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糖尿病肾病（DN）是发达国家肾衰竭的首要病因，但其易感性的遗传架构尚未得到充分阐明。本研究在DN小鼠模型中采用系统遗传学方法，发现了与白蛋白尿、肾小球硬化和巨噬细胞浸润等临床相关表型有关的新型数量性状位点（QTL）。为提供生物学背景并确定候选基因的优先级，我们将单细胞转录组学指导的pQTL和eQTL定位与细胞类型特异性共表达网络相结合，鉴定出192个与白蛋白尿相关的候选pGenes。尽管其中许多为新发现的基因，但27%的基因此前已有遗传关联证据，40%在一个人类糖尿病队列中得到验证。其中12个基因属于一个富集了人类全基因组关联研究（GWAS）信号的足细胞网络。在这些基因中，通过在果蝇肾细胞中进行基因敲低，证实了E3泛素连接酶DCAF6和ZNRF2的功能重要性。我们的系统遗传学方法不仅鉴定出了此前已在人类GWAS中得到验证的DN易感基因，还揭示了潜在的新基因和通路，可用于风险分层和治疗方法的开发。
jacquesb{at}duke-nus.edu.sg
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摘要
糖尿病肾病（DN）是发达国家肾衰竭的首要病因，但其易感性的遗传架构尚未得到充分阐明。本研究在 DN 小鼠模型中采用系统遗传学方法，发现了与白蛋白尿、肾小球硬化和巨噬细胞浸润等临床相关表型有关的新型数量性状位点（QTL）。为提供生物学背景并确定候选基因的优先级，我们将单细胞转录组学指导的 pQTL 和 eQTL 定位与细胞类型特异性共表达网络相结合，鉴定出 192 个与白蛋白尿相关的候选 pGenes。尽管其中许多为新发现，但有 27% 此前已有遗传关联证据，40% 在一个人类糖尿病队列中得到验证。12 个基因属于一个富集人类全基因组关联研究（GWAS）信号的足细胞网络。其中，E3 泛素连接酶
DCAF6
和
ZNRF2
的功能重要性通过在果蝇肾细胞中进行基因敲低得到了证实。我们的系统遗传学方法不仅鉴定出此前已在人类 GWAS 中得到验证的 DN 易感基因，还揭示了可能用于风险分层和治疗方法开发的潜在新基因及通路。
引言
糖尿病肾病（DN）是糖尿病的一种并发症，也是全球终末期肾病（ESKD）最常见的病因之一
1
–
4
。仅有 30%–40% 的糖尿病患者会发生 DN
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，
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，而家族聚集现象表明，遗传背景是决定 DN 易感性的主要因素
7
–
9
。这种易感性的确切分子决定因素仍未得到充分界定。尽管已在富集糖尿病并发症患者的人类糖尿病队列中开展了多项大规模 GWAS，但 DN 的遗传架构
其遗传易感性仍未得到充分阐明，已稳健重复验证的位点寥寥无几，对因果基因的机制性认识也十分有限¹⁰˒¹¹。这可能反映了不同人群中糖尿病肾病表型的异质性，也体现了将统计学关联转化为经功能验证的致病机制这一根本性挑战。
白蛋白尿是反映肾小球损伤的敏感且具有重要临床价值的生物标志物，可预测糖尿病患者肾病进展及心血管风险¹²˒¹³。白蛋白尿在糖尿病肾病病程早期即会出现；与综合性肾功能指标相比，它能更直接地反映肾小球滤过屏障受损，并可对进展为终末期肾病（ESKD）风险最高的个体进行分层。因此，在遗传学研究中以白蛋白尿作为主要定位性状，可获得一种贴近疾病本身且具有机制信息价值的定量表型，用于解析糖尿病肾病易感性的遗传结构。
尽管针对普通人群和糖尿病人群尿白蛋白/肌酐比值开展了大规模全基因组关联研究（GWAS），但与白蛋白尿的遗传力相比，稳健鉴定出的位点数量仍然有限，而且大多数关联信号背后的因果机制尚未明确¹⁴˒¹⁵。动物模型可作为一种有力的补充策略，弥补人类遗传学研究的局限¹⁶–¹⁸。利用近交小鼠品系进行杂交，可构建简化且受控的遗传背景，开展纵向表型分析，并直接评估靶器官病理改变。在遗传分离群体中进行数量性状基因座（QTL）定位，可系统地将遗传变异与白蛋白尿、肾脏病理改变及免疫细胞浸润等连续性疾病性状联系起来¹⁹–²³。
整合分子、代谢和细胞谱分析，系统遗传学方法^24为候选基因的优先排序和验证提供了一个框架，而在人类队列中开展此类研究通常颇具挑战性。更为关键的是，系统遗传学研究中发现的候选基因可以在人类大型队列中直接进行关联性检验，从而为将机制性发现转化为临床相关性提供了直接途径。
历史上，糖尿病并发症动物模型（包括糖尿病肾病）的构建一直颇具挑战，难以建立能够完全再现人类疾病特征的模型^18,25。尽管如此，我们此前已构建了一种小鼠模型，该模型具有许多与人类DN相似的典型特征，包括高血糖、显著的白蛋白尿、肾小球硬化、肾脏炎症和高血压。此外，该模型还表现出显著的、依赖品系的DN易感性。在易感的129/SvEv遗传背景下，小鼠会出现明显的DN表现，而C57BL/6品系则具有抵抗性^26–28。在明确的糖尿病和高血压背景下，这种依赖品系的易感性为定位早期DN的分子决定因素提供了一个易于研究的遗传系统，并可独立于血糖混杂因素开展分析。在本研究中，我们利用该模型构建并验证了一个多层次系统遗传学框架。该框架整合了由小鼠单细胞转录组学指导的数量性状基因座（QTL）定位、表达数量性状基因座（eQTL）定位、细胞类型特异性基因共表达网络分析、无脊椎动物功能验证，以及糖尿病人群中的遗传关联分析，从而系统地筛选并表征DN中导致白蛋白尿和肾损伤的候选基因。
结果
F2小鼠进行性白蛋白尿和肾损伤
为系统解析遗传和细胞因素的
为解析糖尿病肾病的决定因素，我们设计了一项多模态 F2 QTL 定位研究，整合了遗传学、单细胞和整体转录组学、表型分析、代谢组学、人群队列验证，以及在果蝇中对候选基因进行功能验证的研究（图 1A）。129-Akita/ReninTg（129AR）小鼠和 C57BL/6NJ-Akita/ReninTg（BL6AR）小鼠按照方法部分所述进行繁育和饲养。正如既往报道所示^28，24 周龄的 129AR 小鼠出现蛋白尿、肾小球硬化、肾小管增厚以及显著的巨噬细胞浸润，这些表现可通过肾皮质中 CD68+ 沉积物加以证实（图 1B）。相比之下，尽管年龄匹配的 BL6AR 小鼠具有相近的血清葡萄糖水平，并且同时携带 Akita 突变和 Renin 转基因，但未表现出上述病理特征（图 1B、C）。我们利用不同品系对糖尿病肾病的易感性差异，构建了一个 F2 杂交群体（n=279），从而系统绘制表型变异图谱并鉴定疾病的遗传决定因素。F2 小鼠饲养至 24 周龄，每 8 周测定一次血糖水平和蛋白尿；采集 DNA 进行全基因组测序（WGS），取肾脏进行总 RNA 分离、组织学分析和免疫组织化学（IHC）检测，并收集尿液开展靶向有机酸代谢组学分析（图 1A）。
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图 1.
F2 小鼠在糖尿病肾病相关性状方面表现出广泛的表型变异。
F2 QTL 定位研究设计示意图，包括从亲本品系和 F2 小鼠中采集的数据类型、人类验证队列以及果蝇功能验证。各框根据分析类型采用不同颜色标示：eQTL、pQTL、细胞分型、关联分析和验证。（B）代表性的过碘酸-希夫（PAS）染色组织学图像和 CD68...
