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包括 SuCas12a2 在内的 Cas12a2 CRISPR 核酸酶已被证实具有广泛的旁切活性，作用底物包括 RNA、单链 DNA（ssDNA）和双链 DNA（dsDNA）。这种旁切活性可导致靶向细胞清除，并可应用于生物技术、农业和人类健康领域。我们探究了 Cas12a2 核酸酶的天然遗传多样性，并在大肠杆菌（E. coli）中通过 DNA 损伤动力学实验表征了九种新型直系同源蛋白。研究发现，三种新的 Cas12a2 直系同源蛋白（RsCas12a2、SdCas12a2 和 HmCas12a2）对 DNA 具有较强的旁切活性。这些核酸酶与 SuCas12a2 的序列差异显著，同时保留了核心 RuvC 催化残基；此外，在此前报道的、负责将核酸定位于活性位点所必需的芳香族夹钳残基处，它们也表现出序列多样性。我们确定了每种高活性 Cas12a2 核酸酶对 PFS 的偏好及其错配耐受性，从而扩展了现有的 Cas12a2 工具箱；同时还发现了具有明显下游应用影响的功能差异。
Cas12a2 直系同源核酸酶的比较表征揭示了可用于可编程细胞清除的高活性核酸酶 | bioRxiv
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Cas12a2 直系同源核酸酶的比较表征揭示了可用于可编程细胞清除的高活性核酸酶
Anna L. Singer、Emma E. January、Erin K. Zess、Allison J. N. Antonakos、Matthew B. Begemann
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.23.734040
Anna L. Singer¹
Confluence Genetics, LLC，美国密苏里州圣路易斯，邮编 63132
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Emma E. January¹
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Matthew B. Begemann¹
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已有研究表明，Cas12a2 CRISPR 核酸酶（包括 SuCas12a2）对 RNA、单链 DNA 和双链 DNA 具有广泛的旁切活性。这种旁切活性可导致靶向细胞清除，并在生物技术、农业和人类健康领域具有应用前景。我们探索了天然的……
Cas12a2 核酸酶的遗传多样性，并在大肠杆菌（E. coli）DNA 损伤动力学测定中表征了九种新型直系同源物。研究发现，三种新的 Cas12a2 直系同源物（RsCas12a2、SdCas12a2 和 HmCas12a2）对 DNA 具有较强的附带活性。这些核酸酶与 SuCas12a2 的差异很大，保留了 RuvC 催化核心残基；此前报道的、负责在活性位点定位核酸所必需的芳香夹钳残基则呈现出序列多样性。我们明确了每种高活性 Cas12a2 核酸酶的 PFS 偏好和错配耐受性，扩展了现有的 Cas12a2 工具箱，并发现了会显著影响下游应用的功能差异。
引言
CRISPR–Cas 系统是由 RNA 引导、靶向核酸的蛋白质，细菌和古菌利用它们抵御噬菌体、质粒及其他外源遗传元件［1，2］。除了在适应性免疫中的天然作用外，更广泛的 Cas 核酸酶家族成员还被用作基因组工程和诊断工具，包括精准基因组编辑（Cas9、Cas12a）［3，4］以及转录本水平检测（Cas13）［5］。
已有研究表明，多种 CRISPR–Cas 系统具有附带活性，也称为反式切割活性：初始靶标介导的激活发生后，系统会无差别地降解核酸底物［6，7］。这种次级活性有时被视为脱靶效应，例如 Cas12a 对单链 DNA（ssDNA）的降解［6］；有时则被视为一种可利用的特性，可用于靶向降解核酸，例如 Cas13 对 RNA 的附带活性［7］。Cas12a2 是一类 V 型 CRISPR 核酸酶蛋白，其主要防御机制是非特异性的附带活性。Cas12a2 的附带…
