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企鹅为实现翼推进式潜水而演化出鳍状肢，是四足动物肢体特化的一个突出例子。现代企鹅的鳍状肢通过长骨特征性的背腹向扁平化获得结构强化，同时伴有前肢远端肌肉组织的减少；这些特征在不会飞行的潜水鸟类和水生哺乳动物中趋同出现。尽管丰富的化石记录揭示了这些变化发生的形态演变序列，但其背后的演化压力和发育机制仍不清楚。我们发现，在鸟类和哺乳动物的前肢中，扁平的骨形态仅出现在丧失了祖先运动方式的水生谱系中，包括不会飞行的潜水鸟类、鳍足类和鲸类。我们以企鹅胚胎作为研究鳍状肢发育的易于获取的模型，证明其前肢肌肉骨骼形态的早期模式形成与非水生鸟类前肢中的情况相似。相反，鳍状肢表型源于发育后期基因表达以及细胞和组织行为的改变。因此，我们发现，在企鹅前肢发育早期，决定肌肉模式形成的初始信号与其他鸟类并无差异，但胚胎发育晚期细胞增殖的变化导致肌肉大幅减少。同样，企鹅前肢骨最初的横截面比例与能飞行的鸟类相似。然而，这些骨的形状在胚胎发育晚期发生重塑，这一过程与肌腱附着部位骨嵴形成的过程具有共同的分子特征。在这些骨中，形成骨嵴的组织起始于骨的两端（骨骺），并沿外侧边缘延伸至肌腱样结缔组织中骨骼，使长骨沿前后轴增宽，形成扁平的骨骼。利用空间转录组学和比较基因组学工具，我们确定，骨嵴形成组织与长骨软骨之间的差异表达基因显著富集了企鹅谱系中的选择信号，而且这些基因在海洋哺乳动物中也可能发生趋同演化。综上，这些数据表明，企鹅鳍状肢肌肉骨骼形态的演化，是通过在胚胎发育晚期扩展或重新调用通常与肌腱附着位点相关的分子程序而实现的。
胚胎发育晚期新型骨嵴的扩展是圆柱状前肢骨向企鹅鳍状肢扁平骨骼演化转变的基础 | bioRxiv
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胚胎发育晚期新型骨嵴的扩展是圆柱状前肢骨向企鹅鳍状肢扁平骨骼演化转变的基础
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Clifford J. Tabin
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.29.735166
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企鹅为适应翼推进潜水而演化出鳍状肢，是四足动物肢体特化的一个突出例证。现代企鹅鳍状肢的长骨具有特征性的背腹向“扁平化”，并伴随前肢远端肌肉组织的减少，从而使鳍状肢的结构得到强化；这些特征在不会飞行的潜水鸟类和水生哺乳动物中趋同出现。尽管丰富的化石记录揭示了这些变化发生的形态演变序列，但其背后的演化压力和发育机制仍不清楚。我们发现，在鸟类和哺乳动物的前肢中，扁平化的骨骼形态仅出现在丧失了祖先运动方式的水生类群中，包括不会飞行的潜水鸟类、鳍足类和鲸类。我们以企鹅胚胎作为研究鳍状肢发育的易于获取的模型，证明其前肢肌肉骨骼形态的早期模式形成与非水生鸟类前肢中的情况相似。
相反，鳍状肢表型源于发育后期基因表达以及细胞和组织行为的改变。因此，我们发现，在……中
在企鹅前肢发育早期，决定肌肉模式形成的初始信号与其他鸟类并无差异，但胚胎发育晚期细胞增殖的变化导致肌肉大幅减少。同样，企鹅前肢骨骼最初的横截面比例与具有飞行能力的鸟类相似。然而，这些骨骼的形态在胚胎发育晚期发生重塑，其过程与肌腱附着位点处骨嵴形成的分子特征相似。在这些骨骼中，形成骨嵴的组织起始于骨骼两端（骨骺），并延伸至沿骨骼侧缘分布的肌腱样结缔组织中，使长骨沿前后轴增宽，从而形成“扁平”的骨骼。利用空间转录组学和比较基因组学工具，我们确定，骨嵴形成组织与长骨软骨之间的差异表达基因显著富集企鹅谱系中的选择信号，而且这些基因在海洋哺乳动物中也可能发生趋同演化。总体而言，这些数据表明，企鹅鳍状肢肌肉骨骼形态的演化，是通过在胚胎发育晚期扩展或以新方式调用通常与肌腱附着位点相关的分子程序而实现的。
引言
在个体发育及脊椎动物演化过程中，各块骨骼如何获得其独特形态，其发育机制在很大程度上仍不清楚。四足动物肢体长骨的初始模式由肢芽中具有成软骨潜能的间充质细胞凝聚形成，这些细胞凝聚体确立了未来骨骼结构的位置及总体形态。这些凝聚体最初大小相近[1,2]，而其长度的差异
肢体各骨骼要素通过增殖速率的差异[3]、软骨细胞肥大程度的差异[4–7]以及生长停止时间的差异[8]而形成。除了具有精确比例的长度外，各长骨还因局部骨性突起形成骨嵴而具有独特的形态，这些骨嵴为肌腱和韧带等结缔组织提供了稳固的附着位点[9]。
在进化过程中，不同物种的骨骼要素形态发生了显著变化。骨骼比例和形状的改变，尤其是肢体骨骼的改变，促成了脊椎动物运动方式的创新，最终使其能够拓展至原本无法进入的生态位。例如，鸟类和蝙蝠通过趋同进化形成了特化的前肢骨骼要素，从而能够进行动力飞行；而蚓螈、石龙子和蛇类则通过趋同进化出现了显著的肢体退化，以适应侧向波动式运动[10]。
脊椎动物的鳍状肢是肢体衍生性改变中一个尤为有趣的例子，它在龟类、企鹅、鲸类（鲸和海豚）以及鳍足类（海豹和海狮）中独立演化而来。这些谱系都经历了次生海洋适应，即适应陆地生活的四足动物演化出了水生后代。在每个谱系中，这些动物均演化出特化的前肢，其特征是肢体呈扁平状，并伴有明显的侧向增宽或背腹向变薄，从而有利于高效的水下运动。尽管只有部分类群直接利用鳍状肢产生推进力，但所有这些类群都利用鳍状肢的独特形态，将其作为水动力学意义上的“翼面”，以最大限度地提高水中运动的效率[11,12]。
值得注意的是，在鸟类中，翼推进式潜水曾多次独立演化[13]。然而，在现生的翼推进式潜水鸟类中，例如企鹅、潜水鹱（Pelecanoides）、剪水鹱（Puffinus）、鲣鸟（Morus）和河乌（Cinclidae），只有企鹅演化出了鳍状的前肢形态。企鹅是现生鸟类中特化程度最高的类群之一，演化出了多种适应海洋环境的独特特征。企鹅在形态、生理和行为上的一系列适应包括前肢结构的诸多改变，如远端肌肉的肌腱化及丧失[14–16]、前肢骨骼的极度扁平化、翼的缩短，以及翼各节段相对长度的变化[17]，[18]。这些改变共同使企鹅的鳍状肢能够在持续的翼推进式潜水过程中发挥刚性桨和水翼的作用[11,12]。
尽管企鹅是现生鸟类中唯一具有鳍状肢的类群，但在鸟类化石记录中，也可见若干亲缘关系较远、具有鳍状肢形态的不会飞的潜水鸟类，包括翼趾鸟类、曼卡海雀类（或称卢卡斯海雀类）以及大海雀。这些独立演化的现生和已灭绝的不会飞的潜水鸟类谱系，其翼部骨骼结构在形态上的相似性，凸显了鸟类前肢骨骼为提高翼推进式潜水效率而发生的适应性趋同演化；不过，肌肉解剖结构上的差异表明，其肌肉系统的形态趋同程度有限[19]。
这些类群之间所观察到的形态趋同性提示，形成这种形态的发育过程可能存在平行性。然而，目前尚不清楚是否存在
脊椎动物各类群在形成鳍状肢特化结构过程中共有的发育机制。为探究这一问题，我们将注意力转向企鹅鳍状肢的发育。企鹅与不具备其显著前肢形态适应特征的近缘类群之间具有密切的演化关系，同时又能够获取企鹅卵以研究其胚胎发育，因此，企鹅成为理解发育变化如何促使具有鳍状肢的脊椎动物发生骨骼适应性改变的有力研究案例。
在此，我们比较了潜水哺乳动物与鸟类的前肢长骨形态，揭示了这些谱系中导致前肢骨扁平化的平行演化转变。为理解影响鳍状肢肌肉骨骼结构比例与形状的细胞和分子机制，我们进一步研究了企鹅前肢的发育。我们证明，企鹅前肢骨的形态改变并非通过初始骨骼模式形成过程的变化而确立。相反，这些骨骼横截面比例（即纵横比）的改变，是通过胚胎发育晚期骨骺处的骨嵴沿前肢骨前缘和后缘扩展而实现的。这些骨嵴共同表达肌腱和软骨标志物，与适应性及异常骨性突起中在肌腱附着部位形成的骨嵴高度相似。值得注意的是，企鹅胚胎发生过程中骨嵴沿骨骼长轴的延伸，与已灭绝的企鹅干群中骨骼纵横比改变的演化轨迹相吻合。伴随着骨嵴的扩展，企鹅前肢远端的肌肉组织
由于肌肉增殖减少，企鹅前肢远端的鳍状肢逐渐缩小。骨嵴的空间转录组学分析揭示了一些差异表达基因，这些基因在企鹅谱系中富集了基因组选择信号，并且可能在哺乳动物向海洋环境过渡的过程中发生趋同演化。总体而言，这些数据支持这样一种模型：企鹅谱系通过逐步改变肢体发育的晚期过程，演化出了高度衍生的鳍状肢。
结果
前肢骨骼扁平化在丧失其他运动方式的水生鸟类和哺乳动物中趋同出现
我们首先旨在表征鸟类骨骼扁平化的演化模式。此前已有研究记录了潜水鸟类谱系前肢解剖结构的显著变化，但尚未描述整个鸟类系统发育范围内骨骼变化的程度[18]。为量化前肢骨骼形态及其扁平化程度，我们测量了桡骨、尺骨和胫骨骨干的高度（背腹方向）与宽度（前后方向）。我们利用这些测量值，计算了广泛取样的鸟类分类群中各骨骼单元的高宽比（高度/宽度），并将每个物种的尺骨和桡骨数据结合起来，以比较不同演化支的前肢骨骼整体形态（图1B–D和S1A–C）。高宽比接近1.0表示横截面近圆形；高宽比小于1.0表示沿背腹方向扁平化，而高宽比大于1.0则表示沿侧向（前后方向）扁平化。
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图1.
