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肿瘤进展依赖于发生遗传改变的癌细胞与周围基质细胞之间的双向交流。尽管引发肿瘤发生的遗传改变已得到广泛研究，但被肿瘤征用的基质细胞所提供的失调性反馈信号仍知之甚少。在本研究中，我们利用果蝇癌症模型探究这一问题，并鉴定出细胞外基质调节蛋白SPARC是介导肿瘤与基质间交流的因子。SPARC由间充质细胞产生，并转移至上皮性肿瘤细胞，随后经内吞途径被内化。摄取后，SPARC在Rab7阳性的晚期内体中积累，并与Notch配体Delta共定位。SPARC的内化促进内体增大，并降低内体的动态性。上皮性肿瘤中SPARC水平升高，至少部分通过改变Delta的胞内转运，间接减弱Notch信号活性。我们进一步发现，SPARC的N端酸性结构域是其靶向Delta相关内体所特异必需的。综上，我们的研究揭示了一种基质反馈机制，即SPARC在肿瘤发育过程中通过调控内体来调节Notch信号传导。
SPARC通过对Delta和Notch信号传导的内体调控介导肿瘤–基质细胞间通信 | bioRxiv
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SPARC通过对Delta和Notch信号传导的内体调控介导肿瘤–基质细胞间通信
Aurélien
Guillou
，
Nourhene
Ammar
，
Olivier
Josse
，
Emma
Leroux
，
Tsveta
Kamenova
，
Torcato
Martins
，
Samuel
Delage
，
Maurice Joseph
Ringuette
，
Sarah
Bray
，
Hadi
Boukhatmi
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.04.736483
Aurélien Guillou
1
雷恩遗传学与发育研究所（IGDR），雷恩大学
，CNRS UMR6290，雷恩，
法国
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Nourhene Ammar
1
雷恩遗传学与发育研究所（IGDR），雷恩大学
，CNRS UMR6290，雷恩，
法国
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Olivier Josse
1
雷恩遗传学与发育研究所（IGDR），雷恩大学
，CNRS UMR6290，雷恩，
法国
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Emma Leroux
1
雷恩遗传学与发育研究所（IGDR），雷恩大学
，CNRS UMR6290，雷恩，
法国
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Tsveta Kamenova
4
剑桥大学生理学、发育与神经科学系
，Downing Street，剑桥 CB2 3DY，
英国
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Torcato Martins
2
阿威罗大学生物医学研究所医学科学系
，
阿威罗，
葡萄牙
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Samuel Delage
3
多伦多大学细胞与系统生物学系，
加拿大安大略省多伦多市 M5S 3G5
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Maurice Joseph Ringuette
3
多伦多大学细胞与系统生物学系，
加拿大安大略省多伦多市 M5S 3G5
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Sarah Bray
4
剑桥大学生理学、发育与神经科学系，
英国剑桥唐宁街 CB2 3DY
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Hadi Boukhatmi
1
雷恩遗传学与发育研究所（IGDR），雷恩大学，
法国国家科学研究中心（CNRS）UMR6290，雷恩，
法国
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通讯作者：
hadi.boukhatmi{at}univ-rennes.fr
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概要
肿瘤进展依赖于遗传发生改变的癌细胞与周围基质细胞之间的双向通信。尽管人们已对启动肿瘤发生的遗传改变进行了广泛研究，但被癌细胞劫持的基质细胞所提供的失调反馈信号仍然知之甚少。在本研究中，我们利用果蝇癌症模型探讨了这一问题，并鉴定出基质细胞蛋白 SPARC 是肿瘤—基质通信的介质。SPARC 由间充质细胞产生，并被转运至上皮肿瘤细胞中，在那里通过内吞途径被内化。摄取后，SPARC 在 Rab7 阳性的晚期……
内体，并与Notch配体Delta共定位。SPARC的内化促进内体扩大并降低内体动态性。上皮性肿瘤中SPARC水平升高，可通过至少改变Delta的运输，间接减弱Notch信号活性。我们进一步发现，SPARC的N端酸性结构域是其靶向Delta相关内体所特异性需要的。综上，我们的研究揭示了一种基质反馈机制：在肿瘤发生过程中，SPARC通过调控内体来调节Notch信号。
引言
细胞持续不断地与邻近细胞进行通信，而它们之间交换的信号对于多细胞组织的组织和维持至关重要。对这些信号过程进行严格调控，可确保协调的生长、模式形成和组织稳态。相反，这些信号通路的异常激活或不适当部署，是包括癌症在内的多种疾病的基础 [
1
]。例如，在卵巢癌中，发生遗传改变的上皮细胞与周围基质细胞之间的双向信号传递，对肿瘤进展和恶性程度具有关键支持作用 [
2
–
4
]。未经转化的间充质基质细胞被认为会受到癌细胞的“教育”，获得支持肿瘤的特性，从而促进肿瘤发生发展 [
5
]。尽管启动肿瘤发生的遗传突变已得到广泛表征，但当前一项重要挑战是确定基质细胞产生的信号，并阐明这些信号如何维持肿瘤生长及强化恶性行为。理解这些机制至关重要，并可能为替代性治疗策略揭示新的机遇。
我们研究富含半胱氨酸的分泌型酸性蛋白（Secreted Protein Acidic Rich in Cysteine，SPARC）在时时彩计划
肿瘤–宿主间的通讯。SPARC是一种分泌型基质细胞蛋白糖蛋白，可调节细胞–细胞及细胞–基质相互作用，并在发育、组织重塑和损伤过程中受到动态调控[6]。作为基质细胞蛋白家族的一员，SPARC并非主要为细胞外基质提供结构支撑，而是通过调节细胞黏附、增殖及其对细胞外信号的响应来影响细胞行为[7]。SPARC也与肿瘤发生发展有关，但其在癌症中的作用复杂且依赖具体情境。研究表明，SPARC既可抑制也可促进肿瘤生长和转移，具体作用取决于组织类型和肿瘤背景[8, 9]。这两种相反的效应表明，SPARC并非简单的癌基因或抑癌因子，而是肿瘤–微环境相互作用的情境依赖性调节因子。尽管已有大量研究，其发挥这些多样效应的机制仍知之甚少。尤其是，由遗传背景正常的基质细胞或间充质细胞产生的SPARC如何影响肿瘤细胞行为，以及此类信号如何在细胞层面传递，目前仍不清楚。
果蝇遗传模型在解析癌症中细胞间通讯的分子机制方面发挥了重要作用[10, 11]。其中一个模型是EGFR-psq RNAi肿瘤模型：在该模型中，利用Apterous驱动子（Ap-Gal4）并结合RNAi介导的染色质调节因子pipsqueak（psq）敲低，使表皮生长因子受体（EGFR）信号通路在翅盘上皮中持续过度激活（[12]和图S1A）。在该模型中，肿瘤生长为一个大型多层细胞团块，其中转化的上皮细胞与遗传背景为……
形成间充质区室的正常肌母细胞（图 S1A-B’）。该模型为在体内研究肿瘤–基质相互作用提供了一个简单且易于进行遗传操作的系统。事实上，转化的上皮细胞至少通过 Notch 信号通路诱导邻近肌母细胞增殖并维持其存活，从而使上皮区室和间充质区室协同扩增至相近的规模 [12, 13]。Notch 受体存在于上皮细胞和间充质细胞中（图 S1A–B’），而 Notch 配体 Delta 则在上皮肿瘤细胞中高表达（图 S2C–F’）。上皮细胞中的 Delta 通过直接的细胞间相互作用及丝状伪足介导的接触，激活邻近间充质细胞中的 Notch 信号通路。该信号促进肿瘤相关间充质扩增，并协调其与上皮区室的生长 [13]。反过来，间充质细胞通过旁分泌信号环路维持上皮生长和肿瘤进展 [12, 14]。然而，维持上皮肿瘤生长的间充质来源信号究竟为何，以及这些信号作用于肿瘤细胞的机制，目前仍知之甚少。
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图 S1.
