，iPSC-CM 分化批次定义为一个生物学重复。动作电位视频采用 AP Track（一种改良版本的……）进行分析。
Caltrack²⁷，使用 CalTrack²⁷ 评估钙信号，使用 SarcTrack²⁵ 评估收缩性，并使用肌节分析多工具（Sarcomere Analysis Multitool，SarcAsM，版本 0.2.0）³² 评估肌节组织结构。工程化心肌组织（EHT）按既往方法制备³⁰，并作相应修改（见补充方法），随后使用 BeatProfiler³³ 进行分析。
使用 MANT-ATP 分析 DRX 和 SRX
按照已发表的方案³⁴，采用 MANT-ATP（荧光 ATP 类似物）检测分析肌球蛋白的超松弛（SRX）和无序松弛（DRX）状态。简言之，将培养于 6 孔板、至第 30–33 天且未经重新铺板的搏动 iPSC-CM 细胞片切取后置于流动室中，进行去膜处理，并保存于甘油化溶液中。使用松弛缓冲液、MANT-ATP（ThermoFisher Scientific，M12417）及追赶用（非荧光）ATP 溶液，并采用上述 Nikon/Photometrics 成像系统采集荧光衰减图像。
Seahorse 线粒体代谢通量分析
使用 Seahorse XF Mito Stress Test 试剂盒（Agilent，103015-100），并按照 Agilent 用户指南在 Seahorse XF Pro 分析仪上测定细胞线粒体耗氧率（OCR）。将传代后的 iPSC-CM 于第 17 天按每孔 3,000 个细胞的密度接种至 XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板，并培养至第 25 天。按照既往方法²³进行为期 24 小时的药物处理，使用 1 µM mavacamten（见补充方法）。
RNA 研究
将培养至第 30–33 天、经重新铺板的 iPSC-CM 用于 RNA 提取，并使用针对 SVIL 的 TaqMan™ 探针进行 qPCR，以 β-微管蛋白作为对照（见补充方法）。提取的 RNA 样本送至 Novogene（英国剑桥）进行长链非编码 RNA（lncRNA）和 mRNA 测序。将 FASTQ 文件比对至人类参考基因组 GRCh38（Ensembl 第 113 版），并使用 Salmon 进行转录本定量。
所有分析，包括差异基因表达分析和功能富集分析，均在 R（版本 4.5.1）中完成⁽³⁵⁾（补充图 3，见补充方法）。根据 KOLF2 材料转让协议，分析中排除了所有定位于 Y 染色体的基因。
蛋白质研究
对批次冻存的 iPSC-CM 蛋白沉淀进行处理，使用 NuPAGE™ 3% 至 8% Tris-Acetate Mini Protein Gel（Invitrogen™，EA03755BOX）进行 Western 印迹，并使用 iBlot™ 系统（Invitrogen™，IB301001）进行硝酸纤维素干膜转印；随后使用抗 SVIL 抗体或 β-微管蛋白对照进行检测（见补充方法）。将细胞沉淀送至柏林健康研究所（BIH）蛋白质组学核心平台进行整体蛋白质组学分析。包括差异蛋白表达分析和功能富集分析在内的后续分析均在 R（版本 4.5.1）中完成⁽³⁵⁾（补充图 4，见补充方法）。
统计分析
统计分析使用 GraphPad Prism（版本 11）和 R（版本 4.5.1）完成。根据正态性检验结果，在适用情况下采用参数检验：单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Dunnett 或 Tukey 多重比较检验。非参数分析采用 Kruskal–Wallis 检验，并使用 Dunn 事后检验进行多重比较。P < 0.05 被判定为具有统计学显著性。对于 RNA-seq 和蛋白质组学分析，采用 Benjamini–Hochberg 方法校正多重比较；将假发现率（FDR）校正后的 p 值（padj）<0.05 且绝对 log₂ 倍数变化 >1 定义为差异表达基因（DEG）和差异表达蛋白（DEP）。
结果
SVIL 功能缺失（LoF）变异导致 iPSC 衍生心肌细胞中超维林单倍剂量不足
患者特异性的五月婷婷
既往的一项罕见变异研究发现，位于 SVIL 第6外显子的功能缺失（LoF）变异 Glu255Ter（Q255X）是肥厚型心肌病（HCM）的风险变异²（图1A）。该LoF变异影响 SVIL 的主要异构体，包括 SVIL-201（图1B）；GTEx数据显示，SVIL 在心脏和肌肉组织中均有表达⁹（补充图1）。Supervillin 是一种已知的肌动蛋白相互作用蛋白。免疫荧光（IF）结果证实，Supervillin 与肌节Z盘及细胞核共定位；除Z盘的离散区域外，在肌节肌动蛋白带的其他区域未观察到明显定位信号（图1C和D）。在确定Supervillin在iPSC-CM中的表达和定位后，我们采用CRISPR/Cas-9结合同源定向修复（HDR）策略，构建了同基因背景的杂合 SVIL^Q255X/+ 和纯合 SVIL^Q255X/Q255X 变异细胞系，以模拟患者中观察到的LoF变异（图1E）。染色体异常和多能性筛查结果证实了这些细胞系的稳定性（补充图5）。我们对脱靶编辑进行了预测，并对预测概率最高的5个脱靶位点进行了测序，结果未发现脱靶编辑（补充表2和补充图6）。随后将这些细胞系分化为iPSC-CM（补充图7）。对来源于 SVIL^Q255X/+（均值±SEM：0.477±0.067，p=5.6×10^-6）和 SVIL^Q255X/Q255X（0.259±0.038，p=6×10^-10）变异细胞系的iPSC-CM进行RT-qPCR分析显示，与WT（0.921±0.062）相比，RNA丰度呈等位基因特异性的逐级降低（图1F）；这一变化进一步表现为蛋白质水平的单倍剂量不足，Western blot检测结果如下：WT=1.1±0.13；SVIL^Q255X/+=0.3±0.1，p=4×10^-5；SVIL^Q255X/Q255X=0.008±0.002，p=1×10^-6（图1G和补充图8）。在WT、SVIL^Q255X/+ 和 SVIL^Q255X/Q255X 变异iPSC-CM中获取的IF图像
显示了 iPSC-CM 肌节中 Supervillin 定位随剂量增加而逐渐减少的趋势（Figure 1H）。此外，iPSC-CM 的整体 RNA 测序显示，SVIL RNA 随剂量增加而减少（以 SVIL-201 为主，但其他转录本中也可观察到这一现象）；差异转录本使用（DTU）分析证实，SVIL-201 是 iPSC-CM 中的主要转录本，且未发现 LoF 变异遗传同时伴随异构体转换的证据（Supplemental Figure 3C and 9）。
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图 1：SVIL LoF 变异导致 iPSC-CM 中的单倍剂量不足，且杂合与纯合 LoF 所涉及的 Hallmark 通路存在差异。
(A) SVIL-201 转录本示意图，标示 Q255X 变异位点。
(B) Supervillin 蛋白示意图，显示其与其他蛋白的相互作用结构域及 Q255X 变异的位置。
