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蛋白质质量控制系统对于细胞在稳态生长和急性应激条件下维持蛋白质稳态至关重要。然而，随着蛋白质解折叠和聚集速率的变化，单个分子伴侣在活细胞中如何动态重组，目前仍不甚清楚。在本研究中，我们利用超分辨率成像和单分子追踪技术，解析了细菌热休克蛋白70（Hsp70）DnaK在活大肠杆菌细胞内的动态行为。我们发现，即使在最适生长温度下，大多数DnaK分子也已积极参与同蛋白质组的相互作用；而热应激则诱导一类独特的、驻留时间延长的缓慢移动DnaK群体积累。这些相互作用发生于不同的细胞内区域，提示分子伴侣的活动在空间上存在分隔。最后，在缺乏IbpAB、HtpG或DnaJ等辅助分子伴侣的细胞中，DnaK介导的蛋白质折叠活动负担加重。总体而言，我们的研究揭示，与蛋白质组的瞬时相互作用是分子伴侣的一种主要作用方式，使DnaK能够在活细胞中感知并缓解蛋白质毒性应激。
细菌 Hsp70 分子伴侣 DnaK 通过短暂探查蛋白质组，快速捕获应激诱导的错误折叠蛋白质 | bioRxiv
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细菌 Hsp70 分子伴侣 DnaK 通过短暂探查蛋白质组，快速捕获应激诱导的错误折叠蛋白质
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Ada
Pajari
，
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Taras
Redchuk
，
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Jarno
Mäkelä
doi：
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735817
Ada Pajari
1
阿尔托大学神经科学与生物医学工程系
，埃斯波，
芬兰
2
赫尔辛基大学赫尔辛基生命科学研究所生物技术研究所
，赫尔辛基，
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jarno.p.makela{at}aalto.fi
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蛋白质质量控制系统对于细胞在稳态生长和急性应激期间维持蛋白质稳态至关重要。然而，单个分子伴侣分子如何在……中动态重组
随着蛋白质解折叠和聚集速率的变化，活细胞中的相关过程仍缺乏充分理解。在此，我们利用超分辨率成像和单分子追踪技术，揭示了细菌热休克蛋白70（Hsp70）DnaK在活大肠杆菌（Escherichia coli）细胞内的动态行为。我们发现，即使在最适生长温度下，大多数DnaK分子也已积极参与与蛋白质组的相互作用，而热应激则诱导了一类独特的、驻留时间延长的慢速运动DnaK分子群体的积累。这些相互作用发生于不同的细胞内区域，表明分子伴侣活性在空间上相互分离。最后，在缺乏IbpAB、HtpG或DnaJ等辅助分子伴侣的细胞中，DnaK介导的蛋白质折叠活动负担加重。总体而言，我们的研究结果表明，与蛋白质组的瞬时相互作用是分子伴侣发挥作用的主要方式，使DnaK能够感知并缓解活细胞中的蛋白质毒性应激。
引言
蛋白质稳态对于所有活细胞都至关重要，可确保蛋白质在拥挤的细胞内环境中正确折叠、发挥功能并保持可溶性。在应激条件下，温度、代谢或蛋白质表达的变化会增加部分解折叠及易聚集蛋白质的数量，使维持蛋白质稳态的挑战尤为严峻。蛋白质稳态由分子伴侣和蛋白酶构成的相互关联的网络维持，该网络协助蛋白质折叠、防止不可逆聚集、解聚受损蛋白质，并降解无法修复的蛋白质。细菌蛋白质稳态网络的一个核心组分是热休克蛋白70（Hsp70）型分子伴侣DnaK。DnaK是一种ATP依赖性分子伴侣，能够结合蛋白质中普遍存在但通常仅在解折叠状态下暴露的短疏水基序，并促进蛋白质折叠、稳定化、重塑，以及
与下游分子伴侣系统协同作用。对大肠杆菌（Escherichia coli）的蛋白质组规模分析表明，DnaK与至少700种胞质蛋白相互作用，其中包括约180种较易聚集的蛋白质，这些蛋白质在初始折叠过程中或之后高度依赖DnaK¹,²。
在分子水平上，DnaK的活性由ATP酶循环驱动，该循环使分子伴侣在具有不同客户蛋白结合特性的构象之间转换。ATP结合有利于形成开放构象，使客户蛋白得以快速交换；而ATP水解则使DnaK在ADP结合状态下稳定捕获客户蛋白；核苷酸交换使底物结合裂隙重新开放，并促进客户蛋白释放³,⁴。这一循环受到含J结构域的辅助分子伴侣DnaJ（Hsp40）和核苷酸交换因子GrpE的调控：前者刺激ATP水解并促进客户蛋白捕获，后者加速ADP释放及客户蛋白的结合与释放循环⁵–⁸。DnaK还在热休克反应中发挥调控作用：它与DnaJ和GrpE共同控制热休克σ因子σ³²的活性和稳定性，将热休克基因表达与胞质中的蛋白质折叠状态相耦联⁹–¹¹。当蛋白质去折叠进一步发展为聚集时，DnaK会与小热休克蛋白IbpA/B及解聚酶ClpB协同作用。IbpA和IbpB结合变性蛋白，并帮助其维持在随后可由DnaK/DnaJ/GrpE、GroEL-GroES及ClpB分子机器处理的状态¹¹–¹⁸。
尽管DnaK在蛋白质稳态中的作用已得到广泛研究，但在平衡生长期间，DnaK如何在细胞内各项功能之间分配，以及在涉及受损或错误折叠蛋白有害积累的急性蛋白毒性应激期间，这种分配如何重塑，仍不清楚。我们对Hsp70/DnaK机制的认识很大程度上源自于
体外研究缺乏细胞环境、蛋白质组的复杂性、细菌细胞的空间组织，以及多种辅助分子伴侣和竞争性底物蛋白的存在。例如，DnaK在体内与底物的结合不太可能简单地划分为游离和结合两种状态，而应涵盖从与底物高度瞬时的接触到持续时间较长的聚集体相关状态这一连续谱。蛋白质稳态维持需求不仅应改变参与相互作用的DnaK的数量，还应改变单个DnaK分子在不同状态下的驻留时间、这些状态之间的相互转化方式，以及这些状态在细胞内的富集位置。蛋白质变性可在应激开始后数秒内发生，而转录诱导及新生分子伴侣的积累则需要数分钟。因此，应激的最初阶段必须由细胞内已有的分子伴侣来应对。
在此，我们研究了大肠杆菌中DnaK在稳态生长和热应激条件下的动态行为及其与蛋白质组的相互作用（图1A）。为此，我们对活体大肠杆菌中由染色体内源表达的DnaK融合蛋白进行了超分辨率显微成像和单分子追踪（图1B）。此前，这一方法已被用于研究蛋白质–DNA相互作用及大分子相互作用¹⁹–²⁴；在本研究中，我们聚焦于分子伴侣与蛋白质之间的瞬时相互作用。我们发现，DnaK在体内的活性并不限于应激条件；即使在最适生长条件下，它也已广泛参与与细胞蛋白质组的相互作用。热休克通过使DnaK群体向移动缓慢、驻留时间延长且具有独特细胞内定位的状态转变，迅速重塑这一基础相互作用图景。对辅助分子伴侣IbpAB、HtpG和DnaJ的扰动
进一步促使 DnaK 向这一慢速状态转变，表明这些因子有助于在基础条件和应激条件下调节分子伴侣的参与程度。最后，我们表明，仅蛋白质过表达就足以诱导类似热休克条件下的 DnaK 动态行为，证明 DnaK 的运动性能够独立于温度反映蛋白质稳态状况。
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图 1.
