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声学液滴喷射（acoustic droplet ejection，ADE）可实现纳升级液体处理，从而支持复杂的微孔板检测；然而，将实验设计转化为经过验证且可直接供仪器执行的操作指令，仍是制约因素。我们提出了 PickliPy，这是一种开源框架，可将基于电子表格的检测设计转换为经过验证的 ADE 加样列表。PickliPy.Assay 支持组合式、剂量-反应式和多次加样时间进程式分液，而 PickliPy.Screen 则进一步拓展至高通量工作流程，包括文库重排和候选筛选。在多种生物学背景下，该框架均能生成具有良好重复性、可直接用于检测的微孔板，并在人体队列研究中实现标准化操作。对分离的人骨骼肌线粒体进行声学预分液，深化了生物能表型分析，捕捉到了底物切换现象；在人体胰腺 β 细胞中，该方法提高了剂量-反应测定的精确性，并揭示了琥珀酸脱氢酶动力学随年龄相关的变化。我们还对一种无需洗涤的活细胞线粒体功能与形态筛选方法进行了基准评估；其中，深度学习图像分析扩大了检测窗口，而 ADE 则支持了整合性的剂量-反应联合响应分析。总体而言，这些工具使复杂 ADE 实验更易于设计、复现和规模化，可将实验从单个实验台扩展至筛选项目。
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声学液滴喷射（acoustic droplet ejection，ADE）支持纳升级尺度的液体处理，可用于复杂的微孔板实验；然而，将实验设计转化为经过验证且可直接供仪器执行的操作指令，仍然是一个瓶颈。我们提出了 PickliPy，这是一种开源框架，可将基于电子表格的实验设计转换为经过验证的 ADE 加样列表。PickliPy.Assay 支持组合式、剂量-反应式以及多次加样的时间进程式分液；PickliPy.Screen 则进一步扩展至高通量工作流程，包括文库重排和候选集筛选。在多种生物学应用背景下，该框架生成了具有可重复性的、可直接用于实验的微孔板，并实现了人类队列研究中实验执行流程的标准化。对分离的人骨骼肌线粒体进行声学预分液，深化了生物能量学表型分析，捕捉到了底物切换现象；对人胰腺 β 细胞进行研究，则提高了剂量-反应精度，揭示了与年龄相关的琥珀酸脱氢酶动力学变化。我们对一种无需洗涤的活细胞线粒体功能与形态筛选方法进行了基准评估；在该方法中，深度学习图像分析扩大了检测窗口，而 ADE 则支持了整合性的剂量-反应协同响应分析。总体而言，这些工具使复杂 ADE 实验更易于设计、复现和扩展，可从单个实验台推广至大规模筛选活动。
引言
声学液滴喷射（acoustic droplet ejection，ADE）支持新型液体
从面向学术研究的定向实验到采用高通量筛选（HTS）的发现研究，液体分配策略涵盖了多种应用场景¹˒²。声学液滴喷射（ADE）利用声能，在微孔板中将纳升级液滴从任意源孔转移至任意目标孔，且无需物理接触³˒⁴。这一技术可用于文库重排⁵、剂量-反应实验⁶、复杂组合设计⁷、化合物混池⁸˒⁹，并且与移液相比，可降低载体溶剂浓度¹⁰。目前的 ADE 技术适用于多种液体类型¹¹，可直接向细胞培养物中分配液体¹⁰˒¹²，也可制备可供后续使用的即用型测定板¹³˒¹⁴。本文重点讨论如何将 ADE 所支持的复杂实验设计，从便于人类阅读的格式（电子表格）转换为机器可执行的一系列指令。这是 ADE 和 HTS 中的关键步骤，因为在这些场景下，精确规划数千次液体转移操作已是常规工作。与此同时，当代非 HTS 实验室研究也日益采用微尺度和微孔板技术。下文将介绍公开可用且具有通用性的软件工具及其应用，以改进 HTS 与非 HTS 实验设计。
Beckman Coulter Echo ADE 平台既可执行简单的映射转移，也可根据实验方案和挑选清单执行复杂转移。该仪器既可独立运行，也可集成至机器人系统，并由调度软件控制。挑选清单是表格文件，用于指定源孔、目标孔和转移体积。制造商提供的 Echo Plate Reformat、Echo Cherry Pick、Echo Combination Screen 和 Dose-Response 等商业解决方案，是用于创建和执行转移方案的特定任务型图形用户界面（GUI）应用程序。这些应用程序可选择使用挑选清单作为输入，而不必自行创建清单。
重要的是，用户创建的挑选清单也可用于 Plate::Works（Revvity）、Momentum（Thermo Scientific）和 Green Button Go（Biosero）。我们提供的挑选清单设计工具可在 Beckman 生态系统之外使用。
已有多种替代工具被用于应对声学液滴喷射（ADE）控制的相关问题，包括开源工具 FIMMCherry¹⁵ 和 PyEcho¹⁶，以及以概念形式发表的软件：Echo QC¹（Genentech）、Apothecary⁷（AstraZeneca）和 CherryPick¹⁷。这些替代工具分别解决了特定环境中的挑战，其中一些与实验室信息管理系统（LIMS）紧密耦合，而这可能成为学术或初创企业自动化环境中的障碍。目前，公开可用的 ADE 支持软件仍较为零散：现有工具要么只能针对相对受限的实验设计生成兼容 Echo 的转移文件，要么专门实现特定机构的工作流程。为弥补这一实际应用中的缺口，我们提供了一套可在本地部署、文档公开的设计到运行文件工作流程。
在此，我们介绍 PickliPy，它可根据基于电子表格的检测设计生成经过验证、兼容 Echo 的挑选清单。PickliPy 面向不具备 LIMS 的环境开发，基于结构化的 Excel 工作簿输入，也可与常用工具 DataWarrior 配合使用。它能直接生成 Revvity Plate::Works 或其他遵循仪器 API 规范的系统可读取的输出，并生成供下游分析使用的元数据。我们通过多种实验应用展示了 PickliPy 的实用性，包括生物能学检测就绪板、小分子化合物库的灵活重排、剂量反应实验和组合实验。
结果
两种挑选清单范式：检测与筛选
为了
为将直观的板图转换为经过优化和验证、可由机器执行的指令序列（移液清单）及元数据文件，我们开发了两套互补的工作流程，以满足主要应用场景的需求：1）PickliPy.Assay 用于单板工具化合物库的分液，利用多个板图并结合可选的随机化，实现组合配制、剂量–反应设计和时间序列加样（图 1a）。2）PickliPy.Screen 用于化合物库筛选，支持重排布板和可变剂量分液，可使用单一通用布局，将多板化合物库中的化合物自动分配至多个测定板（目标板）的孔中（图 1b）。
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图 1
通过电子表格设计生成可执行的声波液滴喷射（ADE）移液清单，用于测定和筛选工作流程。
a）
PickliPy.Assay 支持使用单个 Microsoft Excel 设计文档对单板工具化合物库进行分液，实现组合配制（箭头 C）、可选随机化（R）的剂量–反应设计（D），以及孔内容物合并（P）。
b）
PickliPy.Screen 支持化合物库筛选，可进行重排布板、添加对照，并为每种化合物设置多个剂量，同时根据需要依次切换源板和目标板（S）。
c）
对于 PickliPy.Assay，SRC 工作表定义源板中化合物的位置、名称及储备液浓度。DST 工作表定义一个或多个分液板图，允许通过多种方式指定化合物及其浓度：
c-i）
每个工作表单元格包含一个或多个标签［其中，标签（红色）与 SRC 中定义的化合物储备液（蓝色）及终浓度相关联］；或者，每个标签对应一种或多种带有浓度信息的化合物（底部）；
c-ii）
每个单元格包含单个标签，并配合浓度图，以便为浓度设置数值并使用 Excel 的自动填充功能；以及
c-iii）
多个板
图谱，包括 c-i) 和 c-ii) 所示的策略，这些策略可组合用于分液。完整示例见图 S2。d) 对于 PickliPy.Screen，SRC 工作表通过一个以 * 作为化合物名称的通配符行，定义添加至源化合物库板的对照以及引用 LIB 工作表的库化合物位置。DST 工作表仅定义一个通用板布局，其中除 SRC 中定义的对照以外的所有标签均根据 LIB 工作表自动填充。这使得可以使用 d-i) LIB 工作表各行中明确指定或引用的终浓度；以及 ii) 同一库化合物的多个剂量。e) 采用 d-ii 所示策略进行剂量–反应分液，展示了 384 孔板设计的一部分。标签前缀 #1 至 #23 表示 23 种库化合物，而标签后缀表示各化合物的不同浓度（相应的标签定义见图 S3）。f-h) 根据针对与 e) 中设计相对应的 SRC 板所生成的挑取列表，对移板路径进行可视化（f）。孔内数字表示分液顺序。(P) 表示针对 DMSO 进行的化合物孔合并。g) 对与 e) 对应的 DST 板上的孔间移动路径进行最短路径优化。h) 使用 e) 中的设计并通过 PickliPy.Assay 进行随机化后的孔间移动路径。
两种方法均使用单个设计文件作为输入，其中包含用于定义源板化合物的库存或源（SRC）工作表（图 1c-d），以及用于定义分液位置和浓度的目标（DST）工作表。这两种方法对这些工作表的处理方式不同：PickliPy.Assay 提供明确的分液模式（图 1ci、ii、iii），而另一种方法则通过自动填充布局实现高通量通用化（图 1di、ii、e），其来源为一个
第三，PickliPy.Screen 的库（LIB；图 1d）工作表。在分配规划过程中会追踪预期的源孔体积，从而能够通过源孔合并避免源孔耗尽（图 1c、d、f，箭头 p）。分配顺序经过优化，以最大限度地减少板移动次数，并可选择进行随机化处理（图 1f–h）。配套工具 PickliPy.QC 和 PickliPy.Visualize 分别通过解析仪器日志文件实现执行后的质量控制，并展示微孔板的移动过程（图 1f–h）。
我们首先使用集成于机器人工作单元中的 Beckman Coulter Echo 650 ADE 设备（图 S1），通过单个板图和用于定义分配体积的标签，演示了点杂交中图案的声学分配（图 2a–b）。
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图 2
实验方案耐受性和源板停留时间决定 ADE 的操作限度。
a） 图案分配的浓度图。
b） 用于承载印迹纸的定制 3D 打印微孔板适配器，其中显示了与 a） 对应的、由 ADE 分配形成的图案。
c–f） 使用荧光素作为示踪剂，比较 ADE 与手动移液在孔间差异方面的表现，所分配的液体包括 H₂O（c）、DMSO（d）以及葡萄糖水溶液（3 M；e）和琥珀酸水溶液（1 M；f）。每种液体分别采用适用于水性液体的 ADE 方案（384PP_AQ_SP2；黑色）和适用于 DMSO 的 ADE 方案（384PP_DMSO2；红色）进行分配。数据表示为 n = 3 个孔重复的均值 ± 标准差，并取自两次独立实验重复的平均值。
