结直肠癌中SMAD4 MH2结构域突变干扰CREBBP/EP300募集及TGF-β诱导的转录|北京沫之东生物技术有限公司

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SMAD4是TGF-β信号通路的核心转录效应因子，其编码基因是一种在多种癌症中频繁失活的肿瘤抑制基因。其MH2结构域中的错义突变是结直肠癌（CRC）中最常见的体细胞变异之一。这些突变与疾病进展及不良预后相关，但其确切的机制性影响尚未得到充分阐明。在此，我们发现，来源于CRC的SMAD4 MH2结构域热点突变（D351H、S357P、R361C和R361H）在不影响染色质占据的情况下，选择性地损害共激活因子的募集。RNA-seq分析显示，所有突变体中TGF-β靶基因的表达均受到广泛抑制。值得注意的是，这些突变导致了不同程度的TGF-β通路无应答：R361H对TGF-β刺激完全无应答，而R361C和S357P仍保留部分转录应答能力，提示共激活因子相互作用界面的受损程度存在等位基因特异性差异。利用greenCUT&RUN开展的全基因组染色质结合分析证实，所有突变体均维持与野生型相似的基因组占据模式，这与各突变体的MH1 DNA结合结构域均保持完整的预期一致。在COLO205细胞中开展的邻近依赖性生物素标记质谱分析显示，与野生型SMAD4相比，所有四种突变体与CREBBP/EP300组蛋白乙酰转移酶复合物及BRD4的相互作用均显著减弱，表明共激活因子的结合受到破坏。综上，我们的研究表明，SMAD4 MH2结构域突变通过选择性减少CREBBP/EP300的募集，损害TGF-β诱导的转录，从而为CRC中SMAD4功能丧失表型提供了分子机制解释。图形摘要O_FIG O_LINKSMALLFIG WIDTH=200 HEIGHT=154SRC="FIGDIR/small/735541v1_ufig1.gif" ALT="图 1000">查看大图（24K）：org.highwire.dtl.DTLVardef@1016676org.highwire.dtl.DTLVardef@eddbdaorg.highwire.dtl.DTLVardef@1fce997org.highwire.dtl.DTLVardef@14bce0a_HPS_FORMAT_FIGEXP M_FIG C_FIG

SMAD4 MH2 突变破坏结直肠癌中 CREBBP/EP300 的募集及 TGF-β 诱导的转录 | bioRxiv

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SMAD4 MH2 突变破坏结直肠癌中 CREBBP/EP300 的募集及 TGF-β 诱导的转录

Md Saiful

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Haw Chan

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Fotouhi

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H.T. Marc

Timmers

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https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735541

Md Saiful Islam

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SMAD4 是 TGF-β 信号通路的核心转录效应因子，也是多种癌症中经常失活的抑癌基因。其 MH2 结构域中的错义突变是结直肠癌（CRC）中最常见的体细胞变异之一。这些突变与疾病进展及不良预后相关，但其确切的机制性影响尚未得到全面阐明。本研究表明，源自 CRC 的 SMAD4 MH2 结构域热点突变（D351H、S357P、R361C 和 R361H）在不影响染色质占据的情况下，选择性地损害共激活因子的募集。RNA-seq 分析显示，所有突变体均广泛抑制 TGF-β 靶基因的表达。值得注意的是，这些突变导致 TGF-β 通路呈现不同程度的无应答状态：R361H 对 TGF-β 刺激完全无应答，而 R361C 和 S357P 则保留部分转录应答能力，提示共激活因子结合界面受损的严重程度存在等位基因特异性差异。

利用 greenCUT&RUN 进行的全基因组染色质结合分析证实，所有突变体均保持与野生型相似的基因组占据模式，这与各突变体的 MH1 DNA 结合结构域均保持完整的预期一致。在 COLO205 细胞中进行的邻近依赖性生物素化质谱分析显示，与野生型 SMAD4 相比，所有四种突变体与 CREBBP/EP300 组蛋白乙酰转移酶复合物及 BRD4 的相互作用均显著减少，表明其与共激活因子的结合受损。总体而言，我们的研究结果表明，SMAD4 MH2 突变通过选择性减少 CREBBP/EP300 的募集，损害 TGF-β 诱导的转录，从而为结直肠癌（CRC）中 SMAD4 功能缺失表型提供了分子机制解释。

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引言

TGF-β 信号传导是后生动物中一条基础且功能多样的通路，调控胚胎发育、组织分化和稳态，而其失调可导致多种人类疾病。¹,² 当 TGF-β 配体与 II 型受体（TGFBRII）结合时，该信号通路被激活，随后 II 型受体交叉激活 I 型受体（TGFBRI）。继而，活化的受体作为丝氨酸/苏氨酸激酶，磷酸化下游效应分子。³ 经典信号传导通过磷酸化胞质中的转录因子 SMAD2 和 SMAD3 进行，二者与 SMAD4 形成蛋白质复合物。该三聚体复合物转位至细胞核，⁴,⁵,⁶ 与转录因子及共激活因子协同调控 TGF-β 靶基因的转录。⁷,⁸ SMAD 蛋白分为三类：受体激活型 R-SMAD（SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5 和 SMAD8）、共同介导因子 Co-SMAD4，以及抑制型 SMAD（SMAD6、SMAD7）。大多数 SMAD 蛋白在结构上具有相似性，其共同特征为