前肢骨骼扁平化在不会飞行的潜水鸟类中趋同出现。
（A）鸡（Gallus gallus）和巴布亚企鹅（Pygoscelis papua）的桡骨与尺骨。（B）现生及已灭绝鸟类桡骨与尺骨的平均横截面高宽比（AR）
物种。图下方的椭圆表示横轴各位置处的骨横截面。AR = 1.0 表示圆形。AR < 1.0 表示背腹向扁平。（C、D）按鸟类亚群对桡骨/尺骨（C）和胫骨（D）的骨高度与宽度进行回归分析。各直线的斜率反映高宽比。椭圆表示不同直线所对应的骨横截面。
能飞鸟类、不能飞行的古颚类以及系统发育分布广泛的能飞潜水鸟类之间，桡骨与尺骨的合并平均高宽比无显著差异（所有比较的校正后 p 值均 > 0.9880）。相比之下，企鹅的桡骨和尺骨高宽比显著低于上述各组，表明其前肢骨显著更为扁平（所有比较的校正后 p 值均 < 0.0001）（图 S1C）。所测各类群的胫骨高宽比均保持一致，表明扁平骨骼是企鹅前肢特有的适应性特征，而非企鹅骨骼发育的一般特征（图 1D）。
为确定已灭绝的干群企鹅是否也具有我们在现代企鹅中观察到的桡骨和尺骨形态改变，我们利用了描述企鹅化石标本的丰富文献。企鹅拥有丰富的化石记录[20–23]，可将企鹅的起源追溯至约 6000 万年前，而企鹅冠群的起源仅可追溯至约 1500 万年前。利用文献中发表的照片和测量数据，我们计算了已灭绝企鹅物种化石的前肢骨高宽比。干群企鹅的桡骨和尺骨平均高宽比显著低于现生不能飞行鸟类、能飞鸟类和能飞潜水鸟类（所有比较的校正后 p 值均 < 0.0001）。将这一分析扩展至已灭绝的不能飞行的潜水鸟类的独立谱系
鸟类也表现出相似的趋势，其中曼卡海雀亚科（Mancallinae）[24]的骨骼显著比现生非企鹅类鸟类更为扁平（与能飞鸟类和能飞潜水鸟类相比，校正后 p 值均 < 0.0001；与不会飞的鸟类相比，校正后 p 值 = 0.0001）（图 1B–C 和图 S1C）。尽管已灭绝、不会飞但能潜水的翼企鹅科物种 H. abashiriensis [25]及大海雀的平均纵横比明显低于能飞鸟类，但由于这些类群各仅有一个物种可供分析，因此未进行显著性检验。在所测量的所有鸟类类群中，现生企鹅表现出最为极端的骨骼形态，其平均纵横比最低；然而，与曼卡海雀亚科相比，这一差异的统计显著性较弱（校正后 p 值 = 0.0228），与干群企鹅相比则无显著差异（校正后 p 值 = 0.8886）（图 S1C）。
这些结果表明，前肢骨的背腹向扁平化至少在三个鸟类谱系中独立演化，而且仅出现在既不会飞又能潜水的谱系中。在高度适应水生环境中运动的鸟类中，前肢骨纵横比反复发生变化，这提示鸟纲以外的水生物种也可能具有相似形态，反映出更广泛的适应或约束模式。为确定其他潜水脊椎动物的前肢骨是否具有相近程度的扁平化，我们测量了水生哺乳动物及相关外群的桡骨和尺骨纵横比（图 2、S2 和 S3）。
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图 2。
桡骨扁平化在鲸类和鳍足类中趋同演化。
（A–C）水生哺乳动物及外群沿桡骨骨干的纵横比（AR）及代表性照片。（A）鲸类（n = 18 个物种）与其他偶蹄类（n = 7 个物种）的比较。
（B）鳍足类（n=7个物种）与其他食肉类（n=14个物种）的比较。（C）水獭类（n=7个物种）与其他鼬科动物（n=7个物种）的比较。（D）鲸类各亚群桡骨中段的AR。仅衍生鲸类具有扁平的骨骼。（其他偶蹄类：n=7个物种；须鲸类：n=3个物种；喙鲸类：n=3个物种；衍生鲸类：n=12个物种）。ns = 差异不显著；* = 校正后p值 < 0.05；* = 校正后p值 < 0.001；** = 校正后p值 < 0.0001。比例尺 = 1 cm。
对鳍足类（海豹和海狮）与鲸类（鲸和海豚）桡骨的测量也表明，与外群相比，其骨骼显著更为扁平。这两个潜水性水生哺乳动物演化支独立演化，均具有水翼形鳍肢[11,12]。除海象外，所有鳍足类的桡骨均显著扁平化；从整体来看，与其他食肉类相比，鳍足类物种的桡骨骨干中段和远端显著更为扁平（校正后p值：近端 > 0.9999；中段 = 0.0007；远端 = 0.0003）（图2B和S2）。总体而言，鲸类物种的桡骨比其他偶蹄类更为扁平，尤其是在桡骨骨干远端（校正后p值：近端 = 0.0190；中段 = 0.0161；远端 < 0.0001）（图2A和S2）。然而，进一步分析发现，在鲸类内部，包含所有须鲸的最早分支演化支须鲸类（Mysticetes），以及喙鲸科（Ziphiidae）[26,27]，与其他偶蹄类相比，其桡骨并未表现出扁平化（校正后p值：非水生偶蹄类与须鲸类比较 = 0.8986；与喙鲸类比较 = 0.6964；须鲸类与喙鲸类比较 = 0.4489）。衍生鲸类的桡骨显著比其他偶蹄类或早期分支鲸类更为扁平（校正后p值：与非水生偶蹄类比较 < 0.0001；与须鲸类比较 =
0.0005；喙鲸 < 0.0001）（图2D和S2）。这表明，尽管扁平的前肢骨已出现在鳍足类的祖先中，但这一性状仅出现在演化上更为衍生的鲸类物种中。有趣的是，水獭利用具蹼的后足和尾部而非前肢推进[12]，且其陆地运动的灵活性明显高于鳍足类，但与其他鼬科动物相比，水獭的桡骨并未表现出扁平化（校正后p值：近端 = 0.2279；中段 > 0.9999；远端 = 0.3943）（图2C和S2）。然而，还应注意，水獭及非水生鼬科动物的桡骨具有扭转形态，这增加了长宽比测量的复杂性（图S3D）。研究还测量了各哺乳动物样本的尺骨，但由于偶蹄类动物的尺骨极度退化，且有时与桡骨融合，哺乳动物尺骨长宽比的比较受到了干扰（图S3A–C）。这些结果表明，在鸟类和哺乳类中，趋同适应以潜水为基础的运动方式的水生物种普遍具有扁平的桡骨。值得注意的是，在这两个演化支中，这一表型仅见于不再保留祖先陆地或空中运动能力的物种，提示二者存在平行的功能约束模式。
与鲸类或鳍足类物种相比，企鹅物种的桡骨扁平化程度显著更高，尤其是在骨骼近端（校正后p值：与鲸类近端相比 = 0.0007；与鳍足类近端相比 < 0.0001；与鲸类中段相比 = 0.0059；与鳍足类中段相比 = 0.2319）。这一差异在尺骨中更加明显，企鹅尺骨沿骨干各测量位置的扁平化程度均显著高于鲸类（校正后p值：近端 < 0.0001；中段 < 0.0001；远端 = 0.0017），并且
在骨干中段和远端均显著比鳍足类的尺骨更为扁平（校正后 p 值：近端 = 0.0513；中段和远端均 < 0.0001）（图 S4）。由于企鹅的桡骨和尺骨比所有其他受测类群表现出更为极端的扁平化，因此可作为这一性状演化的典型实例。
企鹅谱系中前肢长宽比改变的渐进演化
为深入了解企鹅谱系中骨骼增宽的演化过程，我们重点研究了企鹅的尺骨。我们沿尺骨全长测量其宽度，并将现生和已灭绝企鹅的尺骨比例与常用实验模式动物鸡，以及企鹅谱系的近缘类群、前肢长宽比未发生改变的暴雪鹱进行比较（图 3）。鸡和暴雪鹱的尺骨均在骨干两端最宽。
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图 3.