g） 对应于 （c–f） 的手动分配与 ADE 分配的比较。采用未加权线性回归斜率表示 ADE 方案斜率与相应手动分配斜率之比，并给出 95% 置信区间；参考线设为 1.0，表示与手动分配相当。红色数据点表示相对于手动移液的显著偏离。
h） 对线性关系进行的拟合不足检验，涵盖……
分液体积，数值越大表明荧光与期望体积之间的关系偏离线性的证据越强。
i)
源板中 H₂O 蒸发的影响。
j)
在 30% 相对湿度下，源板中无水 DMSO 吸湿的影响。
使用 PickliPy.Assay 对 ADE 的敏感性分析
以下应用使用同一块源板中的水性储备液和 DMSO 储备液进行分液。制造商针对如何根据溶剂选择适当的分液方案提出了严格建议。然而，与其采用不同方案进行两次分液，使用同一方案分配方案不匹配的液体可能更为实用或更快。因此，我们在此测试了针对溶剂类型使用不匹配方案所引入的误差幅度。我们利用 PickliPy.Assay 的浓度图功能，采用分别适用于水性溶液和 DMSO 溶液的声学分液方案，将不断增加体积的荧光素溶液分配至 H₂O 或 DMSO 中（图 2c-f）。水性分液方案与 DMSO 分液方案不匹配并未产生一致的体积偏差，尽管 ADE 分配的 DMSO 少于手动移液（图 2g）。重要的是，在每种情况下，ADE 的线性均优于手动移液（图 2h）。
采用活细胞进行的筛选或实验可能遵循由生物学过程决定的时间进程；此外，根据分液事件之间的时间间隔，水性化合物储备液可能会因 Echo 650 分液腔室内较高的气流而随时间浓缩。这会影响这样的实验设计：源板需在仪器中停留较长时间以完成分液。在 Echo 腔室中长时间停留期间，384PP 板中的水性源液以 3 µL/h 的速率蒸发，无论……
门状态（图 2i）。相反，在环境相对湿度为 30% 时，无水 DMSO 的体积以 0.75 µL/h（1.4%）的速率增加（图 S4j）。在等待期间，通过以程序方式将微孔板从声学分液仪中移出并加盖，可以减轻这些影响（图 S4c）。
这些测试表明，即使在实际操作中对溶剂方案作出折衷，ADE 仍能保持优于手动移液的剂量线性；然而，源板长时间停留会引入可预测的、依赖于溶剂的体积漂移，因此应在有时间要求的生物学工作流程中加以管理。在明确这些操作限度后，我们使用 PickliPy.Assay 将对时间敏感的功能检测转移至预分液、可直接用于检测的形式。
应用 1：可直接用于检测的 ADE 微孔板支持新鲜人线粒体的当日多重表型分析
我们利用 ADE 展示了如何通过预先分液制备定制的、可直接用于检测的微孔板，并将其密封冷冻以供后续使用，从而改进常规研究实验室检测。此类微孔板可在由生物学过程决定的时间使用，而不必受液体处理仪器可用性的限制（图 3）。此前已有研究报道了利用声学分液制备可直接用于检测的微孔板，表明纳升级 DMSO 液滴可在 -18 °C 下安全储存^14。在此，我们展示了 PickliPy.Assay 如何支持此类工作流程，从而实现均一的重复实验和更高的数据密度。
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图 3
可直接用于检测的微孔板支持对时间敏感的人线粒体多重呼吸测定。
a）从人类肌肉活检样本中分离的线粒体（比例尺，2 mm）取自股外侧肌，仅能在较短时间内用于功能检测。
b）可直接用于检测的微孔板部分通过 ADE 分液（红点）制备，部分通过手动移液（蓝色及带标签的孔）制备。“底物试剂盒”由
作为基础培养基加入检测孔中，而“port kit”则加入 Agilent Seahorse XFe96 cartridge 的加样口。
c)
图示设计在每块板上检测两名受试者（上、下半板），包含 22 种条件，每种条件设 2 个复孔，并设 4 个背景孔（b）。XFe96 cartridge 共有 384 个加样口（每孔 4 次加样）。我们采用 8 种不同的加样方案，将其分布于 assay-ready 96-well plate 的 12 列和 4 行中（每行对应一次加样）
(b)
。8 种加样方案与 10 种不同底物条件的组合构成了总计 22 种不同条件。
d)
采用上述 22 种条件对单名受试者进行的典型呼吸测定记录（代表 30 名受试者；Wrobel 等，未发表）。A–D 表示 4 次加样口加样，也分别对应
(b)
中加样板的 4 行。数据以均值 ± 标准误（SE）表示；代表性板中 n = 2 个孔。
e)
在指定加样口加样条件下进行时间过程记录所得的 OCR 和 ECAR 曲线（Succ，琥珀酸；括号内标示总浓度）。线粒体最初以谷氨酸（5 mM）+ 苹果酸（5 mM）呼吸；这些底物由底物试剂板加入，时间为基线测定开始前约 20 min。
f)
比较亚最大琥珀酸浓度下孔间（相同 ADE）和板间（不同 ADE 及 XFe96 运行）OCR 的变异。此时读数对加样口加入的琥珀酸量敏感。数据以均值 ± SE 表示，n = 30 名受试者。
g)
由 OCR 和 ECAR 推算的 P/O 随底物混合物中琥珀酸含量的变化。蓝色曲线对应
(e)
中的数据；红色符号表示以琥珀酸（5 mM；含 rotenone，2 µM）为底物时，在磷酸化呼吸过程中计算得到的 P/O。
h)
丙酮酸（5 mM）+ 苹果酸（1 mM）条件下由 OCR 和 ECAR 推算的 P/O，或
棕榈酰肉碱（15 µM，ADE由DMSO储备液配制）+ 苹果酸（1 mM）底物条件。*，在n = 21名受试者中通过配对t检验得到p < 0.05。
i) 在存在所示底物的条件下，AzB（3.5 µM）、MIC（10 µM、20 µM）和UA（20 µM、40 µM）对磷酸化呼吸的影响。森林图显示贝叶斯后验平均处理效应及95%可信区间（CI）；按底物条件分组，并针对受试者重复测量进行校正（通常为2种化合物）；经FDR校正后具有显著性的效应以红色显示。按照所示处理顺序，受试者数量分别为n = 5、4、5、7和6。
j) 在棕榈酰肉碱（12 µM）、苹果酸（0.78 mM）和丙酮酸（0.49 mM）条件下，存在UA（20 µM、40 µM）和MIC（10 µM、20 µM）时，由OCR和ECAR推导的P/O，表示为同一受试者未经处理条件下数值的百分比。
由于新鲜分离的线粒体存活能力有限，使用Agilent Seahorse细胞外通量分析仪进行的呼吸测定对时间极为敏感，并且涉及对96个检测孔和384个加样端口孔进行大量液体操作（图3a-b）。
因此，当实验布局过于复杂时，复杂设计的常规运行具有较大挑战性，并且容易发生人为错误。我们证明，ADE能够对人骨骼肌线粒体进行复杂的生物能量表型分析：在每个检测板中，针对两名受试者的线粒体制备物，分别在22种不同的时间进程范式下测定氧消耗率（OCR）（图3c、d）。相比之下，经典的偶联实验（或呼吸控制实验）和电子流实验通常各自仅采用一种时间进程记录范式^18。
此处所示实验均在活检后六小时内完成，包括线粒体分离和检测孔加样。
板和加样筒。为适应这一时间要求，我们设计并部分采用 ADE 加样制备了可直接用于检测的“试剂盒”板（图 3b）。为评估这一流程，我们采用呼吸底物琥珀酸进行剂量-反应实验；该实验是图 3d 所示 22 条曲线之一，也以 30 名受试者的平均值呈现于图 3e（OCR 曲线）。在亚最大琥珀酸刺激条件下，我们根据分别进行的 ADE 加样实验计算了孔间和板间变异（图 3f）。板间变异（涉及独立的 ADE 加样）并未显著高于孔间变异。
上述采用 ADE 制备可直接用于检测的试剂盒的方法，将 Seahorse 线粒体呼吸测定从低通量手动流程转变为可重复的当日多重表型分析平台。下文将利用实验通量的提升，以一种新颖的方式分析基于通量计算的指标。
P/O 的测量可用于追踪底物氧化途径
P/O 比描述了氧化磷酸化（OXPHOS）的化学计量关系，即每消耗一个氧原子合成的 ATP 分子数。在分离的线粒体中，该比值可用于追踪底物氧化途径¹⁹。P/O 是一种经典的呼吸测定指标，其计算依据是追踪有限量外加 ADP 的磷酸化过程；然而，由于难以在基于微孔板的呼吸测定中追踪这种有限量的底物刺激，至今仍缺乏高通量检测方法。
因此，我们在此采用一种新颖的基于通量的方法，利用 Seahorse XF 分析仪测得的耦联 OCR 和细胞外酸化率（ECAR）数据，计算分离线粒体的 P/O 比。之所以能够进行这一计算，是因为 ADP 的磷酸化会导致净碱化。为证明这一点，我们采用上述实验范式，以 ADE 逐级加样的琥珀酸
此外，还捕获到了底物从复合体 I 驱动的谷氨酸 + 苹果酸呼吸向复合体 II 驱动的琥珀酸氧化的转换（图 3e、g）。随着琥珀酸对呼吸作用的驱动逐渐增强，P/O 值从复合体 I 的理论值（2.46^20）下降至较低的复合体 II 理论值（1.64^20；图 3g 和表 S1）。与理论值之间的小幅偏差可能源于 Seahorse XF 分析仪绝对标度所造成的已知局限^21,22。丙酮酸 + 苹果酸和棕榈酰肉碱 + 苹果酸产生了显著不同的 P/O 值，从而能够追踪底物转换（图 3h）。由碱化作用推导出的 P/O 值在计入 TCA 循环相关的酸生成后高于预期（表 S1），这与既往研究结果一致^23。我们的方法所提供的更高通量，未来可用于针对这一差异开展机制研究。作为对高数据密度呼吸测定和微孔板规模 P/O 读出的实际检验，我们分析了下述三种与衰老干预相关的小分子的作用。
尿石素 A 和诱导线粒体自噬的香豆素（MIC）不存在直接的急性生物能效应
尿石素 A（UA）作为一种线粒体质量控制增强剂，已得到广泛研究；在人类中进行长期治疗后，可检测到其对线粒体生物标志物的影响以及对肌肉骨骼功能结局的改善^24,25。尽管目前最有力支持的 UA 作用机制是通过激活 PINK-1 通路增强线粒体自噬^26，但据我们所知，尚无研究报道其在人类分离线粒体中的直接作用。利用上述方法，我们检测了 UA 以及近期报道的诱导线粒体自噬的香豆素（MIC）^27 对来自 30 名人类受试者的肌肉线粒体所产生的直接急性作用（图 3i）。 To
为此，我们使用 PickliPy.Assay 将 MIC、UA 和 Azure B（作为阳性对照的具有氧化还原活性的亚甲蓝衍生物^28）储备液均匀分配至额外的储存板中，并将“底物试剂盒”中的培养基手动转移至这些孔中，随后再加满检测板。预处理 30 min 后，UA（20、40 µM）和 MIC（10、20 µM）均未影响人骨骼肌线粒体中由复合体 I 或复合体 II 驱动的呼吸。相比之下，Azure B（3.5 µM）强烈抑制了由纯化的复合体 I 或复合体 II 介导的呼吸，但未抑制以苹果酸 + 丙酮酸为底物时的呼吸。在后一种底物组合中，生成 NADPH 的三羧酸循环反应可能为抗氧化防御提供支持，从而抵消 Azure B 的促氧化作用。据报道，经过 24 h 处理后，UA 可提高分化的 C2C12 肌管中由脂肪酸氧化驱动的 OCR^26，并改变与 β-氧化相关的基因表达特征^29。与这些较长期的完整细胞效应一致，我们发现 UA 对分离的人骨骼肌线粒体没有急性直接作用，包括混合底物（丙酮酸 + 棕榈酰肉碱）的 P/O 比值在内（图 3j）。在建立了采用 ADE 制备的分离线粒体 Seahorse 检测方法后，我们进一步拓展了 PickliPy 在活细胞延时荧光显微成像中的应用。