DnaK 的单分子动态行为。
（A）DnaK 分子伴侣功能示意图。（B）单分子追踪示意图（比例尺：1 µm）。（C）37°C 下 JFX554 标记的 DnaK-HaloTag 的表观扩散系数（D_app）分布（log₁₀ 标度；562 个细胞中的 25324 条轨迹，JML_Ec_05）。平均 D_app：2.76 ± 0.05 µm²/s。（D）37°C 下 GlcB-HaloTag（891 个细胞中的 48682 条轨迹，JML_Ec_141）和 MetE-HaloTag（1052 个细胞中的 43634 条轨迹，JML_Ec_136）的 D_app。平均 D_app 分别为 4.64 ± 0.03 µm²/s 和 4.89 ± 0.13 µm²/s。同时展示了（C）中的 DnaK-HaloTag 分布。（E）30°C 下底物结合缺陷型 DnaK^S427P-HaloTag 的 D_app（944 个细胞中的 18590 条轨迹，JML_Ec_164）。平均 D_app：5.24 ± 0.37 µm²/s。同时展示了图 S1D 中 30°C 下野生型 DnaK-HaloTag 的数据。（F）采用三状态高斯混合模型（GMM）拟合的 37°C 下 DnaK-HaloTag 的 D_app。慢速（S_slow）、瞬态（S_trans）和快速扩散状态（S_fast）的拟合平均 D_app 分别为：0.13 ± 0.01 µm²/s、2.29 ± 0.12 µm²/s 和 4.83 ± 0.06 µm²/s。S_fast 峰对应于图 S1G 中的 GlcB-HaloTag。所用数据与（C）相同。（G）DnaK 各扩散状态的单分子轨迹示例（D_app < 0.45 µm²/s、0.45 < D_app < 5.4 µm²/s，以及 D_app > 5.4 µm²/s）。（H）37°C 下 DnaK-HaloTag 的定位分布（左侧），以及 DnaK-HaloTag 与 GlcB-HaloTag 分布之间的归一化差异
（右侧）。红色表示 DnaK 占有率较高，蓝色表示 GlcB 占有率较高。（I–K）37°C 下扩散状态 S_slow、S_trans 和 S_fast 的定位分布（左侧），以及各状态之间的归一化差异（右侧）。定位结果绘制于归一化的细胞坐标中。所有数据均来自三次生物学重复，± 表示重复间的均值标准误（SEM）。
结果
DnaK 通过不同的动态和空间状态与蛋白质组相互作用
为探究 DnaK 的动态行为，我们对在 37°C、补充甘油、酪蛋白酸水解物和硫胺素的 M9 基础培养基（M9glyCAAT）中生长的大肠杆菌（E. coli）活细胞进行了单分子追踪（图 1A 和 B）。我们通过对染色体内源位点进行遗传修饰，在 DnaK 的 C 端融合了 HaloTag。与野生型相比，所得 DnaK-HaloTag 融合蛋白未影响细胞在半致死性热休克（51°C，15 min）条件下的存活（图 S1A），表明该融合蛋白保留了 DnaK 的功能。成像时，使用可透过细胞膜的 Janelia Fluor 554 染料（JFX554）对 DnaK-HaloTag 进行荧光标记，并通过 VAHEAT 系统控制细胞所在位置的局部温度；该系统在盖玻片处配有光学透明薄膜加热器和集成式温度传感器。
基于已知的 DnaK 分子底物相互作用状态⁸，我们预期至少能够观察到两种不同的动态状态：代表底物与 DnaK 相互作用的低迁移率状态，以及主要对应于细胞质中自由扩散的快速扩散状态。我们根据单分子轨迹测得表观扩散系数（D_app = 2.76 ± 0.05 μm²/s，±SEM），并观察到一个对应于 DnaK 低迁移率的小峰和一个主峰
较快扩散的峰（图1C）。然而，即使在快速扩散的DnaK群体中，分子的迁移率（约3.7 µm²/s）也低于同等大小蛋白质自由扩散的预期值²⁵–²⁷。此外，少量缓慢移动的分子群体不太可能代表所有DnaK–底物相互作用。相反，许多DnaK与客户蛋白之间的接触可能短暂而频繁，因此被包含在较大的快速扩散群体中。
为区分蛋白质相互作用与仅由分子大小主导的扩散，我们将DnaK与大小相近、且主要仅与代谢物发生相互作用的蛋白质进行了比较。由于与代谢物结合预计不会显著改变蛋白质的迁移率，这些蛋白质应主要表现为自由扩散。为此，我们构建了两种与DnaK（70 kDa）大小相近的球状蛋白的HaloTag融合蛋白：GlcB，一种参与苹果酸代谢的80 kDa酶；以及MetE，一种参与甲硫氨酸生物合成的85 kDa酶。此前有研究提出，这两种蛋白质均可在细胞质中自由扩散，不与其他蛋白质或细胞结构形成稳定的相互作用²⁵。与此一致，对MetE-HaloTag和GlcB-HaloTag的单分子追踪显示，两者均仅存在一个快速移动的群体，且扩散分布几乎相同（MetE：D_app = 4.89 ± 0.13 µm²/s；GlcB：D_app = 4.64 ± 0.03 µm²/s）（图1D、S1B–C）。重要的是，尽管这两种蛋白质与DnaK大小相近，但其扩散速度均高于DnaK。这表明，DnaK迁移率的降低是由其与客户蛋白之间频繁的相互作用所致。
为进一步验证我们的假设，我们通过在底物结合结构域中引入点突变来削弱DnaK的底物结合能力。我们构建了DnaK^S427P的HaloTag融合蛋白，此前已有研究表明，该突变体具有
底物结合亲和力降低，同时保留了与野生型 DnaK 相当的 ATP 酶活性²⁸˒²⁹。由于表达 DnaK^S427P 的细胞在较高温度下呈丝状生长，因此在 30°C 下比较了 DnaK^S427P 与野生型 DnaK。在此条件下，DnaK^S427P 的运动性显著增加（30°C 下，DnaK 为 3.01 ± 0.08 µm²/s，DnaK^S427P 为 5.24 ± 0.37 µm²/s）（图 1E、S1D–E）。这一结果支持如下结论：DnaK 的快速峰既包含自由扩散的 DnaK，也包含与客户蛋白结合并快速交换的分子。我们还检测了另一种已报道的底物结合缺陷突变体 DnaK^V436F ³⁰，但该突变仅导致运动性小幅增加，提示其对体内 DnaK–客户蛋白相互作用的影响较弱或外显率较低（30°C 下为 3.37 ± 0.10 µm²/s，图 S1F）。
为定量分析不同 DnaK 运动状态的相对占比，我们采用三组分高斯混合模型（GMM）拟合了表观扩散系数分布（图 1F）。基于分子大小依赖的动态特性，使用 GlcB 数据约束 DnaK 动态中表观自由扩散组分的参数（图 S1B、S1G），因为 MetE 的数值几乎相同（图 S1C）。该分析解析出三种 DnaK 运动状态：慢速态（S_slow）的占比为 19 ± 1%，瞬态（S_trans）为 63 ± 3%，快速态（S_fast）为 18 ± 3%（图 1G）。我们推测，S_slow 是一个低运动性群体，与 DnaK 长时间结合客户蛋白、聚集体或较大的蛋白质稳态复合物的情形一致。在 DnaK^S427P 中，这一群体几乎完全消失（图 1E）。S_trans 代表运动性居中的、短暂的客户蛋白相互作用，而 S_fast 主要由自由扩散的 DnaK 构成。这一结果表明，大多数 DnaK
即使在最适生长温度下，在任一给定时刻也有分子正积极地与客户蛋白相互作用。
尽管细菌缺乏膜包被的细胞器，受损蛋白仍可在细胞质内形成空间组织，尤其是当它们形成聚集体并积累于细胞两极或无拟核区域时³¹–³³。为确定DnaK的不同迁移状态是否也具有不同的胞内定位，我们绘制了各状态下DnaK分子的空间分布图。与在整个细胞体积内均匀分布的自由扩散蛋白GlcB和MetE不同，DnaK在细胞两极和周边区域富集（图1H，图S1H–I）。DnaK的三种迁移状态也呈现出不同的空间分布模式（图1I–K）：与S_fast相比，S_trans更偏向于细胞两极和周边区域，而S_slow表现出最强的两极富集。这些结果表明，DnaK的定位受到其与底物相互作用的影响，且DnaK的迁移状态反映了细胞内蛋白质组折叠需求的空间差异。
热休克迅速重塑DnaK动态行为
鉴于DnaK作为核心热休克分子伴侣的作用，我们接下来探究了DnaK的动态行为如何响应温度从37°C骤升至45°C。为此，将细胞在37°C下培养，随后在显微镜上将温度升至45°C，平均升温时间为7.0 ± 1.2 s（±SEM）（图2A）。在升温前后采集单分子追踪数据。DnaK的动态行为立即发生变化，平均扩散系数（D_app）从37°C时的2.76 ± 0.05 µm²/s降至45°C时的1.11 ± 0.33 µm²/s（±SEM）（图2A），反映出温度诱导的蛋白质稳态变化。与此一致，既往生化研究表明，温度升高会使DnaK/DnaJ/GrpE
使系统转向高亲和力的底物捕获状态³⁴。
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图2.