受体 Notch 和配体 Delta 在 EGFR-psq RNAi 肿瘤中的分布。
(A-B’).
通过表达 EGFR 和 psq RNAi 诱导的肿瘤（ap-Gal4 > UAS EGFR-psq RNAi），同时表达 mCD8-GFP。
(B-B’).
A 中方框区域的高倍图。GFP（绿色）标记上皮细胞，Twist（蓝色）标记间充质细胞。Notch（洋红色）在上皮细胞和间充质细胞中均有表达。比例尺：100 μm。
(C-D’).
同时表达 Dl mScarlet-I 的 EGFR-psq RNAi 肿瘤。Dl mScarlet-I 配体
（洋红色）在上皮细胞中均匀检测到。间充质细胞由 Twist（绿色）标记。
（D–D’）。
（C）中方框区域的高倍放大图。比例尺：100 μm。
（E–F’）。
在上皮细胞中检测到 Delta mRNA 转录本（洋红色）。在间充质细胞中检测到 sparc mRNA（绿色）。DAPI（蓝色）标记细胞核。
（F–F’）。
F 中方框区域的高倍放大图。比例尺：50 μm。
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图 S2。
野生型翅盘和 EGFR-psq RNAi 肿瘤中 SPARC 的表达。
（A–A’）。
在翅盘相关的成肌细胞中检测到 SPARC（洋红色）（绿色，CG965O-YFP）。
（B–B’’）。
A 中方框区域的高倍放大图。比例尺：50 μm。
（C–C’’）。
在 EGFR-psq RNAi 肿瘤的间充质细胞（M）和上皮细胞（E）中均检测到 BM40-SPARC-GFP（绿色）。DE-Cad（洋红色）标记上皮细胞。比例尺：100 μm。
（D）。
在 EGFR-psq RNAi 肿瘤的间充质细胞（M）中检测到 sparc mRNA 转录本（洋红色），而在上皮细胞（E）中未检测到；上皮细胞通过 mCD8-GFP（绿色；ap-Gal4，UAS-mCD8-GFP）显示。
（D’–D’’）。
（D）中方框区域的裁剪图，显示 sparc 转录本的分布。比例尺：50 μm。
（E–E’’）。
在 EGFR-psq RNAi 肿瘤中对 sparc mRNA 转录本（洋红色）和 BM40-SPARC-GFP（绿色）进行分析。BM40-SPARC-GFP（绿色）在由 DE-Cad（蓝色，箭头）标记的间充质细胞（M）和上皮细胞（E）中均可检测到（E）。黄色虚线勾勒出间充质（M）和上皮（E）区室的边界。比例尺：50 μm。
（F–G’）。
验证 EGFR-psq RNAi 肿瘤中 sparc 的敲低效率。对照肿瘤（15B03-LexA；Aop-GFP；F–F’）在间充质细胞中显示 SPARC 信号。在间充质细胞中表达 sparc RNAi 的肿瘤（15B03-LexA；Aop-sparc RNAi】【。
；G–G′）显示 SPARC 水平降低。SPARC 以绿色和彩色灰度显示。DE-Cad（洋红色）标记上皮性肿瘤细胞。比例尺：100 μm。
（H–H″）在 EGFR-psq RNAi 肿瘤（ap > EGFR-psqRNAi；mCD8-RFP）中，mCD8-RFP（洋红色）鉴定的囊泡结构与晚期内体标志物 Rab7（绿色，箭头）发生共定位。图中分别显示合并图像（H）、RFP 通道（H′）和 Rab7 通道（H″）。比例尺：5 μm。
在此，我们利用 EGFR-psq RNAi 模型证明，SPARC 通过调控内体运输介导肿瘤–基质间的通讯。SPARC 由间充质细胞产生，并通过内吞途径转运至上皮性肿瘤细胞中。内化后，SPARC 在 Rab7 阳性的晚期内体中积累，并与 Notch 配体 Delta 共定位。重要的是，SPARC 在这些区室中的积累伴随着内体增大和运动性降低。内体运输的这些变化间接减弱了上皮性肿瘤中的 Notch 信号，可能是由于含有 Delta 的内体更多地转向晚期内体区室，而减少了向质膜的再循环。最后，我们鉴定出 SPARC 的 N 端酸性结构域，该结构域对于其靶向内体以及调控内体动态变化均具有特异性作用。综上，这些发现揭示了肿瘤发育过程中 SPARC 调节 Notch 信号内体控制的一种细胞内机制。
结果
SPARC 在肿瘤相关间充质中表达
为探究 SPARC 是否参与上皮性肿瘤与间充质细胞之间的信号传递，我们首先分析了野生型翅盘中的 SPARC 表达。检测到 SPARC 在翅盘相关的成肌细胞中表达，这些细胞通过成肌细胞标志物 Cut 和 CG9650 进行鉴定（
图 1A–C、图 S2A–B″ 和视频 S1。这些细胞对应于成体肌肉祖细胞（AMP），在幼虫期与翅盘上皮相关联，并最终形成成体飞行肌肉［15，16］。我们采用两种报告系统独立验证了这一表达模式：（i）使用 SPARC-Gal4（SPARC[MI00329-GAL4]）驱动子表达 UAS 膜标记物（UAS-mCD8–RFP）；（ii）使用 BM40-SPARC-GFP fosmid 报告品系［17］。两种报告系统均标记翅盘成肌细胞（图 1D–E’’）。值得注意的是，BM40-SPARC-GFP 盒具有功能性，因为它能够挽救 sparc 功能缺失等位基因导致的致死表型（图 S3 和材料与方法）。相比之下，翅盘上皮细胞不表达 SPARC，因为在该区域既未检测到 SPARC-Gal4 活性，也未检测到 sparc mRNA（图 1D–F、图 2C–C′ 和视频 S1）。随后，我们分析了 EGFR-psq RNAi 肿瘤中的 SPARC 表达，发现其在与肿瘤相关的间充质细胞中仍然存在（图 1G–H’’）。对 sparc 转录本的定量显示，与野生型翅盘相比，肿瘤中的 sparc 表达显著上调，提示其可能参与肿瘤发生（图 1I）。综上，这些数据表明 SPARC 是一种来源于间充质、在肿瘤发生过程中上调的因子，因此我们进一步探究其在肿瘤—基质通讯中的功能。
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图 S3。通过遗传挽救 sparc 功能缺失所致的致死表型，对 BM40-SPARC-GFP 盒进行功能验证。
（A）用于生成同时携带 BM40-SPARC-GFP 盒和 sparc 功能缺失等位基因（SPARC[MI00329-GAL4]）且以 TM6B 平衡的果蝇的遗传杂交方案。
（B）用于检测对 sparc 突变体挽救作用的杂交。
利用缺失 sparc 基因座的缺失品系 Df(3R)BSC524 表型。图中标示了预期子代中可能出现的基因型。
（C–C″）比较预期的孟德尔基因型分布与实验观察到的子代分布。
（C）未发生挽救时的预期比例。
（C′）BM40-SPARC-GFP 表达盒完全挽救突变时的预期比例。
（C″）通过（B）所示杂交获得的实验观察基因型频率。
（D）理论预期与实验结果的基因型分布定量比较。彩色柱表示各基因型所占比例。观察到的分布与预测的挽救情形高度吻合，表明 BM40-SPARC-GFP 表达盒恢复了 sparc 突变动物的存活能力。（****p < 0.0001，卡方检验）
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图 1.