两个结构域，即MH1和MH2。⁸˒⁹ MH1结构域与DNA序列相互作用，而MH2结构域负责介导蛋白质间相互作用，包括与其他SMAD蛋白、转录因子、转录辅因子及受体的相互作用。¹⁰˒¹¹ TGF-β信号通路通过抑制细胞周期进程、促进细胞凋亡和防止细胞永生化发挥肿瘤抑制作用。¹² 然而，在包括结直肠癌（CRC）在内的多种癌症中，经常可观察到TGF-β通路组分编码基因（TGFBRI/II、SMAD2、SMAD3、SMAD4）的突变。¹³ 尤其是，TGFBRII在微卫星不稳定型CRC中经常发生突变（占病例的10%–15%），而SMAD4突变则见于10%–30%的CRC。SMAD4突变主要为错义突变，也包括移码突变，可导致突变型SMAD4的表达、蛋白表达降低或完全缺失。SMAD4表达降低的CRC患者总生存期显著缩短，且对5-氟尿嘧啶等化疗药物的敏感性降低。¹⁴–¹⁶ CRC中近90%的SMAD4突变为错义突变，主要影响MH1和MH2结构域。MH1结构域突变会损害DNA结合能力和蛋白稳定性，而MH2结构域突变则会破坏其与SMAD2/SMAD3及其他伙伴蛋白的相互作用。SMAD4错义突变通常被认为是功能丧失性突变。¹⁷˒¹⁸ 既往研究表明，携带MH2结构域突变的SMAD4无法激活TGF-β诱导的基因表达¹⁹，从而促使CRC更具侵袭性。这种转录激活缺陷背后的分子机制尚待探索。

在本研究中，我们重点对来源于CRC的SMAD4突变体与野生型（wt）SMAD4进行比较分析。我们异位表达了带有标签的SMAD4蛋白

在SMAD4缺失的COLO205细胞中，利用多西环素诱导系统将其与GFP或miniTurbo融合表达，以在转录组、基因组和蛋白质组水平比较其功能。我们的结果表明，所有SMAD4突变体在对TGF-β处理的转录应答中均存在缺陷，这可能源于其与CREBBP/EP300等关键共激活因子的相互作用减弱。

材料与方法

细胞培养与克隆

人结直肠癌细胞系COLO205（RRID：CVCL_F402；购自美国ATCC）和人视网膜色素上皮细胞系RPE-1（RRID：CVCL_4388）均在标准生长培养基（DMEM、10% FBS和1%青霉素/链霉素）中培养。

以SMAD4野生型cDNA为模板，通过定点突变PCR反应构建SMAD4突变体。²⁰ 通过在attR1位点上游插入GFP或miniTurbo DNA序列，对慢病毒质粒载体pCW57.1（Addgene #41393）进行改造，以构建带有N端标签的SMAD蛋白。采用GATEWAY克隆技术（Thermo Fisher Scientific），将SMAD4野生型及突变体cDNA构建体转移至改造后的慢病毒载体中，置于GFP或miniTurbo序列下游。所有质粒构建体均经Sanger测序确认。采用慢病毒转导方案建立表达GFP/miniTurbo标记的SMAD4野生型及突变体的细胞系。使用1 µg/ml嘌呤霉素（Invitrogen，美国）筛选转导细胞。所有细胞系在实验前均经确认无支原体污染。

细胞处理

按所示条件，使用1 µg/ml多西环素（Thermo Fisher Scientific # J60579.22）处理细胞过夜。使用10 ng/ml TGF-β（ProteinTech # HZ-1011）处理细胞，并以等体积DMSO作为对照。TGF-β和DMSO的诱导时间为0至30小时不等，具体依据

具体取决于实验。在CREBBP/EP300实验中，细胞在接受TGF-β处理前，先用5 μM A-485（Med Chem Express）处理4小时，并以等体积DMSO作为对照。

免疫印迹

使用2× Laemmli缓冲液（4% SDS、20%甘油、120 mM Tris-HCl，pH 6.8）制备全细胞裂解液。采用BSA标准品和Bradford法（Sigma-Aldrich）测定蛋白质浓度。将细胞裂解液于95°C变性10分钟，在8%或10%聚丙烯酰胺/SDS凝胶上进行电泳，每泳道上样50 µg蛋白质。采用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜（Invitrogen）。根据所用一抗的不同（补充信息），在含5%脱脂奶粉或5%脱脂奶粉/0.5% BSA的TBS-T或PBS-T中，于室温封闭膜1小时。按照供应商的建议，用封闭液稀释一抗，并将膜与一抗于4°C孵育过夜。次日，用PBS-T或TBS-T缓冲液洗膜3次，每次5分钟，然后于室温与二抗孵育1小时。使用Clarity Western ECL试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA）进行化学发光显影，并使用ChemiDoc成像仪（Bio-Rad，Hercules，CA）采集图像。

qRT-PCR

使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从细胞裂解液中提取细胞RNA。按照制造商的操作规程（Thermo Fisher Scientific），使用随机六聚体引物和SuperScript III逆转录酶将1 µg RNA逆转录为cDNA。按照制造商的说明，使用这些引物组（补充信息），在CFX384 PCR仪（Bio-Rad）上进行qRT-PCR，每个反应使用10 ng cDNA。靶基因的表达值采用2^−ΔΔCt计算

方法，并始终以内参基因（GAPDH、TBP、ACTB、HPRT1、HBMS）进行归一化。除非另有说明，表达值均以相对于对照样本的倍数变化表示。

RNA测序

使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从细胞裂解液中提取RNA。按照制造商的说明，分别使用配备RNA 6000 Nano芯片的2100生物分析仪（均购自美国Agilent公司）和Qubit 4荧光计（美国Invitrogen公司）测定RNA样本的完整性和浓度。仅将RNA完整性值（RIN）不低于9.0的样本用于RNA测序。基因组学与蛋白质组学核心平台（DKFZ，海德堡）按照制造商的说明，使用Illumina TruSeq标准总RNA文库制备试剂盒，由总RNA样本构建测序文库。使用NovaSeq 6000测序仪（美国Illumina公司），以双端100 bp模式对多重化文库进行测序。NGS数据已提交至NCBI BioProject数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/），登录号为PRJNA965939。