化石企鹅尺骨的渐进性侧向扩展。
（A）现生企鹅和企鹅干群化石沿尺骨全长的标准化宽度，与外群鸡（Gallus gallus）和暴雪鹱（Fulmarus glacialis）的比较。尺骨长度方向上各位置的数值表示该位置的宽度偏离均值的标准差数。（B）企鹅干群和现生企鹅的系统发育树（引自 Cole 等，2022）。（C）现生和已灭绝企鹅的尺骨形态（背侧观）。
相比之下，现生企鹅的尺骨沿骨干中部全长增宽，并在距骨近端约三分之一骨长处达到最宽。在祖先企鹅中，我们观察到鹰嘴逐渐延长的模式。鹰嘴是尺骨近端的骨性突起，与肱骨形成关节，并作为肱三头肌腱的附着点。在
在早期干群企鹅（Muriwaimanu tuatahi [28] 和 Anthropornis nordenskjoeli [29]）中，鹰嘴向远端略微延伸至骨干中央。较晚期的干群企鹅（Palaeeudyptes klekowskii [30] 和 Icadyptes salasi [31,32]）表现出中等程度的鹰嘴远端扩展，而在所测量的分化最晚的干群企鹅化石（Kairuku grebneffi、Kairuku waitaki [29] 和 Archaospheniscus lopdelli [23]）中，鹰嘴向远端扩展的程度与现代企鹅相似（图3）。总体而言，除早期分化的 Delphinornis larseni [29] 表现出出乎意料的鹰嘴远端扩展外，我们发现，在企鹅演化过程中，骨骼增宽从尺骨近端开始逐步向远端推进，直至形成现代企鹅所见的比例。这表明，企鹅的扁平骨骼可能是通过向远端逐渐增宽而演化形成的。
企鹅前肢骨骼的扁平化通过侧方骨嵴的新生发育实现
自1908—1910年第二次法国南极考察期间对巴布亚企鹅（Pygoscelis papua）胚胎前肢开展描述性分析以来[33]，企鹅前肢的发育尚未得到进一步研究。早期描述性报告[33]显示，企鹅特有的前肢形态在卵内形成，但前肢骨骼背腹向扁平化及伴随的肌肉组织缩减发生的时间仍不清楚。从原理上讲，这些形态变化可能源于肢体肌肉骨骼系统早期模式形成过程中的演化改变，也可能源于模式形成后或发育晚期阶段的生长、细胞死亡或其他组织重塑过程的变化。
我们采集了一个时间
对巴布亚企鹅（Pygoscelis papua）胚胎的发育过程进行研究，以探究前肢形态变化背后的发育机制（图4A、B）。巴布亚企鹅群居生活，并在春季中后期相对同步地产卵，因此能够有针对性地采集特定发育阶段的胚胎。当卵因捕食或样本采集而损失时，它们通常会再次产卵[34,35]，从而最大限度地降低采集研究用卵对生态的影响。
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图4.
企鹅前肢骨的扁平化发生于胚胎发育晚期。
（A）巴布亚企鹅胚胎发育分期的代表性图像。（B）企鹅胚胎前肢的发育。（C）HH44期鸡和企鹅前肢横切面的番红O–固绿染色，显示企鹅的肌肉组织减少且骨骼形态发生改变。（D）鸡和企鹅在胚胎期及成年期前肢桡骨和尺骨的纵横比。
我们发现，巴布亚企鹅早期胚胎（直至HH29–31期）的前肢在很大程度上与鸡胚相似。然而，这种相似性随着前肢的发育而发生变化，到HH33期时，其前肢在卵内已呈现出明显的鳍状肢形态（图4B）。尽管前肢芽整体上明显变得扁平，但在HH33期，其桡骨和尺骨的平均纵横比与鸡胚相比并无显著差异（p值 = 0.11），表明导致肢芽扁平化的发育机制与导致骨骼扁平化的机制不同。到HH39期时，企鹅的桡骨和尺骨已显著比鸡胚更为扁平（p值 < 6.9 × 10⁻⁵），此后直至成年，其扁平程度不断增加（图4C、D）。因此，企鹅长骨的初始形态发生形成了横截面呈圆形的棒状原基，与……的相似
雏鸡。正是发育后期的重塑过程形成了骨骼扁平化的表型。
为深入了解企鹅发育后期的差异性重塑，我们对HH38期雏鸡和企鹅前肢的平面切片进行了番红O/固绿染色，以突出显示软骨组织。有趣的是，在这一阶段，巴布亚企鹅的许多前肢骨骼，包括尺骨、桡骨、第二腕掌骨以及若干指骨，均具有从骨骺（长骨的末端）起始并沿骨纵向延伸的软骨嵴状结构。在发育阶段相当的雏鸡前肢同源骨骼中，则不存在这些嵴状结构（图5A）。为了解这些结构在发育过程中的变化，我们在多个时间点观察了尺骨。尺骨嵴首先出现在尺骨近端，并在发育过程中沿尺骨外侧缘逐渐向远端延伸（图5B），与企鹅化石记录中观察到的模式一致。我们推测，这一外侧嵴使尺骨在前后方向上增宽，而骨骼在背腹方向上的“高度”并未发生相应变化，从而形成了我们在成年企鹅骨骼中观察到的扁平化宽高比。与这一假说一致的是，第二腕掌骨远端具有明显的骨骺嵴结构，而第三腕掌骨的两端均未检测到骨骺嵴；在成年企鹅中，第二腕掌骨的宽高比呈现显著的扁平化特征，其宽度几乎是仍保持圆形横截面的第三腕掌骨的两倍（图5A、C）。
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图5.