应用 2：采用 ADE 制备的储存板拓展活细胞膜电位检测
来自尸检供体的人分散胰岛细胞用于功能检测的原代培养时间窗口有限（约 10 天）^30。在此，我们旨在通过基于微孔板的多重检测（图 4a），最大限度地增加检测条件的数量，用于线粒体膜电位和质膜电位（ΔψM 和 ΔψP）的荧光延时显微成像^31,^32。
为了用葡萄糖以及添加的生物能量学或代谢调节剂对细胞培养物进行处理，我们设计了一种部分96孔板范式，在整个时间进程中包含多个手动多通道移液步骤
32
。为尽量减少添加的载体体积，我们使用基于Excel的计算表
32
来制备储液微孔板（
图4c
），其中装有过量的2×浓度处理液，并在时间进程记录期间手动将其加入检测板中（
图4d
）。这些储液板的手动制备过程耗时且具有挑战性，因为需要移取体积较小且准确度有限的液体。在此，我们介绍了一种改进的储液板制备方法，即使用通过ADE分配的检测即用板（
图4b
）。活细胞延时实验仍采用手动方式完成。为此，我们创建了PickliPy.BlueTable，这是PickliPy.Assay的专用版本，可根据上述计算工作表生成检测即用板。
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图4
检测即用板支持在荧光显微镜时间进程记录期间对微孔板进行手动液体处理。
a）
人原代胰岛细胞培养物的检测时间窗口有限。图中显示的是分散前的完整胰岛。
b）
使用PickliPy.BlueTable通过ADE分配检测即用板，随后在将其转移至
c）
检测储液板之前，用检测培养基将其溶解。
d）
对培养物进行荧光显微镜观察，并在处理和调节过程中手动更换孔内一半的内容物。
e）
具有代表性的18条件时间进程记录（采用ADE进行的91次实验之一）。数据表示每孔2个视野重复的均值±标准误（SE）。
f）
在不含BSA或FBS的条件下，100 nM和300 nM FCCP在胰腺β细胞中诱导的ΔψM去极化，其中 the
在 16 mM 葡萄糖存在的条件下，显示了来自 24 名受试者的独立记录数据。受试者 1–12 的样本采用 FCCP 手动稀释进行检测，而受试者 13–24 的样本则采用 ADE，并使用图（b–c）所示的工作流程进行检测。
g)
采用贝叶斯多变量线性回归分析影响 100 nM FCCP 所诱导的 ΔψM 去极化幅度的因素。
h)
按分配方式分别进行回归分析，研究 ΔψM⁻¹ 与 FCCP 浓度 ∼ R_FCCP⁻¹ 之间的关系。数据点表示每种分配方式下所有受试者的均值 ± SE，n = 12 和 12。插图：线粒体的简化电学模型。欧姆定律决定了 R⁻¹ 与 ΔψM⁻¹ 之间存在线性关系。
i)
对与 h）中所示平均拟合相对应的每位受试者拟合结果的 p 值进行分析。
j)
在 16 mM 葡萄糖存在的条件下，比较年轻受试者（30–47 岁；n = 10）与老年受试者（52–64 岁；n = 10）胰腺 β 细胞中由 SDH 抑制剂 Atpenin A5 触发的 ΔψM 去极化剂量–反应曲线。数据点表示均值 ± SE；图中显示平均拟合曲线。
k)
比较年轻受试者与老年受试者个体拟合结果的 EC₅₀ 值，对应于 j）。数据点代表受试者。
l)
比较采用手动分配与 ADE 分配进行的实验之间的拟合残差。
m–o)
采用贝叶斯多变量线性回归分析影响 j）中每位受试者拟合指标变化的因素：
m)
曲线下面积（AUC）；
n)
EC₅₀ 值（对应于 k））；
o)
拟合残差（对应于 k））。*，与 Welch 检验比较，p < 0.05。
采用 ADE 生成的储液板，在人胰腺 β 细胞中进行 18 孔、两次加样的 ΔψM 时间进程记录（图 4e）。我们通过分析去极化来检验在队列研究中递送生物能量调节剂的重复性。
通过亚最大剂量的100和300 nM FCCP添加所测得的ΔψM（图4f；取自与图4e所示实验类似的实验中的一个检测条件）。图4f中的数据采集历时8年，前4年采用手动加样，后4年采用ADE加样。手动方法包括为每种浓度分别配制稀释储备液，而ADE则将单一的高浓度化合物储备液以DMSO回填后进行加样（总体积为100 nL）。尽管不同受试者之间的效应量存在差异，但在控制临床协变量和显微镜设置后，效应量与加样方式（手动加样或ADE）并无关联（图4g）。为评估剂量-反应加样性能，将-1/ΔψM绘制为FCCP浓度的函数。根据欧姆定律，二者应呈线性关系（图4h）。与手动加样的反应相比，ADE加样的FCCP剂量-反应曲线往往更接近预期的线性关系（图4i）。在微尺度剂量-反应测定中获得的这一技术优势，随后被进一步用于探究人类供体的生物学特征如何改变ΔψM的调控。
ADE提高剂量-反应精度并揭示β细胞中与年龄相关的SDH调控变化
琥珀酸脱氢酶（SDH）是电子传递链（ETC）的组成部分；从热力学角度看，其产生较高质子驱动力的能力高于复合体I^33，且其活性是胰岛素分泌所必需的^34。与年龄相关的线粒体呼吸功能变化及复合体II相关表型似乎具有组织特异性：在人肝线粒体中已有功能下降的报道^35；在肌肉中，由于运动影响，相关研究结果存在矛盾^36；而在心脏中则未观察到变化^37。采用上述方法，我们在胰腺β细胞中记录了SDH抑制剂Atpenin A5诱导线粒体去极化的4点剂量-反应曲线，以探究 თითქ
探究了年龄介于30–64岁受试者之间的动力学差异（图4j）。供体年龄越大，Atpenin A5剂量-反应曲线下面积（AUC）越小，这与SDH抑制剂诱导去极化效应减弱相一致（图4m）。2型糖尿病（T2D）状态以及手动分配与ADE分配等技术变量均与该结果无关。这一差异源于Atpenin A5的IC₅₀升高（图4k,n）。为评估分配效果，我们比较了手动分配与ADE分配的Hill方程拟合残差。ADE显著改善了拟合效果（图4l,o），表明其对中间稀释液的分配准确性优于手动分配。总之，Atpenin A5的剂量-反应分析显示，老年人供体的β细胞在SDH受到抑制时去极化程度较低，提示SDH动力学或ΔψM调控可能存在年龄相关性变化。在完成这些针对性、适用于检测的工作流程后，我们进一步在探索性线粒体表型分析工作流程中测试了PickliPy.Screen。
应用3：采用文库重排的三剂量线粒体形态-功能筛选
高内涵线粒体表型分析已成为化合物谱分析和作用机制发现的有效策略。近期研究结合了线粒体形态、膜电位、pH依赖性线粒体自噬报告系统以及形态组学特征提取，用于对线粒体扰动进行分类、推断药物作用机制或鉴定线粒体调节剂⁽³⁸⁻⁴⁰⁾。然而，这些研究主要评估图像分析或机器学习的性能，而对实际支持筛选实施的参数鲜有报道。因此，我们采用线粒体表型分析并非开展主要的命中物筛选，而是将其作为PickliPy.Screen及基于ADE的一个具有较高生物学要求的基准测试。
文库重排、活细胞成像流程以及下游线粒体图像分析。
为将线粒体形态与活细胞功能读数相结合，我们构建了稳定且均一表达线粒体靶向低亲和力 ATP 传感器 AT1.03（mito-ATeam）的 HEK293 细胞（图 5a–c）。采用无需洗涤的药物处理、培养和活细胞荧光显微成像模式，我们建立了一种用于筛查小分子对线粒体生物能量学和形态学广泛影响的筛选体系。该体系可作为预筛选，用于选择化合物浓度、识别线粒体相关风险，并利用 PickliPy 界定用于更复杂后续筛选的化合物子集；或者，如下文所示，该体系也可作为一种灵敏的线粒体表型分析平台。将文库化合物从 4 块源板重新排布至 13 块目的检测板中，每种化合物设置 3 个终浓度（1、3 和 10 µM），并在每块板中加入阳性对照和溶剂对照（图 5d、e）。从 4 块源板向 13 块目的板进行分液的过程由单个加样列表控制。培养 48 h 后，通过预定程序由机器人将含有活细胞的微孔板从组织培养箱装载至显微镜的环境控制记录室中，随后进行成像（图 5f 和图 S5a–c）。接下来，我们通过分析筛选中所包含的对照，对这一由设计至加样列表协同控制的流程进行了压力测试。
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图 5
利用 PickliPy.Screen 对线粒体 [ATP] 和形态调节剂进行小分子文库筛选：每块板采用重新排布设计并设置 3 个剂量。
a)
mito-ATeam 检测线粒体基质中的 ATP 水平。
b)
用于筛选的 HEK-mAT1.03 细胞典型融合培养状态，以强度调制的彩争霸
荧光比值图像。N，细胞核；MF，线粒自噬。
c) 拼接后的（4×4 个图块）典型视野，显示 mito-ATeam 强度的均一表达；图像按 384 孔板的孔尺寸比例显示。
d) 源板和
e) 目标板在 ADE 过程中的移动，显示第一个化合物库和第一块细胞培养板（DST #1）。红框表示被分配至 DST #1 的化合物库孔，以及目标板中使用的三种剂量。
f) 加药和铺板的时间安排。为维持环境条件，PFlex 机器人在培养箱与 Echo 650 或 Operetta CLS 之间转移板。
g) 线粒体形态（彩色片段；采用形态学分割）和细胞形状（彩色轮廓）的分析。代表性图像，与 (b) 相对应。
h) 通过计算视觉上连续的线粒体中荧光强度的比值，分析基质 [ATP] 的细胞内异质性。伪彩色编码定义见 (a)。
i) 阳性对照中的基质 [ATP]，以载体处理孔进行归一化。数据点为汇总自所有板的各孔数据。****，Kruskal-Wallis 多重比较检验，p < 0.0001。
j) 对照孔中孔间和板间基质 [ATP] 变异的比较。数据点代表各块板；板间变异以单个数据点表示。
k) 在所示条件下，使用重新训练的网络权重进行 MoDL 分割（绿色；使用原始权重的结果见图 S5e）和形态学分割（紫色）得到的 mito-ATeam 荧光图像（上）及叠加图像（下）。
l) 与使用预训练权重相比，使用数据集内重新训练的网络权重的 MoDL 与无偏形态学分割结果具有更加一致的重叠，这一点由单峰直方图（蓝色）所表明，该直方图的
形态学分割与 MoDL 分割结果的交并比，计算方法如
(k)
所示。
m)
使用 MoDL 分割进行线粒体形态组学分析。上排从左至右：mito-ATeam 荧光图像；经重新训练的 MoDL 对概率图进行分水岭分割后获得的分割图像；骨架化分割结果；距离图，其中像素值按照其到最近背景像素的距离计算。下排从左至右：根据分割区域的面积（A）和周长（P）计算纤维长度；以骨架为掩膜的距离图（叠加显示：分割区域的周长）；根据距离值的归一化共享熵进行着色的线粒体骨架（较低的数值表示线粒体厚度变化更大）；根据最佳拟合椭圆计算的偏心率。
n)
使用
(m)
中所示指标进行筛选的稳健 MAD Z′ 因子，将阳性对照与 DMSO 进行比较；从左至右分别对应三种图像分析流程：形态学分割、使用原始网络权重的 MoDL，以及使用数据集内重新训练网络权重的 MoDL。除图 S5f 中的相应分析外，所有 MoDL 分析均对概率图进行了后处理。