转录组数据集的生物信息学分析

使用snakePipes（v 2.4.1）²¹的mRNAseq模式处理原始测序数据文件，并将生成的特征计数文件用于后续分析。使用DESeq2进行主成分分析（PCA）。使用Galaxy服务器²²生成热图。使用clusterProfiler（版本4.4.3）进行通路分析。

greenCUT&RUN

为分析野生型（wt）和突变型SMAD4蛋白在全基因组范围内的结合谱，将greenCUT&RUN技术应用于表达GFP标记的野生型和突变型SMAD4蛋白的COLO205细胞。所有实验均收集100万个细胞，并用预冷PBS洗涤。将细胞固定于偶联刀豆蛋白A的顺磁性磁珠上，

经0.05%洋地黄皂苷透化处理后，按照前文所述的greenCUT&RUN方案进行实验。将来自果蝇S2细胞的单核小体DNA（20 pg）加入作为标准化用的加标DNA。采用NEB Ultra II试剂盒（New England Biolabs，美国）制备用于测序的DNA文库。分别使用Qubit 4荧光计（Invitrogen，美国）和2100 Bioanalyzer（Agilent，美国）结合DNA高灵敏度检测芯片，对测序文库的DNA含量和片段大小分布进行测定。DNA文库由马克斯·普朗克深度测序核心设施完成测序。NGS数据已提交至NCBI BioProject数据库，登录号为PRJNA965939（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/）。

greenCUT&RUN数据的生物信息学分析

对100 bp双端测序读段进行分析，每个样本分别获得4～12 M条读段。使用Trim-galore（版本0.6.4）的默认参数对原始数据进行质量控制。通过质量控制的序列读段使用bowtie2（版本2.3.5.1）比对至人类参考基因组（hg38版本）和果蝇参考基因组（BDGP5 release 75），参数设置为：-dovetail -local -very-sensitive-local -no-unal -no-mixed -no-discordant -I 10 -X 700。

使用Sambamba（版本0.8.0）对所有样本（包括SMAD4野生型和突变体）进行等量读段校正，并将校正后的数据用于后续分析。使用Homer在默认参数下进行窄峰和宽峰识别，除基于克隆信号的过滤被禁用外，所用参数为-C 0。Homer还用于对峰进行注释并鉴定差异峰。使用deeptools（版本3.5.1）中的computeMatrix函数生成热图，采用默认参数，但对读段总数进行了例外处理，具体为天天中彩票实名

使用选项“averageTypeBins”而非均值，按每个 bin 进行计算。为对矩阵总和进行归一化，将读数除以 SpikeIn 总读数。PCA 分析使用 R 的 DESeq2 软件包完成，通路分析使用 clusterProfiler（版本 4.4.3）完成。

质谱分析

表达 miniTurbo 标记 SMAD4 蛋白的 COLO205 细胞接种于 10 个 15 cm 培养皿中，并使用 1 µg/ml 多西环素诱导过夜。次日，细胞经 10 ng/ml TGF-β 处理 4 小时，随后在正常生长培养基中加入 50 µM 生物素孵育 4 小时。收获细胞时，吸去培养基，依次使用预冷 PBS 和预冷缓冲液 A（10 mM Hepes-KOH，pH 7.9；1.5 mM MgCl₂；10 mM KCl）洗涤。吸去该缓冲液后，在培养皿中加入约 800 µl 完全缓冲液 A（10 mM Hepes-KOH，pH 7.9；1.5 mM MgCl₂；10 mM KCl，以及新鲜加入的 1× Roche CPI、1 mM DTT 和 0.2% NP40），在冰上孵育 5 分钟。使用细胞刮刀收集细胞，并在 3,200 g、4°C 条件下离心 6 分钟后收集胞质组分。使用缓冲液 A 清洗细胞沉淀，以去除残留的胞质蛋白。将细胞核沉淀重悬于 2.5 ml 完全缓冲液 C（420 mM NaCl、20 mM Hepes-KOH，pH 7.9、20% v/v 甘油、2 mM MgCl₂、0.2 mM EDTA 和 0.2% NP40，以及新鲜加入的 1× Roche CPI、1 mM DTT 和 0.2% NP40）中，并在 4°C 下振荡 60–90 分钟。最后，将胞质提取物和细胞核提取物均在 40,000 g、4°C 条件下离心 30 分钟。收集上清液，使用 Bradford 法（Bio-Rad，美国）测定蛋白浓度，并于−80°C 保存备用。

链霉亲和素磁珠（Cytiva，美国）使用结合缓冲液（20 mM Hepes-KOH，pH 7.9，】【。

420 mM NaCl、20%（v/v）甘油、2 mM MgCl₂、0.2 mM EDTA、0.2% NP-40，并新鲜加入1× Roche CPI和1 mM DTT）。对于对照下拉实验，将一半微珠置于含1 mM生物素的结合缓冲液中，另一半置于结合缓冲液中，于4°C孵育60 min。用结合缓冲液洗涤微珠三次。每次下拉实验向洗涤后的微珠中加入1 mg核蛋白裂解液，链霉亲和素下拉实验及生物素封闭的链霉亲和素对照下拉实验均设置三个平行重复。下拉反应于4°C旋转孵育60–75 min。微珠用结合缓冲液洗涤两次，用新鲜加入1× Roche CPI、1 mM DTT和0.2% NP-40的PBS洗涤两次，再用不含添加剂的PBS洗涤两次。²⁶