热休克条件下 DnaK-HaloTag 的扩散动力学。
(A)
上图：温度从 37°C 升至 45°C 过程中的温度读数。左下图：37°C 下 DnaK-HaloTag 的单分子轨迹（蓝色）。线条表示平均表观扩散系数 D_app。右下图：45°C 热休克开始时的 DnaK（红色）。线条表示分箱平均 D_app，阴影区域表示均值标准误（SEM）。
(B)
使用三状态高斯混合模型（GMM）拟合的 37°C 下（与图1F中的数据相同）及 45°C 热休克时间进程中的 D_app 分布（18,962 条轨迹和 869 个细胞）。数据统计信息见表 S1–S2。S_fast 对应于 37°C 或 45°C 下不参与相互作用的蛋白质 GlcB-HaloTag（图 S1B 和 G）。
(C)
由 GMM 得到的 37°C 下及 45°C 热休克过程中 DnaK-HaloTag 各扩散状态的占比。误差棒表示重复实验间的均值标准误（SEM）。数据与 (B) 相同。
(D)
45°C 下 DnaK-HaloTag 的定位分布（左侧），以及 45°C 与 37°C 之间的归一化差异（右侧）。红色表示 DnaK 在 45°C 下的占有率较高，蓝色表示 DnaK 在 37°C 下的占有率较高。(E) 45°C 下 S_trans 的定位分布（左侧），以及 45°C 与 37°C 之间的归一化差异（右侧）。红色表示 45°C 下的占有率较高，蓝色表示 37°C 下的占有率较高。定位结果绘制于归一化的细胞坐标系中。所有数据均来自三次生物学重复实验。
在暴露于 45°C 的 20 分钟内，我们每隔 5 分钟测量一次 DnaK 的动态行为（图2B）。在每个时间点，我们均按此前的方法，使用三组分 GMM 拟合 D_app 分布，并量化慢速（S_slow）、瞬态（S_trans）和快速（S_fast）状态的占比（
图2B和C）。升温后，S_slow 状态的占比迅速增加，在5–7 min后达到峰值，随后逐渐下降，但仍高于37°C时的基线水平。S_trans 状态的占比呈现相反的变化趋势，在最初5–7 min内下降，但到20 min时恢复至37°C时的基线水平；而 S_fast 状态的占比在整个实验过程中持续逐渐下降。总体而言，DnaK的动态行为并未完全恢复至应激前的状态，而是适应了一种新的稳态，其特征是慢速状态占比增加、快速状态群体减少。
为确定热休克是否也会改变DnaK在细胞内的作用位置，我们分析了45°C下DnaK的定位。热休克期间，DnaK向细胞两极和周边区域转移（图2D）。这种重新分布既反映了定位于细胞两极的 S_slow 状态占比增加，也反映了运动性较强的 S_trans 群体内部出现了额外的状态特异性定位变化（图2E）：热休克期间，S_trans 群体更多地分布于细胞周边；相比之下，S_fast 的定位未发生变化（图S2A），而 S_slow 原本就定位于细胞两极（图S2B）。因此，热休克在两个层面上重组DnaK：一是改变DnaK各运动状态的相对丰度，二是使这些状态内的分子发生空间重新分布。总体而言，这些结果表明，已有的DnaK分子群体几乎在升温后立即作出响应，而新平衡的建立则需要超过20 min。
热休克使DnaK稳定驻留于客户蛋白空间富集位点
此外，我们研究了单个分子如何随时间在这些动态状态之间转换。为量化DnaK在各状态下的驻留时间及状态间的转换速率，我们采用了隐马尔可夫模型（HMM）方法，该方法可推断最可能的序列
从单粒子轨迹中推断分子状态。具体而言，我们采用了 ExTrack 框架³⁵，该框架对含噪声的单粒子追踪数据及同一状态内扩散系数的变化具有稳健性，并能够处理快速状态转换。由于基于隐马尔可夫模型（HMM）的方法可能会高估含噪声轨迹中的状态数，产生难以从生物学角度解释的额外状态³⁶–³⁸，因此我们采用了一个粗粒化三状态模型，分别对应于上述定义的慢速、过渡和快速运动状态。
我们首先对 37°C 下采集的 DnaK 轨迹进行 HMM 拟合（图 3A；表 S3）。分析显示，三种状态的表观驻留时间均较短，其中 S_trans 为 0.20 ± 0.02 s，S_fast 为 0.27 ± 0.07 s，S_slow 为 0.20 ± 0.05 s。S_fast 与 S_slow 之间的转换主要经由 S_trans 发生，表明 S_trans 是高运动性 DnaK 与持续时间较长的底物结合之间的动力学桥梁。S_trans 与 S_fast 之间的快速交换可由二者部分重叠的表观扩散系数分布解释（图 1F）。在最适生长条件下，DnaK 在细胞内快速探查潜在底物。这一行为与 DnaK 监测未折叠和错误折叠蛋白质的作用，以及 ATP 驱动的 DnaK 反复结合和释放底物的循环相一致⁸。
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图 3.
DnaK 状态转换动力学的隐马尔可夫模型分析。
（A）通过对 37°C 下的 DnaK 数据进行三状态隐马尔可夫模型（HMM）分析获得的状态转换速率和驻留时间。（B）37°C 下及 45°C 热休克期间 DnaK 各状态的驻留时间。（C）37°C 下及 45°C 热休克期间 DnaK 从 S_trans 转换至 S_slow 的速率。（D）经验性
37°C条件下及45°C热休克期间，各状态下DnaK分子相对定位密度的累积分布函数（CDF）。误差棒表示均值标准误（SEM）。数据与图2相同。数据统计信息见表S3–S4。
为检验热休克如何影响DnaK在各运动状态中的停留时间，我们量化了45°C处理时间进程中的表观驻留时间（图3B）。变化最显著的是S_slow，其驻留时间在升温后的前2 min内增加至原来的4.1倍，达到0.84 ± 0.14 s，随后在余下的时间进程中逐渐缩短，但即使在45°C下处理20 min后，仍高于应激前水平。相比之下，S_trans和S_fast的驻留时间在热休克期间缩短，在5–7 min后达到最低值，并在20 min时恢复至接近热休克前的水平。
除停留时间延长外，更频繁地进入某一状态也可提高该状态的占据比例。基于此，我们接下来量化了热休克期间S_trans → S_slow的进入速率（图3C）。与驻留时间相比，进入S_slow的速率随时间增加得更为缓慢，在热休克10–12 min后达到最大值，约为原来的2倍。因此，热休克期间S_slow状态占据比例的增加主要由驻留时间延长驱动，而非进入事件频率的增加。由此可见，热休克可稳定DnaK与客户蛋白或蛋白质聚集体之间的相互作用，而新发生的慢速状态结合事件数量可能受到既有DnaK分子库可用量的限制。
最后，我们探究了S_slow驻留时间的增加是否与DnaK同更易聚集的蛋白质状态发生结合的局部富集有关。因此，我们量化了处于以下状态的分子的相对密度：
基于热图，分析了热休克前及热休克期间不同状态下的空间分布（图3D）。这反映了DnaK分子的平均聚集程度。在37°C下，S_slow和S_trans的相对密度相近，但热休克导致S_slow的密度显著增加，表现为分布出现长尾。这种空间上的集中与S_slow驻留时间的延长相关，提示DnaK在未折叠或聚集的客户蛋白积累的细胞位点停留更长时间。
IbpAB缓冲DnaK与易聚集客户蛋白的相互作用
高度保守的小热休克蛋白IbpA和IbpB形成异源二聚体，能够结合易聚集的底物，并被认为可与DnaK系统协同作用¹⁶。接下来，我们研究了IbpAB在活细胞中的动态行为，以及这些行为与DnaK的关系。为此，我们在染色体内源位点构建了具有功能的IbpA-HaloTag融合蛋白，并在37°C及45°C热休克期间进行了单分子追踪（图S3A）。与DnaK类似，IbpA在37°C下呈现三种表观运动状态；但与DnaK不同的是，其S_trans和S_fast更容易区分（图4A和B）。这可能反映了IbpA的分子质量较小，使自由扩散的IbpA分子能够以明显更快的速度运动。基于隐马尔可夫模型（HMM），IbpA分子在S_slow、S_trans和S_fast状态下的驻留时间分别为0.17 ± 0.03 s、0.15 ± 0.01 s和0.027 ± 0.002 s（图4C）。结合其与DnaK相似的状态转换模式，以及在37°C下已占较高比例的瞬态中间态，这些结果提示，瞬态中间态可能是分子伴侣动态行为的共同特征，使ATP依赖型和ATP非依赖型系统均能在快速扩散与较稳定的客户蛋白结合之间切换。
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图4.
稳态生长和热休克期间IbpA的动态变化。
（A）37°C条件下（303个细胞中的26619条轨迹）及45°C热休克期间（880个细胞中的16669条轨迹）IbpA-HaloTag（JML_Ec_14）的表观扩散系数（D_app）分布。采用三状态高斯混合模型（GMM）拟合D_app分布。（B）GMM确定的IbpA-HaloTag各扩散状态的占比。（C）通过三状态隐马尔可夫模型（HMM）分析37°C条件下IbpA的单分子数据，获得IbpA-HaloTag的状态转换速率。（D）通过HMM获得的37°C条件下及45°C热休克期间IbpA-HaloTag各扩散状态的驻留时间。所用数据与（B）相同。（E）37°C条件下IbpA-HaloTag的定位分布（左）以及37°C与45°C条件下定位分布的归一化差异（右）。红色表示37°C条件下IbpA的占据程度更高，蓝色表示45°C条件下IbpA的占据程度更高。（F）45°C条件下IbpA-HaloTag的定位分布（左）及其与45°C条件下DnaK-HaloTag定位分布的归一化差异（右；图2D）。红色表示IbpA的占据程度更高，蓝色表示DnaK的占据程度更高。定位结果绘制于归一化细胞坐标系中。数据统计信息见表S1–S4。所有数据均来自三次生物学重复。误差棒和±表示重复实验之间的均值标准误（SEM）。
IbpA对热休克的响应强于DnaK。在45°C暴露期间，S_slow群体的占比在10–12 min后达到约76%（图4A和B），并在15 min后涵盖几乎所有IbpA分子（图S3B），同时S_trans和S_fast群体相应减少。S_slow的驻留时间也显著增加（图4D），在45°C条件下10–12 min后达到1.3 ± 0.1 s，且未见恢复至热休克前水平的迹象。这种驻留时间的增加速度慢于
DnaK的快速增加，很可能反映了这些分子伴侣在蛋白毒性应激中的不同作用。
在热休克期间，IbpA的定位向细胞两极偏移（图4E），这与此前关于IbpA积累于细胞两极附近热诱导蛋白质聚集体的报道一致³¹,³²。与DnaK的直接比较表明，IbpA在37°C时分布更为均匀（图S3C），但在45°C热休克期间，其极性定位比DnaK更为显著（图4F）。这种重新分布主要由IbpA慢速状态占比的大幅增加所驱动，而S_trans或S_fast的空间分布变化较小，且不如DnaK相应状态的空间分布特征鲜明（图S3D–F）。总体而言，这一行为与此前研究中IbpAB聚集体通常可持续存在多个世代的发现一致³²。DnaK通过其ATP依赖性循环迅速结合并重塑未折叠的底物蛋白，而IbpA则积累于易聚集蛋白上。通过结合并稳定这些底物蛋白，IbpAB可能减轻了DnaK所承担的蛋白质稳态维持负担。
为直接检验IbpAB如何影响DnaK与底物的结合，我们在DnaK-HaloTag菌株中引入了染色体ibpAB基因缺失（ΔibpAB），并定量分析了DnaK的动态行为（图5A和S4A）。即使在37°C条件下，IbpAB的缺失也使DnaK的S_slow状态占比增至原来的2倍，表明即便在非应激条件下，IbpAB也有助于限制DnaK与易聚集蛋白的结合。这一效应在热休克期间更为显著，此时ΔibpAB菌株中DnaK的S_slow状态占比增至约85%（图5A和B）。隐马尔可夫模型（HMM）分析进一步表明，DnaK分子在ΔibpAB细胞中维持S_slow状态的时间显著延长，在5–7 min时间点的表观驻留时间为1.6 ± 0.4 s（图5C）。
与野生型细胞不同，ΔibpAB 菌株中 DnaK 的 S_slow 状态占有率在热休克后期时间点未见恢复。
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图 5.