o-p)
方差层级分解，用于区分细胞间变异和细胞内变异对总视野级方差的贡献（堆叠柱状图；数据点），分别针对
(o)
ATeam FRET 比值和
(p)
线粒体纤维长度进行分析（偏心率分析见图 S5g）。数据来自 DMSO（1:1000，v/v）、FCCP + Olgm（寡霉素；4 µM + 2 µg/mL）、Myxo + Olgm（4 µM + 2 µg/mL）和 CCCP（10 µM）处理条件下的 56、30、30 和 31 个孔，这些孔汇总自 13 块微孔板；质量控制时排除了细胞数少于 100 个的孔。
线粒体基质 [ATP] 敏感地反映生物能量学调节
线粒体基质 [ATP]】【。
在线粒体和细胞分割后进行定量分析，并将分析范围限定于聚焦细胞内的线粒体区域（图 5g、h）。作为强生物能量学扰动对照，我们单独使用 CCCP，并将 FCCP 或复合体 III 抑制剂 myxothiazol 分别与 ATP 合酶抑制剂 oligomycin 联用，以阻止线粒体水解糖酵解产生的 ATP。这些对照处理液取自每块文库来源板中所包含的孔（图 5d）。这些强呼吸作用扰动对照使经 DMSO 归一化的孔水平 mito-ATeam FRET 比值发生了高度显著的变化（图 5i），但出人意料的是，却提高了基质中的 [ATP] 浓度。这一结果是预期之中的，因为基质 ATP 浓度并不是氧化磷酸化 ATP 合成的直接替代指标。相反，基质腺嘌呤核苷酸的比例受具有电生性的腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）调控；ANT 通常促进 ATP 输出和 ADP 输入，从而使基质 ATP/ADP 比值低于胞质中的相应比值。在高度糖酵解的 HEK293 细胞中，这种现象与线粒体去极化过程中 ANT 介导的胞质与基质腺嘌呤核苷酸平衡相一致 41，也与糖酵解产生的 ATP 能够在高度糖酵解细胞中维持基质 ATP 的可能性相一致 42。
为对 ADE 进行基准评估，我们分析了板间变异，结果显示其不超过板内孔间变异（图 5j），这表明预定的时间安排和环境控制限制了系统性的板内位置效应和板序效应。阳性对照反应在预期的 90 个孔中被检测到；然而，有 2 至 3 个 CCCP 对照孔因未知原因未产生预期结果，且没有记录到分液错误。
因此，mito-ATeam 检测到了预期的生物能量学翻译 unerquicklich
整个筛选过程中，各扰动的效应均未超出板内变异范围，支持将基质 ATP 作为一种灵敏的功能终点。由于该终点依赖于准确的线粒体分割，接下来我们利用上述数据优化相关图像分析方法。
预训练深度学习分割模型可能受到筛选诱导的生物学变化影响，通过在数据集内重新训练可提升其性能
深度学习已提升荧光显微成像中的线粒体分割效果，近期还可根据形态预测线粒体功能状态
43
,
44
。MitoSegNet 基于多种线粒体表型进行训练
45
，MoDL 则在此基础上进行了扩展和更新
43
。重要的是，预训练模型会编码其训练数据中的细胞类型、探针行为、分辨率、标注风格和表型分布。因此，必须针对筛选所产生的特定生物学变化，评估这些模型在高通量筛选（HTS）中的表现。
在此，我们利用上述数据评估了两种分割方法的表现：一种是我们先前设计的方法，结合空间滤波与基于形态学的分割，以线粒体半峰强度轮廓进行定量测量
31
；另一种是 U-RNet+ 架构 MoDL
43
，其线粒体轮廓分割风格反映了 15 位生物学家对健康细胞的标注。我们使用溶剂对照和阳性对照条件比较了这两种分析方法（
图 5k
和图 S5d）。
阳性对照导致严重的线粒体损伤，并引发大量碎片化。在这些条件下，传统形态学分割方法与预训练 MoDL 模型的结果出现分歧：预训练网络漏检了有害对照处理所产生的大量点状线粒体（图 S5d 箭头所示）。这一差异反映在一个五月婷婷
两种分割结果之间的交并比值呈双峰分布（图 5l）。因此，我们使用 445 张车辆对照图像和阳性对照图像，以及通过算法生成并经目视质量控制的真实值掩膜（图 S5e），重新训练了原始的 MoDL 权重。针对数据集进行的再训练提高了形态学分割方法与深度学习方法在对照状态和受损状态下的掩膜重叠度（图 5l），表明由生物学因素诱导的分布外形态可能导致分割偏差，而通过在实验内进行适度再训练可以缓解这种偏差。
为确定图像分割性能的改善是否能够转化为更好的筛选性能，我们基于不同的测量原理，对四类终点指标进行了基准评估：基于周长和面积推算的纤维长度、基于主成分分析（PCA）的偏心率、基于骨架化得到的厚度不规则性指标（该指标计算为目标边界距离的熵）（图 5m），以及在分割得到的线粒体区域上测量的 mito-ATeam FRET 比值统计量（图 5h）。与使用预训练的 MoDL 权重或传统形态学分割相比，在数据集内对照样本上重新训练 MoDL 后，我们观察到性能显著提升（图 5n 和图 S5f）。
线粒体基质中的 [ATP] 在细胞之间存在差异，而形态主要受细胞内异质性支配
再训练后的工作流程分析了均一 HEK293 培养物中 92,000 个细胞、148 个孔内的 530 万个线粒体轮廓。我们采用层级方差分解方法，确定变异性主要源于细胞之间，还是源于同一细胞内不同线粒体轮廓之间。mito-ATeam FRET 比值的方差同时包含细胞间成分和细胞内成分（图】【。
），而纤维长度和偏心率方差则主要由细胞内异质性解释（图5p和图S5g）。有害的生物能量扰动增加了基质中[ATP]的异质性，但使线粒体形态更加均一，这与原本具有异质性的线粒体网络塌缩为形态更为一致、但受到均一损伤的碎片化状态相一致。
这些结果（另见图5n中上述基准结果）表明，除群体平均强度或形态的变化之外，异质性本身也可以作为筛选终点。所观察到的细胞间基质中[ATP]变异性进一步表明，线粒体高内涵筛选应针对所采样的细胞数量和视野数量优化图像采集，而不应依赖可能低估异质性细胞反应的小视野，即使是在HEK293这类均一细胞系中也是如此。以下最后一个应用利用细胞间异质性来表征化合物对线粒体生物学的影响。
应用4：采用ADE分液的剂量反应揭示具有剂量范围特异性的线粒体形态—功能效应
为展示筛选后的后续验证流程，我们使用PickliPy.Screen为原始化合物库的一个子集及对照组制备了一个挑选式子板，其中包括在同一块板上对化合物进行的一次中间梯度稀释（图6a）。随后，在一个独立的实验流程中，我们采用了如图1e-h所示的9点剂量反应布局，保持DMSO浓度恒定，并对重复样本进行随机化排列。利用图5f-h、m所示的检测方法，我们分析了一组从原始筛选中根据其诱导的显著表型而选出的化合物。
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图6
使用PickliPy.Screen进行剂量反应实验揭示了
HEK293细胞线粒体中的形态-功能耦合。
a)
使用经过筛选的LIB表，将感兴趣的化合物从原始文库板中以ADE方式分配至一块子代板中，并采用两种体积以实现一次中间稀释（DMSO由人工加入）。随后，按照图1e-h所示，使用修改后的LIB表分配剂量-反应系列，并对mito-ATeam HEK293细胞进行48 h培养。
b)
经处理的图像显示了线粒体骨架，其颜色根据距离值的归一化共享熵进行标记（较低的数值表示线粒体厚度变化更大）。轮廓线表示线粒体片段的周长。各图像帧对应于下方寡霉素存在条件下FCCP剂量-反应实验中的数据点。
c)
剂量-反应关系显示了随机化布局的n = 3个平板重复实验的均值 ± SE。实验在寡霉素（2 µg/mL）和10% FBS存在条件下进行FCCP滴定。灰色阴影区域表示DMSO对照组（中位数 ± MAD，n = 66）；对于FCCP滴定实验，DMSO + Olgm（寡霉素；n = 6）对照组以蓝色显示。
d)
功能-形态效应空间轨迹。每个点表示配对孔的平均效应，并根据与其匹配的平板DMSO对照进行标准化。连接各点的线表示浓度逐渐升高，从而在功能-形态空间中形成剂量依赖性路径。不同的轨迹表明，在不同扰动条件下，线粒体长度并非简单地随ATeam FRET比值变化；相反，功能表型与形态表型之间的关系会随化合物及其剂量范围的不同而变化。
e)
ATeam FRET比值与骨架长度的剂量-反应协同响应层级。各行总结了每种化合物在全剂量范围内，以及根据优化断点定义的高浓度和低浓度区间内的结果。各列显示了用于评估……的证据。
分类形态-功能耦联。黑色轮廓表示被接受的门限。二元终点以对勾标记。单斜率适配性，指单一直线斜率是否能够充分拟合；板间一致性，指三块板中至少两块板的斜率符号是否一致；Fieller有界性，指斜率比置信区间是否有界，并在区间完全位于零以上或零以下时显示其符号。形态/[ATP]局部斜率比的Fieller区间完全位于零以上（以“+”表示），表明剂量依赖性下降的基质[ATP]与线粒体缩短相关。“结论”列报告层级：L1，单终点或解耦反应；L2，与剂量相关的协同反应；L3，成比例的局部耦联。细胞水平耦联定义为化合物对同一孔内功能读数与形态学终点之间关联的影响，其方向表示药物使该相关性的斜率增加还是降低。反应和耦联均以- log
10
q值表示，最大截断值为5（其他形态学指标见图S7）。
OXPHOS解耦导致双相性的功能和形态变化
初筛显示，该化合物库中的化合物具有不同的剂量-反应特征，其中包括解耦剂的双相性反应（图S6a）。因此，我们评估了在持续存在寡霉素的条件下，解耦剂FCCP、解耦剂及AMPK激活剂COH-SR4
46
，以及双胍类AMPK激活剂2（文献
47
中的化合物7a）的9点剂量反应。低浓度FCCP可部分逆转寡霉素导致的线粒体碎片化效应，并降低基质ATP水平（
图6b-c
）。然而，在高于1.5 µM时，可能在ΔψM发生崩溃的浓度范围内，线粒体变得更加碎片化，并且
线粒体基质 ATP 增加。这与 ATP 合成和 ANT 对线粒体去极化具有不同敏感性的现象相一致
41
。COH-SR4（不含寡霉素）的 ATP 动力学表现类似解偶联剂，但在低剂量下会引起线粒体碎片化效应（
图 6c
）。AMPK Activator 2 在低剂量下具有降低 ATP 的作用，而对形态的影响在较高剂量时更明显。相比之下，复合物 I 抑制剂二氢鱼藤酮仅导致 ATP 轻度下降和线粒体缩短。值得注意的是，尽管 MIC 不会急性、直接地影响线粒体（
图 3i
），但处理 48 h 后，线粒体 FRET 随剂量增加而下降；UA 在最高 30 µM 时未产生一致影响，而在 50–100 µM 时会使线粒体略微延长（图 S6b）。ATeam 对 pH 敏感，因此，ATeam FRET 比值观察到的部分较大幅度下降，可能是 48 h 处理期间糖酵解上调和培养基酸化所致。这些不同效应促使我们明确分析形态与功能是否存在定量耦联。
剂量范围特异性的形态—功能耦联
线粒体功能与线粒体形态之间的关系一直是一个重要问题。在此，精确的 ADE 剂量—反应记录使我们能够将配对的高内涵成像功能表型与形态表型归纳为一个反应层级，从而明确结构—功能关系的论断。该层级根据药物浓度递增时的孔内平均反应，划分为三个严格程度逐级提高的层次：