企鹅前肢骨骼具有骨嵴样结构。
（A）HH38期雏鸡和企鹅前肢平面切片的番红O和固绿染色。
黑色箭头指示企鹅骨骼中的骨嵴样结构。（B）HH33至HH39胚胎阶段巴布亚企鹅尺骨近端平面切片中的DAPI和F-actin染色。虚线勾勒出骨嵴样结构的轮廓。比例尺（右上角）= 500 μm。（C）成年巴布亚企鹅前肢骨的背侧观和远端观。扁平的翼缘以红色标示。长宽比测量结果（右）显示，尺骨和第2腕掌骨（cm2）呈扁平化，而第3腕掌骨（cm3）则未见扁平化。
企鹅鳍状肢远端的肌肉丧失与骨嵴扩展同时发生
发育中的企鹅胚胎前肢骨外侧边缘的骨嵴，类似于其他骨骼单元中肌腱附着点处形成的骨性增生结构。在小鼠中研究过的至少一处此类肢体肌腱附着部位——三角肌粗隆——已证实，肌肉收缩产生的机械力是其持续维持和生长所必需的[36]。因此，我们想知道肌肉收缩是否参与了企鹅骨嵴结构的扩展。值得注意的是，先前对成年企鹅形态的描述表明，企鹅鳍状肢远端明显缺乏肌肉组织[14]。然而，这并不能排除肌肉活动在企鹅前肢骨骼形态变化中的作用，因为从原理上讲，肌肉组织可能在骨嵴形成时短暂存在于发育中的鳍状肢内，并在后期退化。
我们首先探究企鹅的肌肉组织在肢体发育早期是否表现出正常的模式形成和迁移。在脊椎动物中，肌肉祖细胞在体节生皮肌节的腹外侧边缘发生定向分化，随后脱离并迁移至肢芽内，形成背侧和腹侧肌团，并在其中
增殖并分化为成肌细胞。这些肌块随后分隔为独立的肌束，其形态模式由源自侧板中胚层的结缔组织细胞决定[37–41]。在HH26期，我们未观察到鸡与企鹅之间肌肉迁移模式的差异，并且在鸡和企鹅的前肢中均检测到了HGF（一种早期肌肉迁移信号因子）、TCF4（参与模式形成的肌肉结缔组织的标志物）以及PAX3/7（肌肉前体细胞标志物）的表达（图S5A、B）。
鉴于企鹅前肢的肌肉模式形成表面上正常，我们推测肌肉必定在发育后期丢失。在鸡前肢中，前臂节段的肌块在HH33至HH39期之间逐渐增大（图6A、E），且磷酸化H3S10检测显示其细胞增殖水平较高（图6D、F）。尽管巴布亚企鹅前肢前臂节段的肌块在HH33期最初具有与鸡相近的细胞数量（图6B、E），但其肌细胞增殖水平随时间显著下降，每个肌束中的细胞数量并未增加（图6D–F）。巴布亚企鹅肌细胞增殖水平的下降并未伴随细胞凋亡的增加（图6C和S5C）。
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图6.
增殖减少促使巴布亚企鹅前肢肌肉减少。
（A、B）鸡胚（A）和企鹅胚胎（B）前肢中Sox9与肌球蛋白（MF20）的免疫荧光染色。每列展示同一前肢前臂节段从远端（上）到近端（下）的切片。（C）鸡和企鹅前肢前臂节段中的细胞增殖（pH3S10）和细胞死亡（裂解型半胱天冬酶3）。（D）鸡和企鹅前臂节段中的细胞增殖与肌球蛋白。（E）
HH34—38期鸡和企鹅中肢段每个肌束的细胞数量。（F）鸡和企鹅前肢中肢段发育过程中增殖肌细胞的比例。比例尺 = 50 μm。
总体而言，这些结果表明，企鹅鳍状肢中肌肉的缺失是发育后期细胞增殖发生改变的结果，而非早期肌肉命运决定或迁移发生变化所致。肌细胞增殖的减少早在HH35期就已达到显著水平，其发生时间与企鹅前肢骨嵴的形成基本一致。因此，这些时间点肌肉的相对缺乏表明，远端肌肉收缩不太可能是骨嵴维持或延伸所必需的。
前肢骨嵴共表达软骨和结缔组织标志物
如果在企鹅前肢中观察到的嵴状结构与肌腱附着点处的骨嵴通过类似过程形成，那么我们预期这些组织具有相似的基因表达模式。目前，对这类结构的研究以小鼠前肢最为深入，其中已证实，骨粗隆的骨嵴祖细胞共表达肌腱和软骨标志物，例如肌腱标志物腱生蛋白C（TNC）和硬节蛋白（SCX）[42]，以及软骨细胞标志物SRY盒转录因子9（SOX9）[36]。我们进行了空间条形码RNA测序[43]（Light-seq）（图7A），以确定我们在企鹅前肢中观察到的结构是否在转录水平上类似于小鼠肌腱附着点处形成的骨嵴。利用这种靶向的全基因组转录分析技术，我们比较了尺骨软骨细胞、尺骨骨嵴顶端细胞和骨膜结缔组织的转录谱，后者沿着
沿HH38期巴布亚企鹅前肢尺骨的长度方向（图7A–D）。所得转录组在主成分分析（PCA）图中按组织来源聚类（图7B），且各组织均呈现大量显著差异表达基因（DEGs）（图7C、D及图S6）。
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图7.
企鹅骨嵴样结构的分子特征。
（A）采用Light-seq空间条形码RNA测序技术，对HH38期企鹅软骨细胞、尺骨嵴及骨膜结缔组织进行分析。（B）样本的PCA结果按组织类型分离。（C）Light-seq数据中所有差异表达基因的热图。（D）参与发育过程的差异表达基因热图。（E）HH36期尺骨嵴中SOX9和腱生蛋白-C（TNC）的表达。（F）HH36期尺骨嵴及周围结缔组织中抑制素-A（INHBA）和NCAM的表达。（G）HH38期TNC阳性尺骨嵴周围结缔组织中DCN的富集。（H、I）HH36期尺骨嵴尖端及骨膜结缔组织中SCX的表达。（J）横切面显示SCX和BMP4在尺骨外侧共表达。比例尺：200 μm（A）；100 μm（其余各图）。
正如预期，骨膜结缔组织取样检测到了已知在肌腱和韧带中上调的基因，包括原纤维蛋白-2（FBN2）[44]和纤维连接蛋白-1（FN1）[45]；而尺骨软骨细胞则表达已知的软骨标志物，如骨形态发生蛋白受体1B（BMPR1B）和SRY盒转录因子6（Sox6）[46]。新形成骨嵴中的细胞共表达软骨生成标志物，如骨形态发生蛋白4（BMP4）[47]和甲状旁腺激素1型受体（PTH1R）[48]，以及肌腱标志物，如腱调蛋白（TNMD）[42]。这与企鹅尺骨嵴细胞具有类似于其他骨细胞的身份特征相一致
哺乳动物中所描述的骨嵴和骨粗隆。此外，企鹅尺骨嵴细胞表达TGFβ信号通路的成员，已知该通路是小鼠骨嵴发育所必需的[36]。其中，抑制素A（INHBA）是抑制素和激活素复合物的一个亚基，这两种复合物通过TGFβ受体传递相互拮抗的信号[49]；INHBA在发育中的骨嵴中显著上调，而尺骨软骨和骨膜结缔组织均表达TGFβ受体TGFβR3（图7D和S6D）。I型激活素A受体（ACVR1）可与INHBA形成抑制性复合物，阻断受体结合[49]；在我们的数据集中，ACVR1未呈现显著差异表达，但在这三种组织中均有表达（图S6D和S7B、E）。
为直观呈现企鹅骨嵴相关基因的表达模式，我们对软骨和肌腱标志物进行了抗体染色。在HH38期的横切片中，TNC富集于桡骨和尺骨的外侧边缘（图S6E）；在平面切片中，TNC富集于尺骨嵴顶端，并与SOX9共表达（图7E、G）。与我们的RNA-Seq结果一致，并非所有肌腱标志物都在发育中的骨嵴中表达。核心蛋白聚糖（DCN）和神经细胞黏附分子（NCAM）均广泛表达于沿尺骨全长分布的结缔组织中，但在骨嵴中均不表达（图7F、G）。我们还分析了Scx的表达，该基因在肌腱发育中发挥关键作用，但未出现在我们的RNA-Seq数据中（很可能是由于巴布亚企鹅基因组中该基因的注释不完整）。使用可交叉杂交的鸡源荧光原位杂交探针，我们观察到，在骨嵴仅发生轻微延长的HH36期，Scx在两者中均有表达，即在
骨膜结缔组织（图7I）以及尺骨嵴的尖端（图7H）。在该阶段的横切面中，Scx与软骨标志物Bmp4在尺骨外侧边缘即骨嵴将要形成的部位共表达，提示这些因子的表达预示着骨嵴的形成（图7J）。随后，在HH39期，Scx广泛表达于结缔组织和骨嵴中，但正如预期，其在尺骨软骨细胞中的表达已大幅减少（图S7A、D）。
我们数据库中的若干基因在骨嵴中的表达水平尤为高，提示其在骨嵴延伸过程中发挥作用。Rere（精氨酸-谷氨酸二肽重复序列）是一种在发育过程中发挥多重作用的转录抑制因子[50]，在前肢中广泛表达，但在HH39期，其在骨嵴和结缔组织中的表达明显高于尺骨软骨细胞。有趣的是，Rere在骨嵴近端起始部附近结缔组织中的表达水平（图S7C）似乎远高于发育中的尖端处（图S7F），提示结缔组织的基因表达可能沿骨嵴长轴存在差异。在HH36期，INHBA蛋白存在于这三种组织中，但在骨嵴尖端显著上调（图7F）。在HH39期，我们发现其配对受体——激活素A I型受体（ACVR1）在结缔组织中的表达最强，但在整个发育中的骨嵴中也有相当程度的表达（图S7B、E）。
因此，企鹅尺骨外侧的骨嵴表达正常肌腱附着部位所形成的骨隆起的标志物，其中包括此前已被确定为骨粗隆形成所必需的基因，如TGFβ信号通路成员。
与企鹅骨相关的发育程序
骨嵴显示出选择作用的进化印记
在鉴定出与企鹅发育中的尺骨嵴相关的基因集以及这些组织中表达的部分通路后，我们利用现有的基因组数据集，探究这些基因在具有鳍状肢的谱系中是否受到选择压力。为此，我们考察了所鉴定的差异表达基因（DEGs）是否在两个先前发表的数据集中富集：一个包含企鹅基因组中具有选择印记的基因[51]，另一个包含海洋哺乳动物中发生趋同进化的基因[52]。我们发现，高置信度的差异表达基因（假阳性率：q < E-10）在企鹅祖先分支中受到选择的基因数据集中显著富集（p = 0.040），表明这些基因与企鹅特异性适应的进化有关。当我们区分不同的组织比较时，骨嵴相对于尺骨软骨的差异表达基因显著富集于企鹅中受到选择的基因集（p = 0.049），而骨嵴相对于局部结缔组织的差异表达基因则未出现这种富集（p = 0.991）（图8C和表S2）。
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图8.