在肿瘤间充质细胞中检测到 SPARC。
（A–B）Apterous-Gal4（绿色，ap-Gal4, UAS-mCD8-GFP）驱动上皮细胞中的表达，但不在成肌细胞中表达（Cut，蓝色）。
（B′–B″）SPARC（洋红色）在成肌细胞中表达（Cut，蓝色）。
（C）图（B）的正交视图，显示 SPARC 表达（洋红色）仅限于成肌细胞（M），在上皮（E）中缺失。
（D–E″）SPARC-Gal4（洋红色，SPARC > mCD8–RFP）驱动成肌细胞中的表达；这些细胞同时表达 BM40-SPARC-GFP（绿色）。DAPI（蓝色）标记所有细胞核。
（F）图（E）的正交视图，显示成肌细胞（M）中同时存在 SPARC > mCD8–RFP（洋红色）和 BM40-SPARC-GFP（绿色）的表达。
（G–H″）在成肌细胞（G–G″）以及 EGFR-psq RNAi 肿瘤的间充质细胞（H–H″）中检测到 SPARC 表达（G 中为洋红色，G′ 中为灰色）。15B03-LexA（绿色，15B03-LexA; LexAop-mCD8-GFP）驱动间充质细胞中的表达。DE-Cadherin（DE-Cad；蓝色）标记
上皮细胞。
(I) 采用定量 RT-PCR 测定的 sparc mRNA 表达水平。RNA 样品取自三次独立实验。误差线表示均值标准误（s.e.m.）。比例尺：50 μm。
图 2. 间充质来源的 SPARC 转移至肿瘤上皮细胞。
(A-A’’) 在间充质细胞（绿色，15B03-LexA；LexAop-mCD8-GFP）和由 DE-Cad（蓝色）标记的上皮细胞中，均检测到 SPARC（洋红色）表达。
(B) 在 BM40-SPARC-GFP 品系中，EGFR-psq RNAi 肿瘤的间充质细胞（M；Twist，洋红色）和由 DE-Cad（蓝色）标记的上皮细胞（E）中，均检测到 BM40-SPARC-GFP（绿色）表达。黄色虚线标示间充质细胞（M）与上皮细胞（E）的分界。比例尺：25 μm。
(C-D’) 通过 smFISH 在野生型成肌细胞（C-C’）和间充质肿瘤（D-D’’’）中检测 sparc 转录本（灰色）。SPARC（洋红色，C）和 Twist（蓝色，D）分别标记野生型成肌细胞和间充质细胞。比例尺：25 μm。
(E-E’) EGFR-psq RNAi 肿瘤样本延时序列中的单个时间点（见视频 S2），显示 BM40-SPARC-GFP（绿色）和上皮细胞（洋红色，ap > mCD8-RFP）。比例尺：25 μm。
(F-F’) 为 (E) 中方框区域的高倍放大图。箭头和箭头头分别指示含 SPARC 的大囊泡和小囊泡。比例尺：10 μm。
(F) EGFR-psq RNAi 肿瘤的时间序列（分钟），显示 SPARC（绿色，BM40-SPARC-GFP；箭头）从间充质区室内化至上皮细胞囊泡中的过程。比例尺：10 μm。
SPARC 由间充质细胞产生，并被肿瘤上皮细胞内化
鉴于 SPARC 是一种分泌蛋白，我们探究它是否可能作为一种信号分子，参与间充质细胞与……之间的信号传导。
上皮细胞。对 EGFR-psq RNAi 肿瘤进行更高倍数分析发现，除在间质中表达外，SPARC 也可在上皮肿瘤中检测到，DE-Cad 标记了这些肿瘤（图 2A–A’’）。在间质细胞中，SPARC 在整个细胞内均可强烈检测到；而在上皮肿瘤细胞中，SPARC 则定位于离散的圆形细胞内及膜相关斑点（图 2A’’）。使用 BM40-SPARC-GFP 品系也独立证实了这一分布模式（图 2B 和图 S2C–C’’）。为分析上皮肿瘤中检测到的 SPARC 是否来源于间质细胞，而非由上皮肿瘤细胞自身转录，我们在野生型组织盘和 EGFR-psq RNAi 肿瘤中，采用单分子荧光原位杂交（smFISH，[18]）检测 sparc 转录本的表达（图 2C–D）。结果发现，在野生型和 EGFR-psq RNAi 肿瘤中，sparc 均仅在间质细胞群中转录，在上皮细胞中未检测到转录（图 2D’–D’’’ 和图 S2D–E）。这些观察结果提示，上皮肿瘤细胞中检测到的 SPARC 可能来源于邻近的间质细胞。为检验这一假设，我们对 EGFR-psq RNAi 肿瘤进行了长时间活细胞成像，其中上皮细胞以膜靶向 RFP 标记，SPARC 则通过 BM40-SPARC-GFP 品系进行可视化（图 2E–F’ 和视频 S2）。我们发现，在上皮肿瘤中，SPARC 阳性斑点对应于高度可移动的细胞内囊泡，其大小和运动特征各不相同。对这些延时成像进行更高倍数分析显示，SPARC 经由这些囊泡结构从界面处的间质区室被摄取进入上皮细胞。
在这两个区室之间（图 2G–G′ 和视频 S3）。这些数据表明，存在于上皮肿瘤区室中的 SPARC 并非由局部细胞产生，而是通过细胞内囊泡从邻近的间充质细胞转运而来。
SPARC 根据其细胞定位发挥不同的促肿瘤或抑瘤作用
鉴于在间充质细胞和上皮肿瘤细胞中均检测到 SPARC，我们接下来旨在明确其在各细胞区室中的功能作用。为特异性评估间充质 SPARC 的作用，我们采用 LexA 系统［19］，通过 15B03-LexA 驱动子选择性地下调间充质细胞中的 *sparc*。间充质中 *sparc* 的靶向耗竭显著抑制了肿瘤生长（图 3A–C），表明该区室中的 SPARC 对肿瘤扩增至关重要。为确定 SPARC 转运至上皮肿瘤细胞后的功能效应，我们特异性地在上皮区室中过表达 SPARC，并测量肿瘤大小。该方法使我们能够评估上皮细胞中 SPARC 的细胞自主效应，同时不改变间充质区室中的 SPARC 水平。与对照肿瘤相比，上皮细胞中过表达 SPARC 显著抑制了肿瘤生长（图 3D–F）。综上，这些结果表明，SPARC 对肿瘤生长的作用因其细胞定位而异：在间充质细胞中，SPARC 促进肿瘤生长；而在上皮肿瘤细胞中，SPARC 则抑制肿瘤扩增。后续研究聚焦于 SPARC 在上皮肿瘤细胞中的作用，旨在阐明间充质来源的 SPARC 如何作为细胞间信号调节上皮肿瘤行为。
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图 3.