129/SvEv Akita-ReninTg（129AR，疾病易感）和C57BL/6NJ Akita-ReninTg（BL6AR，疾病抵抗）小鼠的免疫组织化学（IHC）图像。（C）129AR和BL6AR小鼠的尿白蛋白排泄量（UAE）和血清葡萄糖水平（每组n=6）。采用Wilcoxon秩和检验评估差异的统计学显著性。（D、E）箱线图显示F2群体在各时间点的白蛋白尿水平（D）和血糖水平（E）。按照方法部分的定义，始终归于高白蛋白尿组和低白蛋白尿组的小鼠分别以红色和蓝色标示。采用Student t检验评估差异的统计学显著性。（F）低白蛋白尿组和高白蛋白尿组F2小鼠的代表性PAS组织学染色和CD68 IHC图像。（G）低白蛋白尿组和高白蛋白尿组中CD68⁺染色面积的定量分析。采用Wilcoxon秩和检验评估差异的统计学显著性。（H、I）箱线图显示按有无肾小球硬化（H）和结节性硬化（I）分层的F2小鼠的标准化UAE水平。采用Student t检验评估差异的统计学显著性。
F2小鼠的白蛋白尿水平分布范围较广（图1D，补充表2），反映出显著的个体间变异，且白蛋白尿水平随时间逐渐升高。血糖水平在第8周至第16周期间升高，此后未见显著增加（图1E）。白蛋白尿水平处于两个极端的小鼠（分别划分为高白蛋白尿组和低白蛋白尿组）在肾脏组织学方面表现出明显差异，包括硬化程度和巨噬细胞浸润程度（图1F、G）。两组间的RNA差异表达分析揭示了不同的通路特征。高白蛋白尿小鼠中经典致病通路上调，包括炎症反应、上皮-间质
转化和TNF-α信号传导（扩展图1A、B、C）。相反，低白蛋白尿组小鼠中与代谢通路、血管转运和脂肪酸代谢相关的基因表达上调，这些过程与糖尿病肾病（DN）中的肾脏保护作用有关²⁹,³⁰。与既往报道³¹一致，多种尿液代谢物水平与白蛋白尿水平相关，包括乳酸、琥珀酸、丙酮酸和柠檬酸水平（补充图1）。结节性硬化和肾小球硬化更严重的小鼠也表现出更高的白蛋白尿水平（图1H、I），尽管其血糖水平相当（补充图2）。这些发现表明，F2群体是一种具有表型异质性且遗传和分子分层清晰的研究资源，可用于在独立于血糖水平的情况下，对白蛋白尿和肾损伤（巨噬细胞浸润及肾小球硬化）进行系统性定位分析。
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补充图1。
F2队列中尿液代谢物与白蛋白尿的相关性。两两Spearman相关性图展示了24周龄时尿液有机酸代谢物（乳酸、丙酮酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、α-酮戊二酸和柠檬酸）与尿白蛋白排泄量（UAE）之间的关系。各面板的x轴和y轴均表示经对数转换的代谢物浓度，并叠加紫色线性回归线。每个面板均标示Spearman相关系数（r）及相应的p值。最下排面板的y轴表示UAE。显著相关性（p < 0.05）表明三羧酸（TCA）循环中间产物之间存在协同变化，且其与白蛋白尿严重程度相关。
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补充图2。
F2群体中不同组织学严重程度组的血糖水平相当
队列。箱线图显示了24周龄F2小鼠按（A）全局性肾小球硬化评分和（B）结节性硬化评分分层的对数标准化血糖水平。评分0表示不存在相应病变，评分1表示存在相应病变。每个点代表一只F2小鼠。采用双侧Student’s t检验进行统计比较，各比较的p值标注于上方。
DKD中的QTL定位与整合性scRNA-seq分析
我们采用线性混合模型，对所有测定性状进行了QTL定位，包括白蛋白尿、肾小球硬化、巨噬细胞浸润和尿液代谢物。白蛋白尿的多变量QTL定位鉴定出28个显著的表型QTL（pQTL）。其中两个位点与既往在损伤易感的SM/J小鼠和非易感的MRL/MpJ小鼠杂交群体中发现的白蛋白尿相关染色体区域重叠³²，证实了我们方法的可靠性。这28个pQTL共涵盖2,325个蛋白质编码基因。鉴于一个位点内并非所有基因都具有致病作用，我们进行了进一步筛选，以优先确定潜在的疾病相关基因。符合以下条件的基因予以保留：（i）具有人类直系同源基因；（ii）亲本品系间存在序列差异；（iii）在小鼠肾脏中表达。通过这一方法，候选基因被缩减至192个白蛋白尿相关表型QTL基因（pGenes，补充表4）。为后续遗传分析提供细胞层面的背景信息，我们还使用从10周龄小鼠中新鲜分离的肾小球细胞和全肾细胞，对亲本AR和WT品系进行了单细胞测序（图1A、2A–C，补充图3、4）。在单细胞水平上，白蛋白尿相关pGenes主要在足细胞中表达，且在DN易感的129品系中大多下调
品系，提示足细胞基因活性降低是导致疾病易感性的主要因素（图2E）。值得注意的是，在192个与白蛋白尿相关的pGenes中，52个基因此前已被发现与人类DN相关性状有关，包括CKD、T1D、T2D、eGFR下降和高血压（补充表15，扩展图2），呈现显著富集（超几何检验p = 7.93 × 10⁻³³）。此外，我们鉴定出4个基因（GNG2、KAZN、OXR1、PTK2），这些基因此前已在芬兰人群中被发现与DN相关³³。采用相同的分析框架，我们鉴定出5个与肾小球硬化相关的pQTL（涉及25个pGenes）（图2H）。肾小球硬化相关pGenes呈现出与白蛋白尿相关信号相似的模式，包括主要在足细胞中表达，且在129AR品系中表达下调（图2I）。此外，我们还在4号染色体上鉴定出一个与肾小球硬化相关的pQTL，该位点与AGTRAP-PLOD1基因座重叠，而该基因座此前已被发现与高血压和肾损伤有关³⁴˒³⁵。
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补充图3。
展示单细胞数据集质量控制（QC）指标的小提琴图。左图显示各小鼠品系中捕获到的不同基因数量，以“nFeature_RNA”表示。右图显示各品系中捕获到的唯一分子标识符（UMI）数量，以“nCount_RNA”表示。两幅图均显示，各品系的捕获率相近。
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补充图4。
描述本数据集中所捕获细胞的单细胞图。（A）和（B）为UMAP图，分别按细胞提取样本（A）或小鼠品系（B）对细胞着色。（C）为点图，展示无监督聚类和降维后用于细胞簇注释的各类标志基因的表达情况。
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补充图5。
F2队列的全基因组测序指标。直方图展示了F2队列中（A）平均测序深度（中位数为10.9×）、（B）每个样本的单核苷酸多态性（SNP）数量（中位数为414万）以及（C）每个样本的插入和缺失（indel）数量（中位数为106万）的分布。（D）使用D′连锁不平衡指标构建的单倍型区块在染色体上的可视化展示，区块按大小类别进行颜色编码。（E）条形图展示了不同大小区间内单倍型区块数量的分布，涵盖从小于1 kb的短区块到超过1 Mb的大区块。
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图2。
糖尿病肾病性状的单细胞谱分析与基因组关联。
（A）统一流形近似与投影（UMAP）图展示了所有品系中捕获的肾脏细胞类型。（B、C）条形图展示了各品系的细胞比例（B）和细胞总数（C）。（D、F、H）曼哈顿图展示了白蛋白尿（D）、巨噬细胞浸润（F）和肾小球硬化（H）的数量性状位点（QTL）定位结果。水平线表示经多重检验校正后的显著性阈值。（E、G、I）条形图展示了各肾脏细胞类型中具有品系特异性差异表达的pGenes数量，分别对应白蛋白尿pGenes（E）、巨噬细胞浸润pGenes（G）和肾小球硬化pGenes（I）。纵轴表示细胞类型，条形颜色表示相对于129品系的表达方向（红色表示在129品系中表达较低；蓝色表示在129品系中表达较高）。
我们分别鉴定出与巨噬细胞浸润和肾小球硬化相关的19个pQTL（36个pGenes）和5个pQTL（25个pGenes）（
图2F–H
；补充表5、6、7、8）。相比之下，白蛋白尿相关的pGenes则为
主要在足细胞中表达，巨噬细胞浸润相关的pGenes在近端肾小管细胞中的表达最高，且在129AR品系中大多下调（图2G），提示肾小管损伤是该模型中免疫细胞募集的驱动因素。此外，针对尿液中的琥珀酸和苹果酸水平，分别鉴定出4个pQTL（12个pGenes）和13个pQTL（27个pGenes）（补充表9、10、11、12；扩展图3A–D）。
与此同时，我们在F2队列中进行了eQTL定位，以进一步筛选pQTL区间内的候选基因（扩展表1；补充表13和14）。我们鉴定出5,494个受顺式调控的基因和50个受反式调控的基因，其中包括一个位于15:19836442的反式调控热点，该热点所在的14.8 Mb区间涵盖137个基因，可能调控42个基因。在192个与白蛋白尿相关的pGenes中，82个受顺式调控（42%），26个在足细胞中表达下调，进一步支持将这些基因优先列为糖尿病肾病（DN）中白蛋白尿的潜在因果驱动基因。值得注意的是，巨噬细胞浸润与白蛋白尿共有一个位于4号染色体上的pQTL（4:144879108），提示这两种性状可能具有共同的遗传调控机制。
综上所述，通过整合scRNA-seq、pQTL和eQTL定位分析，我们鉴定出了DN中与白蛋白尿相关的新型足细胞基因。接下来，我们聚焦于这192个白蛋白尿相关pGenes，并借助系统遗传学方法，从机制层面探究其与人类DN的相关性。
糖尿病肾病中与疾病相关的细胞特异性网络
为评估其与人类肾脏疾病的相关性，我们首先在All of Us研究计划的糖尿病参与者中，考察了所有白蛋白尿相关基因的DNA序列变异与尿白蛋白/肌酐比值（UACR）的关联（All of Us
Research Program Investigators，2019），这是一个独立的大规模人群队列。在校正年龄、性别、族裔和空腹血糖后，179个人类同源白蛋白尿pGenes中，有72个（40.2%）达到经验性FDR显著性水平，55个（30.7%）达到名义显著性水平（图3），证实源自小鼠的白蛋白尿候选基因在人类UACR相关变异中富集。与未达到显著性水平的pGenes相比，达到FDR或名义显著性水平的基因每个基因携带的高置信度（HC）功能缺失（LoF）变异更多，且LoF变异所占比例更高（扩展图4），进一步支持这些基因座与肾脏白蛋白排泄的功能相关性。总体而言，这些结果确立了该pGene集合对人类研究的转化相关性。
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图3.
白蛋白尿pGenes在糖尿病个体的UACR相关变异中富集。
条形图显示了在All of Us研究计划的3,553名糖尿病参与者中进行检验的每个白蛋白尿pGene所对应的不利（红色）和保护性（绿色）UACR相关变异数量。基因按显著性层级排序并分组：经验性FDR < 0.05（72个基因）、经验性p < 0.05（55个基因）和无显著性（52个基因），各组之间以垂直虚线分隔。基因名称下方的彩色编码条带表示其所在染色体。
为进一步对兼具人类遗传学支持和机制背景的候选基因进行注释，我们将UACR关联结果与细胞类型特异性共表达网络分析相整合，结合两种互补的注释策略，筛选出一组便于开展功能研究的候选基因（图4A）。为此，我们利用亲本品系的单细胞数据构建了95个细胞类型特异性基因共表达网络，并对其进行了注释，以
疾病相关性（补充表16）。对于每个网络，我们考察了以下方面：（i）网络特征基因是否与任一时间点的白蛋白尿相关；（ii）网络中的基因是否包含通过pQTL定位和优先级排序确定的白蛋白尿pGenes；以及（iii）网络基因中的SNP是否在人类按白蛋白尿分层的糖尿病肾病（DN）全基因组关联研究（GWAS）中富集³⁶。该方法在不同肾脏细胞类型中鉴定出多个模块（补充表16）。鉴于白蛋白尿pGenes主要在足细胞中表达（图2E），我们重点分析了在足细胞中表达的网络（图4）。
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图4.
