大豆 Rsv1 位点的 NLR 通过识别病毒 P3 蛋白赋予对大豆花叶病毒 G1–G7 株系的广谱抗性|北京沫之东生物技术有限公司

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摘要

核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）免疫受体基因在抗病育种和病毒病防控中具有重要价值。大豆花叶病毒（SMV）对大豆生产构成严重威胁，大豆品种 Suweon 97 中的 Rsv1 位点可赋予其对 G1 至 G7 株系的广谱抗性。然而，该位点含有至少 18 个 NLR 基因，因此迄今为止，Rsv1 位点介导广谱抗病毒的机制仍未得到充分阐明。本研究建立了一套快速、高效的筛选体系，用于克隆大豆 Rsv1 位点上的 NLR 基因，并从这一高度复杂的位点中鉴定出一个广谱抗病毒 NLR 基因 13g184900。13g184900 编码的 NLR 能够识别所有 SMV 株系（G1–G7）的病毒 P3 蛋白，以及另一种马铃薯 Y 病毒科病毒——菜豆普通花叶病毒（BCMV）。该 NLR 的卷曲螺旋（CC）结构域可与病毒 P3 蛋白直接互作。此外，我们发现该 NLR 起源于中国东部的野生大豆种质，并在驯化过程中被引入若干大豆品种。综上，本研究建立了用于鉴定大豆 NLR 基因的高通量筛选体系，并为 Rsv1 位点如何介导对所有 SMV G1–G7 株系的广谱抗性提供了新的机制视角。

大豆 Rsv1 位点的 NLR 蛋白通过识别病毒 P3 蛋白，对大豆花叶病毒 G1–G7 株系提供广谱抗性 | bioRxiv

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大豆 Rsv1 位点的 NLR 蛋白通过识别病毒 P3 蛋白，对大豆花叶病毒 G1–G7 株系提供广谱抗性

Heyu Zhao、Bei Gou、Jiaqi Liao、Yanxiao Zhao、Tongqing Yang、Peilin Huang、Yingying Zhu、Yi Tie、Mohan Wang、Long Gao、Kai Li、Haijian Zhi、Xiaoyan Cui、Xin Chen、Yi Xu、Kaixuan Duan、Yuanchao Wang、Xiaorong Tao

doi: https://doi.org/10.64898/2026.06.29.735421

Heyu Zhao

1 南京农业大学农业与林业生物安全国家重点实验室，中国南京，210095

2 南京农业大学大豆病虫害防控重点实验室（农业农村部），中国江苏南京，210095

3 南京农业大学植物病理学系植物免疫重点实验室，中国南京，210095

4 南京农业大学作物病虫害综合治理重点实验室（教育部），中国南京，210095

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Bei Gou

1 南京农业大学农业与林业生物安全国家重点实验室，中国南京，210095

2 南京农业大学大豆病虫害防控重点实验室（农业农村部），中国江苏南京，210095

3 南京农业大学植物病理学系植物免疫重点实验室，中国南京，210095

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病虫害防控教育部重点实验室，南京农业大学，南京，210095，中国

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廖佳琪

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赵燕晓

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杨同庆

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Peilin Huang

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Yingying Zhu

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Yi Tie

农业与林业生物 անվտանգության

生物安全，南京农业大学，中国南京，210095

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Mohan Wang

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Long Gao

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Kai Li⁵

农业农村部大豆生物学与遗传育种重点实验室，南京 210095，中国；南京农业大学农学院，南京 210095，中国；作物遗传与种质创新利用全国重点实验室，南京 210095，中国

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Haijian Zhi⁵

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Xiaoyan Cui⁶

江苏省农业科学院经济作物研究所／江苏省园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 210014，中国

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Xin Chen⁶

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Yi Xu¹

南京农业大学农业与林业生物安全全国重点实验室，南京 210095，中国

² 农业农村部大豆病虫害防控重点实验室，南京农业大学……

大学，江苏南京 210095，中国

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Kaixuan Duan

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Yuanchao Wang

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taoxiaorong{at}njau.edu.cn}

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陶晓荣

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中国

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中国

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中国

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摘要

核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）免疫受体基因在抗病育种和病毒病防控中具有重要价值。大豆花叶病毒（SMV）对大豆生产构成严重威胁；大豆品种 Suweon 97 的 Rsv1 位点对 SMV G1 至 G7 株系具有广谱抗性。然而，该位点包含不少于 18 个 NLR 基因，因此，迄今为止，Rsv1 位点介导广谱抗病毒的机制仍未得到充分阐明。在本研究中，我们建立了一种快速、高效的筛选系统，用于克隆大豆 Rsv1 位点的 NLR 基因，并从这一高度复杂的位点中鉴定出一个广谱抗病毒 NLR 基因 13g184900。13g184900 编码的 NLR 能够识别所有 SMV 株系（G1–G7）的病毒 P3 蛋白，以及另一种马铃薯 Y 病毒科病毒——菜豆普通花叶病毒（BCMV）。该 NLR 的卷曲螺旋（CC）结构域可直接与...

病毒 P3 蛋白。此外，我们证明，该 NLR 起源于中国东部的野生大豆种质，并在驯化过程中被引入多个大豆栽培品种。综上，我们建立了一套用于鉴定大豆 NLR 基因的高通量筛选系统，本研究也为理解 Rsv1 位点如何介导对所有 SMV G1–G7 株系的广谱抗性提供了新的机制视角。

引言

大豆（Glycine max）是全球重要的经济作物之一，其富含油脂和蛋白质的种子使其成为世界上最主要的植物油来源¹˒²。随着全球气候变化以及国际贸易日益频繁，植物病害已成为限制全球农业生产的主要因素³˒⁴。预计到 2050 年，气候变化将使美国大豆平均产量降低 86%–92%⁵。利用抗性基因培育抗病作物，是防治病害最有效、最可持续的方法之一⁶˒⁷。在这些抗性基因中，核苷酸结合富亮氨酸重复序列（NLR）基因最具价值，应用也最为广泛⁸。NLR 是植物基因组中最大的抗性基因家族，占抗病基因总数的 60% 以上⁹。NLR 蛋白识别病原物效应子（亦称无毒蛋白/Avr 蛋白），并激活效应子触发的免疫反应（ETI）；这一过程通常伴随超敏反应（HR），从而将病原物限制在初始侵染部位¹⁰˒¹¹。自 1994 年首个 NLR 基因被克隆以来，大豆中仅有 5 个 NLR 基因被克隆。相比之下，其他模式生物和作物中已鉴定出数量更多的 NLR 基因，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的 95 个、水稻（Oryza sativa）中的 55 个、小麦（Triticum aestivum）中的 44 个，