在洗脱缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 7.5，2 M尿素，10 mM DTT）中，使用0.1 µg/ml胰蛋白酶于22°C对结合蛋白进行微珠上过夜酶解。随后加入TFA至终浓度为1%，再将胰蛋白酶酶解肽段结合至C18 StageTip（ThermoFischer，美国）。用80%乙腈洗脱胰蛋白酶酶解肽段，并通过冷冻干燥将其干燥。

质谱分析前，将冻干的胰蛋白酶酶解肽段重悬于10%甲酸中，取重悬样品的三分之一，按照文献²⁷所述方法进行分析，并作少量修改。纳流LC-MS/MS分析采用与Orbitrap Fusion Lumos质谱仪联用的Easy nano-LC 1200系统（Thermo Fisher Scientific）进行。使用有机相含量逐渐增加的二元梯度（流动相A：含0.1%甲酸的水溶液；流动相B：含0.1%甲酸的80%乙腈溶液），以300 nl/min的流速，在25 cm C18反相色谱柱（内径75 μm，粒径2 μm，孔径100 Å）上分离肽段。串联质谱图采集采用一台

数据依赖型 TOP-10 采集方法。每次进行一次 MS 扫描后，以数据依赖模式最多进行 10 次 MS/MS 扫描。为防止样品残留，在链霉亲和素下拉实验样品与生物素封闭的链霉亲和素对照下拉实验样品之间，使用 10% 甲酸空白样品运行 45 分钟。

使用 MaxQuant 软件（版本 1.5.3.30）分析原始数据文件，并使用 UniProt 人类 FASTA 数据库²⁸进行序列比对。选择无标记定量（LFQ）及跨运行匹配选项。此外，启用基于强度的绝对定量（iBAQ）方法，以计算后续的蛋白质相对丰度。使用 Perseus 软件（MQ 软件包，版本 1.6.12）对 MaxQuant 生成的 txt 文件进行进一步处理，以绘制火山图。在 Perseus 分析中，过滤去除污染物和反向序列匹配项。²⁸ 对基于 LFQ 强度的数值进行以 2 为底的对数转换（Log2），使数据呈高斯分布，从而能够基于正态分布数据对缺失值进行插补（宽度 = 0.3，偏移量 = 1.8）。采用双侧 Student's t 检验计算链霉亲和素下拉实验相对于生物素封闭的链霉亲和素对照下拉实验的蛋白质富集程度，假发现率（FDR）设为 5%。将常数 1 设为显著性阈值（S0 = 1）。使用 iBAQ 值确定选择性相互作用蛋白的相对化学计量比。²⁹,³⁰ 所有蛋白质组学数据均可从 PRIDE 数据库（PXD041662）获取。

结果

在 COLO205 细胞中异位表达野生型和突变型 SMAD4 蛋白

本研究旨在考察癌症相关突变对 SMAD4 在 TGF-β 信号传导中功能的影响。为筛选结直肠癌（CRC）来源的 SMAD4 突变，我们考察了

COSMIC和癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库。对这些数据库的检索显示，结直肠癌（CRC）样本中SMAD4的突变频率为12.6%。在4,398例患者样本中共检测到652个突变。其中，478个被鉴定为推定的驱动突变，即已知或预测可赋予癌细胞选择性生长优势的突变。其余174个为乘客突变，其在肿瘤发生中的重要作用尚不明确。驱动突变大多为错义突变（68%，329/478），而截短突变占26%。其余驱动突变包括比例极低的框内突变、剪接突变和融合突变。SMAD4错义突变中有很大一部分（288/652）位于MH2结构域（图S1A、S1B）。

本研究选取了四种在CRC中频繁出现的MH2结构域突变。首先，我们考察了这些错义突变是否影响蛋白质的稳定性或表达。为此，我们选择了CRC细胞系COLO205，该细胞系因SMAD4前四个外显子发生纯合缺失而不表达SMAD4蛋白。³¹通过慢病毒转导，我们构建了表达多西环素（dox）诱导型GFP标记野生型（wt）及突变型SMAD4蛋白的COLO205细胞。使用抗GFP或抗SMAD4抗体对转导细胞系的全细胞裂解液进行免疫印迹分析，确认了野生型和突变型SMAD4蛋白的表达（图1A）。除CRC细胞系外，我们还通过慢病毒转导，在视网膜色素上皮细胞系（RPE-1）中研究了这些突变型SMAD4蛋白的表达。免疫印迹分析显示，GFP标记的野生型和突变型SMAD4的表达水平相近，且均高于内源性SMAD4（图S1C）。

GFP标记的SMAD4蛋白水平相近，表明这些MH2结构域错义突变不影响蛋白质的表达或稳定性。

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图1：

野生型和突变型SMAD4蛋白的异位表达。

A）在COLO205细胞中表达的GFP标记SMAD4蛋白的免疫印迹分析。B）TGF-β处理后磷酸化SMAD2（pSMAD2）的免疫印迹分析。用10 ng/ml TGF-β处理细胞至相应时间点，并以等体积DMSO作为对照。

