离子暴露历史塑造核内膜电压与染色质纹理响应

摘要

尽管生物电日益被认为是细胞功能和形态发生的重要调节因素，该领域几乎完全聚焦于质膜状态。有人提出，核内膜（INM）两侧的电压可能调节核功能，但其如何响应细胞外离子扰动，以及是否与染色质组织相关，仍不明确。在此，我们将比率型基因编码电压指示器 ASAP3-R3 靶向至完整 NRK 细胞中与 SUN2 相关的核膜，并将 INM 电压测量与基于灰度共生矩阵（GLCM）的染色质纹理分析相结合。通过荧光成像和电子显微镜确认了报告蛋白的定位；在分离细胞核中的功能验证表明，抑制钠钾泵会导致 INM 去极化，这与基于 Goldman-Hodgkin-Katz（GHK）模型的预测一致。随后，我们使用经验证的构建体，通过两种处理方式（渐进式〔递增〕暴露或直接施加）测定离子条件变化对 Vnuc 和染色质纹理的影响。在完整细胞中，逐步递增施加不同组的离子溶液（降低钠离子并提高钾离子、降低钠离子、提高钾离子或降低氯离子）会诱导 INM 超极化，并引起染色质纹理的协调变化，包括对比度和熵增加、均匀性降低以及核面积减小。这些效应具有显著的路径依赖性，核响应受到离子暴露历史及顺序的影响：钠离子和钾离子的响应在递增暴露过程中最为明显，而直接暴露于降低氯离子的条件则呈现出更显著的响应特征。直接改变钠离子暴露所产生的变化有限。电学效应和染色质纹理效应，而直接暴露于钾则改变了染色质纹理和核面积，但未显著改变 VNuc。值得注意的是，无论通过曲古抑菌素 A（TSA）诱导染色质松弛，还是通过叠氮化钠/2-脱氧-D-葡萄糖诱导染色质凝缩，以任一方向改变染色质的基线状态，都会减弱钠、钾和氯条件下与离子相关的 Vnuc 及染色质响应。综上，这些发现表明，细胞核是一个动态的离子响应型电结构系统，其中核内膜（INM）电压与染色质组织在功能上相互耦联；离子变化轨迹和既有染色质状态共同决定核响应的幅度。

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离子暴露史塑造内核膜电压与染色质纹理响应

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Hamid Sediqi、Juanita Mathews、Giovanni de Nola、Abigail K. R. Lytton-Jean、Michael Levin

DOI：

https://doi.org/10.64898/2026.06.23.733978

Hamid Sediqi¹

塔夫茨大学 Allen Discovery Center，美国马萨诸塞州梅德福，邮编 02155

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Juanita Mathews¹

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Giovanni de Nola³

麻省理工学院 David H. Koch 综合癌症研究所，美国马萨诸塞州剑桥，邮编 02139

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麻省理工学院 David H. Koch 综合癌症研究所，美国马萨诸塞州剑桥，邮编 02139

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Michael Levin¹˒²

¹ 塔夫茨大学 Allen Discovery Center，美国马萨诸塞州梅德福，邮编 02155

² 哈佛大学 Wyss 生物启发工程研究所，美国马萨诸塞州波士顿，邮编 02115

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通讯作者：

michael.levin{at}tufts.edu

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摘要

尽管生物电日益被认为是细胞功能和形态发生的重要调节因素，该领域的研究几乎完全聚焦于质膜状态。有人提出，核内膜（INM）两侧的电压可能调节核功能，但其如何响应细胞外离子扰动，以及是否与染色质组织相关，仍不清楚。在此，我们将比率型基因编码电压指示器 ASAP3-R3 靶向至完整 NRK 细胞中与 SUN2 相关的核膜，并将 INM 电压测量与基于灰度共生矩阵（GLCM）的染色质纹理分析相结合。荧光成像和电子显微镜证实了报告蛋白的定位；在分离细胞核中的功能验证显示，抑制钠钾泵会导致 INM 去极化，这与基于 Goldman-Hodgkin-Katz（GHK）方程的预测一致。随后，我们利用经验证的构建体，通过两种暴露方式（渐进式〔斜坡式〕暴露或直接施加），测定离子条件变化对 V_nuc 和染色质纹理的影响。在完整细胞中，逐步施加不同组离子溶液，包括降低钠离子/增加钾离子、降低钠离子、增加钾离子或降低氯离子，均会诱导 INM 超极化及染色质纹理的协同变化，包括对比度和熵增加、均一性降低以及核面积减小。这些效应具有显著的路径依赖性，细胞核的响应受到离子暴露历史和顺序的影响：钠离子和钾离子的响应在渐进式暴露过程中最为明显。