分别为 20 个和 9 个。因此，亟须进一步发掘大豆抗性基因。

在影响大豆的病原物中，大豆花叶病毒（SMV）尤为值得关注，因为它广泛分布于中国、美国、巴西、印度和阿根廷等主要大豆生产区。SMV 也是中国和美国大豆上的主要病毒病原物

。SMV 感染会引发一系列症状，包括幼苗活力下降、种皮斑驳、花朵败育以及荚果发育受抑，这些症状共同导致大幅减产和种子品质下降

–

。在中国严重的病害流行期间，产量损失最高可达 50%，具体程度取决于大豆基因型和 SMV 毒株

。早在 1948 年，已有研究首次记载多种 SMV 毒株可引起大豆花叶病。此后，世界各地建立了多种相互独立的 SMV 分离物分类体系。目前广泛接受的 SMV 毒株分类体系，主要依据病毒毒力的差异及其在一组鉴别寄主品系上的表型反应。在美国的 SMV 分类体系中，SMV 分离物被划分为 7 个毒株（G1 至 G7）

。其中，G1 毒力最低：它仅能侵染感病品种，不能侵染所有受试抗病品种。相比之下，G7 毒力最强，能够克服品种抗性，并分别在不同抗病品种上诱发坏死症状和典型花叶表型

。

除 SMV 外，菜豆普通花叶病毒（BCMV）也是威胁大豆生产的重要病毒病原物

。除大豆外，BCMV 还会导致多种豆科作物减产。

包括菜豆、豇豆和花生，因此 BCMV 是影响全球豆科作物生产、造成经济损失最严重的病毒之一^20,21。BCMV 与 SMV 亲缘关系密切，二者的基因组结构和致病机制高度相似^22。SMV 和 BCMV 均属于马铃薯 Y 病毒科（Potyviridae）马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）^23。马铃薯 Y 病毒科约占已知植物病毒总数的 30%，其中包含多种具有重要经济意义、可侵染全球主要粮食作物的病毒^24。其基因组包含一个约 10 kb 的开放阅读框，编码一个多聚蛋白；该多聚蛋白经病毒蛋白酶加工后形成 11 种功能蛋白：P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP 和 P3N-PIPO^25,26。在这些功能蛋白中，P3 蛋白的生化活性及其致病作用仍不明确，因此它是马铃薯 Y 病毒属成员中研究最少的蛋白之一^27。

迄今已鉴定出 4 个独立的 SMV 抗性位点：Rsv1、Rsv3、Rsv4 和 Rsv5^28–31。Rsv1 是最早鉴定并定位于 13 号染色体的 SMV 抗性位点，也是大豆种质中最常见的 SMV 抗性位点^28。与此同时，Rsv1 位点也是已报道 SMV 抗性位点中结构最复杂的位点。在不同大豆品种中，该位点至少包含 10 个等位基因：Rsv1、Rsv1-t、Rsv1-y、Rsv1-m、Rsv1-k、Rsv1-r、Rsv1-s、Rsv1-n、Rsv1-h 和 Rsv1-c^28,32–36。Rsv1 等位基因最初在大豆品种 PI 96983 中被鉴定^32。研究人员还在 PI 96983 的 13 号染色体同一区域定位了两个 SMV 抗性位点，分别称为 Rsc-ps 和 Rsc-pm^37。在所有已报道的 Rsv1 等位基因中，来自大豆品种 Suweon 97 的 Rsv1-h 具有最高的育种应用价值，并且

有研究证实，该基因可使大豆抵抗美国所有 SMV G1–G7 株系

。然而，由于

Rsv1

位点极其复杂且序列高度分化，同时缺乏有效的筛选系统，因此在任何大豆品种中均未鉴定出该位点的抗性基因，其中也包括苏原97（Suweon 97）中的广谱抗性基因。

本研究建立了一种快速、高效的筛选系统，用于鉴定大豆

Rsv1

位点中的 NLR 基因。利用该系统，我们从高度复杂的

Rsv1

位点中鉴定出一个 NLR 基因

13g184900

，该基因可赋予大豆对 SMV 和 BCMV 的抗性。本研究表征的

13g184900

编码的 NLR 能够识别所有 SMV G1–G7 株系以及 BCMV 的 P3 蛋白，继而触发 HR。我们还发现，

13g184900

编码的 NLR 的 CC 结构域可与 SMV/BCMV P3 蛋白直接互作。此外，进化分析表明，该抗性基因起源于中国野生大豆，并在大豆驯化过程中始终保持功能完整性。

结果

建立快速、高效的系统，以筛选大豆

Rsv1

位点中的 18 个 NLR 基因

采用常规方法将每个基因分别转入大豆以验证 NLR 的功能，既耗费人力又耗时。为克服这一技术难题，我们采用

农杆菌

介导的豇豆瞬时表达系统，对

Rsv1

位点中的 NLR 基因进行筛选。豇豆和大豆同属

豆科

，预计具有保守的免疫信号通路。我们此前的研究表明，许多豇豆品种对

黄瓜花叶病毒

（CMV）具有抗性；利用这种豇豆

系统中，在子叶中表达 CMV Avr 蛋白 2a 可诱导强烈的 HR38（图 1a）。这表明，农杆菌介导的外源基因递送可在豇豆叶片中实现稳定表达。为确定哪种豇豆基因型具有最高的外源基因表达效率，我们选取了六个商业豇豆品种。CMV 2a 在所有六个受试品种中均诱导了 HR。值得注意的是，与其他受试品种相比，豇豆品种绿领红帅产生的 HR 最为显著（补充图 1a）。由于我们尚不清楚大豆花叶病毒（SMV）的哪种病毒蛋白可被 Rsv1 位点的 NLR 识别为 Avr 蛋白，因此我们利用实验室现有的 SMV-SC7 分离株构建了 SMV 全长感染性克隆，以表达全部病毒基因。为更直观地观察病毒侵染，我们还将绿色荧光蛋白（GFP）报告基因插入 SMV 基因组序列中。随后，我们通过农杆菌介导的瞬时表达，将 SMV-GFP 感染性克隆导入豇豆子叶。结果显示，通过荧光成像和免疫印迹分析，在六个豇豆品种中均成功检测到 SMV-GFP 侵染（图 1b、c）。与 CMV 2a 的表达结果相似，豇豆品种绿领红帅子叶中的 SMV-GFP 蛋白积累量显著高于其他五个品种（图 1c）。因此，后续研究均采用该豇豆品种。

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图 1. 建立快速、高效的瞬时表达系统，用于筛选大豆 Rsv1 位点的 NLR 基因。a. 通过农杆菌浸润，在豇豆子叶中瞬时表达 CMV Avr 蛋白 2a 后产生的 HR 表型。pCambia2300 空载体（EV）