细胞类型特异性网络分析将疾病相关足细胞网络（DAPNet）鉴定为糖尿病肾病中具有疾病相关性的基因模块。
（A）用于对白蛋白尿候选基因进行优先级排序的两种互补注释策略的示意概览：All of Us糖尿病队列中的人类遗传变异关联分析，以及细胞类型特异性基因共表达网络分析。两种方法共同指向具有转化研究价值和机制背景的候选基因。（B）左：热图展示F2队列中足细胞网络特征基因与第8、16和24周白蛋白尿之间的Spearman相关性。星号表示经Benjamini–Hochberg校正后的显著性（* p < 0.05， p < 0.01，* p < 0.001）。PodoNet2（DAPNet）是唯一在人类DN GWAS中呈富集的网络，以虚线边框标示。右：DAPNet（331个基因）的可视化图，节点按基因表达与白蛋白尿的关联方向着色。堆叠条形图分别展示DAPNet中随白蛋白尿加重而上调或下调的基因比例（上），以及网络中cis-eQTL、trans-eQTL和非eQTL基因的比例（下）。（C）
散点图显示了第8、16和24周时DAPNet特征基因与经缩放处理的尿白蛋白排泄量（UAE）之间的相关性。图中标示了Spearman相关系数和p值。（D）条形图显示了各足细胞网络中白蛋白尿pGenes所占的百分比，并标注了pGenes数量与网络基因总数之比。DAPNet的富集程度最高。星号表示显著性（* p < 0.05， p < 0.01，* p < 0.001）。
在鉴定出的12个足细胞网络中，我们发现10个与白蛋白尿显著相关，其中7个在全部3个时间点均与白蛋白尿相关（图4B）。其中一个网络尤为突出，其331个基因中有201个（60.7%）在白蛋白尿状态下表达下调（图4C）。在这12个网络中，该网络与白蛋白尿的负相关性最强，并包含12个白蛋白尿pGenes（图4C和D）。这些特征表明，该网络与白蛋白尿pQTL分析中观察到的信号相吻合，即大多数pGenes在129小鼠中表达下调（图2E）。我们将该网络命名为疾病相关足细胞网络（Disease-Associated Podocyte Network，DAPNet；扩展图5A），并发现DAPNet富集于囊泡运输、蛋白质运输以及胆固醇稳态和鞘脂代谢等代谢通路（扩展图5B）。值得注意的是，在人类全基因组关联研究（GWAS）中，DAPNet是唯一同时在微量白蛋白尿（校正后p = 0.00149）和晚期糖尿病肾病（DN；校正后p = 0.02061）相关基因中显著富集的足细胞网络。驱动这一富集的主要基因包括与晚期DN相关的Col4a3、Col4a4和Snx6，以及与微量白蛋白尿相关的Plekho1、Tnfsf12和Paqr7，其中若干基因在多个时间点均与白蛋白尿呈一致的负相关（扩展图5C）。
因此，
我们利用DAPNet优先筛选出数量适宜的候选基因，以进行功能性概念验证测试。我们的白蛋白尿相关pGenes中有12个属于DAPNet：Ankrd46、Dcaf6、Dcaf8、Ebag9、Ecd、Emc2、Igsf8、Ptprd、Rrm2b、Slc31a2、Tfb2m和Znrf2。其推定功能见补充表4。其中，Ptprd此前已在汉族和墨西哥人群队列中被鉴定为2型糖尿病（T2D）的全基因组关联研究（GWAS）关联位点³⁷˒³⁸，也被鉴定为高血压的GWAS关联位点³⁹˒⁴⁰；其余基因此前尚未被发现与糖尿病或糖尿病肾病（DN）相关。作为对照，我们还选择了Mllt3，该基因是在足细胞中表达的pGene，与白蛋白尿和巨噬细胞浸润相关，但未被纳入DAPNet；此前研究已发现其与估算肾小球滤过率（eGFR）下降⁴¹及高血压⁴²相关。
DN易感基因的功能验证
白蛋白尿是肾脏滤过能力受损的一种可测量后果，参与这一性状的基因预计会调控对足细胞功能至关重要的过程，包括内吞作用、囊泡运输和细胞骨架动态变化。为直接评估12个DAPNet候选基因的功能作用，我们在果蝇肾细胞中进行了靶向敲低；这些细胞在解剖结构和功能上均与哺乳动物足细胞类似⁴³–⁴⁵。DAPNet基因中仅有6个，即Slc31a2、Ptprd、Emc2、Znrf2、Dcaf6和Dcaf8（以及Mllt3），在果蝇中具有直系同源基因，同时也被鉴定为表达数量性状位点（eQTL），因此被选用于功能验证并接受该测定。我们采用了基于MHC-ANF-RFP报告系统的果蝇滤过测定。在该系统中，肌肉分泌的红色荧光蛋白（RFP）经肾细胞裂隙隔膜滤过后，通过内吞作用被心包肾细胞摄取，并以细胞内囊泡的形式积累，从而为滤过能力提供定量、可视化的读出。
使用Hand-GFP标记肾细胞，并利用DotGal4驱动系统实现细胞特异性敲低和可视化（图5A、C）。为验证该检测方法的灵敏度和动态范围，我们选用了Wingless（Wg），即果蝇中Wnt1的直系同源蛋白；其所属信号通路已被充分证实参与调控肾脏发育和疾病中的细胞结构⁴⁶–⁵¹。敲低Wg导致肾细胞数量明显减少，RFP摄取几乎完全丧失，证实了该检测方法对滤过功能受损的检测具有灵敏性。我们使用Hox基因Sex combs reduced（Scr⁵²）作为阴性对照，目前尚无证据表明该基因影响肾细胞功能。对于每个基因，均以Scr对照的RFP水平进行归一化，以便对不同条件进行定量比较（图5B）。
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图5.
敲低DAPNet基因破坏肾细胞的滤过功能和肌动蛋白组织结构。
（A）肾细胞检测系统的代表性示意图。（B）箱线图展示各候选基因敲低条件下肾细胞的RFP摄取量，数据经阴性对照基因（Scr）归一化。采用Wilcoxon秩和检验评估统计学显著性。（C）各敲低条件下单个肾细胞的代表性共聚焦图像，以63倍放大倍率采集。上排显示MHC-ANF-RFP的摄取情况；下排显示使用FourColors报告系统可视化的丝状肌动蛋白分布。比例尺如图所示。
为评估基因功能，将DotGal4; Hand-GFP, MHC-ANF-RFP果蝇与靶向各候选基因的UAS-RNAi品系杂交，并利用共聚焦成像分析所得F1代子代的肾细胞表型。基因敲低导致了不同的滤过表型（图5C）。敲低Mllt3、Znrf2、Dcaf6/8和Emc2产生了显著的
滤过减少，而敲低 Ptprd 和 Slc31a2 并未降低总体滤过水平。然而，在敲低 Ptprd 和 Slc31a2 的两种条件下，内吞囊泡的数量和大小均有所减少，表明囊泡动态发生改变。相比之下，敲低 Znrf2 导致清晰可辨的囊泡消失，并出现细胞质渗漏，提示细胞完整性受到严重破坏。最显著的缺陷见于敲低 Dcaf6/8 和 Mllt3 的肾细胞，其 RFP 摄取几乎完全丧失。
肾细胞的内吞作用由肌动蛋白丝驱动，肌动蛋白丝构成裂隙隔膜的结构基础，并调控囊泡运输⁵³–⁵⁵。为评估候选基因扰动是否影响细胞骨架组织，我们检测了围心肾细胞中丝状肌动蛋白的分布。在对照细胞中，肌动蛋白在腔隙通道周围形成致密且有序的网络，与正常的滤过结构相一致。相比之下，基因敲低导致了不同的细胞骨架缺陷。敲低 Wg 导致肌动蛋白网络碎片化及外周腔隙扩大。敲低 Dcaf6/8 导致肌动蛋白呈极化且不对称的分布。最严重的表型见于敲低 Mllt3 和 Znrf2 的肾细胞，其肌动蛋白丝变细，主要分布于细胞外周，并伴有大型空泡样结构形成。既往研究报道，Rab7 沉默后也会出现类似的内吞囊泡增大现象⁵⁶，提示内体运输通路受到干扰。
值得注意的是，敲低后导致最严重肾细胞表型的基因，也是在人类队列中与 UACR 关联最强的基因之一。Mllt3、Dcaf6 和 Znrf2 引起了显著的滤过及细胞骨架
缺陷，在 All of Us 队列的糖尿病参与者中均包含多个显著相关的变异（扩展图 6A、B、C），为其在足细胞功能障碍中的作用提供了跨物种支持。
讨论
糖尿病肾损伤的遗传易感性十分复杂，受到多个基因和细胞类型中变异的共同影响。尽管人类遗传学研究已开展数十年，但调控白蛋白尿易感性的因果基因仍未得到明确界定，而白蛋白尿是糖尿病肾病（DN）中肾功能进行性丧失风险的重要决定因素⁵⁷。早期针对白蛋白尿的全基因组关联研究（GWAS）在欧洲血统普通人群的荟萃分析中，仅鉴定出 CUBN 这一个得到稳健重复验证、达到全基因组显著性水平的位点¹⁵,⁵⁸。后续研究鉴定出了更多位点，涉及参与肾小管转运、肾小球滤过屏障完整性维持及 TGF-β 信号传导的基因，包括 SHROOM3、MUC1、COL4A3/A4、TGFB1 和 NR3C2 等¹⁵,⁵⁹。尽管取得了这些进展，白蛋白尿的遗传力仍未得到充分解释，将相关位点转化为生物学机制的工作也尚不完善。在此，我们提出并验证了一个多层次系统遗传学框架，整合小鼠数量性状位点（QTL）定位、单细胞转录组学、基因共表达网络分析、功能验证和人类遗传关联分析，以系统性地对 DN 中白蛋白尿的潜在候选基因进行优先级排序。在所有分析层面，均出现了指向足细胞功能障碍的一致信号。具体而言，我们的研究结果提示，足细胞囊泡运输和肌动蛋白细胞骨架组织的紊乱可能促成疾病易感性。我们鉴定出 26 个与白蛋白尿相关的新型 pQTL 和 192 个候选基因（pGenes），由此构建了一套优先级排序流程
用于对糖尿病肾病（DN）的新候选因子进行功能测试。尽管本研究以白蛋白尿为主要性状，但我们还提供了与巨噬细胞浸润和肾小球硬化相关的pGenes/eGenes目录，以及覆盖全部肾脏细胞类型的95个细胞类型特异性共表达网络。
在鉴定出的28个白蛋白尿相关位点中，有两个此前已在独立的小鼠杂交群体中被证实与白蛋白尿相关，为我们的数量性状位点（QTL）分析方法提供了跨群体验证。此外，pGenes在人类慢性肾脏病（CKD）和DN全基因组关联研究（GWAS）信号中的富集，包括鉴定出4个此前在芬兰人群中被发现与DN相关的基因³³，支持了我们的方法对人类疾病研究的相关性。巨噬细胞浸润与白蛋白尿在4号染色体上共有的pQTL提示，两者存在共同的遗传调控机制，这可能反映了炎症对DN发病机制的作用，而这一作用已有充分文献支持⁶⁰。有趣的是，尿液琥珀酸水平的4个显著pQTL中，有一个定位于13号染色体上包含Sdha的位点（13:74325867）。Sdha编码琥珀酸脱氢酶亚基A，该线粒体酶催化三羧酸（TCA）循环中琥珀酸向延胡索酸的转化。琥珀酸pQTL与编码调控琥珀酸代谢的主要酶的基因共定位，进一步增强了我们对通过QTL定位获得的基因–表型关联的信心。总体而言，这些观察结果验证了我们的系统遗传学方法在DN相关基因和通路鉴定中的生物学意义。