相比之下，直接改变氯离子暴露所引发的响应更为显著。直接改变钠离子暴露对电学特征和染色质纹理的影响有限，而直接改变钾离子暴露会改变染色质纹理和细胞核面积，但不会显著改变 V_(Nuc)。重要的是，无论通过曲古抑菌素 A（Trichostatin-A，TSA）诱导染色质松弛，还是通过叠氮化钠/2-脱氧-D-葡萄糖诱导染色质凝缩，向任一方向改变基线染色质状态，都会减弱钠、钾和氯离子条件下与离子相关的 V_(nuc) 和染色质响应。综上，这些发现表明，细胞核是一种动态的、对离子响应的电-结构系统，其中核内膜（INM）电压与染色质组织在功能上相互耦联；离子变化轨迹和既有染色质状态共同决定核响应的幅度。

• 引言

近几十年来，发育生物电学和非神经元生物电学领域受到广泛关注。研究表明，离子通量和膜电压参与的信息处理远不止发生于可兴奋组织^(3–7)。早期研究发现，静息膜电位（Vmem）是有丝分裂和肿瘤性行为的重要调节因素；后续研究则指出，V_(mem)参与调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡和基因表达^(3, 5, 8, 9)。如今，生物电信号不仅被视为生理状态的读出指标，也被认为是在体内调节模式形成、再生以及癌症相关细胞状态转变的指令性调控因子^(3–5, 9)。尽管相关文献大多聚焦于质膜，但人们早已注意到，细胞内细胞器同样具有生物电学特征¹¹。

尤其引人关注的是早期的∎

核膜（NE）两侧电压的发现意义重大，因为这提示细胞核本身可能具有不同于周围细胞质的电学特性。在一项开创性研究中，Loewenstein 和 Kanno 使用微电极测量了 *Drosophila flavorepleta* 腺细胞细胞核，报告称核质边界具有可测量的电阻和静息电位，且核质相对于细胞质约为负 15 mV¹²。重要的是，实验性穿孔破坏核膜后，电位和电阻均消失，这表明这些电学特性依赖于核边界的完整性，而非记录几何结构造成的伪影¹³,¹⁴。这些早期观察确立了一个基本观点：细胞核与细胞质并不一定在电学上连续，核膜可表现为具有自身电学特性的选择性通透边界¹²,¹³。

在随后的数十年间，电生理学研究开始揭示这些早期观察可能涉及的机制。Mazzanti 及其同事对分离的小鼠原核进行膜片钳记录，在核膜上发现了具有多个电导状态的 K⁺选择性通道，其中最大电导约为 200 pS；他们据此提出，这些通道可通过调节 K⁺跨核膜的移动参与形成核膜电位¹⁴。后续研究还在分离的大鼠肝细胞核中发现了氯离子选择性通道¹⁵，重构了由核内膜和核外膜产生的不同离子电导¹⁶，并进一步揭示了更广泛分布于核周边的功能性离子通道谱¹¹。后来的综述将这些发现归纳为这样一种观点：一个……

NE 的“电学维度”意味着核边界具有不可忽略的离子选择性和电压特性，而非仅仅是内质网（ER）的被动延伸¹¹˒¹³。

除被动离子通道外，NE 还可通过主动转运建立离子梯度。Garner 发现，NE 腔与细胞质及核质之间均存在 Na⁺/K⁺ 梯度，并将这些梯度归因于核膜中的 Na,K-ATPase；他据此指出，核孔对 Na⁺ 和 K⁺ 并非自由通透¹。后续研究进一步表明，核膜处的 Na⁺/Ca²⁺ 交换体活性有助于在分化过程中调节核质 Ca²⁺ 稳态，从而将核离子转运与核信号传导联系起来¹⁷。结合关于核通道和转运体的更广泛综述，这些研究支持这样一种观点：核周边主动参与核离子稳态的维持，而非仅对其进行被动区隔¹˒¹¹˒¹³˒¹⁷。

与此同时，核膜电位这一概念始终面临一个显而易见的理论挑战：鉴于核孔复合体（NPC）的直径较大，这种电压如何能够存在？乍看之下，NPC 似乎会在核质与细胞质之间形成宽阔的水相通道，从而使细胞核发生电学短路。然而，这一质疑假定 NPC 如同一个空洞，但现代转运研究文献并不如此描述它。相反，NPC 是一种具有选择性且动态变化的通透性屏障，其中充满 FG 重复序列核孔蛋白；其转运特性受转运受体及细胞生理状态的调节¹⁸–²⁰。直接研究还表明，核孔的通透性是

对包括 Ca²⁺ 在内的离子条件有响应；与此同时，结构研究表明，NPC 直径可随膜力学性质和代谢状态而在活细胞中扩张或收缩²¹–²³。因此，大孔结构的存在本身并不能排除核电压的可能性；相反，这意味着任何核内电状态都应结合一种受调控且具有有限电导的运输屏障来理解，而不能将其视为简单的开放短路¹¹,¹³,¹⁸–²³。