用作阴性对照。b. 荧光图像显示，六个豇豆品种的子叶组织在农杆菌浸润携带 GFP 报告基因的 SMV 全长感染性克隆后，发生了 SMV-GFP 感染。图像使用倒置荧光显微镜拍摄。将 SMV-GFP 感染性克隆农杆菌浸润至豇豆子叶，并于浸润后 24 h 成像。c. 免疫印迹检测六个豇豆品种子叶中由 SMV 表达的 GFP；这些子叶均经 SMV-GFP 感染性克隆浸润。以 EV 浸润样品作为阴性对照，以丽春红 S 染色作为上样对照。将 SMV-GFP 感染性克隆农杆菌浸润至豇豆子叶，并于浸润后 24 h 进行检测。d. 大豆品种 Suweon 97 中 *Rsv1* 位点的示意图，显示该位点上 18 个 NLR 基因的排列。CC-NB-LRR 型和 TIR-NB-LRR 型 NLR 基因分别以棕色和灰色表示。该位点位于 13 号染色体上。e. 用于筛选能够识别 SMV 的功能性 NLR 的策略示意图。首先将携带 SMV-GFP 感染性克隆的农杆菌浸润豇豆子叶，随后于浸润后 48 h（hpi）进行第二次浸润，导入分别携带单个 NLR 构建体的农杆菌。f. 豇豆子叶中 NLR 基因 *13g184800* 或 *13g184900* 与 SMV-GFP 共表达后 5 d 的 HR 表型。g. 豇豆叶片中 *13g193100* 在有或无 SMV-GFP 条件下共表达后 5 d 接种（dpi）的 HR 表型。h. *13g184900* 和 *13g193100* 编码的 NLR 蛋白的结构域组成。

遗传作图分析和大豆参考基因组分析表明，预测 *Rsv1* 位点内存在 18 个成簇的 NLR 基因，包括 *13g184800*、*13g184900*、*13g187900*、

13g188300、13g190000、13g190300、13g190400、13g190800、13g192100、13g193100、13g193300、13g194100、13g194500、13g194600、13g194700、13g194800、13g194900和13g195100（图1d）。我们通过农杆菌介导的瞬时表达，在豇豆中分别筛选了大豆品种 Suweon 97 的 Rsv1 位点上的这18个 NLR 基因，以确定它们是否能够识别 SMV 并诱导 HR 反应（图1e）。在该检测中，瞬时表达的功能性 NLR 对 SMV 的识别预计会触发豇豆叶片发生 HR 细胞死亡，从而无需进行大豆稳定转化，即可快速鉴定功能性 NLR 基因。利用该检测系统筛选全部18个 NLR 后，我们发现，共表达 NLR 基因 13g184900 和 SMV-GFP 的豇豆叶片出现了明显的 HR 细胞死亡（图1f）。另一个 NLR 基因 13g193100 在与 SMV-GFP 共表达时也会诱导 HR；然而，在没有 SMV-GFP 时，该基因同样会诱导 HR，表明其具有强烈的自身免疫性（图1g）。相比之下，其他 NLR 基因均未触发可检测到的 HR（补充图1b）。13g184900 和 13g193100 均编码卷曲螺旋型 NLR（CNL）抗性蛋白，分别由1130和1189个氨基酸残基组成（图1h）。这两个基因在核苷酸和氨基酸水平上的序列一致性分别为73.2%和68.9%。综上，我们建立了一种基于 HR 的快速筛选系统，可用于从复杂的 NLR 位点中鉴定 NLR 基因；研究结果表明，该方法能够在 Rsv1 位点的多个 NLR 候选基因中，高效锁定负责识别 SMV 的特定 NLR。

13g184900 编码的 NLR 介导对 SMV 的有效抗性

接下来，我们采用豇豆瞬时表达系统，考察是否……

NLR 基因 13g184900 或 13g193100 能赋予对 SMV 的抗性。在豇豆子叶中，共表达 SMV-GFP 和马铃薯病毒 X（PVX）-GFP 的侵染性克隆，以及 35S 启动子驱动的构建体 p2300-13g184900 或 pCambia 空载体（EV）对照。我们预期，如果 13g184900 编码的 NLR 能特异性识别 SMV，则其应赋予植株对 SMV 的抗性，但不能抵抗 PVX。荧光成像和免疫印迹结果均显示，与共表达 EV 对照相比，共表达 13g184900 显著降低了豇豆叶片中 SMV-GFP 表达的 GFP 的分布范围和荧光强度（图 2a、b）。相反，13g184900 并未抑制 PVX-GFP 表达的 GFP（图 2c、d）。这些结果表明，13g184900 可特异性介导对 SMV 的抗性，但不能抵抗 PVX 侵染。我们也以相同方式检测了 13g193100 的抗病毒作用。然而，过量表达 13g193100 会引发强烈的自身免疫反应，从而赋予非特异性抗性。将携带 13g193100 的农杆菌 OD₆₀₀ 降至 0.05 后，未观察到其对 SMV-GFP 侵染有显著的抗病毒作用（补充图 2）。

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图 2. 13g184900 可赋予对 SMV 的有效抗性。a、b. 共表达 SMV-GFP 侵染性克隆与 13g184900 或空载体（EV）对照的豇豆子叶的荧光成像（a）和免疫印迹（b）。渗透接种后 48 h 对豇豆子叶进行荧光成像。Rep. 1–3 表示三个独立的生物学重复。采用丽春红 S 染色作为上样对照。c、d. 共表达 PVX-GFP 与 13g184900 或 EV 对照的豇豆子叶的荧光成像（a）和免疫印迹（b）。采用丽春红 S 染色作为上样对照。e.

在白光（上图）和紫外光（UV；下图）下观察接种 SMV-GFP 的 Williams 82 和 OE-13g184900 植株接种叶及系统叶症状。接种 PB 的 OE-13g184900 植株作为模拟接种对照。f. 通过 RT-qPCR 测定 SMV 接种的 Williams 82 和 OE-13g184900 植株局部叶和系统叶中 SMV CP mRNA 的相对表达量。数据以均值 ± SD 表示，*n* = 3 个独立生物学重复。g. 免疫印迹分析 SMV-GFP 在接种后 14 d（14 dpi）的 Williams 82 和 OE-13g184900 植株系统叶中的积累情况。Ponceau S 染色作为上样对照。h. 6 周龄转基因株系（OE-13g184900-23）和非转基因大豆品种 Williams 82 的表型。比例尺：5 cm。i. OE-13g184900 植株和 Williams 82 的种子形态。比例尺：1 cm。j. OE-13g184900 植株和 Williams 82 的百粒重。