L1，单一终点或解离反应，即只有一个指标发生变化；
L2，与剂量相关的协同反应；以及
L3，比例耦联，即可根据一个指标预测另一个指标。功能—形态空间中的剂量—反应轨迹遵循
呈现出不同的轨迹，表明结构–功能关系随扰动方式和剂量范围而变化（图6d），而层级分析对此进行了量化（图6e）。
在3–10 µM的AMPK激活剂2、15–100 µM的MIC以及0.09–0.3 µM的二氢鱼藤酮处理下，线粒体基质[ATP]随剂量增加而降低，并与线粒体缩短相关（L3；Fieller +；图6e）。在预计会发生生物能量崩溃的1.5–10 µM高剂量范围内，FCCP的作用表现出形态–功能关联，但以线粒体长度衡量时，该关联为非线性（L2）。然而，在这一剂量范围内，基质[ATP]与厚度熵呈比例耦合（L3；图S7）。有趣的是，对于FCCP以及另一种已知解偶联剂COH-SR4（在其整个剂量范围内），[ATP]–形态关系发生了反转。在这些情况下，[ATP]升高与线粒体缩短相关（Fieller −；图6e）。在细胞水平，DMSO孔内的ATeam FRET比值与骨架长度呈正相关（基于66个DMSO孔、按孔聚类的BH q = 7.7×10⁻⁹）。因此，基质[ATP]相对较高的细胞具有更长的线粒体。由于细胞间异质性增加（图S7c），COH-SR4显著增强了这一关联（图6e）。
总体而言，ADE实现了精准分液，并支持对剂量–反应实验布局进行复杂的随机化，而不受人为误差的影响。这些优势共同支持了剂量分辨的形态–功能分析，表明线粒体延长与较高的基质[ATP]相关，但高浓度解偶联剂引发生物能量崩溃的情况除外。
讨论
将ADE与PickliPy提供的灵活控制相结合，改变了我们设计和开展台式规模实验的方式
以及高通量筛选。实验操作中最显著的效益来自使用检测预备板处理微孔板中的细胞培养物，这提高了数据密度，并改善了重复样本间的一致性。许多涉及活体样本的常规检测具有时间敏感性，且依赖于尚未整合到自动化工作流程中的专用仪器。相比之下，集成式机器人工作站通常设于核心设施，由专业人员操作，较难按照复杂检测所要求的精确起始时间进行排程。检测预备板衔接了这两种工作流程：既支持集中式、可编程的制备，又保留了实验台旁执行操作的灵活性。如本文所示，一个重要应用是队列研究中的常规检测，其中定制的检测预备板能够并行检测的条件数量，远超手动移液在实际操作中可实现的范围。
对于高通量筛选，我们着重于在缺乏信息管理后端的情况下提供检测设计工具。我们描述了一种耗材成本低、无需洗涤的筛选方法，可先于成本更高、操作更繁琐的免疫细胞化学检测开展；后者利用缩小范围后的化合物库，以各化合物的优化浓度检测特定生物学过程，并借助 PickliPy.Screen 的候选化合物筛选与加样功能。我们的方法在此前已验证的形态学表型空间分析⁴³,⁴⁴,⁴⁸的基础上拓展了功能性维度，并在此证明，现代人工智能工具和复杂的下游分析可以大规模应用。
本文的一大主题是在队列研究和筛选场景中，大规模提升生物能量学分析的深度。迄今为止，已发现少数以线粒体为干预靶点的候选小分子，旨在缓解疾病或
与年龄相关的衰退，包括 UA²⁴ 和 MIC²⁷。鉴于这些干预措施的作用机制通常尚不明确，我们的生物能量学工具集可直接用于理解现有的线粒体功能增强剂，并筛选新型增强剂。这需要拓展用于评估线粒体功能的指标。其中一项指标是观测变量（如线粒体基质 [ATP]）在细胞和亚细胞水平上的异质性。代谢应激往往会增加线粒体的异质性。然而，异质性并不一定有害，细胞可以维持代谢特征不同的线粒体亚群，以满足不同的功能需求⁴⁹。因此，药物处理后细胞内 mito-ATeam 分布的展宽，可能反映了处于应激状态或发挥代偿作用的线粒体亚群的出现。
我们这些方法的另一个共同特点是采用精确的剂量–反应测定；在小体积测定体系中，使用 ADE 进行此类测定比手动移液更为准确。这使我们能够在高通量筛选背景下，设计并应用关联线粒体形态–功能指标的剂量–反应共响应层次分析，为探索线粒体生物学的机制提供了一套新工具。
总之，本文提出的实验设计框架（PickliPy）为基于 ADE 的工作流程中的常见瓶颈提供了一种模块化且易于使用的解决方案，并支持在实验室台式实验和高通量筛选环境中提高可重复性与数据完整性的更广泛努力。由此提高的数据密度与现代数据分析工具相结合，使研究方法比传统实验室台式实验更为灵敏和全面。
作者贡献
概念构思：AAG、VMK。人体肌肉研究临床
研究构思：JCN、BJS。呼吸测定与胰腺β细胞研究构思：AAG。线粒体筛选构思：AAG、VMK和JKA。研究实施与数据分析：VMK、SAW、CAL、VMD、EBS、ISB、HC、ST、JB、SG、SS、CS、ADC、SVA、WG、AAG。经费获取：LME、GL、JKA。研究监督：JCN、BJS、SM、GL、LME、JKA、AAG。项目管理：LME、GL、AAG。初稿撰写：AAG、VMK、SAW、VMD。审阅与编辑：AAG、LME、JKA、VMK、SAW、VMD。
在线方法
系统配置
PickliPy在置于高效空气微粒（HEPA）过滤罩内的Revvity Explorer G3机器人工作站（Revvity，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）上开发并完成验证。该工作站集成了微孔板存储、液体处理和成像组件，各组件通过沿直线导轨移动的Plate::Handler™ Flex（PFlex）机械臂连接。微孔板存储设备包括一台Liconic STX44自动化培养箱（LiCONiC AG，列支敦士登毛伦）和一个具有63个位置的随机存取架。实验耗材处理设备包括Azenta 4AS封板机和XPeel揭膜机（Azenta，美国马萨诸塞州伯灵顿），以及Agilent VSpin离心机（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。液体处理由三个互补系统完成：Echo 650声波分液器（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州布雷亚）、配备单模块珀尔帖加热/冷却装置CPAC Ultraflat（部件号7000190；Inheco GmbH，德国马丁斯里德）的JANUS（Revvity）液体处理工作站，以及MultiFlo FX（Agilent）批量分液器。高内涵成像采用Revvity Operetta CLS转盘式共聚焦显微镜完成。所有仪器均由Revvity Plate::Works™调度软件（6.30版）统一协调，该软件与Echo Client Utility软件（3.2.3版）对接。配套信息技术基础设施包括两台配备消费级GPU的图像分析工作站，以及一个集中式
文件服务器。未使用实验室信息管理系统（LIMS），也未使用其他集中式高通量筛选专用软件或服务。化合物库数据使用 Microsoft Excel 处理。未使用工作单元内或 Echo 650 中的条形码读取器。下文所述条形码是指通过程序分配给微孔板的标签，用于从移液清单设计到元数据与分析结果合并的全过程中追踪每块微孔板。所有展示的实验均使用上述工作单元，且仅通过 Plate::Works™ 实现完全集成。单次实验中涉及多个源板和目标板的所有分液操作均由 PickliPy 汇总为一份移液清单，调度软件则在需要时自动切换分液器中的微孔板。
材料
Echo 650 使用经 Echo® 认证的 384 孔聚丙烯 2.0（384PP）微孔板或环烯烃共聚物低死体积（384LDV）微孔板作为源板。采用 96 孔 V 型底聚丙烯板（Corning #3363）作为可直接用于测定的储存板。其余所有声波液滴喷射（ADE）操作均以 384 孔玻璃底板（Cellvis #P384-1.5H-N）为目标板。分散的人胰腺 β 细胞的手工培养使用 96 孔半面积玻璃底板（Corning #4580）。小分子化合物库购自 TargetMol，为线粒体靶向化合物库 950（#L5300）；并补充加入了研究关注的化合物（包括本文报道的 MIC 和 UA）。其他试剂购自 Sigma、Fisher 和 Cayman Chemicals。HEK293FT 细胞购自 ATCC。质粒构建体 pcDNA3.1-mito-AT1.03 由大阪大学 Hiroyuki Noji 惠赠。所用 Matrigel 为经人胚胎干细胞（hESC）培养验证、不含乳酸脱氢酶升高病毒（LDEV）的基质（Corning #354277）。
移液清单与元数据
移液清单是遵循 Echo 650 规范的表格数据文件
声学分液器的分液清单，列出实验中所有微孔板各次孔间分液操作及其体积，并以条形码标识各微孔板。库存文件和流程文件均为表格数据文件，专门用于为 Plate::Works™ 定义微孔板的存储位置和处理顺序。PickliPy 生成的元数据记录了计划执行的分液事件，可与分析数据关联。生成的微孔板布局图可复制并粘贴至 Harmony（Revvity）图像采集控制与分析软件中。孔位与化合物的对应关系或合并文件可在 DataWarrior 中并入化合物库数据，也可应用于 Image Analyst MKII（Image Analyst Software，美国加利福尼亚州诺瓦托）中的图像数据集。
PickliPy 的开发
PickliPy 最初使用 Wolfram Research Mathematica 13.3 开发，随后移植至 Python 3.12；截至目前，在各个开发阶段已完成了对 1000 多块目标板的分液。PickliPy 是一款命令行工具，其大部分输入均从单个 Microsoft Excel 格式的设计文件中加载。设计文件包含源板（SRC）、目标板（DST）工作表，以及可选的化合物库（LIB）和目标板黑名单（DST_Blacklist）工作表，也可包含其他计算工作表。脚本逻辑遵循调度软件和声学分液器的功能特性与约束条件。其中一项重要约束是，源板和目标板均须按预定顺序依次使用（由流程文件规定），且微孔板一旦退出处理流程便无法再次使用。Plate::Works 根据条形码筛选分液清单，因此可将所有微孔板的全部分液事件置于同一份分液清单中；当当前微孔板的所有分液指令执行完毕时，Plate::Works 会自动切换微孔板
孔板条形码已完成。声波分液器对孔内最小和最大液体体积存在限制，因此实现了对初始体积和预计用量的精确追踪。Echo 650 仪器可通过手动操作或调度软件发出的测量命令，对源孔进行体积测量。因此，初始体积由用户在 SRC 工作表中提供；此外，若存在 Echo 体积测量文件（*platesurvey.xml），则可自动更新用户输入的数值。源孔中的液体体积可能不足以完成实验。为避免跳过这些分液操作，PickliPy 会根据 SRC 工作表中匹配的化合物名称和储备液浓度，切换至含有相同储备液的另一可用孔（孔合并）。若无可用的备用孔，则会报错。代码通过将转移体积舍入至 2.5 nL 的整数倍（专用于 Echo 650 系列）来确保分液准确性，并标记小体积分液时可能出现的舍入误差，供用户审查。为规避低死体积（LDV）源板单次最大分液体积为 500 nL 的限制，较大体积的分液会自动拆分为多个不超过 500 nL 的分液步骤。该脚本还会优化分液顺序，以使孔板移动路径最短。