另一个相关问题是，核电压不必仅被概念化为完全混合的核质与细胞质之间的单一标量电势差。核膜（NE）形成了三条相互耦合的离子运动路径：跨越外核膜、跨越内核膜，以及通过 NPC。因此，原则上，即使核孔仍允许一定程度的核质交换，局部离子梯度和电状态仍可存在于某一层核膜两侧，并相对于核周腔形成¹¹,¹³,¹⁴。这一点对于内核膜（INM）尤为重要，因为它与核纤层、周边染色质和基因组组织的联系最为直接²⁴,²⁵。从这个意义上说，关键不在于是否存在核孔，而在于跨核边界的电导是否具有足够的选择性、有限性和调控性，从而允许电状态形成并维持。电生理学和运输领域的文献表明，情况确实如此¹,¹¹,¹³,¹⁴,¹⁸–²³。

还需指出的是，细胞核内部并非一个简单且充分搅拌的水相区室，其中的离子和大分子不会瞬时达到平衡。早期活细胞研究表明，染色质在……中呈受限扩散运动。

局限于核内特定区域，而非在整个细胞核内自由探索；与核仁和核周等结构的结合还会进一步限制这种移动性

26

,

27

。Elizabeth Hinde及其同事的研究拓展了这一观点，表明染色质结构会显著影响分子在细胞核内的流动。他们采用互相关分析，证实了依赖于DNA的分子流动，并表明染色质密度会调节惰性蛋白在细胞核内的扩散路径和时间动态

28

,

29

。近期的力学测量则从另一角度提供了补充证据：染色质呈现黏弹性凝胶状结构，而核质表现为较软的黏弹性相，并非可自由混合的液体

30

。这些观察结果并不能证明核孔复合体（NPC）本身能够维持电压梯度，但它们确实反驳了一种过度简化的观点，即核孔通向一个完全混合的汇。相反，这些结果支持这样一种观点：细胞核内的离子移动和电学平衡发生于拥挤、具有结构且扩散受限的环境中

26

–

30

。

关于核内相分离的研究日益增多，也进一步支持了这一图景。许多核内过程，包括转录调控、DNA复制和RNA加工，都发生在生物分子凝聚体中；这些凝聚体会在特定基因组位点局部富集蛋白质和RNA，而非使其在整个细胞核内均匀混合

31

。相分离本身并不能解释核膜电位如何产生或维持，但它进一步支持了一个更广泛的论点：细胞核内部在物理性质上具有异质性，并存在局部区室化。在这一背景下，有限的核孔

电导特性与受限的核内扩散、染色质构象以及基于凝聚体的区室化共同作用，使核膜处存在局部或持续电状态这一设想，比仅依据核孔直径所作的推断更具合理性^(18–23, 26–31)。

电生理学问题尤为重要，因为核膜也是基因组构象的重要组织者。内核膜（INM）的组成有别于外核膜（ONM），与核纤层紧密相连，并参与染色质组织和基因调控^(24, 25, 32)。染色质本身也对离子环境高度敏感。核小体阵列会响应特定盐环境而发生压缩；钠离子和钾离子对高阶染色质折叠的影响并不相同；即使 DNA 缠绕组蛋白形成核小体后，核小体仍保有显著的负静电场^(33–35)。这些观察提示，能够改变核膜电压的离子扰动也可能影响染色质构象；反过来，基线染色质状态也可能决定细胞核对离子变化所产生电学响应的强弱^(24, 25, 33–35)。

尽管在概念上存在这种关联，目前在完整哺乳动物细胞中直接检测内核膜处的电压仍较为有限。核电生理学文献大多聚焦于分离细胞核、通道鉴定、钙稳态调节或核膜的一般转运特性^(1, 11, 13–17)。尚不明确的是，哪些细胞外离子扰动足以改变完整细胞中的内核膜电压，以及此类电学变化是否伴随染色质构象的协同改变。为回答后一个问题，一种定量的

除电压读数外，还需要一种染色质结构的测量方法。灰度共生矩阵（Gray-Level Co-Occurrence Matrix，GLCM）分析提供了这样一种方法。GLCM 最初由 Haralick 及其同事提出，是一种二阶纹理分析方法，用于量化在给定空间偏移下灰度强度值对出现的频率

36

。它不只测量平均荧光强度，还能捕捉图像中强度值彼此相对的空间排列方式。这对染色质研究尤为有用，因为即使两个细胞核的 DNA 染色平均强度相近，其致密与疏松染色质区域的空间组织也可能存在显著差异。因此，从共生矩阵中提取的对比度、熵和同质性等特征，可为评估核内纹理提供定量方法，并检测仅凭目视观察可能难以发现的染色质组织变化

36

–

38

。

第二项技术要求是使用能够定位至核膜本身的电压报告器。Kim 及其同事近期开发了 ASAP3-R3，这是一种比率型基因编码电压指示器，其中电压敏感的 ASAP3 报告器与电压不敏感的红色荧光蛋白 mCyRFP3 融合，使绿色/红色荧光比值能够报告电压，同时校正运动相关伪影