(C) iPSC-CM 的免疫荧光图像，以 Supervillin、α-actinin 和 Actin 染色；荧光信号显示各蛋白在肌节中的定位。
(D) iPSC-CM 经 TO-PRO 核染色，并以抗体检测 Supervillin 和 α-actinin，显示 Supervillin 在细胞核中的定位独立于 α-actinin。
(E) 示意图显示通过 CRISPR/Cas-9 成功构建 Q255X 变异，包括杂合和纯合 G>A 替换；构建结果经 Sanger 测序验证。
(F) RT-qPCR 检测 SVIL，显示 SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中发生 RNA 无义介导的降解（n = 16 个生物学重复）。
(G) Supervillin 蛋白的 Western blot 显示，在 SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中，蛋白水平随等位基因剂量增加而降低（n = 6 个生物学重复）。
(H) 免疫荧光显示，在 SVIL Q255X/+ 和…… iPSC-CM 中，抗体标记的 Supervillin（绿色）呈现定性上的逐步丢失。
SVIL Q255X/Q255X 突变。α-辅肌动蛋白抗体显示为红色，TO-PRO 核染显示为蓝色。
(I) 对 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 的 LC/MS 蛋白质组数据进行基因集富集分析（GSEA）（每种基因型 n = 6 个生物学重复），展示 Hallmark 通路；与 WT 相比达到统计学显著性的通路以粗体圆圈标出（FDR 校正 p 值 < 0.05）。
Supervillin LoF 变异导致细胞电生理、钙处理及肌球蛋白头部构象异常
为了解 SVIL LoF 对 iPSC-CM 细胞功能的影响，我们对 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X 细胞系进行分化，并以 FluoVolt 染色，或转导 RGECO-AV 或 α-辅肌动蛋白-GFP-AV，以测量细胞动作电位、钙瞬变和收缩性（图 2A）。FluoVolt 染色的 iPSC-CM 显示出局限于细胞膜的信号（图 2B），并呈现典型的动作电位波形（图 2C）。获取了 SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 归一化后的平均动作电位波形（图 2D）。不同基因型组之间的动作电位（AP）时程无显著差异：WT（均值±SEM：354.5±5.40 ms）、SVIL Q255X/+（336.6±7.64 ms，p=0.11）和 SVIL Q255X/Q255X 细胞系（340.3±6.65 ms，p=0.22）（图 2E）。与 WT（32.55±0.86 ms）相比，SVIL Q255X/+（28.64±0.62 ms，p=3.1×10⁻⁴）和 SVIL Q255X/Q255X（28.03±0.35 ms，p=9.3×10⁻⁷）变异细胞系中瞬变达到峰值所需时间（AP T_on）均显著缩短（图 2F）。与 WT iPSC-CM（163.2±3.50 ms）相比，SVIL Q255X/+（139.5±4.32 ms，p=3.3×10⁻⁵）和 SVIL Q255X/Q255X（102.4±3.57 ms，p=1.2×10⁻¹⁵）中瞬变衰减至 50% 所需时间（AP T_50off）均缩短（图 2G）。钙瞬变分析采用……
RGECO-AV转导iPSC-CMs并结合自动化CalTrack分析（图2H-M）。iPSC-CMs能够被RGECO-AV构建体高效且均一地转导（图2H）。荧光成像能够在1.5 Hz起搏条件下捕获具有良好重复性的钙瞬变波形（图2I）。归一化并取平均后的钙瞬变显示了WT、SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X变异细胞系的波形特征（图2J）。钙瞬变持续时间反映整个钙瞬变的时长；与WT（496.6±1.92 ms）相比，SVIL^Q255X/+细胞中的该指标更长（503.9±1.678 ms，p=0.017），而SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs中未受影响（494.7±2.29 ms，p=0.73）（图2K）。钙瞬变达到峰值所需的时间（Calcium T_on）在SVIL^Q255X/+细胞中长于WT细胞（113.9±1.22 ms vs 107.7±1.05 ms，p=9.1×10^-5），而在SVIL^Q255X/Q255X细胞中未受影响（106.9±0.97 ms，p=0.83）（图2L）。钙瞬变衰减拟合值（Tau）在SVIL^Q255X/+（283.1±5.09 ms，p=1.6×10^-15）和SVIL^Q255X/Q255X（231.1±4.61 ms，p=0.0092）变异细胞系中均长于WT细胞（212.5±4.23 ms）（图2M）。
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图2：SVIL LoF变异改变动作电位和钙瞬变动力学，但不影响收缩性；杂合LoF变异则改变肌球蛋白SRX/DRX比例。
（A）示意图，展示了在活细胞荧光成像中用于动作电位、钙瞬变和收缩性分析的三种指示剂及其分析流程。
（B）采用FluoVolt动作电位染料染色的iPSC-CMs电影序列中的代表性图像。
（C）从动作电位成像序列中提取的动作电位（AP）轨迹，涵盖电刺激起搏（1.5 Hz）下iPSC-CMs连续发生的去极化过程。
（D）归一化并取平均后的AP轨迹。
涵盖 WT（n = 123）、SVIL Q255X/+（n = 124）和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 的整个数据集（每种基因型包含 4 个生物学重复，共 n = 129 个技术重复）。
(E) WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 的动作电位（AP）时程点图。柱形表示均值 ± 标准差。
(F) WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 达到动作电位峰值所需时间（T_on）的点图。柱形表示均值 ± 标准差。
(G) WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 达到动作电位衰减 50% 所需时间（T_50off）的点图。柱形表示均值 ± 标准差。
(H) 转导 RGECO 钙瞬变指示剂的 iPSC-CM 电影图像序列中的代表性图像。
(I) 从钙瞬变图像序列中提取的钙瞬变曲线；该序列记录了 iPSC-CM 经电刺激（1.5 Hz）诱发的连续钙瞬变。
(J) WT（n = 188）、SVIL Q255X/+（n = 171）和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 整个数据集的归一化平均钙瞬变（共 n = 169 个技术重复，每种基因型包含 4 个生物学重复）。