白蛋白尿相关pGenes主要在足细胞中表达，且在疾病易感的129品系中广泛下调，这是显著且一致的发现。足细胞丢失和功能障碍是糖尿病相关疾病中已得到充分证实的早期特征
肾病
61
–
63
，而且我们观察到的广泛转录失调凸显了这些足细胞遗传通路对 DN 相关白蛋白尿的作用。此外，作为 DN 发病机制的促成因素，这些通路也是潜在的治疗靶点。这与人类研究中的新兴证据一致：足细胞特异性转录程序在糖尿病肾病早期即受到扰乱
64
。
结合表型信息的网络分析已成功识别出疾病相关模块，为支持病理过程的细胞通路及其潜在效应基因提供了依据
65
–
69
。本研究利用网络分析构建了 DN 中细胞类型特异性的疾病相关模块。尽管我们发现多个足细胞共表达模块与白蛋白尿广泛相关，但只有 DAPNet 在微量白蛋白尿和晚期疾病两个阶段均满足最严格的标准，即富集人类 DN 全基因组关联研究（GWAS）信号。这种人类 GWAS 信号富集使 DAPNet 成为最有可能反映生物学上保守且具有临床相关性的疾病过程的模块。因此，我们利用 DAPNet 优先筛选基因进行功能测试。
果蝇肾细胞与人类足细胞在遗传和结构上具有显著相似性，因此已成为公认的肾小球疾病功能遗传学测试系统
43
–
45
。在 12 个 DAPNet 白蛋白尿相关 pGene 中，有 6 个具有果蝇直系同源基因（Slc31a2、Ptprd、Emc2、Znrf2、Dcaf6 和 Dcaf8）；我们选择这些基因进行功能验证，同时还纳入 Mllt3。Mllt3 是一种在足细胞中表达的 pGene，与白蛋白尿和巨噬细胞浸润均相关，既往研究已发现其与 eGFR 下降和高血压有关，但它并非 DAPNet 成员。除 Ptprd 外，其……
此前与T2D和高血压存在关联，而其余候选基因尚未有与白蛋白尿或肾脏疾病相关的报道。足细胞依赖受调控的内吞作用和膜运输来维持裂孔隔膜及足突的结构完整性；在多种模型中，囊泡运输通路受损已被直接证明与蛋白尿性肾病相关
70
,
71
。DAPNet富集于囊泡运输、蛋白质转运以及胆固醇和鞘脂代谢，这与上述生物学机制具有良好的一致性，因为足细胞裂孔隔膜组装于富含胆固醇和鞘脂的脂筏微结构域中，而足细胞脂质代谢失调可导致实验性及人类糖尿病肾病（DN）中的细胞骨架重塑、内质网应激和细胞凋亡
61
。
对每个DAPNet基因进行敲低均导致肾细胞结构或功能异常，证实了这些基因在足细胞生物学中的重要性，也证明了网络和通路分析对于候选基因优先排序的实用价值。表型严重程度的差异反映了各基因不同的功能作用：Mllt3、Dcaf6/8和Emc2敲低产生了最严重的滤过缺陷，RFP摄取几乎完全丧失，提示这些基因在维持肾细胞内吞能力方面发挥着不可替代的作用；Znrf2敲低产生了性质不同的表型，其特征是胞质泄漏和囊泡结构溶解，这与其在维持膜或内体完整性而非囊泡形成中的作用相一致；而Ptprd和Slc31a2敲低并未显著降低总体滤过水平，尽管两者的囊泡动态均发生了改变，这提示这些基因影响的是效率，而非囊泡形成或维持。
内吞能力。上述发现确立了囊泡运输和肌动蛋白细胞骨架调控在候选基因集合中的机制核心地位，也验证了 DAPNet 所识别的通路富集结果。
All of Us 研究计划中的人类遗传学分析为我们的系统遗传学方法提供了具有临床相关性的验证。在 3,553 名糖尿病患者中，40% 的符合条件的 pGenes 与 UACR 的关联达到经 FDR 校正后的显著性。MLLT3 和 DCAF6 同时在果蝇功能验证与人类 FDR 显著性分析中得到支持，是这两种基因可能作为白蛋白尿易感性因果驱动因素的最有力跨物种证据。MLLT3 此前与 eGFR 下降和高血压相关[41,42]；本研究发现，该基因在足细胞中表达，其缺失会损害肾细胞的滤过功能，且其变异与糖尿病患者的 UACR 相关。这为其既往关联与肾小球功能之间建立了机制联系。
在 DAPNet 基因中，DCAF6 和 ZNRF2 均为 E3 泛素连接酶。此类蛋白能够调控并引导底物蛋白降解或发生功能修饰[72,73]。尽管我们首次揭示了 DCAF6 和 ZNRF2 在足细胞中的关键作用，但已有研究表明，泛素连接酶参与足细胞生物学过程，可调控细胞骨架动态、裂孔隔膜完整性和内体运输[74–79]。ZNRF2 与肾损伤[77]及 mTOR 通路激活[78]相关。mTOR 信号通路的激活会显著影响足细胞稳态及糖尿病肾病（DN）的进展[80]。在果蝇肾细胞中敲低 Znrf2 和 Dcaf6/8 后观察到的严重滤过及细胞骨架表型表明，泛素介导的蛋白质调控在……中发挥着不可冗余的作用。
维持足细胞稳态，并为解释其在易发生蛋白尿的足细胞中的下调为何可能导致肾小球功能障碍提供了机制性假说。
本研究存在若干局限性。果蝇肾细胞实验虽然是检验细胞自主性基因功能的有力工具，但无法完全再现这些基因在哺乳动物肾脏中发挥作用时所处的全身性糖尿病和高血压背景。因此，通过全身性或旁分泌机制发挥作用的基因可能会被遗漏。All of Us 人类遗传学分析仅限于具有尿白蛋白/肌酐比值（UACR）数据的糖尿病个体；尽管该队列具有多样性，但其中并未特别富集糖尿病肾病（DN）病例。来自不同族群的大型专门性 DN 队列将有助于提高检测罕见变异关联的统计效能，并按疾病分期进行分层。此外，在缺乏对单个变异进行功能注释的情况下，无法确定人类变异效应相对于果蝇功能缺失表型的方向性，从而限制了在人类变异层面进行因果推断的能力。
除鉴定特定候选基因外，本研究对于理解和管理慢性肾脏病（CKD）及糖尿病肾病具有更广泛的意义。我们的研究结果凸显了具有治疗干预潜力的相关通路，尤其是考虑到在其他疾病中，E3 泛素连接酶及其相关降解机制已被证实具有良好的药理学可调控性。与巨噬细胞浸润和肾小球硬化相关的 pGenes 及细胞类型特异性共表达网络目录，拓展了这一资源在蛋白尿研究之外的应用价值，并为未来研究糖尿病肾病的炎症和纤维化组分奠定了基础。更广泛而言，我们的研究表明，...
跨物种系统遗传学研究揭示了糖尿病肾病中的新型功能通路和遗传通路。我们鉴定出了与白蛋白尿、肾小球硬化和巨噬细胞浸润相关的新型蛋白质数量性状位点（pQTL），通过对小鼠和人类数据集进行联合分析，对新发现的候选基因开展了功能验证，并建立了一个可推广的框架，用于将遗传关联信号转化为机制性认识，从而解决长期以来限制人类肾脏疾病遗传学临床转化的瓶颈问题。
方法
动物研究与时间点样本采集
F₂小鼠通过杂交两个亲本品系获得，亲本品系的获取方法此前已有报道²⁶˒²⁸。所有动物实验均经新加坡国立大学动物护理与使用委员会审查并批准。小鼠饲养于杜克—新加坡国立大学（Duke-NUS）动物房，在受控条件下保持温度稳定的环境，并采用12小时光照/黑暗循环，可自由饮水。小鼠饲喂标准饲料（Specialty Feeds SF100-100，经辐照处理的大鼠和小鼠颗粒饲料）。F₂小鼠饲养至24周龄，并分别于8、16和24周龄置于代谢笼中，收集24小时尿液。采用酶联免疫吸附测定法（Albuwell M，Exocell）检测白蛋白尿。使用25号针头穿刺左侧隐静脉采集血样，每只小鼠约收集2–3 µl血液²⁷。采用血糖仪（Ascensia Bayer Elite）测定小鼠血糖水平。小鼠于24周龄时处死，取出肾脏进行进一步分析。一侧肾脏立即置于液氮中冷冻，另一侧肾脏则固定于10%中性缓冲福尔马林（NBF）中。固定后的肾脏随后色情网
包埋于石蜡中，并切成厚度为 5 µm 的切片用于组织学检查。
亲本品系的单细胞 RNA 测序
对 10 周龄、年龄匹配的野生型小鼠（BL6WT 和 129WT）及 Akita-ReninTg 小鼠（BL6AR 和 129AR）的全肾和肾小球细胞分离物进行了单细胞 RNA 测序。所有小鼠均经腹腔注射氯胺酮麻醉，随后灌注预冷 HBSS 以冲洗肾脏中的血液，再灌注预冷 Dynabeads。取出肾脏，去除肾包膜，并剪切成 1 mm³ 的组织块。
肾小球细胞分离
将剪碎的组织置于预热的酶液 1（1 mg/ml I 型胶原酶、1X Pronase 和 0.33 µl/ml DNase，溶于 HBSS）中，在 37°C 振荡水浴中消化 10 min。所得悬液经 100 µm 细胞滤网过滤两次，以预冷 HBSS 洗涤后，在 4°C 下以 300 × g 离心 4 min。将沉淀重悬于 1.5 ml HBSS 中，置于磁力架上 5 min，并用预冷 HBSS 洗涤磁珠结合的肾小球复合物四次。为解离肾小球细胞，将复合物置于预热的酶液 2（2% 胰蛋白酶、2 U/ml Dispase、2 U/ml D 型胶原酶和 0.33 µl/ml DNase，溶于 HBSS）中，于 37°C 消化 40 min；每 10 min 吹打一次，并在第 30 min 时通过 27G 针头。加入冰冷的 10% FBS/PBS 终止消化，随后在 4°C 下以 300 × g 离心 4 min。为将磁珠与肾小球细胞分离，将沉淀重悬于冰冷的 3% FBS/PBS 中，置于磁力架上 3 min 后收集上清液。重复此步骤两次，并合并所有洗液。最终悬液在 4°C 下以 300 × g 离心 4 min，再重悬于冰冷的 3% FBS/PBS 中。每只小鼠取 15,000 个肾小球细胞，……
按照 Chromium 单细胞 3′ 文库及凝胶微珠试剂盒 v.3 的操作规程进行处理。
全肾细胞分离
将剪碎的组织置于含有 1 mg/ml I 型胶原酶和 0.33 µl/ml DNase 的 HBSS 缓冲液中，在 37°C 振荡水浴中消化 20 min。消化后的组织经 100 µm 细胞滤网过滤，用预冷的 HBSS 洗涤，并于 4°C、300 × g 离心 4 min。将沉淀重悬于 2 ml 预冷的 HBSS 中，与 20 ml 1× 红细胞裂解液混合，于 4°C、300 × g 离心 10 min。将沉淀重悬于 HBSS 中，置于磁力架上 5 min，以分离被磁力保留的肾小球组分与收集于上清液中的肾小管组分。将肾小管组分置于 2 ml 消化缓冲液中，于 37°C 消化 15 min；同时，将肾小球组分置于 1 ml 消化缓冲液中消化 25 min，随后通过磁分离去除游离磁珠。合并两种组分，于 4°C、300 × g 离心 5 min，并使用 Miltenyi Biotec 的碎片去除液去除细胞碎片。将最终沉淀重悬于 HBSS 中，经 30 µm 细胞滤网过滤，于 4°C、300 × g 离心 5 min，再重悬于含 0.5% BSA 的 PBS 中。每只小鼠取 20,000 个全肾细胞，按照 Chromium 单细胞 3′ 文库及凝胶微珠试剂盒 v.3 的操作规程进行处理。