SPARC 在间充质和上皮区室中发挥不同功能。
(A-B).
在间充质细胞中特异性耗减
sparc
会降低肿瘤生长。
对照条件下的
ap > EGFR-psq
RNAi
肿瘤（A），以及使用
15B03-LexA; LexAop-sparc
RNAi
在间充质细胞中敲低
sparc
后的肿瘤（B）。DE-Cadherin（绿色）标记上皮肿瘤细胞，Twist（洋红色）标记间充质细胞。
(C).
对（A）和（B）所示基因型的肿瘤大小进行定量。
****p
< 0.0001（非配对 t 检验；对照组和
sparc
RNAi
组分别有 11 个和 12 个肿瘤；数据合并自三次独立实验）。
(D-E).
在上皮中过表达 SPARC 会限制肿瘤生长。对照条件下（D）以及上皮细胞表达 UAS-SPARC::HA 后（E）的
ap > EGFR-psq
RNAi
肿瘤共聚焦图像。
(D).
RFP（绿色）指示上皮细胞中的
ap-Gal4
表达（D）。
(E).
HA（绿色）指示 SPARC::HA 的异位表达。Twist（洋红色）标记间充质细胞。
(F).
对（D）和（E）所示基因型的肿瘤大小进行定量。
***p
< 0.001（非配对 t 检验；对照组和 SPARC::HA 组分别有 11 个和 9 个肿瘤；数据合并自两次独立实验）。比例尺：200 μm。
异位表达的 SPARC 可减弱上皮肿瘤中的 Notch 信号传导
在肿瘤发育过程中，多条发育信号通路会被劫持以调控生长 [
12
,
13
]。我们探究了间充质 SPARC 是否会干扰上皮区室中的此类通路。为初步检验这一假设，我们使用
Ap-Gal4
在翅盘上皮中过表达 SPARC，并评估其对成虫翅发育的影响。约 10% 的个体在 SPARC 过表达后出现了与 Notch 突变体相似的翅表型。
羽化的成蝇（图 4A–D）。这些数据表明，SPARC 可能会干扰上皮细胞中的 Notch 通路活性。翅盘的背腹（D/V）界是研究 Notch 活性的经典系统 [20]。为监测肿瘤上皮细胞中 Notch 信号的变化，我们使用了 NRE-RFP（Notch 响应元件）报告系统。该报告系统通常在背腹界表达，并能灵敏地响应 Notch 通路活性的变化（图 4E–E’’ 和 [20]）。我们重点分析了 4 日龄肿瘤，此时翅盘区室在形态上仍可与其他致瘤细胞区分开来。在野生型翅盘中，NRE-RFP 的表达局限于翅盘的背腹界（图 4E–E″）。相比之下，EGFR-psq RNAi 肿瘤中，NRE-RFP 在翅盘的上皮细胞中普遍强烈上调，表明 Notch 信号活性升高（图 4F–F″ 和 H）。这一观察结果与肿瘤上皮细胞中检测到的高水平 Delta（图 S1）以及我们此前发现的上皮细胞中的 Delta 是肿瘤生长所必需的结果一致 [13]。值得注意的是，与单独的 EGFR-psq RNAi 肿瘤相比，在肿瘤上皮细胞中过表达 SPARC 显著降低了 NRE-RFP 水平，尽管 Notch 活性并未完全恢复至对照水平（图 4G–H）。与这些观察结果一致，间充质细胞耗竭的肿瘤区域中 NRE-RFP 水平较高，而富含间充质细胞的上皮区域则表现出较低的报告活性（图 4I–K）。综上所述，这些结果提示，来自间充质区室的 SPARC 可能在局部减弱肿瘤上皮细胞中的 Notch 活性。
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图 4.
SPARC 减弱 Notch亚洲视频
上皮肿瘤中的信号传导活性。
(A-C)。
对照果蝇的成虫翅（
Aap>mCD8-RFP
，A–A′）、Notch功能缺失果蝇（
Notch [ts1]
，B–B′），以及在翅盘中SPARC过表达的果蝇（
ap > SPARC::HA
，C–C′）。箭头表示Notch信号传导降低所特有的翅缘缺陷。虚线框对应于A′–C′中的放大视图。比例尺：500 μm。
(D)。
翅表型的定量分析显示，SPARC过表达时Notch翅缘缺陷的发生频率升高。**p < 0.01（卡方检验；对照组和SPARC::HA组分别分析了181和152个翅；数据汇总自4次独立实验）。
(E-E″)。
使用Notch响应性报告基因NRE-RFP（洋红色）显示对照翅盘中的Notch通路活性。翅盘的背侧区室以mCD8-GFP标记（
ap>mCD8-RFP
，绿色）。NRE-RFP的表达局限于背腹（D/V）边界（箭头）。
(F-F″)
在
EGFR-psq
RNAi
肿瘤中，NRE-RFP的表达在整个袋状区上调（星号）。
(G-G″)。
在上皮肿瘤细胞中
EGFR-psq
RNAi
+
SPARC::HA
过表达SPARC，与单独肿瘤相比，NRE-RFP水平降低。
(H)。
所示基因型中归一化NRE-RFP荧光强度的定量分析。
*p < 0.1（非配对t检验，n=13个对照翅盘，n=10个
EGFR-psq
RNAi
翅盘，n=12个
EGFR-psq
RNAi
+
SPARC::HA
翅盘；数据汇总自4次独立实验）。比例尺：100 μm。
(I-I′)。
EGFR-psq
RNAi
肿瘤中的NRE-RFP（洋红色）表达。Twist（绿色）标记间充质细胞，DE-Cad（蓝色）标记上皮细胞。(I′) 在缺乏间充质细胞的肿瘤区域，NRE-RFP水平较高。星号表示NRE-RFP信号较强的区域，而箭头表示NRE-RFP水平……的富含间充质细胞区域。
降低。（J-K）。（I）中方框区域的高倍放大图。比例尺：200 μm。
转移的 SPARC 在含有 Delta 的 Rab7 内体中积累
为了解 SPARC 如何降低上皮肿瘤细胞中的 Notch 活性，我们试图确定 SPARC 与 Notch 通路组分可能汇合的细胞区室。作为初步步骤，我们利用 Ap-Gal4 驱动子在野生型翅盘中过表达 SPARC，并分析其分布（图 5A–F）。Ap-Gal4 在翅盘的一个受限上皮亚区域中被激活，该区域邻接背腹（dorsoventral，D/V）边界，而 D/V 边界以 Delta 表达为特征（图 5A–B’）。这一策略使 SPARC 能够在受限的上皮区域中表达，同时分析其在邻近 Delta 表达细胞中的定位。我们发现，转移的 SPARC 定位于 Delta 阳性斑点状结构中（图 5D–F’’）。这些斑点状结构主要对应于晚期内体，其依据是它们与晚期内体标志物 Rab7 共定位（图 5C–C’’）。一致地，对 EGFR-psq RNAi 肿瘤中 SPARC 的分析显示出相似的模式（图 5G–G’’’）。事实上，在上皮区室内，SPARC 主要存在于 Rab7 内体中（89%，所分析的 144 个囊泡中有 128 个）（图 5G–G’’’）。重要的是，Delta 也富集于这些 Rab7/SPARC 晚期内体中（图 5H–H‴）。相比之下，使用循环内体标志物 Rab11 进行分析显示，在 Rab11 阳性的循环内体中，SPARC 与 Delta 之间不存在可检测的关联（图 5I–I’’’）。综上，这些数据表明，SPARC 被上皮细胞摄取后，会被运输至同时含有 Delta 的 Rab7 区室中。
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图 5.