(K) WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 钙瞬变时程的点图。柱形表示均值 ± 标准差。
(L) WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 达到钙瞬变峰值所需时间（Calcium T_on）的点图。柱形表示均值 ± 标准差。
(M) WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 钙瞬变衰减常数（tau）的点图。柱形表示均值 ± 标准差。
(N) 通过转导 α-辅肌动蛋白 GFP 对肌节 Z 盘进行可视化染色的 iPSC-CM 电影图像序列中的代表性图像。
(O) 从收缩图像序列中提取的肌节收缩曲线，涵盖连续搏动……
由 iPSC-CMs 的电刺激起搏（1.5 Hz）诱导。
（P）整个数据集在 WT（n = 156 个技术重复，来自 5 个生物学重复）、SVIL^Q255X/+（92 个技术重复，来自 4 个生物学重复）以及 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs（181 个技术重复，来自 5 个生物学重复）中的归一化平均模拟收缩性曲线。
（Q）WT、SVIL^Q255X/+ 和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 的肌节水平收缩性点图。柱状图表示均值 ± 标准差。
（R）WT、SVIL^Q255X/+ 和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 的收缩速度点图。柱状图表示均值 ± 标准差。
（S）WT、SVIL^Q255X/+ 和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 的舒张速度点图。柱状图表示均值 ± 标准差。采用稳健回归与离群值剔除（ROUT）方法（Q = 1%）去除离群值。（T）Mant-ATP 追踪实验的实验装置示意图，以及暗条件下 ATP 清洗过程中 Mant 荧光衰减的代表性示例图像。
（U）WT（n = 17）、SVIL^Q255X/+（n = 23）和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs（n = 22）的平均归一化 Mant-ATP 衰减曲线。每个点表示均值 ± 均值标准误，数据采用双指数衰减进行拟合。
（V）WT、SVIL^Q255X/+ 和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 中肌球蛋白 SRX 占总肌球蛋白的百分比。柱状图表示均值 ± 标准差。
随后，研究者将 α-辅肌动蛋白 GFP-AV 与 SarcTrack 联合使用，以评估二维收缩性（图 2N）。单个肌节的追踪显示出稳健的收缩波形，并可通过 SarcTrack 算法对 α-辅肌动蛋白 GFP 标记的肌节进行识别而实现自动检测（图 2O）。平均收缩性曲线显示出……
WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X 细胞系中收缩肌节的肌节长度（图 2P）。根据收缩峰值和舒张峰值测量肌节缩短分数，各基因型组间无变化：与 WT（4.89±0.19%）相比，SVIL Q255X/+ 为 5.06±0.23%（p=0.76），SVIL Q255X/Q255X 为 4.6±0.13%（p=0.35）（图 2Q）。以肌节缩短峰值随时间的变化计算收缩速度，结果显示，与 WT（0.52±0.02 µm/s）相比，SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs 的收缩速度升高（0.59±0.02 µm/s，p=0.04）（图 2R）。以单位时间内肌节舒张的百分比测量舒张速度，各基因型组间无变化（图 2S）。为在生理相关性更高的负荷组织系统中确认这一结果，我们使用 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs 构建工程化心肌组织（EHT）；其收缩功能未见可测量的变化（补充图 11）。
采用 Mant-ATP 追踪实验（图 2T）探究 SVIL 功能缺失（LoF）变异是否影响肌球蛋白的生化状态（图 2U–V）。平均荧光衰减曲线显示，与 WT 和 SVIL Q255X/Q255X 相比，SVIL Q255X/+ 的平均衰减更快（图 2U）。这表明 SVIL Q255X/+ 中推定的超松弛态肌球蛋白（SRX）比例显著低于 WT（68.3±1.7% vs 75.8±1.9%，p=0.0073）；而 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs 中该比例未发生变化（71.3±1.3%，p=0.16）（图 2V）。
SVIL Q255X/+ 导致肌节水平的肥大、结构紊乱和细胞应激，触发纤维化信号通路，并伴随核形态改变
为探究 SVIL LoF 是否会改变收缩装置结构，我们采用 alpha-actinin GFP AV 标记肌节，并……
肌原纤维（图 3A）与 SarcAsM 分析相结合，用于评估收缩形态（图 3B-K）。定制版 SarcAsM 使用每个电影堆栈中一帧处于舒张状态的 iPSC-CM 的 TIFF 图像（图 3B），以提取肌节域（图 3C）、肌原纤维线（图 3D）和肌原纤维长度（图 3E）。测量每个 Z 盘的平均横向长度后发现，与 WT（1.91±0.04 µm）相比，SVIL^Q255X/+（2.283±0.06 µm，p=1.2×10^-7）和 SVIL^Q255X/Q255X（2.225±0.03 µm，p=8.1×10^-8）的长度均增加，提示肌节增宽（图 3F）。使用 1 µM mavacamten 急性处理 1 小时（图 3L）后，与 WT 相比，SVIL^Q255X/+ 的 Z 盘横向长度得到恢复（Δ距离 1.02±0.03 µm，p=0.94），而 SVIL^Q255X/Q255X 则部分恢复（Δ距离 1.08±0.02 µm，p=0.016）（图 3M）。
采用 Z 盘有序参数（OOP）测量肌节排列程度，其中 1 表示肌节完全对齐，0 表示肌节随机排列。与 WT（0.577±0.016）相比，SVIL^Q255X/Q255X 的 OOP 降低（0.506±0.016，p=0.0051）（图 3G）。Z 盘直线度测量显示，SVIL^Q255X/+（0.793±0.003，p=4.4×10^-8）和 SVIL^Q255X/Q255X（0.794±0.002，p=2.0×10^-9）均存在 Z 盘排列异常，这是肌节紊乱的典型特征。mavacamten 处理后，SVIL^Q255X/+ 的该指标得到恢复（Δ1.001±0.004，p=0.99），SVIL^Q255X/Q255X 则部分恢复（Δ0.9908±0.002，p=0.002）（图 3N）。对所有组测量舒张状态下的肌节长度（SL），结果显示，与 WT（1.814±0.005 µm）相比，SVIL^Q255X/+（1.787±0.009 µm，p=0.0094）和 SVIL^Q255X/Q255X（1.731±0.005 µm，p=2.3×10^-13）的 SL 均缩短；mavacamten 处理则使 SVIL^Q255X/+（1.992±0.158 µm，p=8×10^-15）和 SVIL^Q255X/Q255X（1.862±0.004……）的 SL 均增加。