DST 工作表的结构用于提供变量值（例如测定孔体积）、孔板布局图和浓度分布图，以及标签定义。用户可在孔板布局图中输入任意标签，并在布局图下方的标签定义列表中，将这些标签与化合物名称及终浓度相关联。在标签列表的连续行中，同一标签可关联多个化合物名称，以实现组合分液。此外，每个孔板布局图单元格
可包含多个标签。SRC 工作表将化合物名称与源板位置、储备液浓度及可用体积相关联。板图及其后的标签列表可在同一工作表中重复出现。如果重复使用相同的移液清单名称，这些内容将合并至同一移液清单中。
分液前验证
在生成移液清单之前，PickliPy 会验证目标布局中的所有化合物标签是否均已在源库存中定义、是否存在重复的源孔定义，以及可用体积是否足以完成所有分液操作。用户需在 SRC 工作表中指定死体积，且该值必须准确反映源板类型，以确保体积预测准确。
随机化
PickliPy.Assay 可选择对分液孔位进行随机化，同时保持布局边界和分区不变，并尽可能增大重复孔之间的距离，避免重复孔相邻。所有生成的元数据均反映最终随机化后的分液位置。
测定移液清单生成器
PickliPy.Assay 支持基于一个或多个包含标签和浓度信息的板图，逐孔控制分液。DST 工作表中的板图允许用户通过以下方式指定化合物及其浓度：1）每个工作表单元格包含一个或多个标签（标签定义化合物储备液及终浓度）；2）每个标签定义包含一种或多种化合物及其相应浓度；或 3）每个单元格包含一个标签，并配合浓度图，以便将浓度设置为数值并使用 Excel 的自动填充或公式功能。在 DST 工作表中，每个板图描述从某一特定源板向一个或多个目标板进行的分液。合并多个板图可实现二维滴定，以及在其他
所添加的化合物，以及从多个源板向单个目标板进行分液。
筛选分液清单生成器
PickliPy.Screen 支持化合物库筛选，具有化合物库重排、添加对照、多剂量分液以及将存在问题的测定孔列入黑名单等功能。该脚本将标准化合物库表（LIB 工作表）中的条目依次填入孔板布局模板，并根据需要使用足够数量的目标板，以完成整个化合物库的分液。用户创建一个目标板模板（DST 工作表），用于定义化合物库中的化合物和对照的分液位置。对照的定义方式与 PickliPy.Assay 类似，即将标签与某种化合物及其浓度关联，并在 SRC 工作表中列出这些对照化合物的名称。相比之下，化合物库中的化合物不通过名称指定，而是使用标签占位符（例如 #1、#2、#3）标记布局位置。这些标签占位符又与化合物名称占位符及其浓度关联，随后由脚本根据化合物库（LIB 工作表）中的内容依次填充。在源工作表（SRC）中，对照被明确列出，并且可选择使用通配符（*）作为板条形码，表示这些化合物在每块源化合物库板上均位于相同的孔位。
化合物库中的化合物通过单个模板行进行定义，该行使用列引用从 LIB 工作表中提取化合物名称、孔位和板条形码。除上述已定义的对照外，该模板行定义了筛选中所有化合物的位置。在 DST 工作表中，通过在布局中重复使用同一标签来设置重复孔；而多剂量设置则通过使用不同标签实现，这些标签对应相同的化合物名称占位符，但在孔板布局下方的标签定义中指定不同浓度。此处，最终的
浓度可引用 LIB 工作表中的某一列，从而使化合物库中的每种化合物均可按各自预先设定的浓度使用。
用于线粒体膜电位测定的移液清单生成器
PickliPy.BlueTable 是 assay 方法的专用版本，用于为我们此前描述的线粒体膜电位测定制备即用型测定板³²。该方法计算分液体积，并匹配电位测定稀释表中定义的孔位布局³²。该表以部分 96 孔板格式中的 3×6 布局列出时间进程实验中的 3 次连续加样，并以终浓度和储备液浓度指定各孔所需的处理条件，包括联合处理。将化合物储备液分配至即用型测定板中，以便采用延续稀释模式，在测定缓冲液中配制 2 倍浓度的加样液；该模式可在连续半量更换测定缓冲液的过程中，使先前加入的处理物保持浓度恒定³²。分液来源为一块经 Echo 认证的“工具库”（源）微孔板，其中根据库存信息手动加入所需化合物。该“工具库”板也用于储存化合物储备液。对 PickliPy.Assay 稀释表所作的修改包括：将库存表（SRC 工作表）分离至另一个文件，并允许定义组合和溶媒。每个设计文件描述一块单独定制的即用型测定板，PickliPy.BlueTable 则将一批此类设计文件转换为一份移液清单。Echo 650 仪器的液面探测功能可在连续批次之间跟踪源板的体积用量。在活细胞实验当天，用户将即用型测定板解冻、离心并去除封膜，溶解
将已分配的试剂溶于测定培养基中，并转移至测定储液槽。
分液后质量控制
Echo 650 为每次操作生成日志文件：分液记录文件记录转移事件，包括目标体积、实际分液体积以及跳过孔位的错误代码；扫描文件则记录测得的孔内液体体积。对于涉及大量微孔板的筛选和实验，手动审查这些日志并不现实。PickliPy.QC 提供图形界面，可扫描 Echo 日志目录中的近期 XML 文件，显示提取的微孔板条形码以供识别，并支持对选定文件进行批量处理。对于每次转移，该工具均报告源孔、目标孔、化合物身份（根据微孔板条形码和孔位从化合物库数据库中匹配）、目标体积、实际分液体积，以及未分液错误的具体原因。
系统在内部计算体积偏差及违反死体积限制的情况，并仅在存在此类问题时进行标记。输出结果汇总至单个 Excel 工作簿中。如果存在漏加或分液不完全的孔位，可使用 PickliPy.QC 生成仅包含失败转移操作的纠正性分液清单，并将其直接加载至调度软件中，有针对性地重新执行操作，无需手动编辑分液清单，从而避免由此引入错误。
水溶液与 DMSO 溶液 ADE 分液程序的比较
针对每种溶剂，均使用 Echo 650 仪器的 384PP_DMSO2 和 384PP_AQ_SP2 分液程序，对低浓度和高浓度水溶液及 DMSO 溶液的声学分液进行比较。将溶液分配至含有 50 µL H₂O 的 384 孔玻璃底微孔板（Cellvis 1.5H-N）中，并使用 Pherastar FS 酶标仪（BMG Labtech，美国北卡罗来纳州卡里；未集成至自动化工作站）定量测定荧光。荧光素
将（终浓度为240 µM）加入H₂O（100%）、DMSO（100%）以及葡萄糖（3 M）和琥珀酸盐（0.75 M）的水溶液中。每次分液均设置2个技术重复，包括手动移液，且分液操作均重复进行3次。作为对照，还在96孔深孔板中手动稀释染色溶液，随后将其转移至相同类型的目标板中，以完全复现ADE所采用的实验形式。为比较斜率，以荧光强度为响应变量，以分液方法、标称体积及其交互作用为预测变量，进行非加权线性回归拟合。通过比较相对于手动分液的斜率比及其95%置信区间，评估校准特征的差异。
ADE过程中的蒸发与吸湿
蒸发试验通过手动移液向384孔聚丙烯（PP）板的每孔加入50 µL H₂O进行。吸湿试验采用与蒸发试验相同的方法，但使用50 µL新鲜无水DMSO。将该板置于Echo 650的源板位置，并使用Echo Client Utility软件进行扫描检测。首次板扫描检测作为初始基线读数，时间记为0 min（T0）。此后，将板保留在Echo 650中，每隔30 min进行一次扫描检测，直至120 min（T120）。这些数据用于确定蒸发速率随时间的变化。为确定蒸发速率和仪器门的开闭状态是否影响体积变化，分别在仪器门打开和关闭的条件下开展该试验。
在使用水溶液进行较长时间的实验时，Echo 650分液腔内的气流可能导致显著蒸发；因此，SRC工作表中标示的源孔最低体积可能为
设定为高于仪器的截止值。将重复分液事件（例如在较长时间进程中）拆分至多个移液清单文件，可使调度软件在孵育期间弹出源板并为其加盖（图 S4c）。
人骨骼肌线粒体的分离
肌肉活检样本采自巴克研究所人类生物学核心平台招募的受试者，由接受过该操作培训的执业医师在无菌条件下采集。参与者在操作前禁食2小时（水和咖啡因除外）。受试者被告知在活检前12小时内不得饮酒或使用大麻，24小时内不得进行剧烈运动，7天内不得使用阿司匹林及非甾体抗炎药（NSAIDs）。操作前，受试者食用由即食燕麦片（Bob’s Red Mill，美国俄勒冈州密尔沃基）加水制成的标准化餐食。
本文呈现的受试者数据来自一项正在进行的、比较运动员与不运动者的临床研究，是其中用于基准测试的一个子集。受试者总数为 n = 38，女性占50%，年龄的均值 ± 标准差为71.5 ± 4.0岁，BMI的均值 ± 标准差为23.0 ± 3.4，运动员占89%。其中，仅有30名受试者被纳入变异系数分析（图3d–g），这些受试者的全部 n = 4个重复（2块实验板上各设2个重复孔）均通过了基于基线稳定性和曲线质量的仪器质量控制。化合物给药根据剩余样本的可用量进行，因此重复数有所不同。
在仰卧位下采集生命体征。经视诊和触诊后，确定右侧股外侧肌的活检部位。剃除该部位毛发并准备好无菌操作区域后，使用医用级溶液清洁活检区域，所用溶液为2%氯己定或
葡萄糖酸盐或聚维酮碘。将无菌洞巾覆盖于活检部位。在整个操作过程中建立并维持无菌区。使用无菌注射器和针头，在活检部位筋膜上方注射不含肾上腺素的1%利多卡因溶液，剂量不超过4 mg/kg，最大总量为200 mg。受试者口头确认麻醉充分后，使用无菌手术刀片沿已麻醉的路径作一长6–8 mm的切口。
使用5 mm或6 mm骨骼肌活检针，在负压抽吸下采集活检组织。在不将活检针移出切口的情况下，通过在活检针内移动套针，配合负压抽吸切取组织。共连续切取3–5次。仅在所采集组织量不足（<200 mg）时，才进行第二次活检。活检后，在持续按压切口部位的同时包扎伤口，随后向受试者提供护理指导并允许其离开。
将组织置于冰上的1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。取一块3×3×5 mm的组织，沿肌纤维走向分割，以保留肌纤维长度。将30–50 mg（湿重）样本置于500 µL Chappell-Perry缓冲液1（CP1）中〔50 mM Tris、2 mM EGTA、100 mM KCl，用HCl将pH调至7.4；所有试剂均购自Sigma Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）〕，随后转移至冰上，用于线粒体分离。
线粒体分离和检测方法基于既往研究¹⁸，并作了修改。所有操作均在冰上或4 °C条件下进行。使用外科剪刀在500 µL Chappell-Perry（CP1）缓冲液中将活检组织粗略剪碎。静置2 min后，小心移除CP1。加入300 µL CP2缓冲液（在CP1中补加5 mM MgCl₂、0.5% w/v BSA，
加入含1 mM ATP和2.5 U/mL VIII型蛋白酶的溶液），同时放入一枚磁力搅拌子。将样品置于装满冰的腔室中，在磁力搅拌器上于1 min内用N₂气体加压至800 psi，进行空化处理10 min后迅速减压。