激活发生于RNA引导的识别之后，并导致对RNA、单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）的非特异性切割。这种大规模、无差别的核酸损伤会在细菌宿主中触发SOS反应驱动的DNA损伤应答，最终通过细胞凋亡消除细胞[8]。研究人员已阐明SuCas12a2（来源于Sulfuricurvum sp. PC08-66）旁切活性的生化与结构基础：靶RNA结合会重塑RuvC催化位点，使其能够非特异性地容纳dsDNA、ssDNA和单链RNA（ssRNA）底物[9]。
Cas12a2独特的旁切活性已应用于多个研究领域。SuCas12a2已用于诊断，以高灵敏度检测SARS-CoV-2[10]，以及溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）和肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）感染[11]。研究已证实，SuCas12a2及其相关核酸酶GeCas12a2能够在酿酒酵母（S. cerevisiae）和多种人源细胞系中实现靶向细胞清除[12]。近期发表的研究定量分析了SuCas12a2在人细胞中介导的DNA损伤，并利用随后由DNA损伤诱导的细胞凋亡，选择性清除携带致癌突变的细胞[12, 13]。该研究还探讨了靶标转录本丰度、靶向特异性以及小鼠模型中的递送；综合来看，研究结果表明，SuCas12a2可能成为特定肿瘤应用的可行基因疗法，包括针对“不可成药”的p53致癌突变[13]。Cas12a2的诊断能力也已与肿瘤学应用相结合：一项近期研究显示，Cas12a2可被改造为肿瘤成像纳米探针，通过结合致癌mRNA实现肿瘤可视化[14]。
鉴于其在农业、诊断和人类健康等广泛应用领域的潜在影响，我们……
探索 Cas12a2 核酸酶的天然多样性，以鉴定相较于 SuCas12a2 具有独特特征的新型核酸酶，包括动力学活性、特异性和靶向能力。我们从公开基因组数据中鉴定出 SuCas12a2 直系同源物，并通过初步筛选找出具有功能的 Cas12a2 变体。我们对九种新型 Cas12a2 直系同源物的 DNA 损伤动力学进行了表征，并描述了其原间隔序列侧翼序列（PFS）偏好和靶标错配耐受性。我们鉴定出三种高活性核酸酶，可用于可编程细胞清除，且具有独特的序列特征和功能。
结果
Cas12a2 直系同源物的功能表征鉴定出三种高活性新型核酸酶
我们挖掘了公开基因组数据中的全长 Cas12a2 序列，并从多种宿主相关和环境宏基因组中鉴定出 SuCas12a2 直系同源物，包括白蚁肠道来源的 Reticulitermes speratus、Procryptotermes leewardensis、Hodotermes mossambicus 和 Euhamitermes sp.，猪肠道来源的 Sus domesticus、瑞典泥炭冻土、矿山排水，以及两个垃圾填埋场宏基因组（图 1a，补充图 1）。每个直系同源物均采用一个两字母前缀命名，该前缀取自其细菌来源物种；若细菌尚未分类，则取自其真核宿主。各直系同源物来源生物的完整清单、NCBI 蛋白质登录号及对应的内部代号见补充表 S1。
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补充图 1.
24 种 Cas12 核酸酶的最大似然系统发育树，其中外群 Cas12a 和 Cas12a3 分支已折叠。颜色表示根据后续功能表征确定的活性类别。该系统发育树使用 MEGA12 计算［16】【。
氨基酸序列比对结果（使用 MUSCLE [18]）经 ClipKIT [17] 修剪后构建了系统发育树。使用 iTOL [19] 对树进行可视化，并标示主要节点的 Bootstrap 支持度。比例尺表示基于替换率计算的进化距离。
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图 1.