µm，p=2.5×10⁻⁸）（图3I和补充图12）。与WT（19.09±0.37 µm）相比，SVIL^Q255X/+（21.60±0.61 µm，p=3.4×10⁻⁴）和SVIL^Q255X/Q255X（21.85±0.36 µm，p=2.0×10⁻⁶）的肌原纤维长度均有所增加，提示存在肌节肥大（图3J）。Mavacamten治疗使SVIL^Q255X/+（Δ1.004±0.02，p=0.999）和SVIL^Q255X/Q255X（Δ0.957±0.02，p=0.39）的肌原纤维长度均恢复正常（图3O）。随后，我们评估了每条肌原纤维的平均肌节数量，发现与WT（10.54±0.20）相比，SVIL^Q255X/+（12.08±0.33，p=5.7×10⁻⁵）和SVIL^Q255X/Q255X（12.64±0.21，p=4.0×10⁻¹¹）每条肌原纤维的肌节数量均更多（图3K）。综上，这些结果提示，SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X均存在一定程度的肌原纤维排列紊乱和肥大。鉴于supervillin作为细胞骨架肌动蛋白相互作用蛋白的作用，我们进一步研究了SVIL iPSC-CMs的细胞核形态，发现与WT iPSC-CMs（112.1±1.6 µm²）相比，SVIL^Q255X/+（82.1±1.33 µm²，p=1×10⁻¹⁴）和SVIL^Q255X/Q255X（84.24±0.93 µm²，p=1×10⁻¹⁴）的细胞核面积更小（补充图13）。与WT iPSC-CM细胞核（0.873±0.002）相比，SVIL^Q255X/+（0.818±0.004，p=1×10⁻¹⁴）和SVIL^Q255X/Q255X（0.815±0.003，p=1×10⁻¹⁴）的圆度［定义为4π×（面积/周长²）］也有所降低（补充图13）。
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图3：
SVIL功能缺失（LoF）变异表现出肌节水平的肥大和排列紊乱，以及应激信号传导和纤维化标志基因。
（A）通过腺病毒递送α-辅肌动蛋白-GFP以标记肌节Z盘的示意图。
（B）由定制SarcAsM脚本采集的、Z盘经α-辅肌动蛋白-GFP标记的舒张状态iPSC-CM原始图像。
（C）肌节区域
从标记的 Z 盘原始图像中提取，不同颜色表示所识别的名义上不同的肌节区域。
(D)
以红线标记的肌原纤维线，显示跨越单个 iPSC-CM 的预测肌节串。
(E)
肌原纤维长度，根据肌原纤维线中识别出的各肌节串的长度进行着色。
(F)
单个横向 Z 盘长度的散点图，以每个细胞的平均值计算，涵盖 WT（5 个生物学重复中的 156 个技术重复）、SVIL Q255X/+（4 个生物学重复中的 92 个技术重复）和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM（5 个生物学重复中的 178 个技术重复）。F–O 中的横线及误差线表示均值 ± 标准差。采用单因素方差分析，并进行 Dunnett 多重比较事后检验。F–O 的样本量相同。所有参数均在松弛（舒张）状态下测定。
(G)
Z 带操作性有序参数（OOP）的散点图，显示 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中每个细胞的平均 Z 盘排列有序程度。
(H)
肌节水平 Z 盘平直度的散点图，显示 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中每个细胞的平均值。
(I)
松弛状态下平均肌节长度（SL）的散点图，显示 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中每个细胞的平均值。
(J)
肌原纤维长度的散点图，显示 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中每个细胞的平均值。
(K)
散点图显示 WT、SVIL Q255X/+ 和 SVIL Q255X/Q255X iPSC-CM 中每个细胞内每条肌原纤维的平均肌节数量。
(L)
成像前，将 iPSC-CM 与 1 μM 玛伐凯泰或 DMSO（溶剂）对照孵育 1 小时。
(M)
玛伐凯泰处理的散点图，显示 SVIL Q255X/+ + 玛伐凯泰组中每个 iPSC-CM 的平均横向 Z 盘长度变化值（n =
76）以及SVIL Q255X/Q255X + mavacamten（n = 150）与WT iPSC-CMs的比较。M–O各图的样本量相同。
(N)
mavacamten处理后的点图，展示各基因型组相较于WT的每个iPSC-CM平均Z盘平直度差值。
(O)
mavacamten处理后的点图，展示各基因型组相较于WT的每个iPSC-CM平均肌原纤维长度差值。
(P)
RNA水平上SVIL Q255X/+与WT比较的显著差异表达基因（DEGs）棒棒糖图（同时展示SVIL Q255X/Q255X以供比较），按纤维化/细胞外基质（ECM）重塑、肥大/胎儿基因重编程、MAPK/Rho信号传导、白细胞介素/炎症信号传导及细胞骨架基因等主题分类。条形表示经DESeq2大小因子归一化的计数在样本水平上相对于WT的Log2倍数变化的均值 ± 均值标准误（SEM）。
(Q)
蛋白质组学单样本基因集富集分析（ssGSEA）评分的棒棒糖图，展示SVIL Q255X/+与SVIL Q255X/Q255X之间存在统计学显著差异的Reactome通路。通路按细胞骨架与机械信号转导、肥大信号传导、纤维化、氧化应激、细胞死亡通路及干扰素信号传导等主题分组。条形表示ssGSEA评分差值（样本值 − WT均值）的均值 ± SEM。每种基因型均有6个生物学重复。
除SVIL功能丧失（LoF）在肌节水平上的影响外，我们还发现，SVIL Q255X/+变异表现出多种差异表达基因，与促纤维化、肥大、炎症信号传导和结构重塑的RNA特征一致（图3P）。除NPPA和ACTA1外，这些差异表达基因在SVIL Q255X/Q255X变异iPSC-CMs中均未呈现相同变化（图3P）。针对长链非编码RNA（lncRNA）的分析发现，两个突变细胞系共有4个上调的差异表达基因，其中lncRNA-H19与心脏纤维化和肥大有关³⁶（补充图10）。此外，对……的ssGSEA差值分析
Reactome通路相关蛋白分析显示，SVIL Q255X/+和SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs在涉及纤维化与机械转导、心肌肥大、活性氧（ROS）通路、细胞死亡以及干扰素介导的炎症信号传导方面呈现不同的信号特征（图3Q）。综上，这些结果在RNA和蛋白质水平上均证实，SVIL Q255X/+具有肥厚型心肌病（HCM）特征，而SVIL Q255X/Q255X中不存在这些特征。针对HCM特异性相关的GO生物过程（GO-BP）条目进行的过度代表性分析（ORA）进一步支持了这一结果，其中仅在SVIL Q255X/+中观察到疾病特异性条目的富集（补充图14）。我们还评估了所有RNA与蛋白质水平变化之间的一致性（补充图15）。