预处理与质量控制
共进行了三个批次的单细胞 RNA 测序：两个批次用于全肾分离细胞，一个批次用于肾小球分离细胞。将两个全肾细胞批次整合后进行联合分析。首先分别对全肾和肾小球数据集进行分析与注释，随后将其合并，用于差异表达分析及后续下游分析。原始测序数据经过处理
使用10x Genomics Cell Ranger流程（v3.1.0）进行处理，并比对至mm10参考转录组。将所得计数矩阵导入R，并使用Seurat包（v4.0.3）进行处理。使用Python工具Scrublet的R实现版本scrubletR，在默认设置下对每个样本分别进行双细胞去除，并将双细胞注释保留在样本元数据中，以供下游筛选。
全肾样本的初步分析
对全肾样本进行筛选，保留检测到200–4,000个基因、线粒体读段比例低于50%、核糖体读段比例低于20%且血红蛋白读段比例低于3%的细胞。将每个批次内的样本合并为一个对象，仅保留两个批次共有且在所有样本中均有表达的基因。使用Seurat中的CellCycleScoring函数对每个合并对象进行细胞周期评分，随后在SCTransform标准化过程中回归去除这些评分所代表的效应，以校正细胞周期效应。接着，按照Seurat的标准CCA工作流程[282]，使用SCT测定数据和3,000个整合特征对两个批次对象进行整合。对整合后的对象进行主成分分析（PCA），并使用前50个主成分进行聚类和UMAP可视化。聚类分辨率设为1，并使用Seurat中的RunUMAP函数生成UMAP。根据已知标志基因对细胞类型进行人工注释。
肾小球样本的初步分析
对肾小球样本进行筛选，保留检测到200–4,000个基因、线粒体读段比例低于10%、核糖体读段比例低于20%且血红蛋白读段比例低于3%的细胞。将样本合并为一个对象，并使用Seurat中的CellCycleScoring函数对细胞周期基因表达进行评分，同时
随后在 SCTransform 标准化过程中回归去除这些评分的影响。对合并后的对象进行主成分分析（PCA），并使用前 50 个主成分进行聚类和 UMAP 可视化。聚类分辨率设为 1，并使用 Seurat 中的 RunUMAP 函数生成 UMAP。根据文献中已确立的标志基因对细胞类型进行人工注释。
联合分析
在联合分析中，将全肾和肾小球数据集作为独立对象读入 R，并通过过滤去除先前识别的双细胞。按批次合并样本，得到三个对象，其中两个为全肾对象，一个为肾小球对象，并按照上述质量阈值进行过滤。使用 Seurat 中的 CellCycleScoring 函数对每个对象的细胞周期基因表达进行评分，并在 SCTransform 标准化过程中回归去除这些评分的影响。随后，在 SCT assay 上使用 Seurat 的互惠主成分分析（RPCA）方法整合这三个对象。根据初步单独提取样本分析所得的注释，赋予细胞类型标签。
尿液有机酸代谢组学
对尿液样本进行处理，以通过气相色谱-质谱联用法（GC-MS）对有机酸进行靶向定量。简而言之，将 300 µL 组织匀浆或细胞悬液与 10 µL 内标及 10 µL 盐酸 O-乙基羟胺（Sigma Aldrich，美国）混合，以在提取前保护 α-酮基。使用 500 µL 乙酸乙酯提取有机酸，随后用 N,O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺进行衍生化，形成三甲基硅基衍生物。使用配备 VF-1ms 毛细管色谱柱（15 m × 的 Agilent Technologies HP 7890A 仪器进行气相色谱分离。
250 µm × 1 µm），在23.3 psi压力下，以2.5 ml/min的恒定流速运行。气相色谱（GC）升温程序如下：初始温度为70°C，保持2分钟；以40°C/min的速率升温至300°C；最后在300°C保持2.25分钟。采用稳定同位素稀释法，在Agilent 5975C质谱仪上通过选择离子监测进行定量。代谢物浓度以尿肌酐水平进行归一化，以校正样本间尿液浓度的差异。
组织学与免疫组织化学
过碘酸-希夫染色
采用F₂小鼠的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）肾组织切片进行过碘酸-希夫（PAS）染色，以评估肾损伤。PAS染色可检测糖原、糖蛋白和黏膜多糖，从而显示糖尿病肾病特征性的肾小球瘢痕形成和肾小管萎缩。按照制造商说明书进行染色（Abcam，PAS染色试剂盒，ab150680）。简而言之，将切片置于二甲苯中脱蜡，经梯度乙醇复水，用过碘酸溶液处理10分钟，以蒸馏水冲洗后，在希夫试剂中孵育30分钟。用热自来水流水冲洗后，以苏木精复染，脱水，并用D.P.X封片液封片。
CD68⁺免疫组织化学
同样采用F₂小鼠的FFPE肾组织切片，通过CD68染色定量评估巨噬细胞浸润。切片经脱蜡、复水后，在pH 9的Tris-EDTA缓冲液中，于50 kPa压力下处理45分钟进行抗原修复。经PBS洗涤后，将切片与BLOXALL溶液（Vector Laboratories，SP-600）孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，随后再次用PBS洗涤。使用2.5%马血清封闭非特异性结合
20分钟，随后与CD68抗体（1:100，Cell Signaling，97778）孵育。经PBS洗涤后，切片与IMMPress HRP马抗兔IgG聚合物（Vector Laboratories，MP-7401）孵育30分钟。切片与Pierce DAB底物（ThermoFisher，34002）孵育20分钟，或直至观察到信号。最后，切片经苏木精复染、脱水后，使用D.P.X封片液封片。
组织学检查
由不知晓分组信息的病理学家采用参照人类糖尿病肾病（DN）诊断标准³¹改编的半定量评分系统，对肾脏组织病理学进行评估。对系膜扩张、结节性硬化和全球性肾小球硬化进行评分，并将各项病变评分相加，得到总评分（补充表1）。根据扩张区域内系膜细胞的数量对系膜扩张进行分级：<4个＝0分，4–5个＝1分，6–7个＝2分，8–10个＝3分，≥11个＝4分。结节性硬化及非萎缩肾小管的基底膜增厚分别按无（0分）或有（1分）评分。全球性肾小球硬化按无（0分）、≤50%（1分）或>50%（2分）分级。间质纤维化和肾小管萎缩根据皮质受累比例评分：无（0分）、<25%（1分）、25–50%（2分）、>50%（3分）。小动脉玻璃样变按无（0分）、累及1条小动脉（1分）或累及>1条小动脉（2分）评分。
极端表型的鉴定
F₂代小鼠构成了一组具有多样性的样本。为对样本进行分层，我们根据白蛋白尿的分布识别处于分布两端的样本，旨在找出在全部三个时间点均持续表现为高水平或低水平白蛋白尿的小鼠。首先，对各时间点的尿白蛋白水平进行对数转换和Z标准化，将其转换为Z分数。随后，我们
将所有三个时间点的 z 分数始终高于 1 或低于 −1（即高于或低于均值 1 个标准差）的样本分别归组。最终共纳入 26 只小鼠，每个极端组各 13 只，下文分别称为“高白蛋白尿”组和“低白蛋白尿”组。
全基因组测序与变异检测
在小鼠 12 周龄时采集尾部 DNA，用于全基因组测序（WGS）。按照制造商说明，使用 Omega Bio-Tek E.Z.N.A Tissue DNA 试剂盒（D3396-00S）提取 DNA。测序的目标最低深度为 13×。按照基因组分析工具包（GATK）v4 针对生殖系单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（indel）短变异检测的最佳实践流程，对生成的 FASTQ 文件进行处理。简而言之，使用 BWA-MEM 算法将 FASTQ 文件中的序列比对至小鼠（Mus musculus）GRCm38 主组装参考基因组（Ensembl 第 102 版）。使用 samtools v1.16.1 对 BAM 文件进行排序并建立索引，随后使用 MarkDuplicates 去除重复序列。再次使用 samtools 对 BAM 文件进行排序并建立索引，以提高后续步骤的效率。
变异检测使用了三个参考变异集：（i）小鼠基因组计划（MGP）合并变异集、（ii）C57BL/6NJ 变异集以及（iii）129SvEvBrd 变异集，均来源于 dbSNP 第 142 版。碱基质量分数重校准分两步进行。首先，运行 BaseRecalibrator，为每个样本构建模型，综合考虑读段组、测序仪分配的质量分数、测序循环位置和序列上下文等因素。随后，使用 ApplyBSQR 根据该模型重新校准碱基质量分数，为每条读段分配新的质量分数。此步骤对于提高变异检测准确性和减少
由测序伪影引入的错误。重新校准后，我们运行 HaplotypeCaller 对每个样本进行变异检测。该工具利用局部从头组装同时检测单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（indel），为每个样本生成一个基因型变异检测文件（GVCF）。这些 GVCF 文件被整合至 GenomicsDB 数据库中，以高效存储和查询大规模基因组数据。随后，使用 GenotypeGVCFs 对所有样本进行联合基因分型，生成一个包含所有样本基因型的 VCF 文件。使用 VariantRecalibrator 对合并后的 VCF 文件进行进一步优化，以提高变异检测的准确性，并生成一个分层阈值（tranches）文件。利用该分层阈值文件对变异进行过滤，以去除低质量的变异检测结果。最终，使用基于 Ensembl 第 100 版的 Ensembl 变异效应预测工具（VEP）对 VCF 文件进行注释，提供包括基因名称、预测的蛋白质效应和保守性评分在内的功能注释。
数量性状位点（QTL）定位
预处理
对 VCF 文件进行过滤，去除亲本品系和低质量变异。随后，使用命令行工具 PLINK v1.9 将 VCF 文件转换为 PLINK 格式。对 VCF 文件进行过滤，保留双等位基因 SNP，并排除次要等位基因频率（MAF）低于 0.05、基因型缺失率高于 0.1 或 Hardy–Weinberg 平衡检验 p 值低于 0.001 的变异。最终获得 4,867,965 个双等位基因 SNP，用于下游分析。