39

。与此同时，先前的植物研究表明，可通过基于 SUN2 的定位策略将 ArcLight 衍生物靶向核膜

40

；哺乳动物研究则证实 SUN2 是一种内核膜蛋白

41

。这些既有进展使得在哺乳动物细胞中调整比率型基因编码电压指示器（GEVI），用于测量内核膜（INM）电压成为可能。

在本研究中，我们使用一种截短的 SUN2 将 ASAP3-R3 靶向至内核膜（INM）。

序列及连接肽，随后首次利用该报告系统，考察明确的细胞外离子扰动如何影响完整、正常大鼠肾成纤维细胞（NRK-49F）中的核内膜（INM）电压。同时，我们采用对 Hoechst 标记细胞核进行的灰度共生矩阵（GLCM）分析，定量评估染色质纹理。结果表明，提高细胞外钾离子浓度或降低细胞外氯离子浓度会诱导 INM 超极化，并伴随染色质纹理的协调变化；而钠离子扰动则会产生双向响应，具体取决于暴露历程。直接暴露于较低的细胞外钠离子浓度会导致去极化和染色质纹理均一性增加；相较之下，逐步降低钠离子浓度（渐变处理）会诱导超极化，并呈现类似染色质致密化的特征。我们进一步发现，钾离子响应具有显著的顺序依赖性：渐变处理所产生的效应，在直接暴露于相同终点条件时并未出现，揭示了一种动态的非马尔可夫记忆效应。最后，通过实验使染色质松弛或致密化，会削弱离子挑战下正常的电压响应和染色质响应，表明基线染色质状态会限制细胞核的电响应能力。总之，这些发现支持这样一种观点：INM 是一种受调控的生物电膜，其响应具有时间尺度约为 10 分钟的路径依赖性，且核电压动态与染色质组织密切耦联。

• 方法

2.1 分子生物学

CAG ASAP3-R3 构建体由 pc3.1-CAGGS-ASAP3-mCyRFP3 经 NheI 和 HindIII 亚克隆获得；该构建体由 Michael Lin 惠赠（Addgene 质粒编号：193323；http://n2t.net/addgene:193323；RRID:Addgene_193323）。将该片段克隆至含有 CAG 启动子和多克隆位点的 pENTR1A 质粒中。

（MCS）后接入一个 SV40 poly(A)，所使用的位点与从亲本质粒中切除该片段时所用的位点相同。由天然表达的内核膜蛋白 Sun2 的第 26–339 位氨基酸组成的 NLS，通过甘氨酸-丝氨酸连接肽与 ASAP3-R3 的氨基端相连。为进行 Gateway 克隆，首先使用 Telesis BioXP 合成 NLS DNA 序列，随后通过 Gibson Assembly（NEB E2611）将其克隆至 pENTR ASAP3-R3 载体中。随后，采用 Gateway LR Clonase（11791020，ThermoFisher），将所得的 pENTR1A CAG Sun2 ASAP3-R3 重组至基于超活性 piggyBac 转座酶、无需辅助质粒且具有自失活特性的递送系统 pmhyGENIE-3 中。该系统由 Stefan Moisyadi 提供⁴²˒⁴³。pmhyGENIE-3 骨架中含有新霉素抗性基因。所得质粒 HypG3 NeoBB Sun2 ASAP3-R3 使用 ZymoPURE 质粒小量提取试剂盒（D4210，Zymo Research）纯化，并用于后续转染。

2.2 细胞培养

正常大鼠肾成纤维细胞系 NRK-49F（CRL-1570，ATCC）在 Fluorobrite 生长培养基（A1896701，Thermo Fisher）中培养，培养基补充 10% 胎牛血清（FBS）（16140071，Thermo Fisher）、青霉素/链霉素和 GlutaMAX（35050061，Thermo Fisher）。细胞置于 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱中培养；达到 80% 汇合度后进行传代：先用不含钙和镁的 DPBS（D837，Sigma-Aldrich）清洗两次，再用 Accutase（25-058-CI，Corning）解离。细胞使用含 10% 二甲基亚砜（DMSO）（D2438，Sigma）的完全培养基进行冻存。细胞复苏后，至少培养一周再用于实验。

2.3 转染

NRK-49F 细胞在 24 孔板中培养至 30% 汇合度后，进行……

按照制造商的方案，将细胞在 Optimem（31985062，Thermo Fisher）中与 500 ng DNA、P3000 及 1 µL Lipofectamine 3000（L3000008，Thermo Fisher）共同转染。24 小时后更换新鲜培养基，48 小时后使用 Geneticin（1000 μg/ml）筛选转染细胞。14 天后，对细胞进行系列稀释，以获得克隆纯系，并确保其表达和增殖特征符合要求。