不同的 Cas12a2 直系同源蛋白具有不同的 DNA 损伤活性。
(A) 24 种 Cas12 核酸酶的最大似然系统发育树，其中外群 Cas12a 和 Cas12a3 分支已折叠（补充图 1）。颜色表示依据功能表征确定的活性类别。(B) DNA 损伤动力学检测示意图。报告系统构建体除 GFP 报告基因外，还包含可诱导表达的 Cas12a2 和 gRNA 表达盒；GFP 由 recA 启动子驱动。靶标结合会激活附带活性，触发 SOS 应答，继而诱导报告基因表达。(C) 9 种新型核酸酶及 SuCas12a2 的代表性 recA-GFP 报告基因动力学曲线。(D) 在最佳拟合线性区间内计算 recA-GFP 报告基因 S 形曲线的斜率，以 SuCas12a2 为基准，并按活性类别排列。
为快速筛查 Cas12a2 直系同源蛋白的附带活性，我们在大肠杆菌中开发了一种 DNA 损伤动力学检测方法，用于定量检测依赖于靶标的 DNA 损伤（图 1b）。该方法测量由 recA 启动子驱动的 GFP 表达；该启动子会响应 DNA 损伤而被诱导。荧光信号按细胞生长情况进行归一化（RFU/OD₆₀₀）（图 1b）。在 3 小时的生长期间，每 30 分钟测量一次，以确定线性区间；随后使用该区间内的数据点计算活性的变化速率（图 1c）。该检测使用了此前已证实在 Cas12a 和 Cas12a2 核酸酶中均具有较高活性的 gRNA 和靶序列 [15, 8]，
并将靶标活性与配对的非靶标对照进行了比较（补充图 2）。
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补充图 2.
Cas12a2 同源蛋白在 DNA 损伤动力学测定中呈现不同的活性特征。展示了针对靶标（蓝色）和非靶标（灰色）质粒时，由 *recA* 驱动的 GFP 信号（RFU/OD600）随时间变化的代表性动力学曲线。
我们观察到，九种新发现的 Cas12a2 同源蛋白中有三种——SdCas12a2、RsCas12a2 和 HmCas12a2——其 DNA 损伤活性与 SuCas12a2 相当（图 1d）。另外两种同源蛋白 StCas12a2 和 PlCas12a2 的 DNA 损伤活性处于中等水平（图 1d）。其余四种——LeCas12a2、Ba4Cas12a2、EuCas12a2 和 GrCas12a2——产生的 DNA 损伤活性处于非靶标对照的范围内，因此被归类为具有背景水平的活性（图 1d）。值得注意的是，DNA 损伤活性水平各异的 Cas12a2 核酸酶分布于相同的系统发育亚支中（图 1a、补充图 1），这表明高 DNA 损伤活性可能在进化过程中多次独立起源。
尽管 LeCas12a2、Ba4Cas12a2、EuCas12a2 和 GrCas12a2 在 DNA 损伤动力学测定中的表现处于背景水平，但所有九种新发现的 Cas12a2 同源蛋白在基于平板的细菌毒性测定中均表现出旁切活性（补充图 3）。这一发现表明，具有背景水平活性的 Cas12a2 组可能积累 DNA 损伤的速度较慢，或者具有 DNA 损伤动力学测定无法捕捉到的其他旁切作用机制。总体而言，初步结果表明，仅凭序列相似性不足以预测具有高 DNA 损伤活性的 Cas12a2 核酸酶（图 1）。
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补充图 3.