SPARC 在 Rab7 阳性内体中积累
含有 Delta。
(A-B’)。
野生型翅盘中 ap-Gal4 驱动子的表达区域。ap-Gal4（ap>mCD8-RFP，绿色）界定了邻近背腹边界的一个受限上皮区域，Delta 即在该区域表达（洋红色）。图中显示了顶端（B）和基底（B’）切面。比例尺：25 μm。
(C)。
在上皮中过表达 SPARC::HA（ap>SPARC::HA，绿色）后，SPARC 定位于 Rab7 阳性的晚期内体（洋红色）。比例尺：25 μm。插图突出显示 SPARC/Rab7 阳性的内体（虚线圆圈）。比例尺：10 μm。
(D-F)。
在上皮中过表达 SPARC::HA（ap>SPARC::HA，绿色）后，SPARC（绿色，HA）在 Delta 内体（洋红色）中聚积。
(F-F’)。
单通道图像显示 SPARC 与 Delta 在囊泡结构中共定位（虚线圆圈）。比例尺：25 μm。
(G)。
表达 BM40-SPARC-GFP（绿色）的 ap > EGFR-psq RNAi 肿瘤；Rab7（洋红色）标记晚期内体。
(G’-G’’’)。
(G) 中方框区域的高倍放大图显示 SPARC 与 Rab7 内体相关（虚线圆圈）。比例尺：25 μm。
(H)。
表达 BM40-SPARC-GFP（绿色）、Rab7（洋红色）和 Delta（蓝色）的 ap > EGFR-psq RNAi 肿瘤。SPARC/Rab7 内体呈 Delta 阳性。比例尺：25 μm。
(I-I’’’)。
表达 Rab11-CherryFP（洋红色）、Delta（蓝色）和 SPARC（绿色）的 ap > EGFR-psq RNAi 肿瘤。Rab11 囊泡（虚线圆圈）均未与 SPARC 共定位。比例尺：10 μm。
SPARC 促进含 Delta 内体的增大及其动态改变
SPARC 存在于 Rab7 阳性内体中，这提示 SPARC 可能改变内体运输。这也表明 Notch 信号可能会因 Delta 运输发生改变而受到间接影响，因为 Delta 的活性依赖于内吞循环［21，22］。此外，Delta 在 EGFR-psq RNAiav电影
上皮肿瘤细胞，并且是肿瘤发生所必需的（图 S2 及文献[23]）。我们在 EGFR-psq RNAi 肿瘤中观察到了一群具有异质性的上皮囊泡，其大小不一，且 BM40-SPARC-GFP 的表达强度也存在差异（图 6A–A’’）。重要的是，根据 mCD8-RFP 信号鉴定的这些囊泡结构实际上对应于内体，因为其中一些还呈现 Rab7 阳性标记（图 S2H-H’’）。因此，我们利用 mCD8-RFP 信号对囊泡进行分割，并评估 SPARC 的积累是否与囊泡大小相关。结果发现，囊泡大小与 BM40-SPARC-GFP 强度之间存在显著的正相关关系（Spearman r = 0.61，p < 0.0001），表明较大的内体会积累更高水平的 SPARC（图 6B）。此外，与对照翅盘相比，EGFR-psq RNAi 肿瘤中的 Rab7 阳性内体更大（图 6C、E 和 F）。为探究细胞内内体中的 SPARC 积累与内体大小之间是否存在因果联系，我们在翅盘的上皮区室中过表达 SPARC；在正常情况下，该区域并不表达 SPARC。该操作使 SPARC 过表达区域内的 Rab7 阳性内体大小显著增加（图 6C–D 和 F），表明 SPARC 足以促进内体增大。
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图 6。
SPARC 促进内体增大并改变其运动性。
(A-A’’)。
表达 BM40-SPARC-GFP（绿色）和 mCD8-RFP（洋红色）的 ap > EGFR-psq RNAi 肿瘤。根据 mCD8-RFP 的强度对上皮囊泡进行分割，并以黄色勾勒其轮廓。
(B)。
散点图显示，在 EGFR-psq RNAi 肿瘤中，BM40-SPARC-GFP 强度与囊泡大小之间存在正相关关系（Spearman r = 0.61，p < 0.0001）。
每个点代表一个独立囊泡（n = 141）。数据以 log10–log10 坐标显示。红色为线性回归线。
(C–E) 对照翅盘中的 Rab7 内体（绿色）（C，ap>mCD8-RFP）、上皮细胞中过表达 SPARC::HA 时的 Rab7 内体（D，ap>SPARC::HA），以及 EGFR-psq RNAi 肿瘤中的 Rab7 内体（E）。上皮细胞以 mCD8-RFP（洋红色）标记。箭头和箭头头分别表示大型和小型内体。比例尺：10 μm。
(F) 对照翅盘（ap > mCD8-RFP）、上皮细胞中过表达 SPARC::HA（ap > SPARC::HA）以及 EGFR-psq RNAi 肿瘤中 Rab7 阳性内体大小的定量分析。数据以均值 ± SEM 表示。对照、SPARC::HA 和 EGFR-psq RNAi 肿瘤条件下分别分析了 349、706 和 738 个内体，数据来自三次独立实验。（非配对 t 检验，****p < 0.0001。）
(G–G’’) 表达 BM40-SPARC-GFP（绿色）和 Delta mScarlet-I（洋红色），并同时表达 UAS-CD4-miFP（蓝色）的 ap > EGFR-psq RNAi 肿瘤时间序列中的单个时间点（见视频 S4）。箭头和箭头头分别表示大型和小型内体。
(H) 肿瘤上皮细胞中囊泡运动的代表性轨迹。轨迹按囊泡速度进行颜色编码。
(I) 囊泡速度的定量分析。（Student’s t 检验；*p < 0.001，p < 0.01；n = 1351 个小型内体、n = 855 个中型内体和 n = 301 个大型内体；数据合并自三次独立实验。）