2.4 细胞核分离

按照上述方法将细胞从培养板上解离，转移至 15 mL Falcon 离心管中，并以 0.2 rcf 离心 3 分钟。吸去培养基，将细胞沉淀重悬于冰冷的 DPBS 中，再以 0.2 rcf 离心 3 分钟。去除 DPBS 后，将离心管置于冰上，并将细胞重悬于 1 mL 冰冷低渗缓冲液中，该缓冲液含 10 mM Tris-Cl（pH 7.4）、10 mM NaCl 和 0.5 mM MgCl。将细胞置于冰上避光孵育 60 分钟，随后用 27 号胰岛素注射器轻柔吹打 5–10 次，并注意避免产生气泡。每吹打 5 次后，使用 40×物镜在显微镜下检查悬液，以监测细胞裂解情况并避免过度破坏。当约 70–90% 的细胞核从细胞质中释放后，将悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤两次，第二次使用新的滤网。随后将分离出的细胞核重悬于细胞核悬液缓冲液中，该缓冲液含 145 mM KCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl 和 20 mM Tris-HCl（pH 7.4），并补加 1 µM Hoechst 33342。之后将细胞核分为两组：对照组加入等体积 DMSO；处理组加入 50 µM ouabain（Sigma-Aldrich，货号 O3125-5G）和 250 µM strophanthidin。

（MedChemExpress，货号 HY-114252）。

2.5 V_mem 调节处理

将冷冻保存的稳定转染 Sun2 ASAP3-R3 的 NRK-49F 克隆细胞解冻，并在实验开始至少一周前使用完全 Fluorobrite 生长培养基进行培养。成像前 24 小时，将细胞以每孔 20 000 个的密度接种于 96 孔板（Cellvis，货号：P96-1.5P）中。随后，在完全 Fluorobrite 培养基中用 Hoechst 33342（1 µM）对细胞染色 10 分钟，再将其置于 Bonzanni 等人^44 所述的渗透压平衡 Na^+/K^+、Na^+、K^+、Cl^- 系列离子溶液中处理，随后进行成像。

2.6 成像

使用配备 40× 水镜的 ImageXpress HT-AI 共聚焦显微镜采集宽场图像，以表征细胞核 V_mem。Hoechst 染色的细胞核采用 405 nm 激发，并使用 DAPI 滤光片收集发射信号。表达 ASAP3-R3-INM 的细胞分别采用 488 nm 和 586 nm 激发；绿色发射信号使用 FITC 滤光片收集，红色发射信号则使用 Texas Red 滤光片收集。

2.7 全局染色质调节处理

通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性，使用曲古抑菌素 A（TSA）诱导全局染色质松弛。对于钠离子和钾离子系列，将培养于 Cellvis 96 孔板中的 NRK-49F 细胞用 50 nM TSA 处理 24 h 后成像。对于氯离子系列，TSA 的使用浓度为 50–200 nM。对照细胞在含等体积 DMSO 的培养基中处理 24 h。

通过使用叠氮化钠和 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）耗竭 ATP，诱导全局染色质凝缩。将培养于 Cellvis 96 孔板中的 NRK 细胞先置于不完全无葡萄糖 DMEM（Thermo Fisher Scientific，货号 A1443001）中孵育 20 min；该培养基含有 10 mM 叠氮化钠、50 mM

2-DG和1 µM Hoechst 33342。随后，将细胞置于含有相同浓度叠氮化钠和2-DG、不含葡萄糖的离子溶液中，继续处理10 min后进行成像。对照细胞在含有1 µM Hoechst 33342的完全 FluoroBrite 培养基中孵育20 min，随后置于含葡萄糖的离子溶液中处理。

2.8 图像质量控制与处理

使用 Hoechst 染色的细胞核图像生成 ROI 掩膜：先进行高斯模糊（sigma=1），再使用 ImageJ 中的 RenyiEntropy 算法进行阈值分割。在进行纹理分析以及 Sun2 ASAP3-R3 荧光定量之前，对这些图像进行质量控制，以排除模糊图像。模糊检测通过自定义 Python 脚本完成，该脚本实现了一种类似 Tenengrad 的聚焦度量。对每张 Hoechst 图像计算 Sobel 梯度幅值，并测量各分割细胞核 ROI 内的平均梯度强度。排除与图像边缘接触的 ROI；可用 ROI 少于5个的图像也不再纳入后续分析。随后，根据 ROI 聚焦评分的分布，以第25百分位数计算图像级聚焦评分，从而对图像清晰度进行保守估计。对所有符合条件的图像完成评分后，以整个数据集中图像级聚焦评分的第10百分位数作为全局阈值。聚焦评分小于或等于该阈值的图像判定为模糊，并从后续分析中排除；高于该阈值的图像则予以保留。

2.9 Vₘₑₘ 定量

随后，使用非模糊图像集的 ROI 掩膜对 Sun2 ASAP3-R3 的绿色和红色荧光强度进行定量。将这些数值保存为 CSV 文件，并计算 ASAP3-R3-INM 的绿色/红色比值。为计算 ΔVₙᵤc，

ΔG/R（%）除以 41%（即每 100 mV 的变化幅度），再乘以 100〔(ΔG/R)/41% × 100〕。将 Excel 工作表中的数据导入“Prism Graph Pad”，进行统计分析和数据可视化。