(A)
基于平板的细菌毒性测定示意图。将菌株转化，引入两种质粒：质粒 A 携带可诱导表达的 Cas12a2 和 gRNA，质粒 B 携带可诱导表达的靶序列。靶 RNA 的结合会激活 Cas12a2 的附带活性，从而降低菌落存活率。（B）对 9 种新核酸酶的初步筛选结果；根据毒性测定中存活菌落减少的百分比，将其归类为具有功能。
高活性 Cas12a2 直系同源蛋白序列多样，但催化核心保守
为更好地理解 Cas12a2 DNA 损伤活性差异的生化基础，我们比较了 Cas12a2 直系同源蛋白之间的氨基酸序列保守性。分析表明，Cas12a2 直系同源蛋白的序列高度分化，但在关键功能残基附近存在若干高保守、缺口比例较低的区域（Figure 2a）。对高活性 Cas12a2 直系同源蛋白与 SuCas12a2 进行两两氨基酸序列一致性比较发现，RsCas12a2、SdCas12a2 和 HmCas12a2 与 SuCas12a2 以及彼此之间的序列一致性仅为 37–49%（Figure 2b）。相比之下，近期表征的核酸酶 GeCas12a2 [12] 与 SuCas12a2 高度相关（Supplementary Figure 1）。
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图 2. 高活性 Cas12a2 直系同源蛋白序列多样，但催化核心保守。
（A）本文中经功能表征的 10 条 Cas12a2 序列的序列保守性（非缺口）（%）和缺口（%）（上）。依据 SuCas12a2 二元晶体结构（PDB 8D49）[9] 标注的二级结构（下）和关键残基（中）。（B）全长序列的一致性百分比矩阵；（C）SuCas12a2 与高活性 Cas12a2 核酸酶的关键残基映射（蓝色）。氨基酸保守性在】【。
相对于 SuCas12a2，将每个位点评分为相同、保守（保持化学性质）或非保守（发生重大化学变化）。
尽管 Cas12a2 直系同源蛋白的全长序列存在差异，所有受测核酸酶的催化核心均高度保守（补充图 4）。在高活性核酸酶（SdCas12a2、RsCas12a2、HmCas12a2）和 SuCas12a2 中，三个 RuvC 活性位点残基（D848、E1063、D1213）完全相同（图 2c）。切割链（CS）的芳香族夹钳残基 F1092 同样保守，但构成芳香族夹钳、参与核酸定位的其他关键功能残基则更具变异性（图 2c）。在高活性核酸酶（图 2c）及其他受测核酸酶（补充图 4）中，与 SuCas12a2 相比，CS 芳香族夹钳残基 Y1080 和非切割链（NCS）的两个芳香族夹钳残基 Y465、Y1069 均存在保守性或非保守性替换。核酸定位残基呈现出的多样性促使我们进一步探究：高活性 Cas12a2 直系同源蛋白在原间隔序列侧翼序列（PFS）识别和错配耐受性方面是否具有独特偏好。
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补充图 4。
新表征的 Cas12a2 核酸酶在关键功能残基上存在变异。图中标示了此前已表征的两种 Cas12a2 核酸酶（SuCas12a2［8、9］和 GeCas12a2［12］）以及新表征的 Cas12a2 核酸酶的关键残基，并根据 DNA 损伤动力学测定中的活性类别进行颜色编码。各位点相对于 SuCas12a2 的氨基酸保守性评分分为相同、保守（保持化学性质）或非保守（发生重大化学变化）。
原间隔序列侧翼序列（PFS）与】【。
错配谱分析揭示高活性 Cas12a2 直系同源蛋白具有不同的识别偏好
为表征这些核酸酶对原间隔序列侧翼序列（PFS）的偏好，我们使用 DNA 损伤动力学测定法，检测了三种高活性 Cas12a2 直系同源蛋白（RsCas12a2、SdCas12a2、HmCas12a2）以及 SuCas12a2 对七种 3′-PFS 变体的反应。这七种 PFS 变体根据此前发表的 SuCas12a2 全文库 PFS 表征结果选取 [
8
]。所选序列包括经典的 AAAG PFS、在 -2、-3 和 -4 位点发生单碱基替换的序列（AGAG、GAAG、AAGG），以及差异逐渐增大的序列（ACUU、GUGG 和 ACCA）（图 3a）。评估了各 Cas12a2 直系同源蛋白在经典 PFS 下的绝对活性，并据此对其在非经典 PFS 序列上的活性进行归一化（图 3b）。
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图 3.