(J) 内体受限比的定量分析。（Student’s t 检验；****p < 0.0001；n = 1351 个小型内体、n = 855 个中型内体和 n = 301 个大型内体；数据合并自三次独立实验。）比例尺：10 μm。
鉴于内体增大通常与内体……改变相关。
鉴于其对相关性质和转运的影响[24,25]，我们接下来探究了SPARC是否影响内体动态。因此，我们通过活细胞成像分析了表达BM40-SPARC-GFP和Delta-mScarlet-I的EGFR-psq RNAi肿瘤中的内体运动，并同时使用膜定位的miFP标记上皮细胞（图6G–G″）。我们观察到，Delta阳性内体的运动行为具有异质性。值得注意的是，增大的内体始终呈SPARC阳性，且与较小的内体相比，其运动能力降低（图6G–G″及视频S4）。随后，我们通过活细胞成像追踪上皮肿瘤细胞中的囊泡，并根据其大小比较运动能力（图6H及材料与方法）。与小型和中型囊泡相比，大型囊泡的运动速度显著降低（图6I）。与此一致，大型囊泡的限域比更低，表明其运动受到更大限制（图6J）。综上，这些数据表明，SPARC在内体中的积累与内体增大及运动能力降低相关。内体转运的这些改变，从机制上解释了间充质来源的SPARC对上皮肿瘤细胞中Notch信号传导的抑制作用。
SPARC的酸性结构域是其定位于内体所必需的
如上所述，SPARC靶向内体区室是其调节肿瘤–基质通讯的关键步骤。因此，我们试图鉴定负责SPARC定位于这些区室的结构域。SPARC由三个主要结构域组成：N端酸性结构域（结构域I）、卵泡抑素样结构域（结构域II）以及C端细胞外Ca²⁺结合结构域（结构域III）（图7A）。我们使用了一系列带有HA标签的SPARC缺失构建体，分别缺失其中的
单个结构域或两个结构域的组合[26]，并利用 Ap-Gal4 驱动子在翅成虫盘上皮中表达这些构建体（图7A）。SPARC^DIDII 或 SPARC^DI 的表达均导致其与上皮细胞内的 Delta 阳性内体共定位（图7B–C’’），这与我们此前对全长 SPARC 的观察结果一致（图5）。相比之下，缺失酸性结构域的构建体（SPARC^DIIDIII 或 SPARC^DIII）未能在含 Delta 的内体中积累（图7D–E’’）。这些结果表明，SPARC 的酸性结构域（结构域 I）是其靶向含 Delta 内体所特异性必需的。
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图7.
SPARC 的酸性结构域是其靶向 Delta 内体所必需的。
(A).
SPARC 结构域排列及带 HA 标签的缺失构建体示意图。构建体由 UAS 启动子（蓝绿色）驱动，包含 N 端信号肽（SP；黄色），其后依次为结构域 I（酸性；蓝色）、结构域 II（卵泡抑素样；绿色）和结构域 III（细胞外 Ca²⁺ 结合；紫色），C 端带有 HA 标签（橙色）。
(B–E’).
利用 ap-Gal4 过表达 SPARC::HA 缺失构建体（绿色，HA）。Delta 以品红色表示。插图为方框区域的高倍放大图，突出显示 SPARC 与 Delta 的共定位（虚线圆圈）。
(F–I’’).
表达 SPARC^DIDII::HA（F–H’）或 SPARC^DIIDIII::HA（G–I’）的 ap > EGFR-psq^RNAi 肿瘤。组织经 HA（绿色）、Rab7 或 Delta（品红色）染色。插图为方框区域的高倍放大图，突出显示 SPARC 与 Delta 或 Rab7 内体的共定位（虚线圆圈）。
(J).
表达 SPARC 缺失构建体的肿瘤上皮细胞中内体运动速度的定量分析。内体在
表达 SPARC^DIDII::HA 的细胞中，内体的运动能力显著低于表达 SPARC^DIIDIII::HA 的细胞。（****p < 0.0001，Student’s t 检验；SPARC^DIDII::HA 和 SPARC^DIIDIII::HA 条件下分别分析了 1474 个和 1586 个内体；数据汇总自三次独立实验）。比例尺：10 μm。
接下来，我们研究了在 EGFR-psq^RNAi 肿瘤背景下，SPARC 进入内体是否仍然需要其酸性结构域。为此，我们在 EGFR-psq^RNAi 成虫盘的上皮肿瘤细胞中表达了两种 SPARC 缺失构建体：保留酸性结构域的 SPARC^DIDII 和缺失该结构域的 SPARC^DIIDIII。与我们先前的观察结果一致，SPARC^DIDII 在上皮肿瘤细胞内与 Delta 阳性和 Rab7 阳性内体均呈现明显的共定位（图 7F–H’’）。相比之下，SPARC^DIIDIII 未能在 Delta 或 Rab7 阳性内体中积累，而是呈弥散分布（图 7G–I’’），证实了酸性结构域是 SPARC 靶向肿瘤上皮内体所必需的。此外，内体运动的活体成像显示，表达 SPARC^DIDII 的上皮肿瘤细胞中，内体的运动速度显著低于表达 SPARC^DIIDIII 的细胞（图 7J）。综上，这些数据表明，SPARC 定位于 Rab7 阳性内体及其调节上皮肿瘤细胞内体运输特征的能力，均依赖于其酸性结构域。
讨论
在本研究中，我们阐述了 SPARC 作为细胞间介质参与肿瘤–宿主通讯的一种机制。我们发现，间充质细胞产生的 SPARC 被 EGFR-psq^RNAi 上皮肿瘤细胞内化，并被转运至
Rab7阳性的晚期内体区室，SPARC在其中与Notch配体Delta共定位。在EGFR-psq RNAi肿瘤中，SPARC改变内体的性质，导致内体增大且运动性降低。这些变化间接降低了Notch信号传导水平（图8）。
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图8.