共伴侣蛋白缺失对 DnaK 动态的影响。
（A–D）ΔibpAB（JML_Ec_195）、（E–H）ΔdnaJ（JML_Ec_202）和（I–K）ΔhtpG（JML_Ec_147）遗传背景下 DnaK–HaloTag 的动态。（A）ΔibpAB 示意图及表观扩散系数 D_app 的分布（37°C：1139 个细胞中的 21946 条轨迹；45°C：1467 个细胞中的 9423 条轨迹）；（B）高斯混合模型（GMM）各状态的占有率；（C）各状态的停留时间。（D）45°C 下 ΔibpAB 细胞中 DnaK–HaloTag 的定位（左侧），以及 45°C 下 ΔibpAB 与野生型细胞之间的归一化差异。红色表示 ΔibpAB 细胞中 DnaK–HaloTag 占有率较高的区域，蓝色像素表示野生型细胞中 DnaK 占有率较高的区域。（E）ΔdnaJ 示意图及 D_app 的分布（37°C：724 个细胞中的 12317 条轨迹；45°C：961 个细胞中的 7747 条轨迹）；（F）GMM 各状态的占有率；（G）各状态的停留时间。（H）45°C 下 ΔdnaJ 细胞中 DnaK–HaloTag 的定位（左侧），以及 45°C 下 ΔdnaJ 与野生型细胞之间的归一化差异。红色表示 ΔdnaJ 细胞中 DnaK–HaloTag 占有率较高的区域，蓝色像素表示野生型细胞中 DnaK 占有率较高的区域。（I）ΔhtpG 示意图及 D_app 的分布（37°C：849 个细胞中的 23410 条轨迹；45°C：1038 个细胞中的 10415 条轨迹）；（J）GMM 各状态的占有率；（K）各状态的停留时间。定位结果绘制于归一化的细胞坐标系中。数据统计信息见表 S1–S4。所有数据均来自三次生物学重复。误差线和 ± 表示重复实验间的均值标准误（SEM）。
最后，在 ΔibpAB 菌株中，热休克期间 DnaK 的定位
与野生型细胞相比，其极性定位更加明显（图5D和S4B），更接近IbpA的空间分布（图4F）。这表明，在缺乏IbpAB时，DnaK会更广泛地被募集至含有易聚集客户蛋白的细胞极部位。综上，这些结果表明，IbpAB在稳态生长和热休克期间均可缓冲DnaK的工作负荷，限制长寿命的DnaK–客户蛋白相互作用或聚集体相关相互作用的积累。
DnaJ或HtpG的缺失轻度改变DnaK的热休克动态
接下来，我们研究了经典共伴侣蛋白DnaJ如何在体内塑造DnaK的动态行为。DnaJ将客户蛋白递送至DnaK，并刺激DnaK水解ATP，从而促进其转变为与底物高亲和力结合的状态⁸,³⁹。另有研究提出，DnaJ可将DnaK募集至蛋白质聚集体⁴⁰。因此，删除dnaJ使我们能够区分DnaK对客户蛋白的内在探查与共伴侣蛋白驱动的靶向和稳定作用。
在37°C下，DnaJ缺失使S_slow状态占比略有增加，而驻留时间与野生型相近（图5E–G和S4A）。尤其是在热休克后期，ΔdnaJ细胞中从S_trans向S_slow的重新分布比野生型细胞更为显著，S_slow状态占比在15分钟时达到近90%。此外，ΔdnaJ菌株中S_slow状态占比的下降更为缓慢。尽管如此，在整个时间进程的大部分阶段，S_slow驻留时间的增加均与野生型高度一致，表明在急性热休克期间，DnaK进入或维持缓慢的客户蛋白结合状态并不严格依赖DnaJ。我们未观察到DnaK定位的明显变化（图5H）。虽然ΔdnaJ对热休克后存活率的影响较小⁴¹，但ΔdnaJ中的恢复延迟
细胞中的结果表明，在持续热应激期间，DnaJ 有助于客户蛋白的高效处理、重塑或释放。此外，大肠杆菌还编码两种 DnaJ 同源蛋白，其确切的生理作用尚未得到充分阐明⁴²˒⁴³。
进一步地，我们探究了 HtpG 如何在功能上与 DnaK 系统协同作用。HtpG 是细菌中的 Hsp90 同源蛋白，可保护蛋白质免于热诱导的变性⁴⁴。在许多真核细胞中，Hsp90 是必不可少的，并深度参与信号传导、蛋白质成熟和蛋白质组调控⁴⁵。敲除 HtpG 使我们能够检验其是否参与大肠杆菌中 DnaK 与客户蛋白的交接、特定 DnaK 结合客户蛋白的稳定，或底物从 DnaK 循环中的释放。
在 37°C 下，ΔhtpG 对 DnaK 动态的影响较小（图 5I–J 和 S4A）。S_slow 状态占比略有升高，而 S_slow 状态的驻留时间仍与野生型相当。热休克期间，S_slow 状态占比适度升高，超过野生型水平；但与 ΔdnaJ 细胞不同，这一升高随时间推移逐渐回落，其恢复过程更接近野生型。在 ΔhtpG 菌株中，热诱导的 S_slow 状态驻留时间延长发生得更为缓慢（图 5K）。DnaK 的定位也基本未变，除野生型细胞中观察到的模式外，未出现明显的重新分布（图 S4C）。值得注意的是，在这些基因缺失菌株中，S_fast 的扩散统计特征与 GlcB 一致（图 S5D）。综合来看，这些结果表明，HtpG 参与热休克期间与 DnaK 相关的蛋白质稳态维持，并影响 DnaK 各运动状态的总体占比、驻留时间及空间重新分布。
DnaK 动态揭示蛋白质稳态负担
细胞蛋白质经进化能够在蛋白质质量控制网络的能力范围内保持可溶状态，并且有研究提出，
当蛋白质丰度或聚集倾向增加时，所剩的缓冲能力十分有限⁴⁶˒⁴⁷。与这一观点一致，已有研究表明，过表达不稳定或易聚集的蛋白质可诱导热休克蛋白的表达⁴⁸˒⁴⁹。在此，我们考察了是否也能在DnaK动态行为层面直接检测到蛋白质稳态负担的增加（图6A）。为此，我们过表达了天然热不稳定客户蛋白，并测量了DnaK在最适生长温度下及受到额外热应激时的响应。
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图6.