区块构建与剪枝
采用 Haploview⁸¹,⁸² 的区块定义方法构建单倍型区块，以识别彼此处于强连锁不平衡（LD）状态的 SNP 区块。具体而言，使用 plink --blocks 命令对每条染色体分别进行分析，并将区块最大长度设为 130 Mb（对应于
小鼠最大的染色体Chr1）。若90%置信区间的下限大于0.7，且上限至少为0.98，则认为SNP之间存在连锁不平衡（LD）。使用PLINK命令行软件中的indep-pairphase修饰符构建LD区块，窗口大小设为15兆碱基（Mb），步长设为1个碱基，R²阈值设为0.8。pairphase修饰符使用基于最大似然定相的数值对SNP进行剪枝，使其归入与先前构建的区块相同的区块。LD剪枝使SNP数量从4,867,965个减少至240,507个。
表型关联定位
表型的数量性状位点定位主要使用GEMMA（全基因组高效混合模型分析）完成⁸³,⁸⁴。使用经LD剪枝的SNP，根据PLINK格式文件构建亲缘关系矩阵。随后，将该矩阵传入GEMMA命令行工具，使用Wald检验进行关联分析。
CD68⁺定量与QTL定位
对所有F2小鼠的肾脏CD68⁺巨噬细胞浸润情况进行评估。按照前述方法对肾脏切片进行染色，并使用尼康Eclipse Ni-E显微镜的10倍物镜采集图像。每张肾脏切片采集3幅皮质区域图像。使用Fiji（ImageJ）中的自定义宏测量肾皮质图像中的CD68⁺面积。首先，使用H DAB颜色解卷积向量处理图像，以分离与CD68⁺染色对应的DAB信号。采用半径为20像素的滚动球算法去除解卷积后DAB通道中的背景。为按组织面积对染色进行归一化，每幅图像生成两个二值掩膜。第一个掩膜采用固定阈值（0–254）确定组织面积。第二个掩膜采用动态阈值，该阈值通过定位直方图中的第一个组距来确定
强度高于95且包含超过1,000个像素的区域，用于捕获CD68⁺信号。将两个掩膜均转换为二值图像，并使用Fiji的Measure功能进行定量。将CD68⁺面积按组织面积进行归一化，并对每个样本的三幅图像取平均值。采用前述GEMMA方法，以归一化后的CD68⁺面积作为表型进行QTL定位。
硬化肾小球比例的关联定位
以硬化肾小球比例作为数量性状，对肾小球硬化进行QTL定位。该比例通过将发生瘢痕形成及损伤的肾小球数量除以所检查的肾小球总数计算得到。由于数据不服从正态分布且具有零膨胀特征，我们选择采用零膨胀伽马回归，以更好地对数据进行建模，并使用R包glmmTMB⁸⁵,⁸⁶进行关联检验。对于每个SNP，采用似然比检验（LRT）比较包含SNP剂量的完整模型与不含SNP项的零模型，同时纳入前五个主成分（PC）作为协变量。缺乏基因型变异的标记被排除在本分析之外。似然比统计量计算如下：
我们通过置换检验确定全基因组经验显著性阈值。简而言之，在保持基因型矩阵和协变量不变的情况下，将硬化数据随机分配给各样本，并进行全基因组关联分析。每次置换均记录所有SNP中的最大LRT统计量，共进行10,000次置换以确保稳定性。随后，经验p值计算如下：
根据该零分布为各SNP赋予经验p值，并进行显著性检验（经验p < 0.05）。
显著关联位点的优先级排序与候选基因鉴定
采用Benjamini–Hochberg（BH）法对GEMMA所得Wald检验的p值进行多重检验校正。校正后p值小于0.05的SNP被视为与白蛋白尿相关的显著数量性状位点（QTL）。由于分析基于经连锁不平衡（LD）剪枝的SNP进行，因此每个显著标记均代表一个可能与该表型相关联的基因组区域。为进一步界定这些区域，利用基于D′定义的单倍型区块，将每个显著SNP扩展至其对应的区块。这些区块通常跨越数兆碱基，包含众多基因，但预计仅有部分基因具有因果作用。为确定候选基因的优先级，利用亲本基因型数据识别129AR与BL6AR品系之间存在差异的位点，重点关注具有品系特异性序列变异、且这些变异可能影响糖尿病肾病易感性的基因。对位于显著单倍型区块内的基因进行筛选，仅保留129AR与BL6AR小鼠之间存在序列差异的基因。进一步筛选该基因列表，仅保留具有人类直系同源基因且在小鼠肾脏中表达的基因。
RNA提取与测序
使用Omega Bio-Tek E.Z.N.A MicroElute Total RNA试剂盒（R6831-02）提取RNA。将新鲜冷冻的肾脏在冰上切成每块5 mg的组织块，加入300 μL裂解缓冲液（来自提取试剂盒）和1 mm玻璃珠（ThermoFisher，465945000），随后使用珠磨式匀浆器以3,000 rpm脉冲处理60秒，使组织匀浆。检查各管以确保组织完全匀浆，必要时再次进行脉冲处理。收集上清液，并按照制造商的操作规程进行处理。用20 μL水洗脱RNA，并于−80 °C保存。RNA完整性和样品纯度
使用 Agilent Bioanalyzer 2100 进行评估，仅选择 RNA 完整性指数（RIN）大于 7 的样本进行测序。RNA 测序在 Illumina NovaSeq X 平台上进行，采用 150 bp 双端测序模式。
序列比对与预处理
首先使用 Trim Galore 工具对 FASTQ 文件进行修剪，去除低质量读段和接头序列⁸⁷。随后，使用 STAR 比对软件将修剪后的读段比对至小鼠（Mus musculus）GRCm38 主组装参考基因组⁸⁸。使用 Ensembl Release 100 的基因 GTF 文件进行注释，并通过 FeatureCounts 生成计数矩阵⁸⁹。将计数矩阵导入 R，并使用 DESeq2 包进行处理。对数据进行筛选，保留在至少 25% 的样本中计数不低于 10 的基因。
差异表达分析
使用 DESeq2 包进行差异表达分析⁹⁰。为鉴定表达随白蛋白尿水平变化的基因，我们采用了两种方法。首先，采用极端分层分组，筛选高白蛋白尿组与低白蛋白尿组之间的差异表达基因。使用 DESeq 函数和 Wald 检验检测基因表达变化。第二种方法是对所有样本的连续白蛋白尿水平进行分析，使用 DESeq 函数和似然比检验，筛选表达随白蛋白尿水平变化的基因。在各时间点分别进行差异表达分析，并合并结果，以确定与白蛋白尿相关的一组核心基因。使用 Benjamini–Hochberg 方法校正 Wald 检验的 p 值，以控制多重检验的影响。校正后 p 值 ≤ 0.05 的基因被视为差异表达基因。
基因（DEGs）。使用 enrichR⁹¹ 进行通路富集分析。
表达数量性状位点定位
基因表达性状来源于经方差稳定化转换（VST）的 RNA-seq 计数数据，仅保留在至少 25% 的样本中计数不低于 10 的基因。如前所述，使用 GEMMA 对经剪枝筛选的 SNP 基因型与基因表达性状进行全基因组关联检验。在加性遗传模型下，使用线性混合模型（LMM）选项（-lmm 4）进行关联检验。名义 p 值通过对 SNP 固定效应进行 Wald 检验获得。为提高计算效率，导出用于下游处理的关联结果时，仅保留名义 p < 1 × 10⁻² 的 SNP–基因对。对于每个 SNP–基因对，基因组距离计算为 SNP 位置与相应基因中点位置之差的绝对值。顺式 eQTL（cis-eQTL）定义为位于同一染色体上、且 SNP 位于基因中点上下游各 1 Mb 范围内的变异–基因对。所有其他关联均归类为反式 eQTL（trans-eQTL）。顺式 eQTL 的显著性在基因水平进行评估。对于每个基因，确定其所有顺式 SNP 中最小的名义 p 值。采用 Benjamini–Hochberg 错误发现率（FDR）程序，对所有基因进行多重检验校正。FDR < 0.05 的基因被判定为显著的顺式 eGene。为便于结果报告，每个显著顺式 eGene 仅保留其先导 SNP（即名义 p 值最小的 SNP）。反式 eQTL 的显著性在 SNP–基因对水平进行评估。为控制反式关联的族错误率，反式假设检验的总数估算为：
其中，G 为接受检验的基因总数，M 为纳入 GEMMA 分析的 SNP 总数，N_cis 表示
位于基因中点上下游 ±1 Mb 范围内的变异–基因配对数量。顺式配对的数量通过计算 SNP 坐标与以基因为中心的 ±1 Mb 区间之间的基因组区间重叠确定。经 Bonferroni 校正的显著性阈值定义为：
名义 p 值低于该阈值的反式 SNP–基因配对被判定为显著。该校正涵盖完整的反式搜索空间，且独立于对导出的关联分析结果所施加的名义 p 值筛选。
细胞类型特异性网络构建
使用 WGCNA 构建基因共表达网络，该方法基于不同样本间基因表达水平的相关性构建网络⁹²。利用 129AR 小鼠的单细胞数据，鉴定各细胞类型相较于所有其他细胞类型的差异表达基因（DEG），筛选标准为对数倍数变化 ≥ 1 且校正后 p 值 ≤ 0.05。由此获得各细胞类型的差异表达基因，随后将其用于筛选包含 F2 小鼠基因表达数据的批量 RNA 矩阵。该方法使我们能够构建具有已知单细胞表达模式的基因共表达网络，并鉴定在同一细胞类型内共表达的基因。针对每种细胞类型，执行以下步骤：首先，使用差异表达基因列表筛选矩阵，随后采用 DESeq 的方差稳定化变换进行标准化。使用标准化并筛选后的矩阵，通过 pickSoftThreshold 函数计算软阈值幂。软阈值幂是控制网络中基因间连接程度的参数。较高的值会形成连接更紧密的网络，而较低的值则会形成更稀疏的网络。pickSoftThreshold 函数自动确定
最优值。
随后，使用选定的值通过 adjacency 函数计算邻接矩阵。利用 TOMsimilarity 函数将该矩阵转换为拓扑重叠矩阵（TOM），该函数根据基因在网络中的连接情况衡量基因之间的相似性。使用 hclust 函数及 ward.D2 方法对 TOM 矩阵进行层次聚类。利用 cutreeDynamic 函数将所得树状图划分为模块，该函数根据基因的连接情况识别共表达基因模块。在高度为 0.25（对应相关系数为 0.75）处切割树状图，以合并相似模块。将模块的最小规模设定为 30 个基因，以界定模块。使用 moduleEigengenes 函数计算每个模块的模块特征基因（ME），其代表该模块内基因表达数据的第一主成分。根据细胞类型和网络的相对规模，对所得模块、模块特征基因及基因列表进行命名，其中 1 表示规模最大的网络，2 表示规模第二大的网络，依此类推。