SMAD4 MH2结构域突变体无法激活TGF-β诱导的基因

为研究COLO205细胞中TGF-β信号通路的激活情况，我们进行了免疫印迹分析，以SMAD2磷酸化作为检测指标。在时间序列实验中，用10 ng/ml TGF-β处理表达野生型SMAD4蛋白的COLO205细胞，以确定SMAD2磷酸化的峰值时间。免疫印迹分析表明，加入TGF-β后仅30分钟即可检测到磷酸化SMAD2（pSMAD2）的诱导，随后其水平逐渐升高，并在60分钟时达到峰值（图1B）。根据pSMAD2分析结果，在提取蛋白质前，用10 ng/ml TGF-β处理SMAD4缺失、野生型SMAD4及突变型SMAD4细胞1小时。使用GFP和SMAD4抗体进行的免疫印迹分析显示，除符合预期的SMAD4缺失细胞外，所有经多西环素（dox）诱导的细胞中GFP-SMAD4的表达水平均相近（图1A）。同样符合预期的是，所有细胞系均表达内源性SMAD2，且其表达不依赖于GFP-SMAD4的表达。TGF-β处理诱导了内源性SMAD2的磷酸化，证实COLO205细胞中TGF-β通路的上游部分功能完整（图1A）。

接下来，我们通过对野生型和突变型SMAD4细胞进行RNA测序（RNA-seq），研究了全基因组范围内的TGF-β转录特征。我们用以下试剂处理细胞：

对各细胞系进行0至30小时的TGF-β处理，并在每个时间点设置三个重复样本进行RNA测序。对前500个基因进行主成分分析（PCA）显示，SMAD4缺失样本在主成分1（PC1）上与野生型及突变型SMAD4样本分别聚类（图S2）。经TGF-β处理后，野生型SMAD4的各时间点样本在PC2上聚集在一起，与突变型SMAD4样本形成的聚类明显不同（图S2）。综上，PCA分析表明，SMAD4 MH2突变体在转录水平上对TGF-β处理无响应。

共鉴定出3,200个差异表达（DE）基因，并通过无监督层次聚类将其分为四个不同的簇（图2A）。其中，簇3基因在野生型SMAD4细胞中被迅速诱导表达，但在SMAD4突变型细胞中仅受到微弱诱导。簇4基因仅在较晚时间点被诱导表达，且不受SMAD4突变的影响。有趣的是，簇1和簇4基因在SMAD4缺失细胞中的表达水平保持不变。在表达野生型和突变型SMAD4的细胞中，簇2基因在TGF-β处理的较晚时间点表达下调，而在SMAD4缺失细胞中下调幅度小得多。簇1基因在较晚时间点也受到抑制，但这一过程不依赖于SMAD通路（图2A）。综上，时间序列RNA-seq实验表明，结直肠癌（CRC）中发现的SMAD4 MH2突变体会影响早期诱导基因，而这些突变体对晚期转录的影响则小得多。

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图2：

突变型和野生型SMAD4细胞中的TGF-β响应基因。

A）TGF-β诱导后（0、2、18和30小时），野生型和突变型SMAD4 COLO205细胞中差异表达基因的热图及聚类分析；B）使用RNA-seq聚类所得簇2、3和4中的基因进行的KEGG通路分析；C）热图，展示

TGF-β核心组分基因。细胞以10 ng/ml TGF-β处理所示时间，并以等体积DMSO作为对照。

接下来，我们利用不同聚类中的TGF-β响应基因进行通路分析。KEGG通路分析显示，野生型（wt）SMAD4上调的聚类3基因参与DNA复制、细胞周期和p53通路（图2B），而聚类2和聚类4的基因则涉及细胞因子相关通路。此外，对聚类3基因的生物学通路分析显示，排名靠前的多个通路参与细胞周期和DNA复制（图S3）。

出乎意料的是，我们未发现与TGF-β直接相关的通路富集。为检查TGF-β核心响应基因的表达情况，我们对一组受TGF-β信号直接调控的基因进行了热图分析。在表达野生型SMAD4的细胞中，从TGF-β诱导的早期到晚期时间点，TGF-β核心组分基因均被激活。相比之下，在表达SMAD4突变体的细胞中，这些基因对TGF-β无响应，其表现总体上与缺失SMAD4的亲本COLO205细胞相似（图2C）。综上，对表达GFP-SMAD4的COLO205细胞进行的RNA-seq分析表明，野生型SMAD4的表达恢复了TGF-β靶基因的转录响应，而SMAD4 MH2突变体则显著削弱了对TGF-β的响应。

突变型SMAD4可有效结合DNA

对SMAD4进行GFP标记，可通过greenCUT&RUN方法在未经交联的完整细胞中实现其全基因组定位。GreenCUT&RUN依赖于与GFP纳米抗体融合的微球菌核酸酶（MNase），随后通过Ca²⁺激活核酸酶活性，释放与DNA结合的GFP-蛋白复合物。²⁴ 为研究野生型和突变型SMAD4蛋白在全基因组范围内的结合情况，