热不稳定蛋白的过表达诱导DnaK产生类似热休克的响应。
（A）过表达DnaK热不稳定蛋白底物的细胞示意图。
（B）左：过表达MetE-GFP的细胞的代表性荧光图像（比例尺为2 µm）。右：细胞内DnaK各扩散状态的代表性单分子轨迹，与MetE荧光信号叠加显示（比例尺为1 µm）。在过表达（C）MetE-GFP（JML_Ec_157；37°C：449个细胞中的14,643条轨迹；45°C：865个细胞中的6,659条轨迹）或（D）FumA-GFP（JML_Ec_219；37°C：827个细胞中的18,276条轨迹；45°C：925个细胞中的7,176条轨迹）的细胞中，DnaK-HaloTag的表观扩散系数（D_app）。使用三态高斯混合模型（GMM）拟合D_app分布。在过表达（E）MetE-GFP或（F）FumA-GFP的细胞中，由GMM得到的DnaK-HaloTag在37°C及45°C热休克期间各扩散状态的占比。（G）37°C下过表达MetE-GFP的细胞中DnaK-HaloTag的定位分布（左侧），以及37°C下MetE-GFP过表达细胞与野生型细胞之间的归一化差异。红色表示MetE-GFP过表达细胞中DnaK-HaloTag占比更高的区域，而蓝色像素表示DnaK在……中占比更高的区域
野生型细胞。定位结果绘制于归一化的细胞坐标上。（H–I）基于隐马尔可夫模型（HMM）推导的、在过表达（H）MetE-GFP或（I）FumA-GFP的细胞中DnaK各状态的驻留时间。（J–K）各状态下DnaK轨迹到最近的过表达（J）MetE-GFP或（K）FumA-GFP聚集斑点的距离分布。数据统计信息见表S1–S4。所有数据均来自三次生物学重复。误差线和±表示重复实验间的均值标准误（SEM）。
我们选择了两种已被鉴定为DnaK客户蛋白的内源性代谢酶：FumA是一种延胡索酸酶，在柠檬酸循环中催化延胡索酸向L-苹果酸的转化；MetE是一种不依赖钴胺素的甲硫氨酸合酶，参与甲硫氨酸生物合成⁵⁰。为增加客户蛋白负荷，我们将编码FumA-GFP或MetE-GFP的ASKA+质粒⁵¹导入DnaK-HaloTag菌株（图6B）。使用0.1 mM IPTG诱导目标蛋白表达2 h，使MetE和FumA的表达量分别达到野生型水平的1.8倍和2.2倍，且未显著影响细胞存活率（图S6A–B）。在这些条件下，MetE-GFP和FumA-GFP分别在42 ± 6%和31 ± 4%的细胞中形成明显的聚集斑点，而在内源性表达水平下很少观察到聚集斑点（占细胞的9.3 ± 1.2%）（图S5C）。诱导后，我们按照上述方法测量了DnaK-HaloTag的单分子动力学。
FumA和MetE的过表达均在37°C时就提高了DnaK的S_slow状态占比，但FumA的效应更强（约2.1倍），MetE的效应则较为温和（约1.5倍）（图6C–F和S5D）。两种过表达菌株中DnaK的定位均发生了改变，DnaK在细胞两极的富集程度相对增加
与野生型细胞相比（图6G和S5E）。这一变化伴随着 S_slow 驻留时间的增加，表明即使在最适生长条件下，过表达也能稳定 DnaK 的长时结合（图6H和I）。因此，底物过载足以重塑 DnaK 的动态行为和定位，使其呈现类似于热休克时的特征。
接下来，我们探究了 DnaK 的运动状态是否在空间上与过表达蛋白形成的聚集斑点相关。对于每个 DnaK 定位点，我们测量了其与最近的 FumA-GFP 或 MetE-GFP 簇之间的距离，并按 DnaK 的运动状态对该距离进行分析（图6B、J和K）。与 DnaK 被募集至客户蛋白富集位点的观点一致，S_slow 分子距离聚集斑点最近，其与 FumA-GFP 和 MetE-GFP 聚集斑点的距离中位数分别为 387 ± 44 nm 和 516 ± 173 nm。相比之下，S_trans 和 S_fast 分子与最近聚集斑点的距离中位数更大（对于 FumA-GFP，分别为 717 ± 53 nm 和 778 ± 75 nm；对于 MetE-GFP，分别为 648 ± 106 nm 和 666 ± 18 nm）。尽管并非所有 DnaK 分子都定位于可见聚集斑点附近，但这些数据表明，长寿命的 S_slow 状态在过表达客户蛋白积聚位点附近富集。这些实验表明，蛋白质稳态负担的增加可以直接从 DnaK 动态行为的变化中检测到。
最后，我们考察了热应激与底物过表达共同作用对 DnaK 动态行为的影响。在 FumA 和 MetE 过表达细胞中，45°C 热休克均导致 S_slow 状态占比显著增加，同时主要伴随着 S_trans 状态占比的减少（图6C–F）。与野生型细胞不同，在热休克时间进程中，过表达菌株在后期未出现 S_slow 状态占比下降或 S_trans 群体恢复的现象。S_slow 驻留时间为
在热休克期间也有所升高。热休克期间，S_trans 和 S_free 到最近聚集焦点的平均距离缩短，变得与 S_slow 相近（图 S5F–G）。总体而言，这些结果表明，DnaK 能够在 37°C 下缓冲热不稳定客户蛋白过表达所带来的负担，但当底物过载与热诱导的内源性蛋白质组解折叠同时发生时，这种缓冲能力便会趋于紧张。
讨论
通过在底物结合突变株中，以及在热休克、伴侣蛋白网络扰动和热不稳定客户蛋白过表达条件下开展活细胞单分子追踪，我们表明，Hsp70 家族伴侣蛋白 DnaK 在活大肠杆菌细胞中动态分配于不同的运动状态。这些结果将 ATP 依赖性的 Hsp70/DnaK 伴侣蛋白循环置于复杂的细胞内环境中，首次揭示了 DnaK 在稳态生长和蛋白质毒性应激期间如何平衡快速的蛋白质组巡查与较长时间的客户蛋白结合。由于 Hsp70 伴侣蛋白在细菌、真核生物和部分古菌中的结构域架构及 ATP 依赖性客户蛋白结合机制高度保守，此处观察到的动态调控原则很可能具有广泛适用性，同时仍受到物种特异性辅助伴侣蛋白网络的塑造⁶˒⁴¹。
本研究的一项核心发现是，即使在 37°C 这一大肠杆菌的标准生理温度下生长且未受应激的细胞中，大部分 DnaK（>80%）也并非处于自由扩散状态（图 1F）。与大小相近的自由扩散蛋白 GlcB/MetE（图 1D）以及底物结合缺陷型 DnaK^S427P 突变体（图 1E）的比较表明，DnaK 运动性降低反映了其通过短暂或更稳定的相互作用，持续探查细胞蛋白质组。这种结合状态值得注意，因为 DnaK 是
在大肠杆菌的稳态生长过程中，其丰度已相当高，约占细胞总蛋白质量的 1%，估计相当于每个细胞中有 10,000–40,000 个分子⁵²˒⁵³。因此，庞大的基础 DnaK 库似乎并非为应对未来胁迫而保留的非活性储备。相反，其中很大一部分已参与持续进行的蛋白质组监控。这一解释与蛋白质组尺度的研究结果一致：这些研究将 DnaK 确定为大肠杆菌蛋白质折叠网络的核心枢纽，它具有数百种相互作用蛋白，并在缓冲易聚集、部分解折叠的底物蛋白方面发挥尤为重要的作用¹˒²。值得注意的是，尽管 IbpA 是一种不依赖 ATP 的保持型分子伴侣¹²˒⁵⁴˒⁵⁵，它也表现出较大的瞬时结合分子群体（图 4A）。因此，在游动态、瞬时结合态和较稳定结合态之间进行动态分配，可能是细菌分子伴侣的一种普遍工作原理，使其能够持续探查蛋白质组，并在底物负荷增加时迅速重新分配。
我们的发现与一种日益受到认可的观点一致，即快速、短暂的相互作用可以构成细胞内靶标搜索的一种功能模式，而不只是代表未结合状态或非活性状态。这一观点的形成在很大程度上得益于单分子追踪方法，该方法能够分辨在群体测量中被平均化的动态状态转换和分子行为异质性。近期针对转录因子和调控复合物开展的活细胞单分子研究表明，靶标识别往往源于多次短暂、可逆的接触，而稳定结合仅占整个搜索过程的一小部分⁵⁶–⁵⁸。与此一致，许多 DNA 结合蛋白的动态行为主要由
频繁的非特异性DNA相互作用（55–99%）²¹。当到达靶标后成功结合的概率较低时，反复的非特异性结合与解离可通过增加局部采样、同时避免在非生产性位点过度滞留来加速搜索⁵⁹˒⁶⁰。我们的结果将这一观点拓展至蛋白质–蛋白质相互作用，而此类相互作用在活细胞动力学研究中受到的关注要少得多。
