用于活细胞中 E3 连接酶邻近区域光邻近标记的从头设计酶

光催化邻近标记蛋白质组学（photocatalytic proximity labeling proteomics，photo-PLP）已成为在原位快速捕获蛋白质互作组的强大技术。通常，photo-PLP依赖于将光催化剂化学偶联至目标对象，这给衍生化光催化剂的合成以及生物偶联特异性带来了实际挑战。将遗传编码酶的精准性与化学定义光催化剂的多功能性相结合，为进一步拓展邻域图谱构建的适用范围提供了一种模块化方法。在此，我们提出EYClamp，这是一种从头设计的邻近标记酶，以现成可用的光催化剂曙红Y（Eosin Y，EY）作为辅因子。通过采用结构域互换二聚体架构，我们设计出一种能够以高亲和力结合EY（Kd = 10 nM），并将其三重激发态寿命延长29倍的支架。EYClamp能够在活细胞中利用芳基-重氮丙酮、芳基-叠氮化物和酚基生物素，实现高效的多尺度光催化邻近标记。我们将EYClamp基因融合至六种重要的E3连接酶，利用EYClamp鉴定出KEAP1、MDM2、ASB7和STUB1的1,500多个候选邻近蛋白，从而对这些重要邻域提供了广泛且无偏倚的视角。研究揭示了关键的功能网络，包括ASB7参与HP1a/CUL5复合物介导的异染色质重塑。我们的EYClamp为E3连接酶这一庞大家族的photo-PLP互作组发现提供了一种可遗传编码、即插即用的解决方案，并确立了结构域互换作为从头设计光酶的有前景策略。

光催化邻近标记蛋白质组学（photocatalytic proximity labeling proteomics，photo-PLP）已成为一种在原位快速捕获蛋白质互作组的强大技术。通常，photo-PLP依赖于将光催化剂通过化学偶联连接至目标对象，这给衍生化光催化剂的合成以及生物偶联特异性带来了实际挑战。将遗传编码酶的精准性与化学定义光催化剂的多功能性相结合，为进一步拓展邻域图谱绘制的应用范围提供了一种模块化方法。在此，我们提出EYClamp，这是一种从头设计的邻近标记酶，以现成可用的光催化剂曙红Y（Eosin Y，EY）作为辅因子。通过采用结构域交换二聚体架构，我们设计出一种能够高亲和力结合EY（Kd = 10 nM），并将其三重激发态寿命延长29倍的支架。EYClamp结合芳基重氮烯、芳基叠氮和酚-生物素，可在活细胞中实现高效、多尺度的光催化邻近标记。我们将EYClamp与六种重要的E3连接酶分别进行遗传融合。利用EYClamp，我们鉴定出KEAP1、MDM2、ASB7和STUB1的1,500多个候选邻近蛋白，从而对这些重要邻域提供了广泛且无偏倚的观察。研究揭示了关键的功能网络，包括ASB7参与HP1a/CUL5复合物介导的异染色质重塑。我们的EYClamp为大型E3连接酶家族的photo-PLP互作组发现提供了一种可遗传编码、即插即用的解决方案，并确立了结构域交换作为从头设计光酶的一种有前景的策略。

作者声明存在以下竞争性经济利益：J.A.W.和Z.L.已就多尺度互作组分析平台申请专利（加利福尼亚大学董事会，63/472,087）。N.J.K.

与 GEn1E Lifesciences、Maze Therapeutics、Mreza Therapeutics、Rezo Therapeutics 和 Tenaya Therapeutics 存在金钱和/或股票薪酬关系。其他作者声明不存在利益冲突。

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关键词：光催化邻近标记 · 从头设计酶 · E3连接酶 · 活细胞蛋白质组学 · 曙红Y · 蛋白质互作组

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.22.739993v1?rss=1