EGFR-psq RNAi肿瘤中SPARC介导的Delta转运与Notch信号传导调控模型。
间充质细胞产生并分泌SPARC，随后SPARC被转移至邻近的肿瘤上皮细胞。SPARC在Rab7阳性的晚期内体中积聚，促进内体增大，并使Notch配体Delta滞留其中。这阻碍了Delta经由Rab11阳性区室进行有效再循环，导致肿瘤上皮细胞中的Notch信号输出降低。
作为一种基质细胞调节蛋白，SPARC定位于内体区室内这一现象出乎意料。有趣的是，人卵巢癌研究表明，尽管仅在周围的间质细胞中检测到SPARC的mRNA，SPARC蛋白却在恶性上皮细胞的细胞质中积聚[27]。相比之下，在良性卵巢肿瘤中，完整的基底膜将间质区室与上皮区室分隔开来，其上皮细胞中未见SPARC。这些观察结果促使研究者提出，恶性肿瘤中基底膜的缺失使间质来源的SPARC能够接触邻近的癌细胞，并被其内化[27]。EGFR-psq RNAi翅成虫盘肿瘤模型呈现出一个有趣的类似现象。在野生型翅成虫盘中，SPARC由相关联的成肌细胞产生，但在上皮区室内未被检测到，这与完整的细胞外基质将这些组织分隔开来的情况一致。相比之下，EGFR-psq RNAi
肿瘤破坏组织结构，导致上皮细胞与间充质细胞混杂，并引发广泛的细胞外基质重塑。在这些条件下，SPARC可高效地从成肌细胞转移至上皮肿瘤细胞，并在其内体区室中积累。
肿瘤生长通常依赖于癌细胞与周围基质细胞之间的协调相互作用；二者在肿瘤进展过程中共同演化，并共同促进肿瘤扩增及其生物学行为[3,28]。EGFR-psq RNAi模型充分体现了这种协同作用[12,13]。在该模型中，上皮肿瘤细胞与肿瘤相关间充质细胞相互交换细胞间信号，尽管源自具有不同生长特性的组织，但两类细胞的大小最终变得相近。在野生型翅成虫盘中，上皮细胞明显大于与之相关的成肌细胞，而在EGFR-psq RNAi肿瘤中，这两类细胞的大小趋于一致[12,13]。这一变化提示，在肿瘤发生发展过程中，存在协调这两个细胞区室扩增的机制。我们的研究结果提示，间充质来源的SPARC可能参与了这一协调过程，至少部分通过减弱上皮细胞中的Notch信号传导，从而限制上皮生长，使间充质区室得以同步扩增。
内体运输的改变会影响肿瘤生长过程中的信号活性及细胞间通讯。例如，在果蝇中，内体分选复合体ESCRT的关键组分vps25发生突变，会导致Notch受体在增大的内体区室内积累[24,29]。这会引起Notch信号的组成性激活、分泌型配体Unpaired（Upd）的异位表达，以及随后的
激活邻近野生型细胞中的 JAK–STAT 通路，从而以非细胞自主性方式驱动组织过度增生。我们的研究结果揭示了内体运输调控肿瘤发生发展的一种独特机制。我们发现，SPARC 与 Notch 配体 Delta 共同积聚于 Rab7 阳性晚期内体中。这种积聚与上皮肿瘤细胞中 Notch 活性降低相关。这些相反的结果凸显了内体调控的情境依赖性：将 Notch 受体滞留于内体中可促进其非配体依赖性激活，而促进配体 Delta 在晚期内体中积聚则可能限制其再循环至质膜，进而减弱 Notch 信号传导。
SPARC 被广泛认为参与肿瘤–间质相互作用，且常由间质细胞或免疫细胞表达，影响多种癌症的肿瘤进展、侵袭性及患者预后 [9, 30, 31]。尽管具有上述临床相关性，间质来源的 SPARC 如何向肿瘤细胞传递信号并调控细胞内信号通路，其分子机制仍不明确。此外，据报道，SPARC 的功能具有情境依赖性，可随组织类型和肿瘤阶段的不同而发挥促癌或抑癌作用 [8]。这种功能上的双重性使阐明 SPARC 活性的机制基础变得更加复杂。我们的研究结果表明，SPARC 可通过调节内体运输，充当细胞内信号传导的调控因子。具体而言，SPARC 积聚于 Rab7 阳性晚期内体中，而与 Rab11 阳性再循环内体之间未检测到关联。SPARC 在该区室中的积聚与该区室的增大相关，这一表型与内体功能缺陷相关
转运。Delta 的活性依赖于其在内体区室与质膜之间的转运，以维持 Notch 信号传导。我们提出，当 Delta 定位于 SPARC 阳性内体时，其优先被运送至晚期内体区室，而非回收至质膜。这种错误分选会限制可用于信号传导的 Delta，从而减弱 Notch 通路的激活。鉴于 Notch 信号传导在癌症中的核心作用 [32]，这种对 Delta 细胞内转运的调节构成了一个关键调控环节，可能代表一种具有广泛意义的肿瘤–基质通讯形式，并可能有助于解释哺乳动物 SPARC–Notch 相互作用在肿瘤–宿主界面处的情境依赖性效应。
材料与方法
黑腹果蝇品系与遗传学
所有黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）品系均在 25°C 下使用标准培养基饲养。使用的品系如下：w¹¹¹⁸ 作为野生型（wt）、UAS-mCD8GFP（BL#5137）、UAS-mCD8-RFP（BL#27391）、UAS-mCD8-RFP（BL#27392）、Ap-Gal4（BL#25685）、SPARC[MI00329-GAL4]（BL#77473）、BM40-SPARC-GFP [17]、15B03-LexA [12]、lexAop-CD8-GFP（BL#66545）、EGFR-psq RNAi [12]、UAS-SPARC::HA、UAS-SPARCᴰᴵ::HA、UAS-SPARCᴰᴵᴰᴵᴵ::HA、UAS-SPARCᴰᴵᴵᴰᴵᴵᴵ::HA、UAS-SPARCᴰᴵᴵᴵ::HA [26]、Notch [ts1]（BL#2533）、NRE-RFP [33]、Ubiquitin-Rab11cherryFP [34]、Deltaᵐˢᶜᵃʳˡᵉᵗ⁻ᴵ [13]、UAS-CD4-miFP（BL#64183）、CG9650-GFP（CPTI#1741）、Df(3R)BSC524（BL#25052）。EGFR-psq RNAi 肿瘤按照文献 [12] 所述方法诱导。
LexAop-sparc RNAi 果蝇品系的构建
利用 NotI 和 XbaI 限制性酶切位点，将靶向 sparc 的反向重复片段克隆至 pJFRC19 质粒 [35] 中，该片段对应于 UAS-sparc RNAi 品系（VDRC kk108185）中使用的序列。所得的
通过将 LexAop-sparc RNAi 构建体注射至 nos-phiC31-NLS; attP2 果蝇胚胎中，利用 φC31 介导的转基因技术，将其整合至第三染色体 68A4 处的 attP 着陆位点。使用 15B03-LexA 在间充质细胞中表达 LexAop-sparc RNAi，并检测 EGFR-psq RNAi 肿瘤中的 SPARC 蛋白水平，以验证敲低效率（图 S2F–G′）。
免疫染色和原位杂交
EGFR-psq RNAi 的制备及翅成虫盘的免疫荧光染色按照文献 [12, 18] 所述方法进行。免疫荧光染色使用以下一抗：鸡抗 GFP（1:300，Abcam，ab13970）、兔抗 SPARC（1:500，Maurice Ringuette，加拿大多伦多大学）、大鼠抗 RFP（1:800，Chromotek，5F8-20）、小鼠抗 Cut（1:10，DHSB，2B10）、大鼠抗 DCAD2（1:200，DHSB，DCAD2-s）、小鼠抗 Delta（1:50，DHSB，C594.9B）、小鼠抗 NICD（1:100，DSHB）、小鼠抗 Rab7（1:25，DHSB，Rab7-s）、抗 HA（1:1000，Roche，克隆号 3F10）、兔抗 Twist（1:2000，Eileen Furlong，德国海德堡）。单分子荧光原位杂交（smFISH）实验按照文献 [18] 所述方法进行。Delta 和 sparc 探针组由 Biosearch Technologies 制备。探针序列靶向各基因的第 3 外显子。