SVIL杂合与纯合功能丧失（LoF）变异呈现不同的能量代谢特征
我们对SVIL Q255X/+和SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs的液相色谱-质谱（LC/MS）蛋白质组学数据进行了Hallmark通路基因集富集分析（GSEA），以此作为一种无偏的、自上而下的方法来研究能量代谢。结果显示，杂合与纯合变异iPSC-CMs的Hallmark通路反应存在显著差异，涉及氧化磷酸化（OXPHOS）、脂肪酸代谢、干扰素α和γ反应、上皮-间质转化（EMT）、脂肪生成及凝血通路（图1I）。SVIL Q255X/+的Hallmark GSEA分析发现，缺氧（NES=2.01，FDR=4.76×10⁻⁷）、糖酵解（NES=1.48，FDR=0.0089）、经由NFκB的TNFα信号传导（NES=1.79，FDR=2.54×10⁻⁴）、干扰素α（NES=1.99，FDR=5.18×10⁻⁴）、干扰素γ（NES=1.89，FDR=2.03×10⁻⁴）、补体（NES=1.68，FDR=0.0023）、EMT（NES=2.32，FDR=3.74×10⁻⁹）、凝血（NES=1.92，FDR=3.26×10⁻⁴）、MTORC1（NES=1.68，FDR=4.23×10⁻⁴）以及PI3K/AKT/MTOR通路呈显著正向富集
（NES=2.12，FDR=2.01×10⁻⁵）通路。相比之下，这些变化在 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 中不显著或呈负向富集（图1I）。值得注意的是，氧化磷酸化（OXPHOS）在 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中呈现最强的负向富集（NES=-3.17，FDR=1.3×10⁻³⁶），而在 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 中则呈现强烈的正向富集（NES=3.09，FDR=1.32×10⁻⁴¹）。
为进一步探究 GSEA Hallmark 通路分析所揭示的不同突变细胞系间代谢表型差异的机制，我们对 iPSC-CMs 进行染色以显示线粒体。定性观察显示，与野生型（WT）和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 相比，SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中的线粒体减少（图4A–C）。我们进一步采用 Seahorse 通量分析检测 iPSC-CMs 的耗氧率（OCR）（图4D）。图4E 显示了采用 Seahorse 检测获得的 WT、SVIL^Q255X/+ 和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 的归一化 OCR。与 WT（51.27±5.77 pmol/min，p=0.048）和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs（65.6±3.03 pmol/min，p=2×10⁻⁴）相比，SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 的基础呼吸降低（25.33±3.74 pmol/min），而 SVIL^Q255X/Q255X 与 WT iPSC-CMs 之间无显著差异（p=0.36）（图4F）。与 WT（221.5±21.43 pmol/min，p=0.004）和 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs（173.8±11.96 pmol/min，p=0.02）相比，SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 的最大呼吸降低（66.37±12.07 pmol/min），而 SVIL^Q255X/Q255X 与 WT iPSC-CMs 之间无显著差异（p=0.73）（图4G）。与 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs（58.97±2.7 pmol/min，p=1×10⁻⁴）相比，SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 的 ATP 偶联呼吸降低（22.0±3.41 pmol/min），但 SVIL^Q255X/+ 与 WT iPSC-CMs（39.0±4.1 pmol/min，p=0.17）之间无显著差异（图4H）。SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 的质子泄漏（3.33±0.44 pmol/min）低于 WT（12.27±2.49 pmol/min，p=0.0002）和 SVIL
Q255X/Q255X iPSC-CMs（6.63±0.5 pmol/min，p=0.036）（图4I）。与WT iPSC-CMs（170.3±17.07 pmol/min，p=1×10⁻⁴）相比，SVIL^Q255X/+ 的储备呼吸能力降低（41.04±8.69 pmol/min），但与SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs（108.2±10.95 pmol/min，p=0.065）相比，差异无统计学意义（图4J）。以1 µM的Mavacamten处理24小时未能恢复SVIL^Q255X/+ 的耗氧率（OCR）及其他通量分析参数（补充图16）。RNA测序差异表达基因（DEGs）呈现出一致的能量代谢失调特征，GO生物过程（GO-BP）分析显示，SVIL^Q255X/+ 中存在缺氧和细胞外基质（ECM）相关通路，而这些通路在SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs中并不明显（图5K、补充图17）。特别是，参与缺氧诱导因子（HIF）介导的缺氧相关代谢转换的RNA在SVIL^Q255X/+ 中上调（图4K），与SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs的假性缺氧特征一致。此外，利用Reactome通路相关蛋白进行的差值单样本基因集富集分析（delta ssGSEA）显示，SVIL^Q255X/+ 与SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs在线粒体代谢（包括三羧酸循环〔TCA〕和氧化磷酸化〔OXPHOS〕）及脂肪酸代谢通路方面存在差异（图4L）。
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图4：