我们使用表达 GFP-SMAD4 蛋白（wt、S357P、R361C 和 R361H）的 COLO205 细胞进行了 greenCUT&RUN 实验。为分析 GFP-SMAD4 野生型和突变体的结合模式，细胞接受了 TGF-β 处理，并开展了时间梯度实验；随后对释放的 DNA 进行文库构建和深度测序。每个样本的测序读段数均根据 spike-in 对照进行了标准化。数据分析显示，在不同 TGF-β 处理时间下，SMAD4 突变体和野生型样本中的峰总数约为 12,000～35,000 个（图 S4A）。经 TGF-β 诱导后，野生型及所有突变体的覆盖度均有所增加。在所有样本中，TGF-β 处理 18 小时时获得的覆盖度最高。总体而言，约 30% 的峰包含 SMAD4 共识基序（表 S1）。全基因组结合位点分析表明，野生型与突变型 SMAD4 蛋白在不同基因组区域的结合模式几乎相似，但 SMAD4 wt 和 R361C 突变体在基因间区和内含子区域表现出更高的覆盖度（数据未显示）。TGF-β 响应基因 SERPINE1、PMEPA1 和 ID1 的基因组轨迹显示，SMAD4 可结合于这些基因的启动子区域和/或上游区域（图 3A、3B 和 S4B）。差异峰分析显示，与预期一致，TGF-β 处理增强了 SMAD4 的 DNA 结合。TGF-β 处理的早期和晚期时间点分别导致野生型 SMAD4 出现 830 个（4.12%）和 1189 个（6.16%）差异结合位点（图 3C）。其中，390 个峰（830 个峰的 46.9%）和 549 个峰（1189 个峰的 46.17%）包含 SMAD4 共识基序。MH2 区域的 SMAD4 突变体总体上表现出与野生型 SMAD4 相似的特征，这证实这些突变不会影响 SMAD4 的 DNA 结合能力，而该能力由其 MH1 结构域介导。

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图 3：

全基因组结合

野生型和突变型 SMAD4 的分析

A）SERPINE1 基因座处野生型和突变型 SMAD4 结合的覆盖度轨迹；B）PMEPA1 基因座处 SMAD4 蛋白的覆盖度轨迹；C）TGF-β 处理后全基因组范围内野生型和突变型 SMAD4 结合的热图。

对差异峰进行的基因本体（gene ontology，GO）分析未发现早期和晚期诱导基因中与 TGF-β 相关的富集。然而，在基于分子特征的富集分析中，MSigDB M2445 基因集（早期和晚期 TGF-β 诱导的 FDR p 值分别为 6.9×10^-5 和 7.5×10^-4）以及 M2839 基因集（早期和晚期 TGF-β 诱导的 FDR p 值分别为 1.8×10^-3 和 3.1×10^-3）均表现出富集（表 S2）。M2445 特征由在 TGF-β 刺激 10 小时后于 MEF 细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）中上调的基因组成，而 M2839 则由在一组上皮细胞系中受 TGF-β 诱导上调的基因组成。对这 830 个和 1189 个差异峰周围区域进行的覆盖度分析显示，TGF-β 诱导后，SMAD4 突变体的结合也有所增加（图 3C）。

接下来，我们将转录组数据与 TGF-β 激活后全基因组范围内的 SMAD4 结合模式进行了相关性分析。覆盖度分析聚焦于不同基因簇中基因的启动子区域。尽管在相同样本中各基因簇之间的覆盖度未观察到差异（图 S4C），但在早期和晚期诱导时间点，覆盖度均有所增加。综上所述，在 CRC 中分析的 SMAD4 MH2 结构域突变并不影响 SMAD4 的基因组结合。

突变型 SMAD4 与共激活因子的相互作用减弱

由于 SMAD4 MH2 结构域突变会影响 TGF-β 响应基因的转录，我们推测 MH2 结构域突变可能影响 SMAD4……

与其他蛋白质的相互作用。为系统研究TGF-β信号传导背景下的SMAD4蛋白质相互作用网络，采用HA-miniTurbo系统建立了基于邻近生物素化标记的定量质谱（qMS）分析方法。

为此，通过慢病毒转导构建了表达多西环素（dox）诱导型miniTurbo标记的野生型（wt）及突变型SMAD4蛋白的COLO205细胞。使用抗HA表位和抗SMAD4抗体进行免疫印迹分析，结果显示所有SMAD4蛋白的表达水平均相当（图S5A）。对接受TGF-β处理（10 ng/ml，4小时）并同步进行生物素标记的细胞提取核蛋白，随后进行基于链霉亲和素的亲和纯化及qMS分析。在野生型SMAD4细胞中，TGF-β处理后可观察到转录共激活因子CREBBP、EP300、BRD4、KDM1A以及多个MLL3/4复合物亚基的富集（图4A、5A）。正如预期，未诱导条件下未见SMAD2/SMAD3蛋白富集，证实了该方法的特异性。

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图4：

基于miniTurbo的邻近标记及后续qMS分析，用于研究野生型和突变型SMAD4。

对A）野生型SMAD4、B）D351H、C）S357P、D）R361C和E）R361H细胞核提取物中的共激活因子及MLL3/4复合物蛋白进行火山图分析。细胞接受10 ng/ml TGF-β处理4小时，并加入50 μM生物素。以DMSO处理作为对照。

随后，对SMAD4 MH2结构域突变体（D351H、S357P、R361C和R361H）进行比较性qMS分析，以确定共激活因子、转录辅助因子及MLL3/4蛋白复合物亚基的富集情况。结果显示，CREBBP、EP300和KDM1A的标记减少（S357P、R361C和R361H）或完全丧失（D351H）（图4B–E、图5B–E）。相反，MLL3/4的大多数亚基

除D351H突变体外，SMAD4突变体中蛋白质复合物的富集情况与野生型SMAD4相似（图S4B–F）。

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图5：

利用miniTurbo进行邻近标记并结合定量质谱分析，检测SMAD4蛋白相关共激活因子的富集情况。

A）野生型SMAD4、B）D351H、C）S357、D）R361C和E）R361H核提取物中共激活因子蛋白的相对标记水平。细胞用10 ng/ml TGF-β处理4小时，并加入50 µM生物素。

这些数据表明，与野生型SMAD4相比，SMAD4 MH2突变体与共激活因子蛋白的相互作用减弱，其中与CREB结合蛋白（CREBBP）和EP300的相互作用减弱尤为明显，这为MH2突变导致的转录缺陷提供了分子机制解释。