高活性 Cas12a2 直系同源蛋白具有不同的 PFS 谱和错配耐受性。
（A）本研究使用 DNA 损伤动力学测定法检测的累积 PFS 谱及靶标错配系列。最上方的序列为经典 PFS（AAAG）及完全匹配的 RNA 靶标，用于评估所有变体的活性。PFS 变体中发生碱基替换的位置以绿色标出；错配变体中发生碱基替换的位置以黄色标出。（B）各 PFS 变体相对于 AAAG 经典 PFS 的活性热图。（C）各错配变体相对于 0MM 靶标的活性热图。
SuCas12a2 在 AGAG、GAAG、AAGG 和 ACUU 条件下仍保持较强的 DNA 损伤活性，这总体上与此前报道的其对非经典 PFS 序列的耐受性一致 [
8
]。有趣的是，RsCas12a2 可耐受的 PFS 序列范围较窄，并且在 AGAG 和… 处表现出较高的相对活性。
GAAG 的活性高于典型的 AAAG PFS 序列（p 值 < 0.005）。SdCas12a2 展现出独特且细致的 PFS 偏好：在此前无法利用的 GUGG PFS 上具有中等 DNA 损伤活性，而在 AGAG、GAAG 和 AAGG 上则具有强 DNA 损伤活性（图 3b）。这些不同的 PFS 偏好或可使 RsCas12a2 和 SdCas12a2 用于特定应用，从而实现目前使用 SuCas12a2 尚无法达到的效果。
接下来，我们探究了活性最高的三种 Cas12a2 同源蛋白在靶向序列中对错配碱基对的耐受性是否也存在差异。我们合成了一系列靶向质粒，其中包含与向导 RNA 不匹配的 1、2、3 或 4 个碱基对（图 3a）。将各靶标的活性归一化至无错配对照，并使用 DNA 损伤动力学测定法评估 DNA 损伤活性。SdCas12a2 对其原间隔序列中的错配耐受性最高，在含 1、2 和 3 个错配的靶标变体上均产生了强至中等程度的 DNA 损伤活性。SuCas12a2 和 RsCas12a2 的耐受性特征相似，在含 1 个和 2 个错配的靶标上均产生 DNA 损伤活性。HmCas12a2 的特异性最强；当靶标中的错配超过 1 个时，其活性仅处于背景水平（图 3c）。因此，这种核酸酶是靶向存在高度相似脱靶序列的转录本序列的有力候选工具。
讨论
本研究对九种新的 Cas12a2 同源蛋白进行了功能表征，并鉴定出三种具有高 DNA 损伤活性的核酸酶：SdCas12a2、RsCas12a2 和 HmCas12a2（图 1）。在所有十种受测 Cas12a2 同源蛋白中，负责核酸切割的 RuvC 活性位点残基高度保守。这一结果并不令人意外，表明这些催化位点在进化过程中……
受到限制（图 2）。相比之下，芳香族钳夹残基在不同 Cas12a2 直系同源蛋白之间的差异更大（图 2）。研究表明，在 SuCas12a2 中，这些芳香族钳夹残基负责将核酸底物定位于活性位点，并且对旁切活性至关重要 [9]。Cas12a2 直系同源蛋白中这些残基缺乏保守性，提示这些核酸酶在初始靶标切割后可能会发生不同的构象变化，以便在活性位点内定位核酸并实现旁切活性。未来研究需要阐明，功能性 Cas12a2 家族成员的序列差异如何影响蛋白质折叠动力学及底物结合。
原间隔序列侧翼序列（PFS）是 Cas12a2 特异性的关键特征。Cas12a2 要发挥功能，靶转录本中紧邻原间隔序列下游的位置必须存在由四个碱基对组成的序列，该序列可与经典序列（3′ AAAG 5′）不同。具体而言，对 PFS 的识别会触发 Cas12a2 发生构象变化，暴露 RuvC 活性位点，从而启动 RNA 初始切割，并随后产生对双链 DNA、单链 DNA 和单链 RNA 的旁切活性 [8, 9]。本研究鉴定出多种高活性 Cas12a2 核酸酶，其 PFS 偏好性相较于 SuCas12a2 更宽泛或更狭窄（图 3b），分别为拓展可靶向位点范围或提高特异性提供了新工具。对于前一种情况，某些致癌突变在可及范围内并不具有经典 PFS（3′ AAAG 5′）。在这种情况下，例如肝细胞癌的 p53 R249S 热点突变，SdCas12a2 可能能够靶向该位点，因为它能够识别富含 G 的 PFS，如我们的筛选结果所示（GUGG）。
脱靶激活是……
对于 Cas12a2 潜在的肿瘤学应用而言，这一点尤为重要。大多数致癌突变都是患者特异性的单碱基对突变，且位于关键基因中 [