骨嵴差异表达基因和ACVR1相互作用因子在企鹅中受到选择的基因集中富集。
（A）ACVR1相互作用因子网络。（B）ACVR1相互作用因子在企鹅中受到选择的基因数据集中显著富集，但在海洋哺乳动物的相应数据集中并未显著富集。（C）在两种严格程度的阈值下（上：q < 0.01；下：q < E-10），尺骨嵴与结缔组织（绿色）以及尺骨嵴与软骨（蓝色）之间的差异表达基因（DEGs）。尺骨嵴与软骨之间的高置信度差异表达基因在企鹅中受到选择的基因数据集中显著富集。采用较宽松阈值筛选的尺骨嵴与
软骨差异表达基因（DEGs）在海洋哺乳动物趋同进化基因数据集中呈接近显著水平的富集。* 表示 p < 0.05；(*) 表示 p < 0.10。
在分析海洋哺乳动物趋同进化数据集时，这一关联仍然存在，但仅在纳入范围更广、筛选标准更宽松的差异表达基因集（q < 0.01）时，才在较宽松的阈值（p < 0.10）下达到显著水平。同样，骨嵴与软骨之间的差异表达基因在海洋哺乳动物数据集中显著富集（p = 0.079），而骨嵴与肌腱之间的差异表达基因则未显著富集（p = 0.316）（图8C和表S2）。
在企鹅差异表达数据中，一个尤为值得关注的遗传信号是抑制素/激活素信号传导，表现为 Inhba 在发育中的骨嵴内表达量大幅增加，以及 Acvr1 在整个骨嵴中均有表达，并在周围结缔组织中高表达。Inhba/Acvr1 通过 TGFβ 通路传递信号，调控骨和肌腱的形成，而该通路对于小鼠骨嵴的形成尤为必要[36]。研究还表明，Acvr1 激酶结构域的突变可导致人类进行性骨化性纤维发育不良（Fibrodysplasia Ossificans Progressiva，FOP）中的进行性骨过度生长[53]。此前也有研究记录到，抑制素/激活素网络的成员在次生适应海洋生活的哺乳动物中快速进化。例如，在海洋哺乳动物趋同进化数据集中，潜水哺乳动物的 Acvr2b 表现出差异性序列进化（p = 0.0325）[51]。我们还在 Acvr1 的配体结合结构域中鉴定出多个企鹅特异性突变（图S8），但对这些突变的计算评估并未预测其会对蛋白质功能产生显著影响。为确定抑制素/激活素网络是否在企鹅和海洋
哺乳动物谱系，我们基于 Acvr1 的相互作用构建了一个 STRING 网络（图 8A）。我们检验了该网络成员在企鹅和海洋哺乳动物数据集中的富集情况。Acvr1 相互作用网络成员在海洋哺乳动物趋同进化数据集中未显著富集（p = 0.289），但在祖先企鹅中受选择的基因中显著富集（p = 0.020）（图 8B 和表 S2），提示该通路可能参与了企鹅的特异性适应。
讨论
鳍状肢高度衍生的形态是脊椎动物肢体特化的一个引人入胜的例子。肌腱、肌肉和骨骼等多种组织形态的剧烈变化相互整合，使多个不同的脊椎动物谱系得以适应水生环境。在企鹅中，扁平的骨骼与肌肉丧失、肌腱化及籽骨增多共同作用，可能增强了前肢的刚性，使其能够更有效地作为坚硬的鳍状肢，用于翼推进潜水。此外，这种改变后的扁平形态使鳍状肢能够发挥水翼的作用，在水下“飞行”时提供升力[11,12,14–18,20]。这些高度衍生的特征并非企鹅所独有，而是在水生四足动物中多次趋同出现。
在本研究中，我们发现，在鸟类和哺乳动物中，扁平的前肢骨骼在多个独立的水生谱系中趋同演化形成，这些谱系的水下运动依赖于水翼状鳍状肢的使用。值得注意的是，我们仅在已丧失其他前肢运动方式的鸟类和哺乳动物中观察到前肢骨骼扁平化。企鹅、曼卡海雀类和大海雀这些具有明显扁平骨骼的鸟类，都丧失了……的能力
飞行。相比之下，保留飞行能力的潜水鸟类，包括海燕等依靠翼推进的潜水鸟类，并不具有扁平的骨骼。这一趋势也见于鳍足类和鲸类：前者的行走和奔跑能力已大幅退化，转而利用腹部肌肉使身体在陆地上波动前行；后者则完全丧失了陆地运动能力。水獭虽为水生哺乳动物，但其前肢并不用作鳍状肢，且仍保留灵活的陆地运动能力，因此并不具有扁平的前肢骨。总体而言，这一模式可能源于功能约束：扁平的肢骨对于以前肢作为水翼的物种具有适应性，但对于非水生运动则极为不利，因此，只有在不再需要依靠前肢完成祖先型运动的动物中，才可能演化出这种骨骼形态。与这一假说一致，化石企鹅的前肢骨骼仅在推测发生于白垩纪—第三纪（K–T）界线前后的飞行能力丧失之后，才出现形态特化[23,52]。
在我们测量的所有物种中，企鹅前肢骨的长宽比特化程度最高；企鹅胚胎在母体外的卵内发育，因此适合用于分析这些高度衍生的肢体表型的发育过程。通过组织学和空间转录组学分析，我们证明，前肢骨骼的扁平化并非源于软骨内成骨骨骼最初以软骨模型形式出现时，其背腹轴或“高度”的改变。相反，我们描述了一种随后形成的新型骨嵴样结构：该结构起始于企鹅前肢多根长骨的骨骺，并在胚胎发育晚期沿骨的长轴逐渐延伸，从而有效增加骨骼单元的“宽度”。骨骼
具有此类骨嵴的骨骼，包括尺骨、桡骨和第2腕掌骨，在成年个体中显著扁平化，而缺乏这一结构的骨骼，如第3腕掌骨，则仍保持圆形。这表明，胚胎期骨嵴的存在与成年个体骨骼的扁平化表型密切相关，并且可能在很大程度上促成了这一表型。尽管企鹅是我们唯一能够开展胚胎期研究的物种，但大海雀桡骨外侧缘沿线存在的尖锐嵴状结构表明，该物种可能也趋同演化出了类似的骨嵴扩展机制（图S1G）。从外观上看，鳍足类动物的桡骨和尺骨也具有类似骨嵴的结构，沿骨干的部分区域延伸，这可能表明，这种改变骨骼长宽比的机制存在更广泛的趋同演化。鸟类后肢中还演化出了其他高度特化的嵴状结构，例如已灭绝的潜水鸟类黄昏鸟（Hesperornis）中具有大型骨嵴的髌骨[54]，以及潜鸟的髌突（或胫嵴）（图S1K）[55]；这两类鸟均依靠后肢蹬水潜水。因此，骨嵴扩展可能是支持脊椎动物特化运动方式演化的一种共同机制。
我们的分析表明，在企鹅中，至少直到HH39期，即孵化前仅数日，发育中的骨嵴与长骨软骨之间仍由结缔组织分隔。因此，我们推测，促使各长骨及其相应骨嵴融合为单一连续骨骼单元的骨重塑过程，发生于胚胎发育的极晚期，甚至可能发生于出生后。有趣的是，胚胎发生过程中前肢骨骼沿线骨嵴的发育与……相似
在祖先企鹅化石中观察到的尺骨宽度逐渐增大的现象。因此，我们提出了一个解释企鹅前肢骨骼逐渐扁平化演化的模型：在最终融合成单一、完整的骨性结构之前，较为衍生的类群延长了骨嵴向骨膜结缔组织内延伸和骨化的持续时间，并扩大了其范围。
为探究企鹅前肢骨骼外侧骨嵴的发育机制，我们利用空间转录组学分析了该组织中的基因表达。我们发现，沿企鹅尺骨形成的骨嵴共同表达肌腱、结缔组织和骨组织的标志物。其中许多基因的表达模式与啮齿动物模型中肌腱附着点（附着部）正常发育过程中观察到的模式相似，也与人类某些涉及附着部肌腱异位骨化的病理过程中的表达模式相似，包括强直性脊柱炎[56]和骨赘形成[57,58]。发育中的企鹅骨嵴顶端细胞共同表达Scx和BMP4，其表达模式与小鼠三角肌粗隆中的模式相似。
三角肌粗隆形成的启动由新生肌腱发出的、依赖SCX的BMP信号驱动，而其生长和维持则依赖于肌腱传递的肌肉机械力[36]。TNC是一种肌腱标志物[42]，在发育中的企鹅骨嵴顶端显著上调，并被认为参与了强直性脊柱炎中附着部的新骨形成[56]。企鹅骨嵴中配体和受体表达的改变调节了TGFβ活性；该活性既是正常附着部（肌腱—骨界面）发育所必需的[36]，也足以在小鼠模型中诱发附着部病变，当