CREBBP/EP300对TGF-β靶基因的激活至关重要

为研究共激活因子CREBBP和EP300在TGF-β介导的基因激活中的作用，我们使用CREBBP/EP300抑制剂A-485处理表达野生型SMAD4的COLO205细胞。A-485通过竞争性抑制乙酰辅酶A的结合，抑制CREBBP和EP300的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性。³³

定量RT-PCR分析显示，经A-485处理的细胞中，所选TGF-β靶基因的转录应答显著减弱（图S6A）。

为全面评估转录变化，我们对经A-485处理的野生型SMAD4细胞进行了RNA-seq分析。RNA-seq数据的主成分分析（PCA）（图S6B）显示，样本根据处理条件和时间形成了清晰的聚类，验证了数据质量。RNA-seq数据的火山图显示，在基础条件下（未经TGF-β处理），正如预期，单独使用A-485处理即可引起相对于未处理细胞的基因表达变化（图6A）。而

在对照细胞中，ITGA2、FERMT1、SKIL、ITGB6、JUN、INHBE、PMEPA1、LAMC2、SERPINE1和TGFB1等基因被显著激活，而经A-485预处理后，这种诱导作用减弱（图6B）。层次聚类和热图可视化分析证实，抑制CREBBP/EP300后，TGF-β转录程序的响应减弱。热图清晰地区分了仅接受TGF-β处理的细胞与刺激前经A-485预处理的细胞（图6C），表明抑制CREBBP/EP300后，ID2、INHBE、SKIL、ITGA2、ITGB6和JUN等关键TGF-β靶基因的诱导表达显著减弱。综上，这些结果表明，共激活因子CREBBP和EP300的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性对于TGF-β靶基因的转录激活不可或缺。CREBP/EP300功能缺失严重损害该通路，这支持了以下结论：CRC来源的SMAD4 MH2突变所表现出的转录缺陷与其丧失同CREBP/EP300的相互作用有关。

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图6：

CREBBP/EP300降解后全基因组范围内TGF-β靶基因的表达。

A）火山图分析，比较未进行TGF-β诱导时A-485处理细胞与未处理细胞之间的差异基因表达。B）A-485处理细胞与未处理细胞随后均接受18小时TGF-β诱导，分析纳入了2276个差异表达基因。C）使用受TGF-β信号通路调控的基因集进行热图分析。细胞接受10 ng/ml TGF-β处理18小时，并接受5 μM A-485处理4小时。

讨论

SMAD4是TGF-β信号通路中的关键转录效应因子，也是结直肠癌（CRC）中最常发生突变的肿瘤抑制因子之一。尽管CRC中的SMAD4突变……

尽管通常被认为会导致功能丧失，但其MH2结构域错义突变的确切分子后果仍未得到充分阐明。³⁴,³⁵ 一个尚未解决的核心问题是，MH2突变究竟是通过干扰SMAD4与染色质结合的能力，还是通过选择性破坏其在靶位点募集转录共激活因子的能力，来阻断TGF-β靶基因的表达。本研究解答了这一问题，并由此发现了一个具有潜在临床意义的分子脆弱性。

本研究选取了四种常见的SMAD4 MH2结构域突变（D351H、S357P、R361C和R361H），以研究这些突变在TGF-β诱导的转录应答中的作用。对野生型SMAD4与错义突变体进行蛋白表达比较分析表明，这些突变并不影响SMAD4蛋白的稳定性或表达。基于RNA-seq的全基因组基因表达分析显示，重新引入SMAD4可促进已知TGF-β应答基因的激活，而表达SMAD4突变体的细胞则表现出显著减弱的应答。正如预期，全基因组SMAD4结合分析显示，SMAD4突变蛋白与野生型SMAD4具有相似的结合特征。即使在未诱导状态下，SMAD4也能识别SMAD结合元件（SBE）基序，而TGF-β处理可增强SMAD4的结合。有趣的是，在未诱导条件下，R361C突变体的结合水平低于野生型及其他SMAD4 MH2突变体。随后，我们将RNA-seq数据与全基因组SMAD4结合图谱进行关联分析。在RNA-seq基因簇（簇1–4）中，簇3的基因在野生型SMAD4细胞中受到TGF-β的强烈激活。对于RNA-seq基因簇3，野生型和突变型SMAD4的占据情况并未发生变化，尽管

该基因簇主要包含由野生型SMAD4激活的基因。这表明，SMAD4 MH2结构域突变并未阻碍MH1结构域与DNA的相互作用。

一般而言，SMAD蛋白等基因特异性转录因子通过与其他转录因子及共激活因子相互作用，使其靶基因产生高效且适当的转录应答。

通常，基因特异性转录因子识别基因组中长度为4–8 bp的DNA序列，其结合可受到其他基因特异性转录因子的影响；对于SMAD复合物而言，这些因子包括AP-1转录因子。许多研究表明，基因特异性转录因子能够将共激活因子募集至靶DNA。

这些共激活因子能够解除核小体的抑制作用，并通过促进包括RNA聚合酶II（pol II）在内的基础转录机器募集至基因启动子，促进特定基因的转录。

，

Baas及其同事发现，MLL4共激活因子复合物与SMAD特异性转录机器相互作用，以促进pol II介导的转录，

正如我们近期报道的那样，这一过程涉及MLL4与AP-1家族成员JUNB构成的前馈环路。

事实上，我们在野生型SMAD4细胞的邻近标记定量质谱（qMS）实验中鉴定出了多个MLL4复合物成员

（

图4A

）。

我们还观察到，TGF-β诱导后，其他转录因子和共激活因子也出现富集。有趣的是，在未经诱导的样本中，通过邻近标记即可检测到上述大多数共激活因子和转录因子，而仅在TGF-β处理后才观察到SMAD2/SMAD3的富集。这与既往研究结果一致，即SMAD2/SMAD3/SMAD4异源三聚体复合物的形成需要活跃的TGF-β信号传导。