DnaK在拥挤的细胞质中面临复杂的搜索问题：它必须持续巡查庞大的蛋白质组，其中包含大量潜在的低亲和力疏水基序；这些基序大多埋藏于已折叠的蛋白质内部，但会在合成、去折叠或错误折叠过程中暴露出来¹˒⁶¹。高效巡查需要在移动性与结合之间取得平衡。如果与客户蛋白的相互作用过于稀少或过弱，DnaK可能无法捕获易受损的折叠中间体；如果这些相互作用过于稳定，可用的DnaK分子池则会被占用，无法对新的底物进行采样。隐马尔可夫模型（HMM）分析显示，尽管S_fast和S_trans的占比不同，但其驻留时间相近，分别为270 ms和200 ms（图3A），表明快速采样与瞬时结合之间存在频繁转换，这与各状态之间的动态平衡相一致。与此同时，IbpA的状态平衡表现出短得多的S_fast和S_trans驻留时间，分别为30 ms和140 ms（图4C）。与DNA结合蛋白的情况不同（von Hippel & Berg，1989），间歇搜索理论预测，并不存在普遍适用的最优状态比例，而是存在一种由扩散、客户蛋白可及性、识别动力学以及生产性结合概率共同塑造的平衡⁶²。
推断得到的状态转换架构（图3A）表明，DnaK主要通过瞬时状态进入长寿命结合状态，即S_fast ↔ S_trans ↔ S_slow，而非切换
直接从自由扩散转变为稳定结合。这与Hsp70的多步骤循环一致。ATP结合态的DnaK能够快速结合并释放客户蛋白，而ATP水解则使DnaK转变为闭合的、高亲和力的ADP结合态，从而稳定底物结合³˒⁸˒⁶³。DnaJ通过刺激ATP水解促进这一转变，而GrpE则促进核苷酸交换、ATP重新结合、底物结合结构域重新开放以及客户蛋白释放⁷˒⁶⁴。尽管DnaK的运动状态无法直接对应于特定的核苷酸状态或构象状态，S_trans可能反映了体内一种主要的工作模式：DnaK首先识别客户蛋白，随后要么释放客户蛋白并返回S_fast状态，要么进一步形成稳定的S_slow复合物。这一观点与单分子重构研究的结果一致；这些研究表明，DnaK和DnaJ通过反复进行构象选择与解折叠的动态循环，重塑错误折叠的客户蛋白⁶⁵。
DnaK的运动状态在细菌细胞质内具有空间组织性（图1I–K）。这表明，DnaK在具有空间结构的蛋白质稳态环境中发挥作用，而非作为均匀分布于细胞质中的储备。尽管细菌缺乏膜包被的区室，但已有研究表明，受损蛋白质会聚集于特定的亚细胞区域，包括细胞两极³¹–³³。这种空间组织可能源于拟核排斥、局部拥挤、聚集体成熟、膜邻近区域的损伤，或较老蛋白质组装体在细胞两极的滞留。在此背景下，DnaK似乎遵循其客户蛋白的空间分布，使分子伴侣活性不仅与客户蛋白的种类和丰度相关，还与其细胞内位置相关。热休克期间，DnaK进一步向细胞两极及周边区域富集，伴随着
S_slow 的重分布最为显著，这与这些区域中长寿命 DnaK–客户蛋白相互作用的积累一致。既往研究同样报道，热休克后 DnaK 及其他蛋白质质量控制因子在细胞两极富集³¹–³³。
急性热休克导致 DnaK 的运动性立即下降，在温度骤升后数秒内即可检测到，使 DnaK 转向与客户蛋白更持久的结合状态（图 2A）。这一快速响应表明，早在热休克诱导的分子伴侣表达能够显著提高蛋白质丰度之前，细胞就已通过预先存在的 DnaK 库获得了抵御蛋白毒性应激的初步保护¹¹,¹⁷。这也凸显了本研究将薄膜温度控制与单分子追踪相结合的创新性，使得在温度骤升后数秒内测量 DnaK 动态成为可能。时间分辨追踪进一步表明，早期响应主要由 S_slow 状态的稳定化驱动，而非 S_trans → S_slow 转变速率的即时升高（图 3B 和 C）；热休克最初两分钟内，S_slow 的驻留时间增至约 4 倍，而进入该状态的速率增幅较小，在 10–12 分钟时达到峰值，仅增至约 2 倍。这表明，热休克首先使 DnaK 更稳定地结合于变得更难释放或重塑的客户蛋白或组装体，而非立即提高相遇频率。客户蛋白可能变得更易聚集、具有更高的多价性，或更依赖 ATP 驱动的反复重塑，从而延长 DnaK 的驻留时间。
IbpA 表现出更为显著的热休克诱导重分布，大多数分子（>80%）进入慢速状态，并在持续热休克期间以更长的驻留时间（约 1.3 秒）维持该状态，未检测到恢复（图 4B 和
D）。这一行为与 IbpAB 作为非 ATP 依赖性保持型伴侣蛋白的已知作用一致：它们结合易聚集蛋白，并使其保持在可供后续 ATP 依赖性伴侣蛋白和解聚酶处理的状态¹²˒¹⁴˒⁶⁶˒⁶⁷。因此，DnaK 与 IbpA 的比较揭示了两种互补的应激响应：IbpA 逐渐以缓慢且长寿命的状态积累在易聚集的底物蛋白上，以在持续的蛋白毒性应激期间稳定这些底物；而 DnaK 则始终分布于快速态、瞬态和慢速态，这与其在主动的 ATP 依赖性底物识别、重塑和释放过程中发挥更广泛作用相一致。
ibpAB 缺失表明，即使在最适生长条件下，IbpAB 也能减轻 DnaK 的工作负荷，敲除菌株中处于慢速态的 DnaK 比例增至约 2 倍（图 5A）。热休克期间，这一负担进一步加重，处于慢速态的 DnaK 占比达到约 80%，且到 20 min 时仍几乎未见恢复（图 5B）。此外，ibpAB 缺失导致 DnaK 的定位发生变化（图 5D），这可能表明 DnaK 承担了 IbpAB 的部分功能。因此，IbpAB 似乎通过将易受损的底物蛋白稳定在保持型伴侣蛋白结合态，降低了 DnaK 的驻留负担；这种结合态不易使 DnaK 在动力学上陷入缓慢相互作用中。
相比之下，尽管 DnaJ 在底物递送和刺激 DnaK 的 ATP 水解方面具有经典作用⁷˒⁸，dnaJ 缺失对 DnaK 动态的影响却略为温和（图 5E–H）。这表明，体内 DnaK 与底物蛋白的整体结合并非仅由 DnaJ 介导的靶向作用决定。尽管已知 DnaJ 能够调节 DnaK 某些特定相互作用的效率、特异性或持续时间，但大肠杆菌还编码两种 DnaJ 同源蛋白 CbpA 和 DjlA，其确切的生理作用
仍未得到明确定义。研究表明，CbpA和DjlA共同作用时能够在体外和体内补偿DnaJ的缺失，但二者单独作用时均无法实现这一补偿，J结构域蛋白家族的其他成员也不具备此能力⁴²,⁴³。这种补偿可能使DnaK在缺乏DnaJ的情况下仍保留相当程度的底物结合活性，但在持续热休克期间，后续底物处理的效率仍会降低。
与此同时，删除htpG仅引起DnaK占据比例、驻留时间及定位的轻微变化（图5I–K）。HtpG是细菌中的Hsp90同源蛋白，在底物重塑过程中与DnaK协同作用，但并不像DnaJ或GrpE那样直接调控DnaK的ATP酶循环。生化研究表明，DnaK首先捕获非天然构象的底物，随后可在后续重塑步骤中与HtpG协同作用¹³,⁶⁸。因此，HtpG不太可能是DnaK整体底物识别或热诱导重分布所必需的，但可能有助于处理特定的底物亚群，或参与底物成熟的后期阶段。
蛋白质过表达通过增加需要稳定或重塑的DnaK底物的丰度，提供了一种无需改变温度即可增加蛋白质稳态负担的独立途径。FumA和MetE的过表达均在37°C时就使DnaK的动态行为向S_slow状态偏移，表明即使在其他方面均为最适生长条件的情况下，底物表达水平的升高也足以重塑DnaK的动态行为（图6C和D）。当过表达与热休克相结合时，这种应激相关的重分布进一步加剧，S_slow状态的占据比例达到60%–80%，驻留时间也随之延长（图6E–I）。在这两种情况下，S_slow状态占据比例的增加均伴随着DnaK定位的改变，DnaK分子富集于FumA和MetE斑点附近，朝向细胞
细胞两极（图6G和S5E）。DnaK对FumA和MetE的响应差异可能反映了客户蛋白的特异性属性，包括折叠速率、热稳定性、聚集倾向、DnaK结合基序的暴露程度以及对降解的易感性。与这一观点一致，近期研究表明，DnaK对所表达蛋白质变体的响应同时取决于翻译速率和蛋白质稳定性⁴⁸。总体而言，DnaK的动态行为可作为客户蛋白负荷增加的读出指标，这对于细菌生理学和生物技术具有更广泛的意义，因为蛋白质过表达、代谢失衡、突变积累和环境胁迫均可增加对蛋白质质量控制系统的需求。因此，DnaK单分子追踪可能在出现大型聚集体或明显生长缺陷之前就检测到蛋白质稳态胁迫。
综上，我们的结果支持这样一种模型：DnaK是一种动态分配的蛋白质稳态资源，而非仅在胁迫发生后才被动员的被动储备。分子伴侣库通过快速交换的相互作用持续监测蛋白质组，而ATP驱动的DnaK重塑则将这种快速探测与持续时间更长的客户蛋白相互作用相耦联（图7）。通过实时解析这些转变，我们表明，蛋白质稳态维持能力不仅取决于分子伴侣的丰度，还取决于分子伴侣利用的动力学和空间组织方式。这一框架为理解Hsp70生化循环如何在拥挤的细胞环境中运行提供了新见解，并为理解有限的蛋白质质量控制网络如何快速适应不断变化的生理需求提供了一种通用策略；这种适应机制很可能在不同生命域中具有保守性。
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图7.