为进一步评估 13g184900 是否赋予大豆对 SMV 的抗性，我们构建了由其天然启动子驱动该 NLR 基因的双元表达载体，并将其转化至对 SMV 易感的大豆品种 Williams 82⁽³⁹⁾。共获得 12 株 T₀ 转基因植株和 4 个 T₁ 转基因株系，其中 T₁-23 株系中 13g184900 的表达水平最高。我们还将 13g193100 转化至大豆。相比之下，表达 13g193100 的转基因植株在分化阶段均出现黄化和坏死，且无法再生为完整植株。因此，未能成功获得表达 13g193100 的大豆转基因株系。基于此，我们在后续实验中使用携带 13g184900 的大豆转基因株系（OE-13g184900）。

3 周龄的 Williams 82 和 OE-13g184900 植株……

用 SMV-GFP 感染叶片的提取物进行机械接种。接种后 10 天（dpi），Williams 82 的接种叶片出现典型的黄绿色花叶症状，而 OE-

13g184900

的接种叶片则出现 SMV 感染诱导的典型 HR 细胞死亡（

图 2e

）。至接种后 17 天，Williams 82 的上部新生叶片也出现花叶症状，表明 SMV-GFP 已建立系统性侵染。相比之下，OE-

13g184900

的新生叶片未检测到花叶相关症状（

图 2e

）。在紫外（UV）光下，Williams 82 的接种叶片和系统叶片均可检测到绿色荧光，而 OE-

13g184900

叶片中未检测到此类荧光（

图 2e

）。病毒积累检测结果显示，在转基因植株的系统叶片中，未检测到 SMV-GFP 的外壳蛋白（CP）或 GFP（

图 2f, g

）。这些结果表明，

13g184900

能够有效赋予大豆对 SMV 的抗性。

我们还研究了导入

13g184900

是否会对大豆造成适合度代价。在相同生长条件下，与非转基因 Williams 82 相比，六周龄 OE-

13g184900

植株的株高和生长适合度均无显著差异（

图 2h

）。此外，与非转基因植株相比，OE-

13g184900

植株的种子形态和大小均无显著差异，百粒重也未见显著差异（

图 2i, j

）。

13g184900

编码的 NLR 可识别所有 SMV G1–G7 株系的 P3 蛋白，并将其识别为 Avr 蛋白

为确定

13g184900

编码的 NLR 所识别的 Avr 蛋白，我们分别克隆了 SMV-SC7 的全部 11 个蛋白编码基因，并将每个基因分别与

13g184900

共表达。共表达 13g184900

与 SMV P3 蛋白共表达可诱导强烈的 HR，而与其他 SMV 基因共表达未检测到 HR，这表明 SMV P3 是由 13g184900 编码的 NLR 识别的 Avr 蛋白（图 3a 和补充图 3）。为进一步解析其免疫识别的分子机制，我们开展了一系列体内和体外互作实验，以验证 13g184900 与 P3 之间的相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）实验确认了全长 13g184900 NLR 蛋白与 SMV P3 在体内发生相互作用（图 3b）。酵母双杂交（Y2H）和萤火虫荧光素酶互补成像（LCI）实验进一步表明，该 NLR 的卷曲螺旋（CC）结构域与 P3 蛋白直接相互作用（图 3c、d）。此外，未检测到 13g184900 的 NB-ARC 或 LRR 结构域与 P3 蛋白之间存在相互作用（补充图 4a–c）。

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图 3. 13g184900 编码的 NLR 将所有 SMV G1–G7 株系的 P3 蛋白识别为 Avr 蛋白。a. 本氏烟（N. benthamiana）叶片中瞬时共表达 13g184900 与 SMV P3 后的 HR 表型。P3 基因克隆自实验室保存的 SMV-SC7 分离株。b. Co-IP 实验显示在本氏烟中共表达的 13g184900-2×Flag 与 SMV P3-HA 之间的相互作用。将 GUS-2×Flag 作为阴性对照。使用抗 Flag 磁珠进行免疫沉淀，并分别用抗 HA 和抗 Flag 抗体进行免疫印迹检测。c. Y2H 实验显示 13g184900 的 CC 结构域与 SMV P3 之间的相互作用。空载体（EV）和 SV40 大 T 抗原（T）/p53 分别作为阴性和阳性对照。d. 萤火虫荧光素酶互补（LCI）实验。

展示了本氏烟叶片中13g184900的CC结构域与SMV P3的相互作用。e. 本氏烟叶片中共表达13g184900与分别来自SMV G1至G7株系的P3蛋白时产生的HR表型。来自SMV G1至G7株系的P3基因通过化学合成获得。采用紫外光对本氏烟叶片进行拍照。f. Y2H实验表明，13g184900的CC结构域可与来自全部七个SMV株系（G1–G7）的P3蛋白相互作用。空载体（EV）和SV40大T抗原（T）/p53分别作为阴性和阳性对照。

Suweon 97的Rsv1位点可赋予其对SMV G1–G7株系的广谱抗性35,40。我们化学合成了来自SMV G1至G7株系的P3基因41,42，并分别与13g184900共表达，以检验13g184900是否为Suweon 97中Rsv1位点的NLR基因，能够赋予其对所有SMV G1–G7株系的广谱抗性。13g184900与各株系P3蛋白共表达均可诱导HR（图3e），表明13g184900是赋予大豆SMV广谱抗性的NLR基因。此外，我们证明13g184900的CC结构域可与全部七个SMV株系的P3蛋白相互作用（图3f）。来自七个SMV株系的P3蛋白核苷酸序列高度保守（序列一致性≥88.89%）（补充图5）。

13g184900编码的NLR还可通过识别病毒P3蛋白介导对另一种马铃薯Y病毒科病毒BCMV的抗性

先前研究报道，Suweon 97不仅对SMV具有抗性，也对BCMV具有抗性43。为确定13g184900是否也能赋予对BCMV的抗性，我们构建了携带GFP基因的BCMV感染性克隆（BCMV-GFP）。我们通过农杆菌介导的……方式，在豇豆品种的子叶中表达BCMV-GFP。

瞬时表达系统。结果表明，该侵染性克隆能够在豇豆中成功表达（补充图6）。随后，我们在豇豆子叶中共表达13g184900与BCMV-GFP侵染性克隆。结果显示，13g184900与BCMV-GFP共表达可诱导豇豆叶片发生HR细胞死亡，并强烈抑制BCMV-GFP的积累，表明13g184900能够有效识别BCMV并赋予抗性（图4a-c）。随后，我们分别用BCMV-GFP接种OE-13g184900和Williams 82。转基因植株的接种叶片形成局部坏死斑，而新发育的系统叶片保持无症状（图4e）。相比之下，非转基因植株的系统侵染叶片出现典型的花叶症状（图4e）。与上述表型一致，通过Western blot分析在OE-13g184900植株的上部新叶中未检测到BCMV-GFP（图4f）。

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图4.