2.10 GLCM 纹理分析

使用自定义 Python 流程对保留的 Hoechst 图像进行纹理分析，该流程实现了基于掩膜的灰度共生矩阵（GLCM）分析。在提取特征前，根据完整细胞核掩膜内像素强度的第 99 百分位数，将每幅图像归一化为 16 位强度值。具体而言，将给定图像中所有掩膜阳性像素强度的第 99 百分位数作为归一化参考值，并对图像进行重缩放，使该值对应于 65,535。超过此范围的数值均予以截断。该归一化方法降低了图像间绝对信号强度的差异，同时保留与染色质纹理相关的细胞核内强度关系。

为统一纹理分析所使用的区域，从每个 ROI 中提取以质心为中心的正方形图像块。在最终提取特征前，对所有 ROI 进行扫描以确定可行的图像块尺寸。对于每个 ROI，使用棋盘距离变换估算可完全容纳于 ROI 内的最大偶数边长。根据所得分布，确定分别适用于 80%、90% 和 100% ROI 的最大边长，并据此选定最终用于分析的偶数边长。仅保留完整正方形图像块能够完全落入 ROI 掩膜内的 ROI。

对于每个纳入分析的 ROI，采用基于掩膜的 GLCM 方法，根据提取的正方形图像块量化纹理特征。在计算 GLCM 前，将像素强度量化为 8 个灰度级。共生矩阵

计算所用像素距离为 2、4、8 和 12 个像素，并采用四个角度方向（0°、45°、90° 和 135°）。仅纳入两个像素均位于 ROI 掩膜内的像素对。随后对所得灰度共生矩阵（GLCM）进行对称化和归一化，以生成概率矩阵。基于每个 GLCM 计算三种纹理特征：对比度、同质性和熵。对比度定义为……，用于反映局部灰度变化。同质性定义为……，用于反映共生概率集中在对角线附近的程度。熵定义为……；计算时加入一个较小的常数，以避免零概率值导致数值不稳定。首先在单个 ROI 水平计算纹理特征。随后，对每张图像汇总 ROI 水平的数值，计算各特征的均值和标准差，并记录分析的 ROI 数量。之后进一步汇总这些图像水平的数值，以生成各实验组的统计摘要。针对每个 GLCM 距离分别生成汇总结果。对比度、熵和同质性的变化通过后续解液的数值减去第一种解液的数值得到。

• 结果

3.1 INM 定位型电压指示器（GEVI）：ASAP3-R3 的靶向与验证

为表征核内膜（INM）的电压变化，我们构建了靶向核膜的 ASAP3-R3 融合蛋白：将 SUN2 核靶向序列（第 26–339 位氨基酸）通过柔性甘氨酸-丝氨酸连接肽融合至 ASAP3-R3 的 N 端（图 1A-i）。荧光成像显示，该构建体富集于核膜，与 ASAP3-R3 成功靶向核周区域的结果一致（图 1A-ii）。透射电子显微镜进一步……

证实了 ASAP3-R3-Nuc 定位于核膜，包括定位于由核膜向核质内延伸的 I 型和 II 型核质网内陷中（Figure 1B）。这些观察结果表明，该报告探针定位于具有生物学意义的核膜区室，适用于监测完整细胞中的核内膜（INM）电压动态。

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Figure 1.

ASAP3-R3 成功定位于核内膜。

(A-i) ASAP3-R3-Nuc 构建体设计示意图。将 SUN2 的核靶向区域（由第 26–339 位氨基酸组成）通过柔性甘氨酸-丝氨酸连接肽融合至 ASAP3-R3 的 N 端，以保留 cpGFP 和 mCyRFP3 的荧光特性。(A-ii) 代表性荧光显微图像，分别以绿色和红色显示 cpGFP 与 mCyRFP3 的荧光。白色箭头表示该构建体在核膜处富集。(B) 电子显微图像显示，ASAP3-R3-Nuc 定位于核膜的 I 型和 II 型核质网内陷中。

接下来，我们验证了 INM-ASAP3-R3 是否能够检测已知的核膜电位扰动。在分离的细胞核中，使用斯特rophanthidin和乌本苷抑制核内膜钠钾泵后，与 DMSO 处理的对照组相比，膜电位去极化约 +5 mV（p=0.003，n=10，单样本检验；Figure 2A）。这一实验测得的变化与根据 Goldman–Hodgkin–Katz（GHK）方程以及已报道的核内钠离子¹、钾离子¹和氯离子浓度²估算的膜电位一致；估算时假设采用文献报道的质膜标准通透性比：PK:PNa:PCl ≈ 1:0.03:0.5¹⁰（Figure 2B）。这些发现支持采用

INM-ASAP3-R3 作为 INM 电压变化报告器的应用。

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图 2.