ATP驱动的DnaK模型
细菌细胞内的蛋白质组监控与客户蛋白结合。
DnaK 持续对细胞质进行采样，从而监控暴露的疏水基序。客户蛋白的捕获促使 DnaK 进入一种瞬态中间状态，在该状态下，DnaK 的构象重塑将快速采样与长时间的客户蛋白处理过程联系起来，尤其是在易发生聚集的位点。
研究局限性
本研究依赖于根据迁移率分布和隐马尔可夫模型（HMM）分析推断的扩散状态，并通过扰动实验验证状态归属及识别具有不同功能的 DnaK 亚群。基因缺失表型可能综合反映了分子伴侣处理过程的即时效应，以及热休克网络较为缓慢的重塑效应。此外，每种状态在分子层面上都可能具有异质性，尤其是瞬态群体，其中可能包含多种与客户蛋白结合且快速交换的分子物种。同时，这些测量无法确定各 DnaK 状态中所包含的客户蛋白。这一局限性对于解释细胞极部／周边信号尤为重要，因为目前尚不清楚其中分别有多大比例代表典型的易聚集胞质蛋白、膜邻近客户蛋白，或涉及多种质量控制因子的混合组装体。最后，细菌细胞质中的扩散不仅受客户蛋白结合的影响，还受到大分子拥挤、空间限域、局部黏度和亚细胞位置的影响²⁷,⁶⁷；因此，不应轻率地将迁移率变化一一对应地换算为所结合客户蛋白的数量。未来，将内源性 DnaK 追踪与可区分客户蛋白的报告系统相结合，对核苷酸循环突变体及其与辅助分子伴侣的相互作用进行扰动，或对 DnaK 与 IbpA、DnaJ 或 ClpB 进行多色追踪，将有助于阐明这些动态过程。
材料可获得性
菌株
本研究生成的数据可应要求提供。
作者贡献
概念构思，A.P.和J.M.；方法学，A.P.；研究实施，A.P.和J.M.；经费获取，J.M.；正式分析，A.P.；数据整理，A.P.；可视化，A.P.和J.M.；项目管理，J.M.；软件，A.P.和T.R.；监督指导，J.M.和T.R.；初稿撰写，A.P.和J.M.；审阅与编辑，A.P.、T.R.和J.M.。
利益声明
作者声明不存在竞争性利益。
材料与方法
细菌菌株与生长条件
所有细菌菌株及其来源均列于表S5。所有菌株均为大肠杆菌（E. coli）K12 MG1655的衍生株，赋予抗生素抗性的插入基因盒分别以kan、amp和cm表示，对应卡那霉素抗性（Kmʳ）、氨苄青霉素抗性（Ampʳ）和氯霉素抗性（Cmʳ）。在注明的情况下，抗性基因两侧带有FLIP识别靶（frt）位点，当pCP20载体表达Flip重组酶时，可切除插入片段⁶⁹。用于聚合酶链式反应的寡核苷酸列于表S6。
染色体融合构建体和基因缺失通过λ-RED重组、Gibson组装或P1转导构建⁶⁹–⁷¹。利用λ-RED重组将HaloTag及kan基因盒插入染色体原位位点，再通过P1噬菌体转导将其转移至受体MG1655菌株。通过λ-RED重组，以kan基因盒替换目标基因，从而引入染色体缺失。所有细菌菌株均通过PCR和Sanger测序确认。首先利用Gibson组装，将DnaK单点突变体与HaloTag-卡那霉素抗性基因盒一同克隆至质粒载体中，随后
经扩增后，利用 λ-RED 重组插入原生 dnaK 位点。
进行显微成像时，将细胞置于添加了 0.2% 甘油、0.1% 酪蛋白氨基酸和 1 µg/ml 硫胺素（v/v）的 M9 最小培养基（M9glyCAAT）中，在 30°C 或 37°C 下培养过夜。次日，将细胞稀释 1000 倍，并培养至光密度（OD₆₀₀）约为 0.1。按照先前描述的方法⁷³，使用 Janelia Fluor JFX554 配体⁷²标记 HaloTag。简而言之，在培养基中加入 1.5 μM JFX554 配体，将细胞置于加热模块上振荡孵育 30 min；随后用培养基洗涤四次，期间使用温控离心机（Sigma 2-16KHL）保持温度；再让细胞恢复 60 min（同时保持处于指数生长期），并在成像前进行最后一次洗涤。最后，将细胞点样于用 M9 培养基制备的 1%（w/v）结冷胶垫（#J63423.30，Thermo Fisher Scientific）上，并覆盖 VAHEAT 盖玻片。对于携带 ASKA+ 质粒的 JML_Ec_219 和 JML_Ec_157 菌株（表 S7）的过表达实验，在成像前额外使用 0.1 mM IPTG 诱导细胞 2 h。
菌落形成单位
为确定各菌株在热休克后的增殖能力，进行了菌落形成单位（CFU）测定。简而言之，将过夜培养物稀释约 1000 倍，并培养至指数生长早期。将各培养物在 51°C 下热休克 15 min。随后，对热休克前后的培养物分别进行系列稀释，并将细胞点样于 LB 琼脂平板上，在 30°C 下培养过夜。携带 ASKA+ 质粒的 JML_Ec_136 和 JML_Ec_141 菌株在热休克前用 0.1 mM IPTG 孵育 2 h。
光激活定位显微术
活细胞单分子追踪
光激活定位显微成像（PALM）在一台定制的全内反射荧光（TIRF）显微镜上进行，该显微镜基于快速自动化模块化显微镜（RAMM）系统（ASI Imaging）搭建，配备电动载物台、z轴电动物镜安装座和电动滤光轮（US-2000、MIM4、TG8，ASI Imaging）。荧光测量使用功率为100 mW、波长为561 nm的激光，透射率设置为70%（iChrome MLE，Toptica）。激光经准直后，通过100倍油浸物镜（CFI Plan Apochromat Lambda D，数值孔径1.45，Nikon），以实现大倾角薄层照明的角度聚焦于样品上（Tokunaga et al. 2008）。荧光发射光通过二向色镜和陷波滤光片（ZT405/488/561rpc和ZET405/488/561m，Chroma）进行滤光，并使用EMCCD相机（iXon Life 897，512×512像素，Andor）进行检测。采用透射照明采集明场图像，用于细胞分割。透射照明由LED光源和聚光镜（ASI Imaging）提供。PALM影像序列的采集帧时间为5.475 ms，每次采集20,000帧。使用功率为100 mW、波长为488 nm的激光，在透射率设置为3%的条件下，测量相应菌株的总体GFP荧光（iChrome MLE，Toptica）。
成像过程中的温度控制和监测通过VAHEAT加热载物台（Stable Scopes GmbH）实现。实验前，使用等离子体清洗机（Tergeo plasma cleaner，Pie Scientific）对VAHEAT芯片进行等离子体刻蚀，以去除背景荧光颗粒。除非另有说明，首先在30/37°C下对细胞进行记录，随后将温度升至45°C。热休克期间，每隔5 min对样品进行一次记录，直至20 min。
单分子追踪分析
荧光斑点的检测与追踪采用
使用 Trackpy⁷⁴ 进行。对于延时成像视频中的每一帧，采用带通滤波、峰值检测和强度阈值筛选来检测荧光斑点。随后，以这些初始定位结果为起点，进行高分辨率位置精修。如果细胞区域内的分子在连续帧中的位置相距不超过 1.06 µm，则将其连接为同一条轨迹。如果在同一检测半径内检测到多个定位点，则将这些定位点全部从分析中剔除。利用深度神经网络 Omnipose 对明场图像进行细胞分割，以确定细胞区域⁷⁵。我们使用 [BF_model6] 模型对数据进行分割。通过逐步均方位移计算表观扩散系数，以确定分子的运动性，计算公式如下：
其中，x(t) 和 y(t) 表示分子在时间 t 时的坐标，Δt 为相机的帧率，n 为轨迹中的总步数。由于计算所得 D_app 的可靠性较低，位移次数少于 9 次的轨迹未纳入分析。
分子的不同动态状态预期会反映在其 D_app 值中。为确定各扩散状态下分子的运动性及所占比例，参照文献 24，采用基于期望最大化算法的高斯混合模型（GMM）⁷⁶，对各条件下经 log₁₀ 转换的 D_app 数据进行拟合。由三个高斯分布构成的混合模型中，各状态的均值、标准差和权重均为自由参数。对于 IbpA-HaloTag，采用所有参数均可自由变化的三高斯混合模型拟合实验数据。对于 DnaK-HaloTag 数据，快速运动组分的均值（S
fast）的值根据各温度下 GlcB-HaloTag 的快速运动峰确定（图 S1B 和 G）。在热休克期间，慢速状态（S_slow）的平均 D_app 固定为所有热休克时间点的 D_app 平均值。
隐马尔可夫建模
采用 Python 的 ExTrack 隐马尔可夫模型（HMM）软件包³⁵分析动态状态之间的转变速率。算法以三种扩散状态进行初始化；基于生物学对照，各状态扩散系数的初始平均估计值与实验数据经高斯混合模型（GMM）拟合得到的平均 D_app 值相同（图 S1B 和 G）。对于每种扩散状态，HMM 算法推断其平均扩散系数、状态占有率及各状态之间的转变概率。通过计算各状态的总退出速率，得到平均驻留时间。
对于部分独立重复实验，HMM 输出出现了闪烁或黏滞性驻留时间伪影，将其判定为从 S_fast 极快速退出的转变，而非真实的分子状态变化。由于 S_fast 是一种短寿命状态，且 S_trans 的扩散系数取值范围较宽，其中许多值接近 S_fast，因此这一问题进一步加剧，有时难以分辨驻留时间。为此，仅对易出现这些伪影的数据集施加快速状态（S_fast）向外转变概率的约束 [extrack_constrained.py]。对离开 S_fast 的总概率设置上限，使模型无法给出短于约三帧的驻留时间；三帧是我们认为能够可靠分辨的最短时间尺度。同时，为保证数值稳定性，设置了一个较小的下限，而两种转变之间的相对偏好则允许自由变化。这保留了
在转移模型中保持灵活性，同时避免拟合产生人为偏短的 S_fast 驻留时间。
定位分析
使用函数 [spatial_distribution.py] 绘制单分子定位热图。该脚本在共享的主成分空间（sklearn.decomposition.PCA）中构建并比较点坐标的二维热图。对于每个数据集，脚本计算二维直方图，并通过以下步骤生成轮廓：将数据集的原始掩膜坐标映射到与热图相同的二维网格上，使用高斯滤波器（σ = 0.5）对该掩膜直方图进行平滑，计算 Otsu 阈值（乘以 0.5），并在该阈值处绘制等值轮廓；同时使用所得二值掩膜，将轮廓外的热图数值置零。热图按定位点总数进行归一化，差值热图则通过将归一化热图彼此相减得到。为避免长细胞中存在多个拟核而导致数据偏倚，分析中排除了面积大于 2.5 µm² 的细胞。该脚本还生成沿细胞长度方向的一维分布（直方图和核密度估计曲线）。此外，脚本通过将每个经掩膜处理的热图除以相应数据集的定位点数，得到“相对密度”，并绘制各状态的经验累积分布函数。
使用脚本（distance_to_aggregates.py）分析 DnaK 轨迹到 MetE-GFP 或 FumA-GFP 簇的距离。使用 trackpy 检测簇；对于含有多个簇的细胞，后续分析采用到最近簇的距离。使用（intensity_per_cells.py）分析每个细胞的荧光强度。仅使用面积 ≤ 2.5 µm² 的细胞。
补充图及图注
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图
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图 S1.