13g184900编码的NLR还可通过识别另一种马铃薯Y病毒科病毒BCMV的P3蛋白介导抗性。a. 瞬时共表达13g184900与BCMV-GFP侵染性克隆的豇豆叶片中的HR表型。b、c. 在共表达BCMV-GFP侵染性克隆与13g184900或空载体（EV）对照的豇豆子叶中，对BCMV-GFP积累进行荧光成像（b）和免疫印迹（c）分析。豇豆子叶在农杆菌注射后48 h进行荧光成像。Rep. 1-3表示3个独立的生物学重复。采用Ponceau S染色作为上样对照。d. 共表达13g184900与BCMV P3的本氏烟叶片中的HR表型。e. 接种BCMV-GFP的Williams 82和OE-13g184900植株局部叶片和系统叶片的表型。接种PB的植株作为模拟接种对照。f.

在 14 dpi 时对 Williams 82 和 OE-13g184900 植株系统叶中的 BCMV-GFP 积累进行免疫印迹分析。Rep. 1–3 表示三个独立的生物学重复。采用 Ponceau S 染色作为上样对照。g Co-IP 检测在本氏烟（N. benthamiana）中共表达的全长 13g184900-2×Flag 与 BCMV P3-3HA 之间的相互作用。将 GUS-2×Flag 作为阴性对照。使用抗 Flag 珠子进行免疫沉淀，并分别用抗 HA 和抗 Flag 抗体进行免疫印迹检测。i. LCI 检测 13g184900 的 CC 结构域与 BCMV P3 之间的相互作用。j. Y2H 检测表明，13g184900 的 CC 结构域与 BCMV P3 直接相互作用。空载体（EV）和 SV40 大 T 抗原（T）/p53 分别作为阴性和阳性对照。

此外，我们克隆了编码 BCMV P3 蛋白的基因，发现 13g184900 也能够识别 BCMV P3 并诱导 HR（图 4d）。Co-IP 检测证实，全长 13g184900 NLR 蛋白与 BCMV P3 在体内相互作用（图 4g）。LCI 和 Y2H 检测表明，13g184900 编码的 NLR 蛋白 CC 结构域与 BCMV P3 蛋白相互作用（图 4h、i）。序列比对分析显示，BCMV P3 与 SMV P3 的核苷酸序列一致性约为 58.7%（补充图 7）。综上，这些结果表明，13g184900 编码一种 NLR，可识别 G1–G7 所有 SMV 株系的 P3，并通过与病毒 P3 蛋白相互作用，对相关马铃薯 Y 病毒 BCMV 也具有抗性。

NLR 基因 13g184900 的进化起源

为探究 13g184900 在 Suweon 97 中的进化起源及功能保守性，我们基于其在野生大豆（Glycine soja）中的同源基因构建了两棵系统发育树，并且……

栽培大豆。如图 5a 所示，

13g184900

与野生大豆 YSD56、PI483463 和 Yongin-0 的同源基因紧密聚为一支（序列一致性 ≥ 97.84%）。由于

13g184900

编码的 NLR 蛋白通过其 CC 结构域识别 SMV/BCMV Avr 蛋白，我们还利用 Suweon 97 和多个野生大豆种质资源中同源基因的 CC 结构域编码序列进行了系统发育分析（

图 5b

）。结果显示，整体进化模式与基于全长编码序列构建的进化模式高度一致。其中，Suweon 97 的

13g184900

与野生大豆 Chr 11 和 Chr 13 上的直系同源基因紧密聚为一支，序列一致性为 95.3% 至 99.67%。最高序列一致性（99.67%）出现在

13g184900

与源自中国的野生大豆 YSD56 Chr 11 上的直系同源基因之间（

图 5a

）。

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图 5.

大豆 NLR 基因

13g184900

进化起源与多样化的系统发育分析。a. 野生大豆（

Glycine soja

）种质资源中

13g184900

全长同源基因的系统发育树。右侧标示各序列对之间的一致性。b. 全球栽培大豆（

Glycine max

）中

13g184900

全长同源基因的系统发育树。右侧标示各序列对之间的一致性。c. 基于野生大豆种质资源中

13g184900

同源基因 CC 结构域编码序列构建的系统发育树。所有树的内部节点均标注了自举支持值。

在栽培大豆中，

13g184900

与 Jidou 17、ENREI 和 Kosuzu 的同源基因聚为一支（序列一致性 >99.5%），而 Williams 82 和 Jack 等其他栽培品种则聚成另一支（序列一致性为 75.09%–78.67%）（

图 5c

）。该基因

其在不同大豆栽培品种中的直系同源基因之间表现出极高的序列相似性，表明该基因具有高度进化保守性，这对其介导的抗病性至关重要。

讨论

大豆是全球经济价值最高的作物之一。在大豆病原物中，大豆花叶病毒（SMV）是危害最严重、分布最广泛的病毒病原之一。因此，克隆并开展 SMV 抗性基因的功能鉴定，对大豆抗病育种至关重要。本研究基于豇豆子叶瞬时农杆菌浸润，建立了一种快速筛选大豆复杂 NLR 基因座中 NLR 基因的方法。利用该方法，我们从高度复杂的 *Rsv1* 基因座中鉴定出广谱 NLR 抗性基因 *13g184900*，该基因能够识别 SMV G1–G7 株系以及另一种马铃薯 Y 病毒科病毒——菜豆普通花叶病毒（BCMV）。在大豆中稳定表达 *13g184900* 可赋予植株对 SMV 和 BCMV 的抗性。

基于豇豆子叶的筛选系统可通过 HR 诱导的细胞死亡以及 GFP 荧光的强度和空间分布，对来自 Suweon 97 的 *Rsv1* 基因座上的 18 个 NLR 基因进行快速功能筛选。该豇豆筛选平台也非常适用于筛选发生间接互作的 NLR 与 AVR，因为此类间接识别所需的豆科宿主因子在基于 *N. benthamiana* 的筛选系统中无法检测到⁴⁴⁻⁴⁶。除用于发现抗病毒 NLR 基因外，该筛选系统还可拓展用于挖掘抗其他大豆病原物的 NLR 基因，包括大豆疫霉、锈菌和线虫，从而为大豆复杂 NLR 基因座的功能解析提供高效的技术平台。此外，该系统还可用于…

以筛选菜豆、蚕豆、豇豆、荷兰豆和绿豆等其他豆科作物中的 NLR 基因。此外，由于 SMV-GFP 和 BCMV-GFP 可在豇豆子叶中大量积累，本研究建立的瞬时表达系统也可用于研究 SMV 和 BCMV 的复制、移动及宿主抗性机制。