内核膜 ASAP3-R3 的验证。

从 NRK 细胞中分离细胞核，加入 1 µM Hoechst 33342，并在冰上孵育 15 min。随后将细胞核分为两组：对照组加入等体积 DMSO，另一组加入 250 nM strophanthidin 和 50 µM ouabain。之后将细胞核分装至 96 孔板（Celvis），并在室温下孵育 1 小时，以抑制内核膜钠泵；随后使用 ImageXpress Confocal 显微镜成像。Hoechst 33342 使用 405 nm 激发，并通过 DAPI 滤光片采集发射信号；INM-ASAP3R3 的 cpGFP 使用 488 nm 激发，并通过 FITC 滤光片采集发射信号；RFP 结构域使用 586 nm 激发，并通过 Texas Red 滤光片采集发射信号。根据大小和圆度筛选生成分离细胞核的掩膜，并将掩膜膨胀以覆盖核膜，用于定量绿色/红色比值。(A) 抑制 INM 钠钾泵后，细胞核发生 +5 mV 去极化（i），该数值以 DMSO 对照细胞核为基准进行归一化。（n=10，p=0.003，单样本 t 检验；误差线表示标准差）。(B) 该数值与根据 GHK 方程估算的 V_mem 一致；计算采用 Garner¹ 报道的钠、钾浓度和 Satish² 报道的氯离子浓度，并假设标准通透性比 pK:pNa:pCl ≈ 1:0.03:0.5¹⁰。

3.2 混合钠/钾浓度梯度揭示 INM 超极化与染色质纹理重塑之间具有状态依赖性耦联

接下来，我们探究细胞外离子扰动是否会改变 INM 电压，以及这些变化是否伴随可测量的染色质组织变化。我们将细胞暴露于

采用两种方法处理不同的离子溶液：渐进式（递增）暴露，即逐步改变离子溶液，直至达到最终终点浓度；或直接暴露，即立即将外部溶液更换为最终终点浓度。在混合钠/钾校准系列中，直接暴露于单一钠/钾条件，与基线相比，未显著改变核膜电位（Vnuc）（p>0.05，n=10，单因素方差分析；图3A-i）。与此一致，GLCM分析显示，在直接暴露方案下，对比度、熵或同质性均无显著变化（p>0.05，n=10，单样本检验，FDR校正；图3B-i）。然而，直接暴露后核面积显著增加（0.00040.05，n=10，单因素方差分析），但在（ii）递增实验中观察到显著的渐进式超极化，在45 mM钠/100 mM钾时达到约-9 mV（p<0.005，n=10，单因素方差分析）。（B-i）GLCM分析显示，直接暴露后对比度、熵或同质性均无显著变化（p>0.05，n=10，单样本Wilcoxon检验，FDR校正），但核膨胀显著（0.02

0.0004，n=10，单样本检验，FDR校正）。（B-ii）在递增实验中，GLCM分析显示对比度和熵显著渐进增加，同时同质性渐进降低（0.050.05，n=9，单样本检验，FDR校正；图4B-i）。

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图4。

钠系列诱导INM超极化和染色质压缩。

完整NRK细胞在Cellvis 96孔板中培养24 h，随后于37 °C、5% CO₂条件下成像。使用完全FluoroBrite培养基中的Hoechst 33342（1 µM）对细胞染色，之后将培养基】【。

被含钾溶液替代。在直接暴露实验中，细胞暴露于单一钾浓度；在递增实验中，细胞依次暴露于钠浓度逐步降低的溶液。（A）在核内膜（INM）处进行的 ASAP3-R3 测量显示：（i）直接暴露实验中，除 N5 外，所有溶液条件下的核膜电位（Vnuc）均无显著变化（p<0.05，n=14，单因素方差分析）。相反，（ii）递增实验中观察到显著的分级超极化（p<0.05，n=10，单因素方差分析），在钠浓度为 84 mM 时达到约 −10 mV。（B-i）直接暴露后，灰度共生矩阵（GLCM）分析显示，对比度、熵或同质性均无显著变化（p>0.05，n=9，单样本检验，经 FDR 校正）。（B-ii）在递增实验中，GLCM 分析显示对比度和熵显著分级升高，同时同质性分级降低（p<0.05，n=9，单样本 Wilcoxon 检验，经 FDR 校正）；在钠浓度为 84 mM 时，核面积也发生变化。（C）钾系列溶液的离子组成。总体而言，这些发现与染色质压缩增加、结构复杂性增强以及染色质同质性降低相一致。误差线表示标准差。

相比之下，当细胞核经历钠浓度逐步降低的递增过程时，钠浓度降低会使 INM 显著分级超极化，在钠浓度为 84 mM 时达到约 −10 mV（p<0.05，n=10，单因素方差分析；图 4A-ii）。这种依赖于递增过程的电压响应伴随着协同的染色质纹理变化，包括对比度和熵分级升高，以及同质性分级降低（p<0.05，n=9，单样本检验，经 FDR 校正；图 4B】【。

-ii). 核面积单独进行分析，结果显示，在 84 mM 钠条件下核面积显著减小。

因此，钠浓度降低并未产生仅由测量时钠浓度决定的固定 INM 响应。相反，钠的作用取决于细胞核接触该离子条件时所处的时间背景。急性降低钠浓度仅产生有限的电学效应和染色质纹理效应，而逐步降低钠浓度则引发明显的 INM 超极化，并伴随与染色质凝聚相关的纹理变化。这些发现表明，与钠相关的 INM 电压动态具有历史依赖性：细胞核响应受先前离子暴露的影响，而非仅由瞬时钠浓度决定。