（A）DnaK-HaloTag 菌株（JML_Ec_05）、野生型菌株（MG1655）和 ΔdnaK 菌株（JML_Ec_60）的菌落形成单位测定。（B）37°C 下 JFX554 标记的 GlcB-HaloTag（JML_Ec_141）的表观扩散系数（D_app）分布。（C）37°C 下 JFX554 标记的 MetE-HaloTag（JML_Ec_136）的 D_app 分布。（D）30°C 下 JFX554 标记的 DnaK-HaloTag（JML_Ec_05）的 D_app 分布（来自 962 个细胞的 77994 条轨迹）。（E）30°C 下 DnaK^S427P-HaloTag 的 D_app 分布。（F）30°C 下 DnaK^V436F-HaloTag 的 D_app 分布（平均 D_app 为 3.37 ± 0.10 µm²/s；来自 598 个细胞的 70019 条轨迹）。同时展示了 30°C 下野生型 DnaK-HaloTag 的 D_app 分布。（G）45°C 下 JFX554 标记的 GlcB-HaloTag 的 D_app 分布（来自 857 个细胞的 23519 条轨迹）。平均 D_app 为 3.94 ± 0.46 µm²/s。采用双状态高斯混合模型拟合 D_app 分布。慢扩散状态和快扩散状态的平均 D_app 分别为 0.18 ± 0.24 µm²/s 和 4.79 ± 1.35 µm²/s。（H）37°C 下 MetE-HaloTag 的定位分布（左侧），以及 MetE-HaloTag 与 DnaK-HaloTag 分布之间的归一化差异（右侧）。（I）37°C 下 GlcB-HaloTag 的定位分布（左侧），以及 GlcB-HaloTag 与 DnaK-HaloTag 分布之间的归一化差异（右侧）。定位点绘制于归一化细胞坐标上。所有数据均来自三次生物学重复。± 表示重复实验之间的均值标准误（SEM）。
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图 S2.
45°C 下 DnaK–HaloTag 在（A）快速状态（S_fast）和（B）慢速状态（S_slow）下的定位分布。左：45°C 下的分布；右：45°C 与 37°C 之间的归一化差异（红色表示 45°C 下的占据率更高，蓝色表示 37°C 下的占据率更高）。定位点绘制于归一化细胞
坐标。数据与图2相同。数据来自三次生物学重复。
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图S3.
（A）IbpA-HaloTag（JML_Ec_14）和野生型（MG1655）的菌落形成单位测定。（B）45°C下JFX554标记的IbpA-HaloTag的D_app分布。采用双状态高斯混合模型对分布进行拟合。慢扩散状态的平均D_app：15–17 min：0.19 ± 0.03 µm²/s（来自166个细胞的1419条轨迹）；20–22 min：0.19 ± 0.02（来自183个细胞的2380条轨迹）。快扩散状态的平均D_app固定为37°C下IbpA-HaloTag的平均D_app（7.7 ± 0.08 µm/s²）。（C）37°C下IbpA-HaloTag的定位分布（左侧），以及37°C下IbpA与DnaK-HaloTag定位分布之间的归一化差异（右侧）。（D–F）37°C下扩散状态S_slow、S_trans和S_fast的IbpA定位分布（左侧），以及各状态之间的归一化差异（右侧）。定位分布绘制于归一化细胞坐标上。所有数据均来自三次生物学重复。±表示重复实验之间的均值标准误［SEM］。
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图S4.
（A）45°C下共伴侣蛋白缺失菌株中JFX554标记的DnaK-HaloTag的D_app分布。采用三状态高斯混合模型对分布进行拟合（数据与图5相同）。（B）45°C下野生型DnaK-HaloTag（左）和ΔibpAB菌株（JML_Ec_195，右）沿归一化细胞长度的定位分布。（C）ΔhtpG菌株（JML_Ec_147）中DnaK–HaloTag的定位分布，左：45°C下的分布；右：45°C下ΔhtpG菌株与野生型DnaK-HaloTag之间的归一化差异。定位分布绘制于归一化细胞坐标上。（D）JFX554标记的GlcB-HaloTag和ΔdnaJ菌株中DnaK-HaloTag的D_app分布（5–7
分钟），温度为45°C。数据与图5E和图S1G相同。所有数据均来自三次生物学重复。
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图S5。
（A）携带FumA-GFP（JML_Ec_219）或MetE-GFP（JML_Ec_157）ASKA+过表达质粒的菌株及其野生型背景菌株（MG1655）的菌落形成单位测定。三组培养物均在生长过程中预先用0.1 mM IPTG诱导2小时。（B）蓝色柱：内源表达FumA-GFP（JML_Ec_250，3015个细胞）或MetE-GFP（JML_Ec_249，2870个细胞）的细胞荧光强度。灰色柱：转入MetE-GFP（JML_Ec_157）或FumA-GFP（JML_Ec_219）ASKA+过表达质粒的细胞荧光强度。携带过表达质粒的菌株在成像前用0.1 mM IPTG诱导2小时。（C）含有0、1、2或≥3个FumA-GFP或MetE-GFP荧光焦点的细胞比例。（D）过表达MetE-GFP或FumA-GFP的菌株中DnaK-HaloTag的表观扩散系数（D_app）分布，采用三状态高斯混合模型（GMM）拟合。数据与图6相同。（E）37°C下FumA-GFP过表达菌株（JML_Ec_219）中DnaK-HaloTag的定位分布（左），以及FumA-GFP过表达菌株与野生型之间DnaK-HaloTag分布的相对差异（右）。定位点绘制于归一化的细胞坐标系中。45°C下，各状态DnaK轨迹至最近的（F）MetE-GFP或（G）FumA-GFP荧光焦点的距离分布。所有数据均来自三次生物学重复。误差线和±表示重复实验间的均值标准误（SEM）。
致谢
感谢Mäkelä课题组其他成员的支持、讨论以及对稿件的审慎审阅。感谢Luke Lavis博士惠赠JFX554、DnaK V436F质粒和Omnipose模型，
分别为 Victor Sourjik 博士和 Paul Wiggins 博士。本研究获得欧洲研究理事会（ERC StG TEMPADAPT，101075984）和芬兰研究理事会（349116 和 353572）的资助。A.P. 获得赫尔辛基大学微生物学与生物技术博士项目资助。计算和数据处理工作依托 CSC——科学信息技术中心提供的资源完成，并得到 Susanne Merz 和 Simo Tuomisto 的技术支持（阿尔托科学计算研究软件工程师计划）。资助方未参与研究设计、数据收集与解读，也未参与将本研究提交发表的决策。
已声明的资助方信息
欧洲研究理事会
，101075984
芬兰研究理事会
，353572
，349116
脚注
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主要联系人
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细菌 Hsp70 分子伴侣 DnaK 通过瞬时采样蛋白质组，快速捕获应激诱导的错误折叠
Ada Pajari、Taras Redchuk、Jarno Mäkelä
bioRxiv
2026.07.01.735817;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735817
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细菌 Hsp70 分子伴侣 DnaK 通过短暂探查蛋白质组，快速捕获应激诱导的错误折叠蛋白
Ada
Pajari
,
Taras
Redchuk
,
Jarno
Mäkelä
bioRxiv
2026.07.01.735817;
doi:
https://doi.org/10.64898/2026.07.01.735817
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关键词：DnaK分子伴侣 · 蛋白质稳态 · 热应激 · 蛋白质错误折叠 · 单分子追踪 · 超分辨率成像
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