23
,
24
]。Cas12a2 激活的 DNA 损伤必须足够特异，才能以单碱基对分辨率清除细胞，同时保留正常健康细胞。Cas12a2 的特异性将取决于 PFS 适配性与原间隔序列错配的共同作用，以此判断发生非预期 Cas12a2 附带活性的可能性。在 PFS 特异性较高的一侧，我们鉴定出 RsCas12a2；在测试的 PFS 序列中，它仅偏好其中三种（图 3b）。这种核酸酶或许更适用于人类健康相关应用，因为此类应用需要限制脱靶活性，而 PFS 适用范围过广可能会增加脱靶位点 [
22
]。此外，我们还在 DNA 损伤动力学测定中发现，与 Cas12a2 家族的其他成员相比，HmCas12a2 的 DNA 损伤活性对原间隔序列内错配的耐受性较低。此前研究已表明，SuCas12a2 在哺乳动物细胞培养系统中具有单碱基对特异性 [
13
,
12
]。这提示，本文采用的基于
E. coli
的动力学测定对 DNA 损伤具有更高的灵敏度，或者哺乳动物细胞培养系统的生理条件存在足够差异，从而限制了错配活性。将 SuCas12a2 在哺乳动物培养系统中的结果与本文所述结果进行比较后，我们推测，在真核系统中，HmCas12a2 对错配的耐受性可能与 SuCas12a2 相当或更低。
总之，RsCas12a2、SdCas12a2 和 HmCas12a2 为 Cas12a2 工具箱提供了互补的新成员，各自适用于不同的应用领域。我们已证明，这些新……
高活性 Cas12a2 直系同源蛋白不能与 SuCas12a2 互换使用；每种蛋白在活性、PFS 识别和错配耐受性方面各具特点，可针对特定的治疗或工业应用进行选择。总体而言，本研究拓展了我们对 Cas12a2 功能多样性的认识，表明不同家族成员的核酸酶行为存在显著差异。随着对 Cas12a2 家族的持续探索，还需确立关键原则，以指导具备强效核酸损伤活性和高特异性的 Cas12a2 工具的筛选与开发。
材料与方法
细菌菌株构建
菌株以购自 Invitrogen 的 *E. coli* BL21-AI 为基础构建。采用转化方式将表达 Cas12a2 和向导 RNA 表达盒的 pACYC 质粒导入 BL21-AI 细胞；Cas12a2 和向导 RNA 分别由 T7 启动子与 Lac 阻遏蛋白系统、T7 启动子驱动。用于 DNA 损伤动力学测定的菌株还在该质粒上包含一个由 *recA* 启动子驱动的 GFP 表达盒。随后，将携带 500–600 个碱基对靶基因序列的第二个 pBR322 质粒转化至已含 Cas12a2 和向导 RNA 的菌株中；该质粒含有或不含 T7 启动子。菌株在含卡那霉素和氯霉素的双重选择条件下培养，并用于后续的细菌毒性和 DNA 损伤动力学测定。
细菌测定
基于平板的细菌毒性测定
首先采用细菌毒性测定，在 *E. coli* 中对新型 Cas12a2 核酸酶进行初步验证。将携带双质粒的菌株接种于含选择性抗生素的 5 mL LB 肉汤培养基中，培养过夜。次日，将新鲜培养物接种为 3 个重复，使其 OD 归一化至约 0.02，并在 37°C、250 rpm 振荡条件下培养 2 小时。Cas12a2 的表达以及……
guide 是通过加入 5 μL 1 M IPTG 和 50 μL 20% 阿拉伯糖诱导表达的。诱导 2 小时后，进行 10 倍系列稀释，随后涂布于含氯霉素的 LB 琼脂平板上，以维持对 Cas12a2 和 gRNA 质粒的筛选。次日计数菌落，并将各处理组的存活率记录为相对于非靶向对照的降低百分比。
DNA 损伤动力学测定
菌株在含筛选抗生素的 5 mL LB 培养液中培养过夜。次日，将各处理组的 3 个重复接种至新鲜的 5 mL 培养液中，使 OD 标准化至约 0.02，并在 37°C、250 rpm 振荡条件下培养 2 小时。取各处理组的 3 个重复样品，每份 100 μL，以等体积 LB 转入透明底 96 孔板中，并加入 2 μL 20% 阿拉伯糖和 2 μL 0.1 M IPTG 进行诱导。在 3 小时的时间过程中，每隔 30 分钟测量一次 OD₆₀₀ 和 GFP 荧光。对各时间点 3 个重复的背景扣除后 RFU/OD₆₀₀ 值取平均，以绘制动力学曲线。
Cas12a2 序列鉴定