3.4 逐步升高钾浓度揭示 INM 电压与染色质纹理重塑之间具有历史依赖性耦合

为确定 INM 电压响应是否仅取决于当前离子条件，还是也受细胞核先前离子暴露历史的影响，我们比较了直接暴露和逐步暴露于仅含钾溶液的情况。在直接暴露条件下，较高钾浓度并未显著改变相对于基线的 Vnuc（p>0.05，n=11，单因素方差分析；图 5A-i）。然而，同样的直接钾暴露改变了染色质纹理：对比度和熵降低，而均一性升高（p<0.05，n=11，单样本检验，FDR 校正；图 5B-i）。直接暴露于钾后，核面积也显著增加（p<0.01，n=11，单样本检验，FDR 校正；图 5B-i）。

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图 5.

钾浓度系列处理诱导 INM 超极化和染色质凝聚。

将完整 NRK 细胞培养于 Cellvis 96 孔板中。

在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 h 后进行成像。使用完全 FluoroBrite 培养基中的 Hoechst 33342（1 µM）对细胞染色，随后将培养基替换为含钾溶液。在直接暴露实验中，细胞暴露于单一钾浓度；在递增实验中，细胞依次暴露于钾浓度逐步升高的溶液。（A）在核内膜（INM）处进行的 ASAP3-R3 测量显示，（i）直接暴露实验中的核膜电位（Vnuc）无显著变化（p>0.05，n=11，单因素 ANOVA）；而（ii）递增实验中则出现显著的分级超极化（p<0.0001，n=19，单因素 ANOVA），在钾浓度为 100 mM 时达到约 −10 mV。（B-i）GLCM 分析显示，直接暴露后对比度和熵显著降低，而均匀性和核面积增加（p>0.05，n=11，单样本 Wilcoxon 检验，FDR 校正）。（B-ii）在递增实验中，GLCM 分析显示对比度和熵显著分级升高，同时均匀性（p<0.05，n=9，单样本检验，FDR 校正）和核面积（p<0.0001，n=19，单样本检验，FDR 校正）分级降低。（C）钾浓度系列的离子组成。总体而言，这些结果与染色质压缩程度增加、结构复杂性增强及染色质均匀性降低相一致。误差线表示标准差。

相比之下，当细胞核在逐步递增过程中接触钾条件时，细胞外钾浓度升高会导致 INM 显著分级超极化，在钾浓度为 100 mM 时达到约 −10 mV（p<0.0001，n=19，单因素 ANOVA；图 5A-ii）。这一电压响应伴随着分级升高的ನ್ನಡ

在染色质对比度和熵方面，同质性呈梯度式下降（p<0.05，n=9，单样本检验，FDR 校正；图 5B-ii），核面积也呈显著梯度式下降（p<0.0001，n=19，单样本检验，FDR 校正；图 5B-ii）。

因此，最终的钾条件并未产生固定的 INM 电压响应。相反，钾的作用取决于细胞核经历离子环境的时间顺序。急性钾暴露改变了染色质纹理，但未显著改变 Vnuc；渐进式钾浓度递增则引起显著的 INM 超极化，并伴随协调一致的、与染色质压缩相关的纹理变化。这些发现表明，INM 电压动态具有历史依赖性和状态依赖性，而非仅仅反映瞬时钾浓度。

3.5 氯依赖的 INM 电压-染色质耦联不同于钠和钾的响应模式

为确定氯相关的 INM 电压响应是否同样受既往离子暴露历史影响，我们接下来比较了直接扰动和递增式扰动下仅改变氯离子的情况。与钠和钾实验系列不同，直接降低氯离子浓度会引起显著的梯度式 INM 超极化（0.0010.05，n=5，双因素 ANOVA）。然而，100 nM TSA 处理显著减弱了 Vnuc 对氯离子实验系列的响应。误差线表示标准差。

致谢

感谢 Patrick McMillen 提供共聚焦显微镜培训。本研究部分由澳大利亚富布赖特委员会、Astonishing Labs 与塔夫茨大学签订的赞助研究协议，以及约翰·邓普顿基金会的 62212 号资助支持。本出版物中表达的观点属于……

作者声明：本文观点不一定代表约翰·邓普顿基金会或富布赖特项目的观点。本研究还获得美国国家癌症研究所 Koch 研究所支持（核心）基金 P30-CA14051 的部分资助。我们感谢 Koch 研究所 Robert A. Swanson（1969）生物技术中心提供支持，尤其感谢 Peterson（1957）纳米技术材料核心设施（RRID:SCR_018674）。

已申报的资助方信息

Astonishing Labs

约翰·邓普顿基金会，

https://ror.org/035tnyy05，62212

美国国家癌症研究所，

P30-CA14051

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关键词：核内膜电压 · 离子暴露历史 · 染色质纹理 · 核电生理 · 路径依赖性

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.23.733978v1?rss=1