SVIL杂合功能丧失（LoF）变异改变OCR和线粒体代谢通路，呈现假性缺氧特征。
（A–C）使用线粒体抗ATP5A抗体染色的（A）WT、（B）SVIL^Q255X/+ 和（C）SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs的代表性免疫荧光图像。（D）用于WT、SVIL^Q255X/+ 和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs的Seahorse通量分析的微孔板布局示意图。（E）WT、SVIL^Q255X/+ 和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs的平均归一化耗氧率。每种基因型均设8个技术重复（N=8）。
组（适用于图E–J），其趋势经2个生物学重复验证。每个数据点均以均值 ± 标准差绘制。
(F)
WT、SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs各孔基础呼吸水平的点图。误差棒表示均值 ± 标准差。
(G)
WT、SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs各孔最大呼吸水平的点图。误差棒表示均值 ± 标准差。
(H)
WT、SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs各孔ATP偶联呼吸水平的点图。误差棒表示均值 ± 标准差。
(I)
WT、SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs各孔质子泄漏水平的点图。误差棒表示均值 ± 标准差。
(J)
WT、SVIL^Q255X/+和SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs各孔呼吸储备能力的点图。误差棒表示均值 ± 标准差。
(K)
SVIL^Q255X/+与WT比较中代谢相关显著差异表达基因（DEGs）的RNA水平棒棒糖图（同时展示SVIL^Q255X/Q255X与WT的比较结果以供参照），按丙酮酸脱氢酶激酶（PDKs）、氧化磷酸化和HIF介导的糖酵解转换分组。误差棒表示经DESeq2大小因子归一化的计数在样本水平上相对于WT的log2倍数变化的均值 ± 均值标准误（SEM）。
(L)
SVIL^Q255X/+与SVIL^Q255X/Q255X之间存在统计学显著差异的Reactome通路的蛋白质组单样本基因集富集分析（ssGSEA）评分棒棒糖图。通路按线粒体功能/代谢和脂肪酸/脂质代谢主题分组。误差棒表示ssGSEA评分差值（样本评分 − WT平均评分）的均值 ± SEM。每种基因型包含6个生物学重复。
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图5：
SVIL范式概述：
SVIL-201转录本编码成年人心脏中的supervillin蛋白。一项罕见变异研究发现了SVIL
杂合性功能缺失变异作为HCM的一种新型驱动因素。已发现SVIL纯合性功能缺失变异可导致骨骼肌肌原纤维肌病10型，但几乎没有证据表明其具有显著的心脏表型。
讨论
利用患者特异性人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）的超绒毛蛋白心肌病模型，我们首次揭示了一种新的致病机制，该机制由编码非经典肌动蛋白相互作用性Z盘及肌膜附着复合体支架蛋白的基因变异所驱动（图5）。主要发现如下：SVIL截短变异通过单倍剂量不足导致HCM；在心肌细胞中，SVIL功能缺失（LoF）杂合状态比纯合状态的危害更大；肌节结构紊乱和线粒体功能障碍分别通过损害机械信号转导和细胞呼吸驱动疾病发生；假性缺氧是驱动代谢重塑的关键致病机制；玛伐凯泰可纠正肌节结构紊乱，但不能改善线粒体功能障碍。
我们证实，患者特异性SVIL Q255X变异导致iPSC-CM中的RNA水平呈等位基因剂量依赖性下降，这与无义介导的mRNA降解及蛋白质水平的单倍剂量不足相符，并通过RT-qPCR（图1F）和蛋白质印迹分析（图1G）得到验证，同时获得多组学分析的佐证（补充图3C和4C）。重要的是，我们在LC/MS分析中未发现截短型超绒毛蛋白的证据。这一现象具有独特性，因为除MYBPC3²⁴和ALPK3⁴变异外，大多数驱动HCM的变异均为具有显性负效应的错义变异；而在FLNC等Z盘相关基因中，错义变异通常导致HCM，截短型LoF变异则导致扩张型心肌病（DCM）⁶。因此，旨在上调SVIL表达以治疗相关心肌病的基因疗法具有吸引力。
超绒毛蛋白单倍剂量不足是
另一个独特之处在于，携带杂合变异的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CMs）表现出与肥厚型心肌病（HCM）一致的特征，而携带纯合变异的iPSC-CMs则未表现出这些特征。这与现有的有限临床文献报道一致[2,20]。进一步了解纯合变异携带者的表型将有助于阐明这一现象，但此类携带者的罕见性限制了相关研究。Hedberg-Oldfors等人[20]报道的4例SVIL功能丧失（LoF）纯合变异患者表现出新发现的骨骼肌肌原纤维肌病10型（MFM-10），并伴有轻度心脏表型，符合Z盘相关肌病的特征[6]。有趣的是，目前尚未发表的临床证据并未提示杂合变异携带者存在骨骼肌病特征。可以推测，纯合变异携带者以骨骼肌病为主要表现，可能是因为supervillin在骨骼肌中可直接与nebulin相互作用，而nebulin变异是导致杆状体肌病的重要因素[37]。现有文献将supervillin描述为一种关键的肌动蛋白相互作用蛋白，在肌原纤维形成、核纤层及肌膜肋结构中发挥重要作用；肌细胞内该蛋白的缺失可能会干扰收缩功能或力的传递能力[8,10,11]。值得注意的是，我们的突变型iPSC-CMs表现出等位基因剂量依赖性的肌节长度缩短，提示supervillin缺失时，细胞在基础状态下处于过度收缩状态（图2P和3I）。Oh等人[8]提出，supervillin在肌膜肋处充当肌动蛋白丝与肌膜之间的额外连接，这或许可以解释上述现象：其功能丧失会削弱肌节在肌膜上的锚定，从而损害细胞内及细胞间的机械信号转导。
此外，这一重要支架蛋白的部分和完全缺失可由增加的肌节