异位表达[59]。特别是，抑制TGFβ信号传导的Inhba在整个骨嵴中显著上调。尽管在我们的数据集中，与Inhba作用相反、促进TGFβ信号传导的激活素并未呈现差异表达，但我们在激活素受体Acvr1的配体结合结构域中鉴定出了若干企鹅特异性突变。这一点尤为引人关注，因为Acvr1激酶结构域中的功能增强型突变会导致人类异位骨生长[53]。这些模式共同表明，发育中小鼠肌腱附着部位的骨嵴形成、企鹅特化鳍状肢中的骨嵴形成以及人类相关病理过程，其背后的机制存在相似之处。
研究表明，无论在胚胎发育期间还是在成年动物中，肌腱骨附着点对机械力均具有极强的可塑性，从而使传力结构能够适应力学条件的变化[9,60]。事实上，已有研究表明，某些肌腱骨附着点依赖肌肉收缩所产生的力的传递，才能形成成年形态。例如，尽管小鼠三角肌粗隆的初始形成不需要肌肉活动，但其持续生长依赖肌肉收缩产生的机械刺激[36]。成年企鹅前肢远端的肌肉组织极度退化[14]，这提示前肢骨嵴的延伸可能不依赖肌肉。在本研究中，我们详细描述了企鹅胚胎肌肉组织的减少，这一过程与骨嵴形成在时间上基本同步。肌肉丧失与骨嵴延伸在时间上的重合表明，企鹅依靠远端肌肉收缩来实现骨嵴延伸和维持的可能性较低，但仍不能完全排除。
令人惊讶的是，我们发现前肢肌肉的丧失在
企鹅的这一变化并非通过减少早期肌肉前体细胞的迁移或通过细胞凋亡导致肌细胞死亡来实现，而是通过减少胚胎发育晚期的肌肉细胞增殖来实现。这一发现与既往报道一致：跳鼠后肢远端的肌肉丢失发生在肌肉前体细胞正常迁移的情况下，且未伴随细胞凋亡或坏死的增加[61,62]。在差异显著、最终均表现出远端肌肉丢失的不同分类群中，成肌细胞仍能正常迁移至肢体远端，这可能表明早期肌肉模式形成受到一定程度的发育约束，其原因或许在于，干扰肌肉形成的早期步骤可能产生多效性的不利影响。
在尺骨软骨细胞和结缔组织中，我们鉴定出了一些在企鹅谱系中具有选择信号的差异表达基因集（DEGs），提示其中某些基因的改变可能促成了鳍状肢的演化。具体而言，Acvr1发育网络中的成员及骨嵴差异表达基因在企鹅受选择基因数据集中呈富集。有趣的是，尽管骨嵴共同表达软骨和结缔组织标志物，但只有在骨嵴与软骨的比较中差异表达的基因才表现出企鹅中的选择富集。这表明，骨嵴中表达的非软骨基因（包括骨嵴特有的基因，以及骨嵴与结缔组织共有的基因）受到更强的选择，因此可能推动了扁平骨骼的演化。
哺乳动物的鳍状肢可能通过平行的发育机制发生了趋同演化，甚至可能涉及对某些相同受选择基因的改变
企鹅中的选择。事实上，尽管Acvr1相互作用因子在海洋哺乳动物中并未显著富集于趋同进化相关基因，但在考察企鹅骨嵴与软骨之间的差异表达基因（DEGs）时，我们确实观察到了轻度显著性。尽管这一发现仅限于采用较宽松纳入标准筛选出的差异表达基因集，但这些基因在水生哺乳动物数据集中的富集程度已非常接近通常采用的显著性阈值（p = 0.079）。先前描述海洋哺乳动物中趋同进化基因组元件的研究支持了我们在此的发现，其中详细报告了肌腱相关基因的富集[51]。尽管经历了约3亿年的分化演化，在趋同演化出这些受多基因调控的肢体形态改变的不同演化支之间，仍能发现共同机制关联的模式，这一点相当引人注目。这提出了一种令人期待的可能性：水生哺乳动物与鸟类前肢特化的形成机制之间，可能确实存在趋同的重叠。
综上，我们发现，企鹅鳍状肢的肌肉和骨骼形态并非源于肢体早期模式形成的改变，而是源于胚胎发育晚期模式形成后对现有结构的修饰。企鹅前肢骨骼的扁平化是通过启用一套共同的发育程序实现的，该程序也在肌腱附着部位形成骨嵴。我们推测，在企鹅演化过程中，这些骨嵴可能沿骨骼长轴不断延伸，最终形成现代企鹅所呈现的比例形态。尽管目前仍无法对其他具有鳍状肢样形态的物种开展胚胎学研究，但我们揭示了骨骼在系统发育变化中的相似之处
专门利用前肢进行水中运动的鸟类和哺乳动物的结构及其基因组选择信号。总体而言，这些结果是理解高度特化肢体形态的演化与发育的重要一步。
材料与方法
样本采集
所有胚胎的采集均遵循相应的机构动物护理与使用委员会（IACUC）指南。白来航鸡胚胎购自 Charles River（马萨诸塞州），巴布亚企鹅胚胎依据福克兰群岛研究许可证 R29/2022，采集自西福克兰群岛的韦德尔岛。鸡胚在 38°C 下孵育至适当发育阶段；巴布亚企鹅卵则在预定日期采集，以获得特定发育阶段的胚胎。鸡胚组织在 PBS 中解剖，经 4% 甲醛固定后，进行 OCT 包埋和切片处理。巴布亚企鹅组织在 PBS 中解剖，于 4% 甲醛中保存和运输，并在 4°C 下保存，直至进行 OCT 包埋和切片处理。
免疫荧光、HCR 原位杂交及组织学
固定后的胚胎经蔗糖梯度脱水，最终蔗糖浓度达到 37%，随后以 37% 蔗糖溶液与 OCT（Tissue-Tek）按 50:50 比例混合的包埋液进行包埋。使用 Leica CM3000 冰冻切片机进行切片。进行免疫组织化学染色时，将切片置于含一抗的 PBTS（PBS/BSA 0.2%、Triton 0.1% / SDS 0.02%）中孵育过夜，用 PBST 洗涤 2 次，每次 10 分钟，再与二抗孵育 1 小时，用 PBST 洗涤 2 次，每次 10 分钟，最后用 DAPI 复染。所用一抗包括抗 SOX9 抗体（Millipore）、抗磷酸化 H3S10 抗体（Millipore）、抗切割型半胱天冬酶 3 抗体（Cell Signaling）、抗 TNC 抗体（Millipore）、INHBA/激活素 A 抗体（Invitrogen）、NCAM 抗体（Invitrogen），以及
DCN（Abcam）的稀释比例为1:500，MF20、Pax3和Pax7（均购自Developmental Studies Hybridoma Bank）的稀释比例为1:50。针对鸡Scx和Bmp4的定制HCR原位杂交探针购自Molecular Instruments（MI）。针对企鹅Acvr1、Rere和Pth1r的定制HCR探针由本实验室设计，并以寡核苷酸池的形式向Integrated DNA Technologies（IDT）订购。
进行HCR RNA-FISH时，首先用1× PBS洗涤载玻片2次，每次5分钟，以去除OCT包埋剂，随后将载玻片浸入70%乙醇中1–2小时。在室温下用1× PBS洗涤载玻片2次，每次5分钟，然后加入预热的杂交缓冲液（Molecular Instruments），于37°C孵育10分钟。随后，将载玻片置于含探针的预热杂交缓冲液中，MI探针的终浓度为40–60 nM，IDT探针的终浓度为10 nM，加盖盖玻片后置于湿盒中，于37°C孵育过夜。之后用探针洗涤缓冲液（MI）洗涤载玻片2次，每次30分钟，再于室温下用100% 5× SSCT洗涤2次，每次20分钟。将载玻片干燥后，加入250 μL扩增缓冲液（MI），置于湿盒中，在室温下预孵育30分钟。分别将发夹探针H1和H2于95°C加热90秒，随后在室温下避光冷却30分钟，以完成快速冷却处理。各取4 μL发夹探针，加入500 μL扩增缓冲液（MI）中，使终浓度为48 nM，并于室温下避光共同孵育5分钟。将载玻片干燥后，加入发夹探针溶液，置于湿盒中孵育过夜。随后于室温下用5× SSCT洗涤载玻片3次，每次20分钟，再用DAPI孵育，并用Fluoromount-G封片以供成像。