，

在未诱导状态下，SMAD4 同时定位于细胞核和细胞质中⁴⁰,⁴²，这解释了为何在未诱导状态下可检测到共激活因子和转录因子与 SMAD4 相互作用。重要的是，经 TGF-β 处理后，MH2 结构域突变型 SMAD4 蛋白仍能与 SMAD2/SMAD3 相互作用，表明这些 SMAD4 突变体在形成 SMAD2/SMAD3/SMAD4 三聚体方面不存在缺陷。与 SMAD2 和 SMAD3 不同，在表达 SMAD4 MH2 结构域突变体的细胞中，TGF-β 诱导后的共激活因子募集显著减少。尤其值得注意的是，与野生型 SMAD4 相比，CREBBP/EP300 和 BRD4 的富集水平降至约 1/3 至 1/20。我们提出，这种共激活因子相互作用受损，是 SMAD4 MH2 结构域突变体中观察到的 TGF-β 依赖性基因激活缺陷的基础。

为检验 CREBBP/EP300 组蛋白乙酰转移酶对本研究细胞系统中 TGF-β 诱导的基因激活的重要性，我们使用选择性抑制剂使表达野生型 SMAD4 的 COLO205 细胞中的 CREBBP/EP300 组蛋白乙酰转移酶（HAT）失活，并进行了转录组分析。抑制 CREBBP/EP300 可使表达野生型 SMAD4 的 COLO205 细胞中 TGF-β 靶基因的转录激活完全消失。这些结果与既往研究一致；既往研究表明，CREBBP/EP300 在原代内皮细胞中依赖 SMAD、由 TGF-β 诱导的基因表达过程中发挥关键作用⁴³，早期报道也证实了在转染的 293T 细胞中 CREBBP/EP300 与 SMAD 蛋白之间的相互作用⁸。此外，Narita 等人发现，A-485 介导的 CREBBP/EP300 抑制并未改变染色质占据情况，却使增强子激活完全消失，表明有效的基因激活需要在 DNA 占据之后募集共激活因子并发挥乙酰转移酶活性⁴⁴。目前，

目前尚不清楚组蛋白或其他蛋白质的乙酰化是否对TGF-β介导的激活至关重要，这将有待进一步研究。

总之，我们的研究表明，尽管本研究中的一组SMAD4 MH2突变体能够高效结合基因组，但其调控TGF-β响应基因的功能存在缺陷。这些SMAD4突变体与共激活因子CREBBP/EP300的相互作用减弱，为SMAD4 MH2突变体激活TGF-β诱导基因的功能缺陷提供了分子机制解释。

利益冲突声明

所有作者均声明不存在与本研究相关的利益冲突。

作者贡献

Md Saiful Islam：

研究构思；数据整理；正式分析；研究实施；方法学；初稿撰写；审阅与编辑。

Sheikh Nizamuddin：

数据整理；正式分析；初稿撰写；审阅与编辑。

Timothy En Haw Chan：

研究实施；方法学；审阅与编辑。

Omid Fotouhi：

研究实施；审阅与编辑。

Stefanie Koidl：

研究实施；审阅与编辑。

H.T. Marc Timmers：

研究构思；经费获取；方法学；项目管理；监督指导；审阅与编辑。

致谢

我们感谢弗赖堡大学医院Lighthouse核心设施、海德堡德国癌症研究中心（DKFZ）基因组学与蛋白质组学核心设施，以及弗赖堡马克斯·普朗克免疫生物学与表观遗传学研究所深度测序平台。我们感谢Timmers实验室成员就本研究开展的有益讨论及提出的建议。本文图件使用BioRender应用程序绘制，特此致谢。本研究获得德国研究基金会（DFG）通过SFB850的B9项目提供的经费支持。

已声明的资助方信息

德国科学基金会，德国波恩，SFB850，B9项目

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增强子通过依赖于 p300/CBP 活性的转录起始前复合物（PIC）组装、RNA 聚合酶 II（RNAPII）募集及暂停解除而被激活。

Mol Cell.

2021;

(10):

2166–82.

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SMAD4 MH2 突变破坏结直肠癌中的 CREBBP/EP300 募集及 TGF-β 诱导的转录

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SMAD4 MH2 突变破坏结直肠癌中的 CREBBP/EP300 募集及 TGF-β 诱导的转录

Md Saiful Islam,

Sheikh Nizamuddin,

Timothy En Haw Chan,

Omid Fotouhi,

Stefanie Koidl,

H.T. Marc Timmers

bioRxiv

2026.06.30.735541;

doi:

https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735541

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SMAD4 MH2 突变破坏结直肠癌中的 CREBBP/EP300 募集及 TGF-β 诱导的转录

Md Saiful Islam,

Sheikh Nizamuddin,

Timothy En Haw Chan,

Omid Fotouhi,

Stefanie Koidl,

H.T. Marc Timmers

bioRxiv

2026.06.30.735541;

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https://doi.org/10.64898/2026.06.30.735541

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关键词：结直肠癌 · SMAD4突变 · MH2结构域 · TGF-β信号通路 · CREBBP/EP300募集 · 转录调控

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735541v1?rss=1

来源出处

结直肠癌中SMAD4 MH2结构域突变干扰CREBBP/EP300募集及TGF-β诱导的转录 https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735541v1?rss=1