突变型诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）出现结构紊乱和细胞核缩小，直接提示机械转导过程受损。这种双向机械转导主要发生于肋节和黏着斑（细胞内部则通过Z盘），这些结构同时充当机械感受器，激活下游应激及肥大信号通路³⁸。我们假设，在SVIL功能缺失（LoF）的情况下，如SVIL Q255X/+所表现的部分功能缺失比完全功能缺失更具破坏性，因为这些机械转导结构中的异常复合物和混合复合物会改变化学计量平衡，其危害大于完全缺失。SVIL杂合截短突变可能保留了足够的蛋白质，导致力传递复合物错误组装，从而改变信号传导阈值，并触发下游应激及肥大信号反应；而SVIL纯合功能缺失则表现为一种获得代偿的功能缺失状态。我们的多组学发现进一步支持SVIL Q255X/+中机械转导失调的假说，因为我们在SVIL Q255X/+ iPSC-CMs中观察到纤维化增加、肥大信号通路（MTORC1、PI3K/AKT/MTOR和MAPK/Rho）增强及炎症反应增强，而这些变化在SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs中并未出现（图1I、3P和3Q）。当我们分析SVIL Q255X/+和SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs中与肥厚型心肌病（HCM）相关的基因本体生物过程（GO-BP）条目时，也观察到了类似结果：SVIL Q255X/+ iPSC-CMs中多种关键HCM通路显著富集，而SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs中未见这些通路富集（补充图14）。有趣的是，长链非编码RNA H19（lncRNA-H19）在病理性心肌肥大中表达上调³⁶，我们在SVIL Q255X/+和SVIL Q255X/Q255X iPSC-CMs中均发现了这一现象，且纯合状态下的log₂倍数变化更大（补充图10）。LncRNA-H19通过以下途径负向调控心肌肥大：
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ和NFAT信号通路，并在纤维化、血管生成和炎症反应中发挥复杂作用³⁶。综上所述，这提示两种突变细胞系均存在一定程度的代偿，并支持纯合功能丧失（LoF）状态得到代偿的假说。
核心肌节基因变异通过降低肌节ATP利用效率，使能量需求增加，进而导致细胞能量耗竭，从而引起肥厚型心肌病（HCM）²²。与之不同，SVIL^Q255X/+直接扰乱线粒体功能，表现为氧耗率（OCR）和电子传递链（ETC）呼吸能力降低，而SVIL^Q255X/Q255X诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）中未见这一现象；我们的免疫荧光（IF）染色、Seahorse分析和多组学结果均验证了这一点。Supervillin的功能可能类似于中间丝蛋白结蛋白（desmin）；后者也是一种参与机械信号转导的Z盘和肌膜肋蛋白，其缺失可导致结蛋白病（一类伴有心脏表现的肌原纤维肌病）。众所周知，结蛋白缺失可通过线粒体定位异常等多种机制导致横纹肌线粒体功能障碍³⁹；结蛋白敲除（KO）小鼠的心脏表现出线粒体数量减少、超微结构缺陷，以及氧化磷酸化（OXPHOS）和脂肪酸代谢严重受损⁴⁰。StringDB并未预测结蛋白与supervillin存在相互作用，而且在我们的组学数据中，结蛋白也不属于差异表达基因（DEG）或差异表达蛋白（DEP）；结合SVIL^Q255X/+中线粒体自噬相关基因BNIP3和BNIP3L上调、提示线粒体周转增加的结果，我们推测，SVIL相关心肌病中的线粒体功能障碍可能存在类似机制。
我们进一步探究了代谢通路相关的差异表达基因，以佐证能量代谢方面的发现，并发现丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）及相关基因的表达升高
与葡萄糖代谢和转运相关，同时 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中参与线粒体电子传递链（ETC）的基因表达降低（图4K）。PDK1 通过磷酸化抑制丙酮酸脱氢酶（PDH），阻止丙酮酸转化为乙酰辅酶A；乳酸脱氢酶A（LDHA）则催化丙酮酸转化为乳酸，两者共同使丙酮酸偏离三羧酸（TCA）循环，转而用于乳酸生成^41。结合 VEGFA、SERPINE1 和 NDUFA4L2 等其他经典 HIF 信号通路靶基因表达的升高，可能的机制是 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中的细胞假性缺氧状态引发了 HIF 介导的糖酵解转换，而 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 中不存在这一现象。基于 GO-BP 的转录组过度富集分析（ORA）进一步支持了这一点，显示 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中细胞缺氧应答相关过程显著富集（补充图17）。针对 Reactome 通路的蛋白质组差异单样本基因集富集分析（delta ssGSEA）进一步证实了这一结果：在 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中，与脂肪酸代谢、丙酮酸代谢、PDH 复合体、TCA 循环、线粒体复合体、有氧呼吸及电子传递相关的通路呈负向富集，而这些通路在 SVIL^Q255X/Q255X iPSC-CMs 中则呈相反的正向富集（图4L）。
此外，我们认为，SVIL^Q255X/+ 中超松弛态（SRX）比例的降低是继发性变化，而非疾病的原发驱动因素。经典的高收缩性肌节型肥厚型心肌病（HCM）变异会破坏肌球蛋白 mesa 区域和相互作用头基序（IHM）的稳定性^42,43；与之不同，SVIL^Q255X/+ 中 SRX 比例的降低和无序松弛态（DRX）比例的升高并未伴随收缩力增强或细胞能量代谢水平升高。我们推测，肌球蛋白可能受到继发性代偿效应的影响，以维持收缩力，而这一效应与机械信号转导受损同时发生于
超绒毛蛋白单倍剂量不足状态。SVIL^Q255X/+ 中继发性的 DRX 增加，进一步提高了本已处于能量耗竭状态的心肌细胞的能量需求。因此，这种细胞假性缺氧状态导致 SERCA2 泵等亚细胞区室出现能量供需失衡²²，从而使钙瞬变持续时间延长，正如在 SVIL^Q255X/+ iPSC 来源心肌细胞（iPSC-CMs）中所观察到的那样（图 2J–M），其临床表现为舒张功能障碍。这进一步通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK）和 MAPK 通路激活肥厚信号传导，我们的多组学结果为此提供了证据。
最后，我们发现，肌球蛋白变构抑制剂玛伐凯泰可纠正两种突变细胞系中的肌节排列紊乱，并降低缩短分数（图 3M–O，补充图 12）；但与既往在经典肌节型肥厚型心肌病（HCM）中的结果不同²³，24 小时处理未能纠正 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 的线粒体功能障碍（补充图 16）。已知玛伐凯泰可通过提高 SRX 比例来减轻粗肌丝型 HCM 中的过度收缩²³˒²⁴，并可纠正细肌丝型 HCM 中的钙超敏感性及钙调控紊乱²⁸。然而，鉴于 SVIL 心肌病属于 Z 盘/肋节相关 HCM，在此类患者中使用玛伐凯泰并非直接针对疾病的发病机制。由于 SVIL^Q255X/+ iPSC-CMs 中 DRX 的增加可能具有代偿作用，逆转这一变化可能导致急性收缩功能不全。不过，仍有必要明确，长期使用玛伐凯泰能否通过其对肌节组织结构的积极作用，纠正 SVIL 单倍剂量不足所致的线粒体功能障碍。靶向线粒体生物能量代谢的治疗可能成为 SVIL 相关心肌病的一种新型治疗策略。
与其他现有治疗方式相结合。
结论