网络表征与 MAGMA 富集分析
采用多种互补方法对网络进行注释。首先，使用 R 中的 cor 函数计算网络特征基因与各时间点白蛋白尿之间的相关性，并在每种细胞类型内进行 Benjamini-Hochberg 校正。此外，针对每个网络，分别统计以下基因的数量：（i）白蛋白尿相关 pGenes；（ii）129 和 BL6 品系之间的差异表达基因；（iii）eQTL 分析中鉴定出的 eGenes。为评估临床相关性，进一步使用 MAGMA（基因组注释的多标记分析）检验网络中人类糖尿病肾病 GWAS 信号的富集情况，该方法
在考虑连锁不平衡的同时，将SNP水平的汇总统计数据整合为基因水平的关联结果。由于尚无专门针对人类白蛋白尿的GWAS可用，我们采用了一项已发表的糖尿病肾病GWAS，该研究根据白蛋白尿状态对患者进行分层。该数据集包含健康对照与不同阶段糖尿病肾病病例之间的比较，涵盖微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和终末期肾病。汇总统计数据获取自JDRF糖尿病肾病协作研究计划GWAS资源。GRCh37基因位置文件和千人基因组计划的欧洲人群参考数据获取自MAGMA参考数据门户。MAGMA分析分三步进行。首先，采用基因上、下游各10 kb的窗口将SNP注释至基因。其次，结合GWAS汇总统计数据、参考基因型数据及SNP至基因注释文件，计算基因水平的关联统计量。第三，使用各网络内的基因进行基因集富集分析。校正后p值低于0.05的网络被认为在相应人类性状中显著富集。
果蝇肾细胞成像实验
Dotgal4, UAS-FourColors品系的构建
用于肾细胞表达研究的品系包括：dorothy-GAL4（dotGAL4）、由肌球蛋白重链（MHC）增强子驱动表达的、与心房利钠因子（ANF）分泌肽融合的红色荧光蛋白（RFP）报告基因品系（即MHC-ANF-RFP），以及由hand增强子驱动表达绿色荧光蛋白的品系（hand-GFP）；这些品系均由Zhe Han惠赠⁹³。FourColors通过DNA合成构建（Synbio Technologies，美国新泽西州），包含荧光蛋白编码序列，其两侧为用于Gateway的attL1/2位点
采用重组克隆技术（Invitrogen，美国）将其克隆至果蝇表达载体 pUASg.attB.3XHA（由苏黎世的 J. Bischof 和 K. Basler 惠赠）⁹⁴。该序列设计用于表达与 TagBFP 融合的 SV40 核定位序列⁹⁵˒⁹⁶、与 mNeonGreen 融合的 Src 肉豆蔻酰化序列⁹⁷˒⁹⁸、与 mKO 融合的 LifeActin⁹⁹˒¹⁰⁰，以及与果蝇 jupiter 基因编码序列融合、用于定位至微管的 mKate2¹⁰¹˒¹⁰²。该多顺反子构建体在各编码基因之间含有 P2A 和 T2A 序列，以实现肽链自切割¹⁰³，同时含有用于 Flp 依赖性重组的 FRT 序列¹⁰⁴。该构建体由 Best-Gene Inc.（加利福尼亚州）注射至 attP2（BDSC 品系 8622）P[CaryP]attP2 68A4 位点。通过标准遗传杂交，将阳性品系与 dotGAL4 品系杂交，以获得在肾细胞中表达全部四种荧光蛋白的稳定组合品系。
果蝇遗传学与杂交
所有品系均获自布卢明顿果蝇品系中心（NIH P40OD018537）。所使用的 TRiP 品系汇总于补充表 17¹⁰⁵。
果蝇肾细胞的示踪物摄取功能测定与肌动蛋白分布
分别收集 Dotgal4; HandGFP; MHC-ANF-RFP × UAS RNAi 品系或 Dotgal4; Four colors × UAS RNAi 品系杂交所得 F₁ 代雌蝇，进行解剖，用于示踪物摄取实验和肌动蛋白分布研究。在麻醉状态下去除果蝇附肢，随后将果蝇转移至含有 1× PBS 的解剖皿中。将果蝇腹面朝上放置，使用 Dumont #5 镊子去除胸部及后端。在腹部两端均已开放的情况下，沿腹部中线从前端开口向后端开口作一直线切口，从而展开腹部并去除内部的
器官。仍附着于角质层的心管和围心肾细胞被立即制片，用于活体成像。将样本以角质层朝下的方式置于载玻片上，载玻片两侧各贴有两层 Scotch 胶带。向样本滴加数滴 PBS 后盖上盖玻片，并在成像前密封边缘。使用配备 40× 和 63× 物镜的 Zeiss LSM 800 共聚焦显微镜对肾细胞进行成像，以观察其排列情况，并采用 Airyscan 模式对单个肾细胞进行超分辨率成像。
人类变异水平关联分析
在 All of Us 研究计划受控层级数据集 v8 的糖尿病参与者中，对白蛋白尿候选基因（pGenes）进行变异水平的尿白蛋白/肌酐比值（UACR）关联检验。纳入有 2 型糖尿病诊断记录（SNOMED 201820、201826）的参与者。排除获处方二甲双胍的参与者，因为已有研究表明，二甲双胍可通过 AMPK 介导的通路独立降低白蛋白尿¹⁰⁶，这可能混杂基因型对 UACR 影响的检测。同样排除获处方 SGLT2 抑制剂的参与者，因为这类药物可不依赖于基础肾小球病理改变而直接减少尿白蛋白排泄，从而可能掩盖真实的遗传关联¹⁰⁷。进一步排除协变量（年龄、性别、种族或血糖）缺失的参与者，最终纳入 3,553 名参与者进行分析。从 gnomAD 获取 pGenes 内的变异，并在 All of Us 数据库中查询其携带状态。
对于每个基因，针对糖尿病队列中至少有 10 名个体携带的所有变异，进行协变量校正的线性回归，以经 log₁₀ 转换的 UACR 为结局变量，并以
将年龄、性别、种族和血糖作为协变量。采用Benjamini-Hochberg方法控制基因内多重检验。将校正后p < 0.05的变异归类为不利变异（β > 0，携带者的UACR较高）或保护性变异（β < 0，携带者的UACR较低），并将每个基因的方向性平衡定义为不利变异数减去保护性变异数。为评估观察到的方向性富集是否超出随机预期，实施了置换检验。使用不随基因变化的随机种子，对经协变量校正的log₁₀-UACR残差进行500次置换，确保在每次重复中对所有基因应用相同的表型重排。采用闭式普通最小二乘估计量，基于残差化后的结局变量计算各变异的统计量，并在每次重复中以相同方式进行基因内Benjamini-Hochberg校正。每个基因的经验p值定义为名义显著变异数等于或超过观察值的置换次数占比，计算公式为(k + 1)/(N + 1)。对全部179个人类直系同源基因应用Benjamini-Hochberg方法，得到经验FDR。基因被划分为经验FDR < 0.05（n = 72）、经验p < 0.05（n = 55）或不显著（n = 52）三类。
作者贡献
T.M.C.、E.P.和J.B.构思了本项目。J.B.和T.M.C.共同指导本项目并获得研究经费。K.M.完成了所有生物信息学分析，包括QTL和eQTL定位、单细胞转录组分析、基因共表达网络构建及人类变异关联分析；进行了CD68免疫组织化学染色及定量，并在J.B.和T.M.C.的协助下撰写了稿件。R.B.S.进行了小鼠繁育和F2
杂交世代构建、协调样本采集、制备用于测序的单细胞悬液，并处理用于代谢组学分析的尿液样本。B.L.F. 对肾脏组织学切片进行评分和注释。M.S.T. 收集小鼠表型数据。J.W. 制备肾脏组织并提取 RNA，用于群体 RNA 测序。S.S. 开展果蝇肾细胞 RNAi 杂交实验和功能测定。J.C. 和 J.-P.K. 进行尿液有机酸的气相色谱-质谱（GC-MS）数据采集，并参与代谢物结果解读。J.G. 参与早期生物信息学分析并提供意见。K.M.、R.B.S.、S.S.、J.W.、B.L.F.、J.G.、J.C.、M.S.T.、J-P.K.、S.B.G.、E.P.、N.S.T.、T.M.C. 和 J.B. 参与数据解读。所有作者均已审阅并批准稿件的最终版本。
扩展图
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扩展图 1。
高白蛋白尿组与低白蛋白尿组之间的差异表达基因（DEGs）。（A）火山图展示两组间上调和下调的差异表达基因数量。显著差异基因（p.adj < 0.05，logFC ≥ 1）分别以红色（高白蛋白尿组中上调的基因）和蓝色（下调的基因）标示。（B）和（C）分别展示上调基因和下调基因的富集通路。通路富集分析使用 enrichR 进行。
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扩展表 1。
F2 代小鼠肾脏中按染色体汇总的 eQTL 定位结果。
基于 F2 代小鼠（n=279）的全肾 RNA-seq 数据，采用线性混合模型进行 eQTL 定位，列出各染色体上鉴定出的显著顺式 eGenes（FDR < 0.05）和反式 eGenes（经 Bonferroni 校正）的数量。最后一列列出各染色体上同时属于白蛋白尿 pGenes 的顺式 eGenes 的数量及百分比，其定义为
经优先级筛选后位于显著 pQTL 位点内的基因。百分比以每条染色体上顺式 eGenes 的总数为基准计算。在所有染色体上，白蛋白尿 pGenes 均未与反式 eGenes 重叠。
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扩展图 2。
属于 GWAS 命中基因的白蛋白尿 pGenes。为便于展示，图中绘制了这些基因的人类直系同源基因。左：展示哪些基因在一个或多个类别中属于 GWAS 命中基因。右：点图展示各基因内与性状相关的 SNP 的最低 p 值。
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扩展图 3。
F2 队列中尿液有机酸 pGenes 的 QTL 定位及细胞类型特异性表达。（A）曼哈顿图展示 F2 队列中尿琥珀酸水平的线性混合模型（LMM）QTL 定位结果。（B）条形图展示在各肾脏细胞类型中具有品系特异性差异表达的尿琥珀酸 pGenes 数量，并按效应方向分层（相对于 BL6AR，红色表示在 129AR 中表达较低；蓝色表示在 129AR 中表达较高）。（C）曼哈顿图展示尿苹果酸水平的 LMM QTL 定位结果。（D）条形图展示尿苹果酸 pGenes 在各肾脏细胞类型中的品系特异性差异表达，并按效应方向分层。在 A 和 C 图中，每个点代表一个遗传位点，横轴为染色体位置，纵轴为经 BH 校正的 −log10(p 值)。红色水平线表示显著性阈值（经 BH 校正的 p < 0.05）。显著位点以放大的点表示。细胞类型缩写：PT，近端小管；DCT，远曲小管；LOH，亨利袢。