通过 BLAST 分析鉴定 Cas12a2 序列。分析所用序列来自 NCBI 和 JGI 的现有原核生物基因组及宏基因组序列，查询序列为全长 SuCas12a2 蛋白序列或高度保守的功能结构域。
系统发育分析
使用 MEGA12 [16]，基于经修剪（ClipKIT [17]）的氨基酸序列比对结果（MUSCLE [18]，基于密码子），构建包含 15 种 Cas12a2 核酸酶的最大似然系统发育树，并以 Cas12a 和 Cas12a3 作为外群。使用 iTOL [19] 对树进行可视化，Bootstrap 值基于 1000 次迭代计算。
序列比对与残基定位
对 10 种已表征的……进行全长序列比对（MUSCLE [18]，基于密码子）。
Cas12a2 核酸酶（SuCas12a2、RsCas12a2、SdCas12a2、HmCas12a2、StCas12a2、PlCas12a2、Ba4Cas12a2、GrCas12a2、LeCas12a2、EuCas12a2）及参考序列 GeCas12a2 [12]。依据 SuCas12a2 二元晶体结构（PDB 8D49）[9] 标注了二级结构元件和关键残基。相对于 SuCas12a2，对关键功能残基的氨基酸保守性进行评分，分为相同、保守性替换（保留化学性质）或非保守性替换（发生重大化学性质变化）。
补充表格
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表 S1。
Cas12a2 同源蛋白组
补充序列
以下提供 Cas12a 外群（4 条序列）、Cas12a2 同源蛋白（15 条序列）和 Cas12a3 外群（5 条序列）的 FASTA 格式补充序列。
Cas12a 外群
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Cas12a2 同源蛋白
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Cas12a3 外群
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脚注
↵
*
第一作者。
参考文献
1.
↵
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摘要
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免费全文
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发布于2026年6月24日。
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《Cas12a2直系同源蛋白的比较表征揭示了可用于程序化细胞清除的高活性核酸酶》
Anna L. Singer、Emma E. January、Erin K. Zess、Allison J. N. Antonakos、Matthew B. Begemann
bioRxiv
2026.06.23.734040；
doi：https://doi.org/10.64898/2026.06.23.734040
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《Cas12a2直系同源蛋白的比较表征揭示了可用于程序化细胞清除的高活性核酸酶》
Anna L. Singer、Emma E. January、Erin K. Zess、Allison J. N. Antonakos、Matthew B. Begemann
bioRxiv
2026.06.23.734040
doi：https://doi.org/10.64898/2026.06.23.734040
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关键词：Cas12a2核酸酶 · CRISPR旁切活性 · 直系同源蛋白 · 核酸酶表征 · 程序化细胞清除
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.734040v1?rss=1