我们还鉴定出 NLR 基因 13g184900 可识别 SMV P3，并将其作为 Avr 蛋白。然而，另一种鉴定出的 NLR 基因 13g193100 表现出强烈的自免疫反应，因此无法鉴定其 Avr 决定因子。既往研究表明，P3 和 HC-Pro 蛋白发生协同突变后，SMV 能够逃避大豆品种 PI96983 的 Rsv1 等位基因介导的抗性；这表明 P3 和 HC-Pro 均可作为被该 Rsv1 识别的 Avr 蛋白⁴⁷–⁴⁹。NLR 基因 13g193100 可能负责识别 HC-Pro。我们还发现，13g184900 编码的 NLR 能够识别全部七种 SMV 株系的 P3。综上，这些结果表明，13g184900 是 Suweon 97 中 Rsv1 位点介导广谱 SMV 抗性的关键抗性基因。然而，不同大豆品种的 Rsv1 等位基因在遗传组成和基因组组织结构方面差异很大，因此不同等位基因可能识别不同的 Avr 蛋白。仍需进一步表征 Suweon 97 及其他品种中 Rsv1 等位基因识别的 Avr 决定因子。

SMV 抗性是中国大豆抗性育种的一项重要性状。SMV 株系多样且变异频繁，单一抗性基因常常会失效⁵⁰。迄今为止，仅有两个 SMV 抗性基因 Rsv4 和 Rsc4-3 已被克隆并得到功能验证。这两个基因均属于

不同的抗病基因家族在抗病毒机制上存在显著差异。

Rsv4

并非典型的 NLR 型抗病基因

。其抗性表现为症状延迟出现、病毒在植株体内的系统性传播受限，而非完全免疫；特定病毒突变体能够克服这种抗性。

Rsc4-3

属于 CNL 型抗病基因，与

Rsv3

位点候选基因

NBS_C

等位，在基因组定位区间上部分重叠，并对 SMV 具有保守的抗病毒功能。

Rsc4-3

能够赋予植株对多种 SMV 株系的抗性，但对 SC15 株系无效

。因此，本研究鉴定出的广谱抗 SMV NLR 基因

13g184900

为培育抗不同 SMV 株系的大豆品种提供了宝贵的基因资源。

BCMV 也会对其他豆类造成威胁

。因此，本研究鉴定出的 NLR 基因

13g184900

也可用于豆类及其他豆科作物，以实现对 BCMV 的抗性。

13g184900

是否能赋予植株对其他马铃薯 Y 病毒科病毒的广谱抗性，仍有待未来研究验证。即使该 NLR 基因无法识别并抵抗其他马铃薯 Y 病毒科病毒，多项研究也已证实，可通过基因工程或定向诱变扩大 NLR 免疫受体的病原识别范围

–

。本研究所述由

13g184900

编码的 NLR 对 Avr 蛋白的保守识别机制，为进一步利用和改造该 NLR 基因奠定了重要基础，并展现出巨大潜力，有望使其在不同作物中赋予对多种马铃薯 Y 病毒科病毒的广谱抗性。

进一步的序列比对分析表明，大豆品种 Suweon 97 中的

13g184900

与位于第 11 号染色体上的同源基因具有 99.67% 的序列一致性。

野生大豆种质 YSD56。这表明，该 NLR 基因起源于中国东部的野生大豆。这些同源基因分布于不同染色体上，反映了大豆第 11 号与第 13 号染色体之间的同源关系；这一关系源于一次全基因组复制（WGD）事件^58–60。具体而言，第 13 号染色体上包含 Rsv1 位点的 NLR 抗性基因簇，在第 11 号染色体的共线区域中具有对应的同源 NLR 基因簇。从种质分布来看，该基因存在于若干东亚大豆栽培品种中，但在本研究纳入分析的其他主要大豆产区栽培品种中未见。我们的研究还鉴定出该位点的另一个 NLR 基因 13g193100，该基因会引发强烈的自免疫反应。因此，我们无法获得稳定表达该基因的大豆转基因株系。根据这些结果，我们推测，Rsv1 位点内其他 NLR 成员（如 13g193100）带来的适合度代价，可能使 Rsv1 位点在育种过程中未能导入其他主要产区的栽培大豆中。然而，目前尚无研究系统比较具有和不具有 Rsv1 位点的大豆株系之间的生长性状。这种分布模式背后的进化与育种机制仍有待深入探索。

总之，我们建立了一种高效筛选大豆高度复杂 Rsv1 位点中 18 个 NLR 基因的体系，并鉴定出 13g184900。该基因是一种广谱抗性基因，可识别 SMV G1–G7 株系以及另一种马铃薯 Y 病毒科病毒 BCMV。我们的研究结果进一步彰显了 13g184900 在不同大豆栽培品种分子抗性育种中的应用潜力。这些发现也为……奠定了基础。

为进一步鉴定 NLR 基因、培育广谱抗病毒品种以及研究大豆中 NLR 与 AVR 的相互作用奠定了重要而坚实的基础。

方法

植物材料与栽培条件

在表型测定实验中，将豇豆（包括 6 个商业品种：Lvlinghongshuai、Wanshouchun、Xinyuaiman、Ningjiangsanhao、Yangzijiangerhao、Youliangwang）、本氏烟（N. benthamiana）和大豆（Williams 82 及 13g184900 过表达植株）的种子播种于 Pindstrup 基质（0–6 mm，pH = 6.0）与蛭石按 1:1 混合的基质中，并在多台环境控制温室中培养。温室光周期为 16 h 光照（25 °C）/8 h 黑暗（23 °C）。为获得过表达株系，将大豆品种 Williams 82 的幼苗置于组织培养基中，在环境控制培养室内培养。培养室采用 14 h 光照/10 h 黑暗的光周期，光照强度为 20,000 lux。

质粒构建与大豆转化

从大豆品种 Williams 82 的系统侵染叶片中提取 SMV SC7 株系的全长 RNA，并反转录合成第一链 cDNA。将 eGFP 编码序列插入 SMV 的 NIb 与 CP 编码区之间。使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech，中国南京）将全长 SMV-GFP 重组片段克隆至二元载体 pCB301 中 CaMV 35S 启动子下游。随后将最终构建的感染性克隆转化至农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株，用于后续病毒接种实验。通过 RT-PCR 扩增 Rsv1 位点中的各个 NLR 基因及 SMV 和 BCMV 病毒蛋白的全长编码序列，并在其 N 端或……端融合 HA 或 FLAG 标签。

将 NLR 基因 13g184900 和 13g193100 的全长编码序列分别插入植物双元载体 pCambia2300S，并置于 35S 启动子控制下。另将这两个 NLR 基因的全长编码序列插入植物双元载体 pFGC5941，并由其自身启动子驱动；载体中 bar 基因赋予草铵膦抗性，作为筛选标记。这两个过表达构建体被导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 AGL1，并用于在 Williams 82 遗传背景下培育转基因大豆植株。

大豆遗传转化采用已建立的子叶节转化方案，并作少量修改⁶¹˒⁶²。将生根良好的 T₀ 植株移栽至装有基质与蛭石 1:1（v/v）混合物的花盆中，并在温室内、相同的光周期和温度条件下生长。随后，通过在三出复叶上涂施 100 mg/L 草铵膦进行叶片除草剂筛选。提取草铵膦耐受植株的基因组 DNA，并通过 PCR 扩增目标 NLR 基因和 bar 筛选标记，进一步确认阳性转基因株系。