立即加入1 mL CP1。使用在含0.5% BSA的CP1中预冷的移液器吸头，将样品转移至手持式匀浆器。使用2 mL松配合B型研杵匀浆10次，然后将匀浆液转移至干净的2 mL Eppendorf管中。用200 µL CP1冲洗匀浆器，并将冲洗液转移至收集管中。将离心管离心（4 °C，500 × g，10 min，加速档位：3，减速档位：3）。收集上清液，经40 µm滤器过滤后再次离心（4 °C，10,000 × g，10 min，加速档位：3，减速档位：3）。
再次弃去上清液，用CP1轻柔洗涤沉淀，在1 mL CP1中匀浆40次以重悬沉淀，重悬后稀释至2 mL。将样品离心（4 °C，10,000 × g，10 min，加速档位：3，减速档位：3），弃去上清液，用CP1轻柔洗涤沉淀，并将其重悬于100 µL CP1中。根据Pierce BCA蛋白定量测定（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的结果对产量进行归一化，通常测得的蛋白量为60–200 µg。
用于深度生物能量学表型分析的Seahorse XF试剂盒板分装
通过声波液滴喷射（ADE）和手动预分装可直接用于检测的“试剂盒”板，减轻了向Seahorse XFe96检测孔及传感器卡匣加样孔加液所带来的液体处理负担。具体而言，将兼容ADE的小体积加液（DMSO或水溶液，加液体积不超过7 µL，通常为100 nL）与大体积水溶液加液（检测缓冲液及底物、核苷酸等）分开，分装至四块板中（AQ Port、AQ Substrate、ECHO Port和ECHO Substrate；
见下文），各自冷冻保存至使用时。“底物试剂盒”作为基础培养基加入测定孔中，而“加样口试剂盒”则在混合声学液滴喷射（ADE）分液与批量分液所得液体后，加入 Seahorse XFe96 卡匣的加样口中（图 3b）。分液操作使用 PickliPy.Assay，并利用实验设计 Excel 工作簿中的附加工作表进行所需计算（例如标准 Seahorse XF 加样口加样稀释计算¹⁸）。
分离线粒体的 Seahorse XF 呼吸测定
实验前一晚，使用 Seahorse XF 校准液在 37 °C 下对 Seahorse XFe96/XF Pro 传感器卡匣（Agilent，美国加利福尼亚州洛杉矶）进行水化。Seahorse XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板在 37 °C、环境空气条件下脱气至少 4 小时。将加样口和底物的即用型测定板解冻并离心（4 °C，500 × g，3 分钟，加速：1，减速：1）；两者各由 1 块水相（AQ）板和 1 块声学分液（ECHO）板组成，每个传感器卡匣共需 4 块板。使用 12 通道移液器，按行将 AQ 加样口板中的 250 µL 液体转移至 ECHO 加样口板（A、B、C、D 行分别转移至 E、F、G、H 行），以溶解其中的物质。使用 12 通道移液器，按行将该混合液各 20 µL 加入传感器卡匣的加样口中（E、F、G、H 行分别加入 A、B、C、D 加样口），填满全部 384 个加样口。
将加液后的板置于 Seahorse XFe96 分析仪中进行校准。与此同时，将线粒体悬液以每孔 1 µg 的量接种至已脱气并冷却的 XFe96/XF Pro 细胞培养微孔板（未经任何包被）中，每孔含 20 µL MAS1 缓冲液〔2 mM HEPES、10 mM K₂PO₄、1 mM EGTA、70 mM 蔗糖、220 mM 甘露醇、5 mM MgCl₂，使用 KOH 在 37 °C 下将 pH 调至 7.4；所有试剂均购自 Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）〕，并补充 0.5%（w/v）BSA，同时加入相同的缓冲液
加入背景孔中，随后将微孔板离心以固定线粒体（4 °C，2000 g，20 min，加速档位：1，减速档位：3）。
使用12道移液器，将AQ底物板中的250 µL液体逐行转移至ECHO底物板（A、B、C、D行分别转移至E、F、G、H行）。使用12道移液器，将100 µL室温底物轻柔地加入细胞培养/测定板中，覆盖在线粒体上方（E、F、G、H行分别转移至A/E、B/F、C/G、D/H行）。对于化合物加药实验（UA、MIC、AzB），将120 µL室温底物与含有4行药物的ADE加药板中的药物混合。随后取其中100 µL加入细胞培养板的E–H行，即位于已加入未加药底物的A–D行下方的各行。立即将该板装入XFe96仪器。5个测量阶段（基线、加样口A、加样口B、加样口C、加样口D）的测定运行设置均相同，每个阶段包含3个循环，每个循环包括混匀1 min、等待1 min和测量3 min。
P/O比值的测量
根据本课题组此前的研究²⁰˒²²及其他研究²¹，利用ECAR和OCR计算P/O比值（或ADP/O比值；每消耗一个氧原子所合成的ATP分子数）。在Seahorse XFe96分析仪上开展专门的双重复实验，以pH相对于HCl浓度（mM）的变化斜率计算缓冲能力。为此，向120 µL MAS1中分4次加入20 µL的2.4 mM HCl。将实验测得的ECAR除以实测缓冲能力（0.32 mM/pH），再乘以2.28 µL（微室体积）和1.6的校正因子（由Agilent提供），转换为质子生成速率（PPR）。P/O比值按−PPR/(2×OCR)计算，使用
寡霉素敏感性速率，因此其数值不受质子泄漏的影响。琥珀酸或谷氨酸 + 苹果酸的氧化除通过磷酸化外，不会导致质子的净生成或净摄取，从而避免了基于碱化计算的 P/O 值发生偏差。相比之下，其他常用的底物组合，如丙酮酸 + 苹果酸或棕榈酰肉碱 + 苹果酸，可能会导致碳酸或柠檬酸的形成，具体取决于其在三羧酸（TCA）循环中氧化的完全程度。为追踪这一情况，我们计算了基于碱化的 P/O 值，结果见表 S1。
人原代分散胰岛细胞培养
分散胰岛细胞培养物由多个胰岛中心提供的死后捐献人胰岛制备，这些中心包括 Prodo Laboratories（加利福尼亚州尔湾）、加利福尼亚大学旧金山分校糖尿病中心，以及通过胰岛整合分配计划获得胰岛的相关中心。2 型糖尿病器官供者由胰岛中心根据 HbA1c 和病史界定。按照既往报道的方法³⁰，使用 AccuMAX 将胰岛细胞分散，在 Prodo PIM(S) 培养基中培养，并以每孔 5,000 个细胞的密度接种于经 PEI（1:15,000，w/v；37 °C 过夜）包被的玻璃底半面积 96 孔微孔板（Corning #4580）中，在含 5%（v/v）Geltrex 的条件下培养 6–10 天。每块板以 3×6 的排列方式在 18 个孔中接种细胞。分散胰岛细胞培养所用的生长培养基为 PIM(S)，按照供应商的建议添加人 AB 血清（5%，Corning #CV35-060CI 或 Gemini #100-512 或 #100-712）、谷氨酰胺和谷胱甘肽（PIM(G)；Prodo），并添加 100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素。
胰腺 β 细胞的质膜和线粒体膜电位测定
使用四甲基罗丹明，通过荧光显微镜测量绝对线粒体膜电位（ΔψM）
按照先前描述的方法，使用甲酯（TMRM）和FLIPR（#R8126 FLIPR Membrane Potential Assay Explorer Kit；红色版；Molecular Devices），并对测定缓冲液的配制方法进行了修改，以使用ADE。记录在两台配备Perfect Focus System的尼康Eclipse Ti全电动宽场荧光显微镜上进行，显微镜配有定制的Lambda 821 LED光源（Sutter Instruments，美国加利福尼亚州诺瓦托）或早期使用的Lambda LS氙弧灯光源、Lambda 10-3发射滤光轮、Andor iXon Life 888（Oxford Instruments，英国）或Cascade 512B（Photometrics）EMCCD相机，以及尼康电动载物台或MS-2000线性编码电动载物台（ASI；美国俄勒冈州尤金），使用Elements 5.20软件（Nikon，美国纽约州梅尔维尔）和S-Fluor 10×干式物镜进行记录。TMRM和FLIPR信号每隔100 s采集一次，所用滤光片组如下，依次列出LED波长（nm）、激发波长—发射波长（nm/带宽）：TMRM为561、586/20—641/75（曝光时间30 ms，功率14%）；FLIPR为506、509/22—542/27，并使用459/526/596分光镜（30 ms，7%；均购自Semrock，美国纽约州罗切斯特）。记录前4 h，用补充了7.5 nM TMRM、1:100 FLIPR、1 µM四苯硼酸钠和1 µM zosuquidar的改良培养基（无荧光RPMI，含3 mM葡萄糖、1 mM NaHCO₃、20 mM TES和2 mM谷氨酰胺）洗涤细胞三次。将细胞置于37 °C空气培养箱中孵育，使探针达到平衡，并在基线记录前30 min再洗涤两次。使用相同的测定培养基，在配有700 µL玻璃内衬（以防止TMRM被塑料侧壁吸附而耗损）的96孔深孔储液板中配制2倍浓度的待添加溶液，具体方法是使用PickliPy.BlueTable，将预先通过ADE分装至测定就绪板中的储备液溶解，随后立即
将这些溶液转移至玻璃内插管中。对于预制检测板，采用声波液滴喷射（ADE）向V形底96孔聚丙烯板的每孔分配100 nL DMSO储备液。分配体积由一种或多种化合物储备液及DMSO补足，从而能够在恒定的溶剂载体浓度下开展剂量–反应和组合实验。随后，将V形底板各孔中的内容物溶解于200 µL检测培养基中，获得2倍浓度的处理液。相比之下，该检测方法早期的手动版本先用移液器手动向玻璃内插管中加入0.35 µL DMSO储备液，再加入700 µL检测培养基；进行剂量–反应记录时，则针对每个终浓度使用经适当稀释的储备液。
通过使用PickliPy.BlueTable及原始储备液稀释设计表，保留了原始实验方案的一项重要特征：由于在制备储液板时设置了转移保留步骤，连续加样不会稀释先前加入的调节剂³²。时间进程记录依次包括基线记录、使用多道移液器手动更换一半培养基以施加处理、记录、第二次处理及记录，以及按前述方法加入用于电位校准的试剂³⁰˒³²。使用Image Analyst MKII分析记录数据。采用“利用已知kP和Goldman电位并结合神经网络进行完全校准”和“完全校准”方案对ΔψP和ΔψM进行校准。通过双硫腙染色鉴定β细胞，所展示的数据仅代表β细胞，而非全部分散的胰岛细胞。
稳定表达mito-AT1.03 ATP传感器的HEK293细胞系的构建
从原始pcDNA3.1质粒⁵⁰中通过PCR扩增mito-AT1.03的开放阅读框（ORF），并按照制造商说明将其克隆至pENTR-D-TOPO中。使用
通过与 pLenti-CMV-Hygro 质粒进行 LR 重组，构建了 pLenti-mito-AT1.03，并经测序验证。