进行番红O/固绿染色时，先将冷冻切片载玻片置于ddH₂O中洗涤10分钟，用0.08%固绿染色5分钟，再用1.0%乙酸漂洗10秒（之后不再冲洗），
用0.1%番红O染色3分钟，随后在0.5%乙酸中浸蘸一次，再用80%乙醇洗涤2次、二甲苯洗涤2次进行脱水。使用Permount封片，并在尼康体视显微镜下成像。
长宽比测量
使用数字游标卡尺，对哈佛大学比较动物学博物馆（MCZ）馆藏的哺乳类和鸟类成年骨骼标本进行测量（表S1）。© 哈佛大学校长及研究员。
鸟类物种：在骨干的近端、中段和远端区域，分别对高度（背腹方向）和宽度（前后方向）各测量至少2次。每个物种至少测量2根桡骨、2根尺骨和2根胫骨。
哺乳类物种：沿骨干选取三个点，分别对高度（背腹方向）和宽度（前后方向）各测量一次。对于具有明显骨嵴的鳍足类物种，在骨嵴最宽处、紧邻骨嵴下方处以及骨干呈圆形且未经特化的一端进行测量。在条件允许的情况下，测量2根桡骨、2根尺骨和胫骨。为进行亚组间比较（例如鲸类与其他偶蹄类），对每个物种在给定位置（近端、中段、远端）的所有测量值取平均值，并使用代表该物种的单一数值进行统计检验。
胚胎标本：取中肢段中部的横切片，经DAPI染色并使用共聚焦显微镜成像后，在ImageJ（FIJI）中测量长宽比。
已灭绝物种：已灭绝物种的测量值取自文献，或通过描摹并测量已发表的桡骨和尺骨照片获得[24,25,28–32]；大海雀除外，其测量由我们进行
MCZ 馆藏标本的桡骨和尺骨（表 S1）。
使用 R 中 pheatmap 的“scale”功能计算已灭绝企鹅沿尺骨长度方向的相对宽度，该功能先减去均值（中心化），再除以标准差（标准化）。
统计检验：使用 GraphPad Prism 中的单因素方差分析比较成年个体骨骼的测量值。当比较所有类别时，使用 Tukey 多重比较检验校正多重假设检验（图 2D、S1C、S4）；当仅比较部分类别时，则使用 Bonferroni 多重比较检验（图 2A–C）。使用 R 中的 Welch t 检验比较胚胎的长宽比。
成年个体桡骨和尺骨以及大海雀完整关节连接骨架的图像均拍摄自哈佛大学 MCZ 馆藏标本，© 哈佛学院校长及研究员（表 S1）。鸡的完整关节连接骨架图像来自维基共享资源（圣保罗大学兽医与动物科学学院兽医解剖学博物馆，Wagner Souza e Silva）。
Light-seq
在 1× PBS 中分离已固定的 HH38 期巴布亚企鹅前肢中段，经 7% 蔗糖溶液逐级处理后，转入 OCT（Tissue-Tek）与以 1× PBS 配制的 30% 蔗糖溶液按 1∶1 混合的溶液中，随后冷冻，并在涂覆聚-L-赖氨酸的 Ibidi 腔室载玻片上制备厚度为 20 μm 的冷冻切片。将载玻片以 800 rcf 离心 5 分钟以促进切片黏附；随后将载玻片浸入 10 nM、pH 6 的柠檬酸钠溶液中，并在蒸汽加热器中孵育 10 分钟，进行抗原修复。原位逆转录（RT）与加 A 尾、条形码标记、跨接头合成、置换及文库制备均按照此前所述方法⁴⁷进行，并作如下修改。我们在条形码杂交混合液中加入了 2 mg/ml 剪切鲑鱼精子 DNA（Invitrogen）和 10% 硫酸葡聚糖，以减少非特异性
条形码结合。在置换步骤中，于37°C孵育45分钟期间，每隔15分钟用移液器将含RNase H的溶液反复吹打数次，以提高回收率。按照先前所述方法⁴⁷，使用Nextera XT文库制备试剂盒（Illumina）及针对i5端的定制引物，对样品进行标签化片段化。测序在NextSeq500上进行，读长为150，并掺入30%的PhiX。所有重复样本合并后，在同一次NextSeq500测序运行的两个泳道中进行测序。
测序数据分析在哈佛医学院O2集群（Kernel 2.10.0）上使用已发表的Light-seq分析代码进行，所用软件包括Python（v3.7.5）、PyTable（v6.1）、samtools（v1.12）、pysam（v0.17.0）、numpy（v1.21.4）、pandas（v1.4）、Biopython（v1.79）和scikit-bio（v0.5.6）。简而言之，使用UMI-tools（v1.1.1）从Read 1中提取条形码、UMI和cDNA序列。随后，将cDNA序列比对至巴布亚企鹅（Pygoscelis papua）基因组（GenBank组装登录号：GCA_010090195.1）。使用FeatureCounts，通过分数读段计数及GFF注释“CDS”（-M --fraction -g gene_id -t gene）将读段分配至基因，并使用UMI-tools dedup⁷¹按基因进行去重。使用自定义Python脚本⁴⁷，依据条形码序列对读段进行拆分。在R（v6.1）中使用DESeq⁶³进行差异基因表达分析。使用ggplot2（v4.0）绘制火山图，并使用pheatmap函数（v1.0.12）绘制富集基因热图。
比较基因组分析
采用SUMSTAT方法，分别在企鹅祖先进化数据集[52]和海洋哺乳动物趋同进化数据集[51]中，对企鹅组织差异表达基因（DEGs）进行富集分析。与其他基因集富集分析方法相比，该方法已被证明具有较高的统计效能、灵活性和简便性[63–
65]。简言之，将每个基因经对数转换的 p 值求和，并与相同基因集大小的随机抽样得分分布进行比较，以确定富集 p 值。剔除在数据集之间无法映射的所有基因 ID。不同 Q 值阈值下的基因集彼此存在子集关系，因此这些检验并不独立，不宜进行多重假设检验校正。
图 2D、S2、S3A 中的哺乳动物系统发育树使用 PhyloT（https://phylot.biobyte.de），基于 NCBI 分类编号（表 S1）生成。通过对文献[26,27]中须鲸和喙鲸的相对分支长度值取平均，进一步细化了鲸类的系统发育关系。
Acvr1 STRING 网络使用 STRING（https://string-db.org），以智人（Homo sapiens）的 Acvr1 为查询对象生成。
作者贡献
C.L. 和 C.J.T. 构思了本研究。所有作者均参与了实验设计。C.L. 和 H.A.G. 采集了企鹅和鸡的胚胎样本，并对现生鸟类及哺乳动物骨骼进行了测量和摄影。C.L. 完成了组织学、免疫荧光、显微成像、图像定量、Light-seq、测序分析以及企鹅骨骼化石分析。H.A.G. 对成年个体的纵横比进行了统计分析。
C.L. 和 H.A.G. 完成了 HCR 及相关显微成像。S.T. 完成了基因组学和生物信息学分析。C.L. 和 H.A.G. 制作了图件。C.L. 和 C.J.T. 撰写了论文初稿，H.A.G.、M.P.H. 和 C.J.T. 在所有作者提供重要意见和建议的基础上完成了后续稿件。
补充信息图注