豇豆和本氏烟草中的瞬时表达

采用子叶完全展开的 14 日龄幼苗进行农杆菌浸润。携带目标构建体（包括 SMV-GFP、BCMV-GFP、PVX-GFP 感染性克隆及 NLR 过表达载体）的根癌农杆菌菌株 GV3101，在添加 100 mg/L 卡那霉素和 50 mg/L 利福平的 LB 培养基中，于 28 °C、220 rpm 振荡过夜培养。以 5000 rpm 离心 5 min 收集 GV3101 菌体，随后用农杆菌浸润缓冲液（10 mM MES，pH 5.6；10 mM MgCl₂；150 mM 乙酰丁香酮）重悬。浸润前，将菌液悬液于 28 °C 避光孵育 2–3 h。

在豇豆筛选体系中，首先将携带 SMV-GFP 或 BCMV-GFP 感染性克隆的农杆菌培养物调整至 OD₆₀₀ = 1.0，并注射接种豇豆子叶。接种后的植株于 25 °C 培养 24 h，随后进行第二次注射接种，所用农杆菌培养物携带 NLR 基因构建体，且 OD₆₀₀ 调整至 0.5。之后将注射处理的豇豆移回温室，并在相同条件下培养。接种后 5 天（dpi）目视记录过敏性反应（HR）细胞死亡表型；接种后 36 h（hpi）使用荧光显微镜观察并成像记录 GFP 荧光信号。

本氏烟草（N. benthamiana）叶片中的农杆菌介导瞬时表达按照文献 63 所述方法进行。

SMV/BCMV 机械接种

为更清晰地观察病毒侵染情况，我们使用 SMV-SC7-GFP 感染性克隆进行机械接种。首先将 SMV-SC7-GFP 感染性克隆农杆菌接种至本氏烟草植株。接种后 14 天出现系统性病害症状时，收集受侵染的叶片组织，并在 1× 磷酸盐缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄ 和 2 mM KH₂PO₄，pH 7.4）中研磨。为保持病毒的侵染活性，所得粗匀浆立即用于接种。选用叶片完全展开的大豆植株（播种后约两周）作为接种材料。将 600 目金刚砂轻轻撒于单叶表面作为磨擦剂，再用戴无菌手套的手指将病毒匀浆轻轻涂抹于叶片表面。接种后，用无菌蒸馏水冲洗去除残余接种物和金刚砂。以磷酸盐缓冲液进行模拟接种，作为阴性对照。BCMV 的机械接种则……

按照上述针对 SMV 所述的相同方案进行。

共免疫沉淀（Co-IP）实验

对于 Co-IP，将携带编码 FLAG 标签的 13g184900 和 HA 标签的 SMV P3（或作为对照的空载体）构建体的农杆菌菌株共同浸润本氏烟（*N. benthamiana*）叶片。浸润后 24 h，收集 1 g 浸润叶片组织，使用研钵和研杵将其在 2 mL 冰冷提取缓冲液中研磨。提取缓冲液含 10% [v/v] 甘油、25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA、150 mM NaCl、10 mM 二硫苏糖醇、2% [w/v] 聚乙烯吡咯烷酮、0.5% [v/v] Triton X-100 及 Complete 蛋白酶抑制剂混合物。匀浆于 4 °C 下以 18,000 ×g 离心 30 min，随后将上清液与 30 μL 抗 FLAG 琼脂糖珠（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）在 4 °C 下轻柔旋转孵育 2 h。之后用 IP 缓冲液（50 mM Tris-Cl，pH 8.5；100 mM NaCl；1 mM EDTA）洗涤珠子六次，将其重悬于 SDS-PAGE 上样缓冲液（150 mM Tris-HCl，pH 6.8；30% 甘油；6% SDS；0.3% 溴酚蓝；300 mM DTT）中，并于 95 °C 煮沸 5 min。洗脱蛋白经 SDS-PAGE 分离后转移至 PVDF 膜，并使用抗 FLAG（Sigma-Aldrich，货号 A8592，1:10,000）和抗 YFP（Sigma-Aldrich，货号 SAB4301138，1:10,000）一抗进行免疫印迹检测，随后使用 HRP 偶联的山羊抗兔二抗（Sigma-Aldrich，货号 A0545，1:10,000）。通过膜的 Ponceau S 染色确认蛋白上样量一致。

RT–qPCR 分析

使用 FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme Biotech，中国南京）从大豆叶片中提取总 RNA。采用 HiScript III RT SuperMix（Vazyme Biotech，中国南京）将提取的 RNA 反转录为 cDNA。我们使用 ChamQ 进行 qRT-PCR。

采用 Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech，中国南京），在 ABI Prism 7500 Fast 实时荧光定量 PCR 系统（Life Technologies，美国马萨诸塞州贝弗利）上进行检测。

GmActin11 用作内参。

酵母双杂交（Y2H）实验

将不同组合的诱饵载体（pGBKT7/BD）和猎物载体（pGADT7/AD）共转化至 Y2H Gold 酵母细胞中。首先将转化子接种于缺少色氨酸和亮氨酸的合成限定培养基（SD/-Trp-Leu）上，并于 28 °C 培养 3 天。随后，将酵母细胞用 ddH₂O 按 1:1（v/v）稀释，接种于 SD/-Trp-Leu-His-Ade 培养基上，并于 28 °C 培养 3 天。转化了 BD-P53 和 AD-SV40T 的酵母用作阳性对照。

荧光素酶互补成像（LCI）实验

分别将 Glyma13g184900 的 CC、NB-ARC 和 LRR 结构域编码序列，以及 SMV 和 BCMV 的全长 P3 编码序列，克隆至萤火虫荧光素酶 N 端（nLUC）和 C 端（cLUC）载体中。所有重组构建体均经 Sanger 测序验证，并转化至农杆菌（*A. tumefaciens*）GV3101 菌株。为进行瞬时共表达，将相应农杆菌悬液（OD₆₀₀ = 1.0）按等体积混合，并注射至 4–5 周龄本氏烟（*N. benthamiana*）植株的叶片中。注射 24 小时后，将 150 μg/mL 荧光素钾盐（Yeasen，中国上海）均匀喷洒于注射区域。避光孵育 5–10 分钟，使底物渗透并降低背景噪声后，使用低光照冷却 CCD 成像系统（Tanon，中国上海）检测并成像荧光素酶发光信号。