我们在人诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CM）患者模型中，揭示了SVIL功能丧失（LoF）变异驱动肥厚型心肌病（HCM）的机制，验证了此前发表的罕见变异关联研究结果。我们提出了一种新的致病机制：支架蛋白的单倍剂量不足改变了机械信号转导和细胞能量代谢，触发促肥大和促纤维化信号级联反应，从而导致HCM表型。我们建立了SVIL相关HCM的机制框架，证实了SVIL作为HCM相关基因的重要性。
利益披露
H.W.是Cora Biosciences的创始人，并担任CardiaTec科学顾问委员会成员；这两家公司均未参与本研究。A.J.S.担任CORA Biosciences的顾问，但个人未从任何报酬中获益。JSW曾获得Bristol Myers Squibb的研究资助，曾担任Health Lumen、Tenaya Therapeutics、Solid Biosciences和Genomics England的有偿顾问，并且是Saturnus Bio的创始人，持有该公司股权。
非标准缩写与首字母缩略词
HCM：肥厚型心肌病
HCM SARC+：肌节型肥厚型心肌病
HCM SARC−：非肌节型肥厚型心肌病
LoF：功能丧失
GWAS：全基因组关联研究
MFM：肌原纤维肌病
GTEx：基因型-组织表达
HDR：同源定向修复
DEG：差异表达基因
DEP：差异表达蛋白
LC/MS：液相色谱-质谱
AV：腺病毒
GSEA：基因集富集分析
ssGSEA：单样本基因集富集分析
ORA：过度代表性分析
GO-BP：基因本体论-生物过程
IHM：头部相互作用基序
SRX：超松弛态
DRX：无序松弛态
OXPHOS：氧化磷酸化
MAPK：丝裂原活化蛋白激酶
SERCA：肌质网/内质网钙ATP酶
致谢
本研究由
本研究获得了授予 C.N.T. 的 Wellcome Sir Henry Dale 研究员基金（222567/Z/21/Z）和英国心脏基金会（BHF）卓越研究中心（CRE）资助（RE/24/130024）的支持。奥本海默纪念信托研究生奖学金和林肯学院 Keith Murray 研究生奖学金为 Y.J.L. 提供了支持。本研究还获得了英国心脏基金会授予 CureHeart H.W. 的 Big Beat Challenge 资助（资助编号：BBC/F/21/220106）以及牛津 CRE3（RE/18/3/34214）的支持。BHF 研究项目资助（FS/4yPhD/F/21/34157）为 IB 提供了支持。RDM 学者计划为 S.TM.J. 提供了支持。N.B. 参加了 BIH Charité 临床科学家计划，该计划由柏林夏里特医学院和夏里特柏林卫生研究所资助。J.S.W. 获得了英国医学研究理事会、Sir Jules Thorn 慈善信托基金［21JTA］、英国心脏基金会［RE/24/130023；BBC/F/21/220106］以及英国国家健康与护理研究所（NIHR）帝国理工生物医学研究中心的支持。BR 获得了牛津 NIHR 生物医学研究中心的支持，以及 Wellcome 职业发展研究员基金（302210/Z/23/Z）的资助。BR 还感谢牛津英国心脏基金会卓越研究中心的支持。
本研究所表达的观点仅代表作者本人，并不一定代表资助方的观点。
为实现开放获取，作者已对由本研究产生的任何作者接受稿版本采用知识共享署名（CC BY）许可协议。
脚注
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共同第二作者
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摘要
/
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Portland Press Ltd.；
2015。
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发布于2026年7月6日。
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揭开 Supervillin 的面纱
：SVIL
单倍剂量不足通过损害机械转导和细胞能量代谢导致肥厚型心肌病
Yifan J.
Li
,
Yiangos
Psaras
,
Violetta
Steeples
,
Josephine M.
Watkins
,
Charlotte
Hooper
,
Marta
Moya-Jódar
,
Thomas
Nicol
,
Alexander J.
Sparrow
,
Marcos
Garcia-Lacarte
,
Samuel TM
Jones
,
Isabelle
Bond
,
Niklas
Beyhoff
,
Paul
Robinson
,
Marieluise
Kirchner
,
Philipp
Mertins
,
James S
Ware
,
R Thomas
Lumbers
,
Betty
Raman
,
Hugh
Watkins
,
Christopher N.
Toepfer
bioRxiv
2026.07.01.735949；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735949
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揭开 Supervillin 的面纱：SVIL 单倍剂量不足通过损害机械转导和细胞能量代谢导致肥厚型心肌病
Yifan J.
Li
,
Yiangos
Psaras
,
Violetta
Steeples
,
Josephine M.
Watkins
,
Charlotte
Hooper
,
Marta
Moya-Jódar
,
Thomas
Nicol
,
Alexander J.
Sparrow
,
Marcos
Garcia-Lacarte
,
Samuel TM
Jones
,
Isabelle
Bond
,
Niklas
Beyhoff
,
Paul
Robinson
,
Marieluise
Kirchner
,
Philipp
Mertins
,
James S
Ware
,
R Thomas
Lumbers
,
Betty
Raman
,
Hugh
Watkins
,
Christopher N.
Toepfer
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2026.07.01.735949；
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https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735949
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关键词：SVIL单倍剂量不足 · 肥厚型心肌病 · 机械转导 · 线粒体功能障碍 · 代谢重塑 · iPSC衍生心肌细胞
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.01.735949v1?rss=1