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差示扫描荧光法（DSF）被广泛用于评估蛋白质热稳定性，以及在样品消耗量有限的情况下比较蛋白质变体、配体或制剂。然而，DSF所得参数在不同实验室、仪器和分析流程之间的可重复性仍缺乏明确界定。在本研究中，我们开展了一项分两个阶段的实验室间基准研究，使用同一份VHH样品，涉及26个实验室、28台仪器以及7种DSF仪器型号。在第一阶段，参与者采用各自常规的数据采集和分析流程；在第二阶段，数据采集条件实现了统一。数据集首先由各实验室进行分析，随后使用MoltenProt进行集中式再处理。参与者报告的表观熔解温度（Tm）在同一仪器内表现出良好的重复性，但仪器间离散程度中等。统一数据采集条件并未显著降低这种离散程度。相较之下，集中式再处理缩小了保留数据集之间的分布范围，表明除仪器依赖性因素外，分析流程和数据接受标准也会对结果产生影响。与差示扫描量热法（DSC）的比较进一步表明，表观Tm高度依赖于荧光读出方式。对于该VHH，350 nm处的单波长荧光与DSC转变温度的一致性最接近，而350/330 nm比值和重心均值通常会给出更高的数值。此外，DSF所得的表观解折叠焓比表观Tm表现出更大的变异性。总体而言，这些结果表明，在特定仪器和分析流程内，DSF可以具有很高的重复性，但不同仪器之间的定量可比性取决于仪器特异性影响、荧光读出方式的选择以及分析策略。提高可比性需要透明报告数据采集与分析条件、明确的数据质量标准，以及经过充分表征的参考材料，以监测仪器依赖性偏差。
差示扫描荧光法（DSF）被广泛用于评估蛋白质热稳定性，并在样品消耗量有限的情况下比较蛋白质变体、配体或制剂。然而，DSF所得参数在不同实验室、仪器和分析流程之间的可重复性仍缺乏明确界定。
在此，我们报告了一项分两个阶段开展的实验室间基准研究，该研究采用了共享的 V
W.S. 和 A.L. 是 NanoTemper Technologies 的员工。
A.H.M. 和 R.W.W. 是 Unchained Labs 的员工。
A.K. 是 Bio-Rad 的员工。
M.E. 是 Applied Photophysics Ltd. 的员工。
其余作者声明不存在利益冲突。
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关键词：差示扫描荧光法 · 蛋白质热稳定性 · 实验室间基准测试 · 表观熔解温度 · 仪器间变异性 · 数据分析标准化
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.10.12.758416v1?rss=1