序列比对与系统发育树构建

本研究从大豆品种 Suweon 97 中克隆获得了 13g184900 的全长编码序列。野生……的同源 NLR 序列

从美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库及已发表的野生大豆基因组组装数据中，分别获取大豆种质材料（包括 YSD56、PI483463、Yongin-0、W05 和 F）及大豆栽培品种（包括 ENREI、Kosuzu、Hwangkeum、Hefeng 25、Jinyuan、PI 594527、PI 438471、Wenfeng 7、Nongdadou 2、Tanba、Ooyachi-2、Zhonghuang 13、Tianlong 1、Fukuyutaka、Harosoy、ZN 6、EMBRAPA 537、Lee、UC 8、UA 4805、Williams 82 和 Jack）的序列。使用 MAFFT v7.0 并采用默认参数进行多序列比对。基于比对结果，使用 EMBOSS Needle 工具计算两两核苷酸序列一致性。使用 MEGA-X 中实现的最大似然法构建并可视化 13g184900 及其同源基因的系统发育树。

作者贡献

T.X.R. 和 W.Y.C. 负责监督本研究。T.X.R. 和 Z.H.Y. 设计研究并撰写论文。Z.H.Y. 和 G.B. 完成了大部分实验和数据分析。L.J.Q. 和 Z.Y.Y. 协助培育转基因大豆株系。Z.Y.X.、Y.T.Q.、H.P.L.、T.Y. 和 W.M.H. 参与载体构建和植物栽培。G.L. 协助进行序列比对和系统发育树构建。C.X.Y. 和 C.X. 提供了本研究所用的大豆种子材料。L.K. 和 Z.H.J. 协助开展病原菌接种试验。X.Y. 为研究设计提供了宝贵建议。D.K.X. 为大豆遗传转化提供了技术支持。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

补充图图注

补充图 1.

通过在豇豆子叶中进行瞬时农杆菌浸润，筛选大豆 Rsv1 位点的 NLR 候选基因。a. 瞬时表达 CMV Avr 2a 蛋白后，六种不同豇豆品种的过敏性坏死（HR）表型。

通过农杆菌浸润。pCambia2300 空载体（EV）作为阴性对照。b. 浸润后第 5 天，表达 NLR 基因 13g187900、13g188300、13g190000、13g190300、13g190400、13g190800、13g192100、13g193100、13g193300、13g194100、13g194500、13g194600、13g194700、13g194800、13g194900 和 13g195100，并共表达 SMV-GFP 的豇豆子叶中的 HR 表型。

补充图 2. 低水平表达 13g193100 对 SMV-GFP 无显著抗病毒作用。将携带 13g193100 的农杆菌菌悬液调整至 OD₆₀₀ = 0.05 后进行浸润。共表达 SMV-GFP 感染性克隆与 13g184900 或空载体（EV）对照的豇豆子叶荧光成像。Rep. 1–3 表示 3 个独立的生物学重复。采用丽春红 S 染色作为上样对照。

补充图 3. 本氏烟草（N. benthamiana）叶片瞬时共表达 13g184900 与其他 10 种 SMV 编码蛋白（包括 P1、HC-Pro、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb、CP 和 P3N-PIPO）时的 HR 表型。

补充图 4. 13g184900 编码的 NLR 蛋白的 NB-ARC 和 LRR 结构域不与 SMV P3 蛋白互作。a,b. 本氏烟草叶片中的萤火虫荧光素酶互补成像（LCI）检测。将 13g184900 的 NB-ARC（a）或 LRR（b）结构域与荧光素酶 N 端（nLuc）或 C 端（cLuc）片段融合，并按图示组合与融合有互补荧光素酶片段的 SMV P3 或空载体（EV）对照共表达。c. 酵母双杂交（Y2H）检测表明，13g184900 的 NB-ARC 或 LRR 结构域不与 SMV P3 直接互作。空载体（EV）和 SV40 大 T 抗原（T）/p53 分别作为阴性和阳性对照。

补充图 5. 系统发育分析和序列

七种 SMV 株系 P3 编码序列的同一性分析。将 SMV G2–G7 株系的 P3 核苷酸序列与 G1 株系进行比较。图中显示各株系相对于 G1 的序列同一性百分比。编码 SMV G1–G7 株系 P3 蛋白的核苷酸序列下载自美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库。

补充图 6。

豇豆子叶中 BCMV-GFP 的表达。a. 六个豇豆品种的子叶组织经农杆菌浸润导入携带 GFP 报告基因的 BCMV 全长侵染性克隆后，显示 BCMV-GFP 侵染情况的荧光图像。图像使用倒置荧光显微镜采集。豇豆子叶经农杆菌浸润导入 SMV-GFP 侵染性克隆，并于浸润后 24 h 进行荧光成像。b. 免疫印迹检测六个豇豆品种子叶中经浸润导入 SMV-GFP 侵染性克隆后由 BCMV 表达的 GFP。以 EV 浸润样品作为阴性对照。丽春红 S 染色用作上样对照。

补充图 7。

BCMV P3 与 SMV G1–G7 P3 的序列比对。将 BCMV P3 编码序列（1,041 bp）与七种 SMV 株系的 P3 序列进行核苷酸水平的比对。

致谢

本项目获得以下项目资助：中国国家重点研发计划（2022YFD1401200 和 2023YFD1401000）、中国国家自然科学基金（32430088 和 32220103008）、中国教育部基础学科与交叉学科突破计划（JYB2025XDXM703）、农业与林业生物安全全国重点实验室联合研究计划（编号：SKLJRP2506）、云南省烟草公司重点项目（2025530000241001）及云南种子实验室（项目编号：

202205AR070001）。

基金资助信息声明

中国国家重点研发计划

中国国家自然科学基金委员会

，32430088

，32220103008

中国教育部基础学科与交叉学科突破计划

，JYB2025XDXM703

国家农业和林业生物安全重点实验室联合研究计划

，SKLJRP2506

云南省烟草公司重点项目

，2025530000241001

云南省种子实验室重点项目

，202205AR070001

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大豆 Rsv1 基因座来源的 NLR 通过识别病毒 P3 蛋白赋予对大豆花叶病毒 G1–G7 株系的广谱抗性

bioRxiv

2026.06.29.735421；

doi：https://doi.org/10.64898/2026.06.29.735421

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大豆 Rsv1 基因座来源的 NLR 通过识别病毒 P3 蛋白赋予对大豆花叶病毒 G1–G7 株系的广谱抗性

bioRxiv

2026.06.29.735421；

doi：https://doi.org/10.64898/2026.06.29.735421

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关键词：大豆NLR免疫受体 · Rsv1抗病位点 · 大豆花叶病毒 · P3蛋白识别 · 广谱抗病毒抗性 · 野生大豆驯化

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.29.735421v1?rss=1

来源出处

大豆 Rsv1 位点的 NLR 通过识别病毒 P3 蛋白赋予对大豆花叶病毒 G1–G7 株系的广谱抗性 https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.29.735421v1?rss=1