sparc 功能缺失致死表型的遗传挽救
为评估 BM40-SPARC-GFP 表达盒的功能，使用 sparc 功能缺失等位基因 SPARC[MI00329-GAL4] 进行了遗传挽救实验。首先，将携带 BM40-SPARC-GFP 转基因的果蝇与 SPARC[MI00329-GAL4] 进行重组，建立 BM40-SPARC-GFP, SPARC[MI00329-GAL4] 品系。将该品系的处女雌蝇与携带缺失染色体 Df(3R)BSC524/TM6C, Sb 的雄蝇杂交，该缺失涵盖包括 sparc 在内的数个基因。子代
对子代进行评分，以确定其是否具有 BM40-SPARC-GFP, SPARC[MI00329-GAL4]/Df(3R)BSC524 基因型。在未进行挽救的情况下，预计该基因型会因 sparc 缺失而致死。获得具有该基因型的存活成虫表明，BM40-SPARC-GFP 表达盒能够实现功能互补。将子代中各基因型的频率与预期的孟德尔分离比例进行比较，以评估挽救效率（图 S3）。
定量逆转录 PCR
每种条件下解剖 30–40 个翅成虫盘，并按照制造商说明，使用 TRIzol 试剂（Life Technologies）提取总 RNA。使用 M-MLV 逆转录酶（Promega，M531A）将 RNA 逆转录为 cDNA。使用 SYBR Green I Master Mix（Roche，04707516001）在 LightCycler 480 系统上进行定量 PCR。每种条件均分析三个独立的生物学重复。转录本水平以内参基因 Rpl32 进行归一化。
显微成像与数据分析
固定样本
在 BIOSIT 平台（雷恩大学），使用 LSM980 Airyscan2 或 Leica SP8 共聚焦显微镜对荧光样本进行成像。使用 20×、40× 或 63× 物镜采集图像，图像尺寸为 1024 × 1024 像素。使用 ImageJ 进行图像处理，并在 Adobe Illustrator 中完成最终图版的编排。进行荧光定量时，所有实验条件下的样本均平行处理和分析。各样本的共聚焦图像均采用相同的激光功率和检测器设置采集。对于每个 Z 轴图像堆栈，在测量前均生成荧光强度求和投影图。
活体成像
在 Schneider 果蝇培养基中解剖幼虫。将荷瘤组织置于添加青霉素–链霉素的 Schneider 培养基中进行封片
（Invitrogen 15140-122）、15%胎牛血清（Biosera FB-1200/500）和胰岛素（Sigma I5500）。将样本置于18 × 18 mm盖玻片（VWR 631-1567）与35 mm Lumox培养皿（Sarstedt 94.60077.331）之间。为防止图像采集过程中蒸发，在制备好的样本上覆盖Halocarbon 27氟碳油（Sigma H8773）。使用LSM980 Airyscan2显微镜（雷恩大学BIOSIT平台）进行活体成像，成像腔室温度维持在25°C。使用63×物镜采集延时图像序列，分辨率为1024 × 1024像素，每30 s采集一次图像。
为定量分析内体中的BM40-SPARC-GFP荧光强度（图6A–B），制备表达EGFR-psq RNAi、BM40-SPARC-GFP及膜标记物mCD8–RFP的翅成虫盘，并进行共聚焦显微成像。基于mCD8–RFP信号，使用Fiji/ImageJ中TrackMate插件的阈值检测器自动分割内体结构。随后，在相应区域内测量BM40-SPARC-GFP的平均荧光强度。采用Spearman秩相关系数评估内体面积与BM40-SPARC-GFP水平之间的相关性，并在散点图中展示回归趋势。
为通过内体追踪分析其运动性，使用Fiji/ImageJ中的TrackMate插件检测并随时间追踪内体，生成分配有唯一轨迹ID的运动轨迹。提取TrackMate计算的运动性参数，包括平均速度和限域比，并将其与相应的轨迹ID匹配。随后，根据平均面积将内体分为三个大小组（小型：< 0.2 µm²；中型：0.2–0.5 µm²；大型：> 0.5 µm²）。采用非参数方法比较不同大小组之间运动性参数的分布
进行统计检验，并通过图表进行可视化展示。
利益冲突
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
我们感谢布卢明顿果蝇品系中心、维也纳果蝇资源中心（VDRC）和发育研究杂交瘤库提供果蝇品系和抗体。感谢 Roland Le Borgne、Peter Lorincz 和 Caroline Dillard 对稿件进行审阅并提出批评性意见。感谢雷恩显微成像中心（MRic，BIOSIT，Biogenouest）的 Xavier Pinson 和 Stephanie Dutertre 提供技术支持，以及 Cyrille Surbled 在果蝇品系维护和技术方面提供的帮助。Bray 实验室的研究工作获得了英国医学研究理事会项目资助（MR/L007177/1 和 MR/T014156/1）。Boukhatmi 实验室的研究工作获得了 AFM-Téléthon Trampoline 项目（#23108）、ATIP-Avenir（法国国家科学研究中心，CNRS）及法国抗癌联盟的资助。N.A. 获得了 AFM-Téléthon 博士研究生奖学金（#23846）和法国医学研究基金会（FRM）奖学金（FDT202404018608）的资助。E.L. 获得了 AFM-Téléthon 博士研究生奖学金（#29992）的资助。T.M. 获得了葡萄牙科学与技术基金会（FCT）第五届 CEEC 助理研究员资助（DOI：10.54499/2022.02406.CEECIND/CP1720/CT0014）。
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SPARC通过对Delta和Notch信号传导的内体调控介导肿瘤与基质之间的细胞间通信
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，
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Martins
，
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Ringuette
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Hadi
Boukhatmi
bioRxiv
2026.07.04.736483；
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https://doi.org/10.64898/2026.07.04.736483
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