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扩展图 4。
显著的白蛋白尿 pGenes 富集了高置信度功能丧失变异。左：箱线图
展示达到 FDR 或经验显著性水平（FDR 或经验 p < 0.05，n=127）的白蛋白尿 pGenes 与未达到显著性水平的 pGenes（n=59）中，每个基因所含的 gnomAD 外显子高置信度（HC）功能丧失（LoF）变异数量。右：箱线图展示上述两组中每个基因的 HC LoF 变异占全部变异的比例。采用 Wilcoxon 秩和检验进行统计比较。各项比较的 p 值标注于其上方。
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扩展图 5。
通过对足细胞基因共表达网络进行无偏分析鉴定的疾病相关足细胞网络（DAPNet）。（A）DAPNet 基因的网络可视化。节点表示基因；边表示 STRING 数据库中置信度评分大于 0.5 的蛋白质–蛋白质相互作用。节点形状表示基因类别：圆形表示网络基因，菱形表示同时属于白蛋白尿 pGenes 的基因。带有黑色轮廓的节点还被鉴定为 eQTL 基因。节点颜色反映各基因与第 24 周白蛋白尿的 Spearman 相关性，范围从蓝色（强负相关，r = -1）到红色（强正相关，r = 1）。DAPNet 基因的完整列表见补充表 16。（B）DAPNet 基因的基因集富集分析。条形表示显著富集的基因本体生物学过程条目的 BH 校正后 -log10(p) 值。最显著的富集条目包括高尔基体囊泡运输、蛋白质分泌、胆固醇稳态和鞘脂代谢过程，反映了膜运输和脂质代谢在该网络中的主导作用。（C）驱动 DAPNet 在微量白蛋白尿阶段（左）和糖尿病肾病（DN）晚期阶段（右）的人类糖尿病肾病 GWAS 信号中呈现富集的前沿基因。热图
显示各基因与第8、16和24周白蛋白尿之间的Spearman相关系数。星号表示统计学显著性（* p < 0.05， p < 0.01，* p < 0.001）。
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扩展图6。
经功能验证的DAPNet候选基因中与UACR相关的变异。（A）基因座图显示，在All of Us研究计划的糖尿病参与者中，9号染色体MLLT3基因座内与尿白蛋白/肌酐比值（UACR）相关的变异。红色点表示超过显著性阈值的有害变异，绿色点表示超过显著性阈值的保护性变异（虚线，BH校正后p < 0.05）。（B）1号染色体DCAF6基因座的基因座图。（C）7号染色体ZNRF2基因座的基因座图。在所有分图中，每个点代表一个变异，横轴为染色体位置，纵轴为经BH校正的关联检验p值。标注的变异均超过显著性阈值。蓝色点表示不显著的变异。关联检验采用线性混合模型，并校正年龄、性别、种族和空腹血糖水平；对所有受检pGene直系同源基因进行基因水平的FDR校正。
补充部分
补充表
补充表1。
用于F2小鼠肾脏病理评估的组织学评分标准。该半定量评分系统改编自人类糖尿病肾病的评估标准，用于评价肾脏损伤。评分项目包括系膜扩张、结节性硬化、全局性肾小球硬化、肾小管基底膜增厚、间质纤维化和肾小管萎缩，以及小动脉玻璃样变。表中列出了各项特征的评分及其相应定义。
补充表2。
所有F2小鼠（n=279）的表型数据。包括
组织学评分、24周时尿液有机酸代谢物水平（µmol/24小时）、8、16和24周时血糖水平、24小时尿量、白蛋白浓度、尿白蛋白排泄量，以及标准化CD68+面积。
补充表3。
通过线性混合模型定位在F2队列中鉴定出的与尿白蛋白排泄量（UAE）相关的显著表型数量性状位点（pQTL）。每行代表经Benjamini–Hochberg校正后一个显著位点的先导SNP（校正后p < 0.05）。各列包括SNP标识符、染色体、单倍型区块大小、区块坐标、区块内基因数量、次要等位基因频率、等位基因，以及8、16和24周时的原始及校正后p值和效应量（β）。
补充表4。
白蛋白尿pGenes：从UAE pQTL位点中优先筛选出的192个候选基因。保留的基因须在129AR和BL6AR亲本品系之间存在序列差异、具有人类直系同源基因，且在小鼠肾脏中表达。各列包括小鼠基因名称、来源先导SNP、是否有顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）证据支持（是/否）、人类直系同源基因、果蝇直系同源基因、单倍型区块大小、表达该基因的肾脏细胞类型，以及已知功能。
补充表5。
通过线性混合模型定位在F2队列中鉴定出的与CD68+巨噬细胞浸润相关的显著pQTL（校正后p < 0.05）。各列包括SNP标识符、染色体、单倍型区块坐标及大小、次要等位基因频率、等位基因、原始及校正后p值，以及效应量。
补充表6。
CD68 pGenes：依据亲本品系间序列差异、人类直系同源基因及肾脏表达情况进行筛选后，从巨噬细胞浸润pQTL位点中优先筛选出的36个候选基因。各列与补充表4相同。
补充表7。
鉴定出的与全局性肾小球硬化相关的显著pQTL
采用零膨胀伽马回归模型，并基于置换检验计算经验p值。各列包括SNP标识符、染色体、单倍型区块坐标及大小、次要等位基因频率、等位基因、原始p值和经验p值，以及效应量。
补充表8。
肾小球硬化pGenes：根据亲本品系序列差异、人类直系同源基因及肾脏表达情况进行筛选后，从肾小球硬化pQTL位点中优先确定的25个候选基因。各列同补充表4。
补充表9。
通过线性混合模型定位鉴定的24周龄时尿液琥珀酸水平的显著pQTL（校正后p < 0.05）。各列包括SNP标识符、染色体、单倍型区块坐标及大小、等位基因频率、次要等位基因频率、等位基因、原始p值和校正后p值，以及效应量。
补充表10。
琥珀酸pGenes：根据亲本品系序列差异、人类直系同源基因及肾脏表达情况进行筛选后，从尿液琥珀酸pQTL位点中优先确定的12个候选基因。各列同补充表4。
补充表11。
通过线性混合模型定位鉴定的24周龄时尿液苹果酸水平的显著pQTL（校正后p < 0.05）。各列包括SNP标识符、染色体、单倍型区块坐标及大小、次要等位基因频率、等位基因、原始p值和校正后p值，以及效应量。
补充表12。
苹果酸pGenes：根据亲本品系序列差异、人类直系同源基因及肾脏表达情况进行筛选后，从尿液苹果酸pQTL位点中优先确定的27个候选基因。各列同补充表4。
补充表13。
在F2队列（n=279）的全肾RNA-seq数据中鉴定的显著顺式eQTL。采用Benjamini-Hochberg方法，在FDR < 0.05的阈值下共鉴定出5,494个顺式eGenes
程序。顺式表达数量性状位点（cis-eQTL）定义为位于同一染色体上、距基因中点±1 Mb范围内的SNP–基因配对。各列包括基因名称、先导SNP、基因所在染色体及位置、与SNP的距离、等位基因、次要等位基因频率、效应量（beta）、标准误、名义p值和FDR q值。
补充表14。
在F2队列（n=279）的全肾RNA-seq数据中鉴定出的显著反式表达数量性状位点（trans-eQTL）。在整个反式搜索空间内进行Bonferroni校正后，共鉴定出50个反式eGene。反式eQTL定义为位于不同染色体上，或距离超出基因中点±1 Mb范围的SNP–基因配对。各列包括基因名称、先导SNP、基因所在染色体及位置、与SNP的距离、等位基因、次要等位基因频率、效应量（beta）、标准误和名义p值。
补充表15。
既往已被报道与慢性肾脏病（CKD）或糖尿病肾病（DN）相关性状存在关联的白蛋白尿pGene。在192个白蛋白尿pGene中，52个在人类全基因组关联研究（GWAS）中曾被报道与CKD、1型或2型糖尿病、估算肾小球滤过率（eGFR）下降或高血压存在关联。各列包括小鼠基因名称、相关人类性状、GWAS疾病性状描述、已报道的最小p值、相关SNP、研究登录号和PubMed ID。
补充表16。
基于亲本品系单细胞RNA-seq数据，采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建的95个细胞类型特异性基因共表达网络的汇总。对于每个网络，各列包括网络名称、来源细胞类型、网络大小、与各时间点白蛋白尿的Spearman相关系数及校正后的p值、与白蛋白尿pGene的重叠情况、129与BL6品系间差异表达基因的数量、网络内顺式和反式eGene的数量，以及来自van Zuydam等人的微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和终末期肾病（ESRD）的MAGMA富集p值
等，2018年，DN全基因组关联研究（GWAS）。
补充表17。
用于肾细胞敲低实验的果蝇RNAi品系。列出了过滤功能测定和肌动蛋白成像实验中使用的各UAS-RNAi品系的名称及其在布卢明顿果蝇品系中心的编号。
致谢
感谢Behmoaras实验室成员提供的有益讨论与见解。感谢杜克—新加坡国立大学动物实验中心工作人员提供的动物饲养支持。感谢“All of Us”研究计划的参与者和研究人员为本研究提供数据。“All of Us”研究计划由美国国立卫生研究院院长办公室资助。感谢Z. Han提供MHC-ANF-RFP、Hand-GFP和DotGal4果蝇品系，感谢J. Bischof和K. Basler提供pUASg.attB.3XHA表达载体。果蝇品系购自布卢明顿果蝇品系中心（NIH P40OD018537）。
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关键词：糖尿病肾病 · 跨物种系统遗传学 · 数量性状位点 · 单细胞转录组学 · 足细胞共表达网络 · 因果基因鉴定
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.06.30.735464v1?rss=1