使用 Virapower（Invitrogen）第三代慢病毒包装试剂盒，在 HEK293FT 细胞中制备慢病毒，并通过超速离心进行浓缩。为建立表达 mito-ATeam 的细胞系，以低感染复数（MOI）转导新鲜的 HEK293FT 细胞，并在潮霉素筛选条件下培养。随后，使用 BD FACSAria II 细胞分选仪（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）分选出中高表达水平的细胞。HEK-mAT1.03 细胞培养于添加了 10% 胎牛血清（FBS）、100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM 培养基（高糖、含谷氨酰胺）中。
用于 HEK-mAT1.03 筛选的微孔板 Matrigel 包被
将 Cellvis P384-1.5H-N 384 孔玻璃底微孔板置于 Revvity 工作站的 Liconic 培养箱中脱气 1 小时，以尽量降低 Matrigel 凝胶化过程中形成气泡的可能性。将 Matrigel 置于冰上解冻，并按照官方建议，使用与 mito-ATeam 细胞培养相同的 DMEM 培养基进行稀释。启动自动化 Matrigel 包被程序前，将分液吸头在 4 °C 下预冷至少 30 分钟，并在 JANUS 液体处理工作站的台面上放置 3 块帕尔贴制冷板，设定为 0 °C，预冷至少 20 分钟。帕尔贴制冷板用于使大型单槽储液槽中的 Matrigel 和 PBS 保持低温，并冷却微孔板。
在包被过程中，将微孔板逐块从培养箱转移至液体处理工作站台面的制冷板上，冷却至少 3 分钟；同时，将吸头浸没于经帕尔贴制冷的 PBS 中以保持低温。使用液体处理工作站的 96 通道 MDT 机械臂，以每孔 12 µL 的体积对微孔板内部的 240 个孔进行包被
……板孔中。液体分装完成后，立即使用 VSpin 在室温下以 500 × g 离心 90 秒；随后将板置于室温支架上静置 3 分钟，使其缓慢升温，再放回 37 °C 培养箱中过夜孵育，之后用于细胞接种。若涂层板计划在 24 小时内不使用，则仅孵育 30 分钟，并手动存放于 4 °C 冰箱中，直至使用。孵育后，在接种细胞前吸除内侧 240 个孔中的培养基。
小分子化合物库的处理
线粒体靶向化合物库（Mitochondria-Targeted Compound Library；TargetMol Chemicals Inc，马萨诸塞州波士顿）以 384PP（#5300）规格购入，并根据使用 PickliPy.Screen 为 Echo 650 仪器生成的转移清单，直接转移至 384LDV 板中，制备子板。
在 Revvity G3 Explorer 工作单元内，所有板的移动均由 PFlex 机械臂执行，并由 Plate::Works 调度软件协调。解冻后的密封化合物库板从随机存取架转移至 VSpin 离心机（Agilent Technologies），使液体汇集至孔底。这是实现精准声学分液的必要步骤，因为准确检测液面弯月面并确定其位置对 ADE 至关重要。随后，使用自动化封板去除器（Automated Plate Seal Remover，Azenta Life Sciences）揭封化合物库板，并将其与空的子板 LDV 板一同转移至 Echo 650。直接制备子板时，采用一对一转移：将含有 320 个已加液内侧孔的源板原样复制至子板。初筛时，向每块源板中手动加入对照化合物（未稀释的 DMSO、FCCP + 寡霉素（4 mM + 2 mg/mL）、黏噻唑 + 寡霉素（4 mM + 2 mg/mL）以及 CCCP（10 mM）），再分配至子板……
板。对于剂量-反应整合，采用相同的自动化 Plate::Works 操作流程，但在 Echo 仪器中依次更换源板，依据 PickliPy.Screen 创建的移液清单，将所有目标化合物转移至同一块子板上。完成后，所有子板均进行封膜，并送回板库储存。
运行结束后，使用 PickliPy.QC 对分液准确性进行验证（见“分液后质量控制”）。PickliPy.QC 会根据子板内容生成更新后的库存表，该库存表可直接作为后续筛选移液清单生成的 LIB 表输入。
标准的 384 孔库板布局将第 1-2 列和第 23-24 列保留为空（共 320 个可用孔）。对于 mito-ATeam 筛选，对该布局进行了重新设计。每块检测板包含 75 种化合物，分别以 1、3 和 10 µM 三种浓度进行分液，同时设置 6 个 DMSO 载体对照孔，以及各 3 个 FCCP + 寡霉素、myxothiazol + 寡霉素和 CCCP 阳性对照孔。分液仅限于中央 240 个孔，以避免水浸物镜产生的板边缘干扰。
线粒体结构与 [ATP] 筛选
HEK-mAT1.03 细胞在定制的无荧光 DMEM 培养基中进行培养、加药和成像。该培养基不含酚红、核黄素和叶酸，并补充 10% FBS（ThermoFisher，货号 A5670701）、1% 青霉素-链霉素（ThermoFisher，货号 15070063）、20 mM TES、1 mM 丙酮酸钠和 4 mM 谷氨酰胺。将细胞以每孔 5,000 个细胞的密度接种于 50 µL 培养基中，接种位置为 Matrigel 包被的玻璃底 384 孔微孔板的内部 240 个孔（见上文），以避免板裙与镜头发生碰撞。每块板均使用配备 5 µL 盒式蠕动泵的 MultiFlo FX 大体积分液器进行接种，
随后，将细胞置于 LiCONiC 培养箱中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育过夜，以促进细胞贴壁。
随后，使用 PickliPy.Screen 生成的挑选列表，将化合物从化合物库子板（384LDV）中通过 Echo 650 直接分配至细胞板中，整个化合物库在单个批次中完成处理。将 50 nL 化合物分配至 50 µL 细胞培养液中。在分配过程中，384 孔板中的这些细胞培养液体积在倒置板位置下保持稳定。随后，将加药培养物孵育 48 小时。接种和加药流程均通过以下设备实现全自动化：料架、培养箱、加盖机、离心机、封膜剥离机、封板机、MultiFlo FX 分液器以及 Echo 仪器。上述步骤由 Plate::Works 和 PFlex 机械臂控制。
使用 Operetta CLS 进行成像，在共聚焦模式下采用 63×、数值孔径（NA）为 1.15 的水浸物镜，设置相机 2 倍像素合并。每孔在单一焦平面上采集 16 个视野，并采用 Two Peak 自动对焦方法，该方法针对该细胞系和板型进行了优化。为对 mito-AT1.03 生物传感器进行比率定量，采集两个通道：CFP（激发波长 435–460 nm，发射波长 470–515 nm，100% LED 功率下曝光 80 ms）以及 CFP 到 YFP 的 FRET 通道（激发波长 435–460 nm，发射波长 525–580 nm，100% LED 功率下曝光 80 ms）。成像流程通过以下设备实现全自动化：培养箱和显微镜；由 Plate::Works 和 PFlex 机械臂进行控制。
线粒体形态组学
从 Harmony（Revvity；使用“Write Archive”功能）导出图像数据，并在 Image Analyst MKII 中打开整个筛选数据集，该数据集由 13 块板组成（剂量-反应实验则为 3 块板）。Image Analyst MKII 由 Image Analyst Software（美国加利福尼亚州诺瓦托）提供；采用其内部读取方法“Open Instrument-specific TIFF folder”打开数据。化合物
使用 PickliPy.Screen 生成的元数据文件（table_merge.txt）将化合物身份和浓度映射到孔位，从而能够根据处理条件自动标注所有成像数据。为测量所有报告的特征，在所有板的所有孔中执行图像分析流程（https://github.com/gerencserlab/IA-Mito-Morphomics.git），采用“在所有位置运行”操作。分析采用无监督、自动化工作流程进行，且不生成中间图像数据集。对拼接图像进行平场校正和背景校正，然后进行图像拼接。基于 CFP 和 FRET 图像的总和，结合空间滤波与形态学分割生成线粒体轮廓，方法如前所述[31]，或使用 MoDL[43]。为使 MoDL 适用于我们的工作流程，我们改进了其图像块处理方式以避免边缘伪影，引入图像重采样以匹配训练和推理分辨率，并将 MoDL 集成到基于 Python Flask 的服务中以实现自动化（https://github.com/gerencserlab/HTS-MoDL.git）。在 Image Analyst MKII 中，MoDL 生成的概率图经过分水岭分割后处理，以尝试区分相互接触的线粒体。使用 Cellpose 的 cyto3 模型对 ATeam 总和图像进行分割，以确定细胞边界；随后依据上述总和图像中的点状相对于弥散信号指数对分割结果进行清晰度质量控制，并剔除边缘接触的细胞。Cellpose 也通过 Python Flask 服务实现自动化（https://github.com/gerencserlab/IA-Cellpose-tools.git）。
在整个视野中或以分层方式测量形态学参数：先将通过质量控制的 Cellpose 细胞转换为 Image Analyst MKII 中的 ROI，再首先执行指定的……
然后计算每个 ROI 中的统计量（例如分段指标或像素强度比值的均值、方差或中位数），再对视野中的所有 ROI 计算更高层级的统计量。计算了以下形态学指标：纤维长度 = (P + sqrt(max(0, P^2 - 16 * A))) / 4；偏心率 = sqrt(max(0, 1 - minor_eigenvalue / major_eigenvalue))，其中，P 为周长像素数，A 为以像素计的面积；次小特征值和主特征值来自基于 PCA 的椭圆拟合，分别对应于覆盖某一分段像素的最佳拟合椭圆的短轴和长轴。骨架长度是骨架化图像中每个分段（线粒体）所包含的像素数。厚度熵定义为沿骨架化分段到线粒体边缘的距离的归一化份额熵，其计算公式为 exp(ln(total) - sum(x_i * ln(x_i)) / total)/n，其中 n 为骨架中的像素数，x_i 和 total 分别表示距离图像中的像素（距离）值；该距离图像是在对二值化线粒体图像进行反相后计算得到的。在某些情况下，对均值进行了 Winsor 化处理，即将低于第 1 百分位数或高于第 99 百分位数的值截断。ATeam FRET Ratio 数据按每个...
关键词：声学液滴喷射 · 微孔板检测 · 高通量筛选 · 实验设计自动化 · 剂量-反应分析 · 深度学习图像分析
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.07.05.735934v1?rss=1