图 S1. 企鹅的前肢骨比其他鸟类更扁平。
（A–B）鸟类桡骨和尺骨近端（A）及远端（B）的纵横比（AR）
骨骺。（C）按鸟类亚群比较各物种桡骨和尺骨中段的平均纵横比（AR）。a、b和c彼此之间差异显著。（不能飞行类群：n=3个物种；可飞行类群：n=8个物种；可飞行且可潜水类群：n=12个物种；曼卡海雀亚科：n=4个物种；干群企鹅：n=5个物种；现代企鹅：n=5个物种）。（D–J）代表性鸟类的桡骨和尺骨：（D）小蓝企鹅，（E）王企鹅，（F）巴布亚企鹅，（G）大海雀。箭头指示沿桡骨分布的明显骨嵴。（H）漂泊信天翁（可飞行、可潜水）和巴布亚企鹅（不能飞行、可潜水）桡骨和尺骨的横断面观。（I）北方暴雪鹱和（J）赤脸鸬鹚桡骨和尺骨的侧面观。（K）普通潜鸟胫骨近端发达的骨嵴形成胫骨嵴。
图S2. 按系统发育关系展示水生哺乳动物物种的桡骨扁平化程度。
各哺乳动物物种桡骨中段附近的纵横比测量值。颜色表示哺乳动物的不同演化支。
图S3. 哺乳动物前肢骨纵横比测量中的复杂情况。
（A）各哺乳动物物种尺骨中段附近的平均纵横比测量值。（B）大羊驼的桡骨与尺骨完全融合，导致无法测量尺骨的纵横比。虚线表示融合区域。（C）水牛及其他牛科动物的桡骨和尺骨显著退化并部分融合，使测量变得复杂。（D）水獭的桡骨（左）发生扭转，因此其远端在前后平面内扁平，而非在背腹平面内扁平。水獭的尺骨（右）则易于测量。比例尺=1厘米。
图S4. 企鹅的前肢骨比水生哺乳动物的更扁平。
企鹅（n=5）的平均纵横比测量值，
鲸类（n=18）和鳍足类（n=7）物种桡骨或尺骨骨干沿线三个位置。ns = 无显著性；校正后p值 < 0.01；*校正后p值 < 0.001；****校正后p值 < 0.0001。
图S5. 巴布亚企鹅前肢早期肌肉迁移未见可检测到的改变。
（A）HH26期鸡和企鹅前肢中的肌肉迁移。（比例尺，200 μm）。（B）在HH26期企鹅前肢中可检测到早期肌肉模式形成基因HGF、TCF、PAX7和PAX3。（比例尺，500 μm）。（C）企鹅后肢第3趾外侧缘的剪切型半胱天冬酶3染色阳性对照。（比例尺，50 μm）
图S6. 企鹅前肢空间Light-seq分析鉴定的差异表达基因。
HH38期软骨细胞与骨膜结缔组织（A）以及软骨细胞与尺骨嵴（B）比较中显著上调基因的火山图。（C）FGF受体、配体及Notch通路基因的表达。（D）Light-seq数据中所关注的发育相关基因的表达。（E）HH38期巴布亚企鹅前臂横切面中腱生蛋白-C（TNC）定位的定量分析。
图S7. HH39期Scx、Acvr1和Rere的空间表达。HH39期企鹅尺骨嵴的荧光原位杂交。（A、D）Scx转录本主要局限于结缔组织和嵴中，且在发育中嵴的顶端表达量高于其与尺骨连接处。（B、E）Acvr1在结缔组织中的表达量最高，但在发育中的嵴中也有丰富表达。（C、F）在发育中嵴的顶端附近，Rere在所有组织中的表达水平相近，但在靠近尺骨连接处的结缔组织中表达量更高。
图S8. Acvr1中的企鹅特异性突变。Acvr1配体结合的蛋白质序列比对
结构域根据相似的化学性质和保守性（由 Clustal X 预测）着色。红色星号标示企鹅谱系的基部。底部的红色箭头表示在 Acvr1 中鉴定出的企鹅特异性突变。
表 S1.
所测量的现生物种和化石物种的馆藏编号。
表 S2：
骨嵴差异表达基因（DEGs）和 ACVR1 相互作用因子在企鹅和海洋哺乳动物中富集于受选择的基因。
致谢
感谢 Marie Manceau 提醒我们关注企鹅翼部骨骼结构的适应性变化，并为取得企鹅卵采集许可提供关键帮助。感谢哈佛大学比较动物学博物馆的 Jeremiah Trimble、Kate Eldridge、Mark Omura 和 Madeleine Mullon 在馆藏标本方面提供协助；感谢 Emma West 和 Josie Kishi 就 Light-seq 实验流程提供建议；感谢 Marie Manceau、Camille Curantz 和 Maria Castro Scherianz 协助采集巴布亚企鹅样本；感谢 Lewis Clifton 和韦德尔岛工作人员在样本采集与后勤安排方面提供协助；感谢 Chaitra Prabhakara 在 H.A.G. 无法接触甲酰胺期间慷慨协助开展杂交链式反应（HCR）实验；感谢 Robin Carpenter 协助测量哺乳动物骨骼。成像工作在哈佛医学院 MicRoN 核心平台完成，RNA 测序使用布罗德研究所的 Broad Walk-up 测序服务完成。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）授予 C.J.T. 的 HD 032443 号项目资助。H.A.G. 获得达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会 Lallage Feazel Wall 博士后奖学金（DRG-2447-21）及 NIH K99GM157508 号项目的支持。基因选择的比较分析部分由 NIH 授予 MPH 的 HD115763 号项目资助。
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发表于2026年7月2日。
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胚胎发育晚期新型骨嵴的扩展
是圆柱状前肢骨在进化过程中转变为企鹅鳍状肢扁平骨骼的基础
Charlie
Longtine
，
Hannah A.
Grunwald
，
Stephen
Treaster
，
Matthew P.
Harris
，
Clifford J.
Tabin
bioRxiv
2026.06.29.735166；
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.06.29.735166
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胚胎发育晚期新型骨嵴的扩展是圆柱状前肢骨在进化过程中转变为企鹅鳍状肢扁平骨骼的基础
Charlie
Longtine
，
Hannah A.
Grunwald
，
Stephen
Treaster
，
Matthew P.
Harris
，
Clifford J.
Tabin
bioRxiv
2026.06.29.735166；
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https://doi.org/10.64898/2026.06.29.735166
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关键词：企鹅鳍肢 · 骨骼形态演化 · 胚胎晚期发育 · 骨嵴形成 · 趋同演化 · 空间转录组学
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.29.735166v1?rss=1